Nghiên cứu xác định loài vi khuẩn ncardia sp gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng (tranchinotus blochii lacepéde, 1801) tại khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG

LÊ THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LOÀI VI KHUẨN NCARDIA sp. GÂY
BỆNH ĐỐM TRẮNG NỘI TẠNG Ở CÁ CHIM VÂY VÀNG
(Tranchinotus blochii Lacepéde, 1801) TẠI KHÁNH HÒA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Công nghệ sinh học

Nha Trang – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG

LÊ THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LOÀI VI KHUẨN NOCARDIA sp. GÂY
BỆNH ĐỐM TRẮNG NỘI TẠNG Ở CÁ CHIM VÂY VÀNG
(Tranchinotus blochii Lacepéde, 1801) TẠI KHÁNH HÒA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Công nghệ sinh học
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN:
1. TS. NGUYỄN VĂN DUY
2. TS. VŨ KHẮC HÙNG

Nha Trang - 2014


i

LỜI CẢM ƠN
Thời gian làm báo cáo gói gọn trong 3 tháng nhƣng vô cùng quý báu và hữu
ích đối với bản thân em. Em có cơ hội vận dụng kiến thức đã học vào thực tiễn và
hoàn thiện những lỗ hổng kiến thức, đồng thời giúp em có cơ hội tiếp xúc với môi
trƣờng công việc cũng nhƣ rèn luyện các kỹ năng làm việc, kỹ năng giao tiếp trong
cuộc sống.
Trƣớc tiên, với tấm lòng tôn sƣ trọng đạo, em xin gửi lời cảm ơn tới quý
Thầy Cô tại Trƣờng Đại học Nha Trang, quý Thầy Cô khoa công nghệ sinh học đã
dạy bảo em trong suốt thời gian 4 năm đại học vừa qua.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Duy, TS.Vũ Khắc Hùng,
ThS. Dƣơng Văn Quý Bình, đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức
vô cùng quý báu để em hoàn thành bài đồ án tốt nghiệp này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh, chị đang làm việc tại
phòng công nghệ sinh học – Phân viện thú y miền Trung, Nha Trang, Khánh Hòa,
đã tạo điều kiện thuận lợi và tốt nhất cho em trong quá trình thực tập.
Cuối cùng xin kính chúc tất cả quý Thầy Cô, cùng TS. Nguyễn Văn Duy,
TS.Vũ Khắc Hùng, ThS. Dƣơng Văn Quý Bình và anh chị lời chúc sức khỏe và
thành công.
Nha Trang, tháng 6 năm 2014.


ii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3
1.1. Tổng quan về chi vi khuẩn Nocardia ...............................................................3
1.1.1. Đặc điểm phân loại học của Nocardia .......................................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của chi Nocardia .........................................................4
1.1.3. Đặc điểm hóa sinh của các loài vikhuẩn thuộc chi Nocardia ....................7
1.2. Tổng quan về cá chim vây vàng .......................................................................8
1.2.1. Đặc diểm phân loại của cá chim vây vàng .................................................8
1.2.2. Đặc điểm hình thái của cá chim vây vàng ..................................................8
1.2.3. Đặc điểm phân bố của cá chim vây vàng .................................................10
1.2.4. Tình hình sản xuất giống và ƣơng nuôi cá chim vây vàng trên thế giới và
ở Việt Nam .........................................................................................................10
1.2.5. Các bệnh thƣờng gặp trên cá chim vây vàng ...........................................12
1.3. Những nghiên cứu về chi Nocardia gây bệnh cá ...........................................12
1.3.1. Nocadiosis - bệnh đốm trắng nội tạng ở cá ..............................................12
3.2 Những nghiên cứu về định danh loài vi khuẩn thuộc chi Nocardia trên cá ....15
3.2.1 Các loài cá nƣớc ngọt và nƣớc mặn ở Châu Á ..........................................15
1.4. Các phƣơng pháp định danh vi khuẩn ............................................................18
1.4.1. Tổng quan về các phƣơng pháp định danh vi khuẩn ................................18
4.1.3. Phƣơng pháp hiện đại ...............................................................................21
Chƣơng 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................................................29
2.1. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................29
2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu .........................................................................29
2.2.1. Hóa chất và môi trƣờng, thuốc thử ...........................................................29
2.2.2. Thiết bị chuyên dụng ................................................................................31
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ..............................................................................32
2.3.1. Thu mẫu cá bệnh ......................................................................................32

iii

2.3.2. Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh....................................................................32
2.3.4. Nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn. ...............................................................33
2.3.5. Nhuộm vi khuẩn và nhuộm các tiêu bản phết từ mô của nội tạng cá bệnh
............................................................................................................................33
2.3.6. Định danh vi khuẩn bằng thử nghiệm test hóa sinh .................................35
2.3.7. Định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử ..............................................37
2.4. Sơ đồ khối mô tả các bƣớc thực hiện khi nghiên cứu định danh vi khuẩn từ cá
bệnh ........................................................................................................................40
3.1. Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng tại
Khánh Hòa .............................................................................................................41
3.2. Kết quả nhuộm mô cá bệnh trên các tiêu bản phết .........................................45
3.3. Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh ..........................................................................47
3.4. Kết quả định danh vi khuẩn bằng test hóa sinh truyền thống .........................52
3.5. Bƣớc đầu định danh dựa trên sinh học phân tử. .............................................55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................57
Kết luận .....................................................................................................................57
Kiến nghị ...................................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................58
Tài liệu tiếng anh .......................................................................................................58


iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số phản ứng thủy phân để phân biệt các loài Nocardia ........................8
Bảng 2.1. Bảng đọc kết quả của O/F test ....................................................................36
Bảng 3.1. Bảng tổng hợp mẫu cá bị bệnh thu đƣợc sau 5 lần thu mẫu .......................41
Bảng 3.2. Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng trong nội tạng ............................44

Bảng 3.3. Kết quả phân lập vi khuẩn Norcadia từ cá bệnh.........................................48
Bảng 3.4. Kết quả các phản ứng hóa sinh của 20 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ cá
bệnh..............................................................................................................53
Bảng 3.5. Các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ cá vây vàng ở Nha Trang
và so sánh với các tác giả khác ....................................................................54


v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Edmond Nocard (1850 – 1903) - Ngƣời đầu tiên phát hiện và phân lập vi
khuẩn Nocardia ...............................................................................................3
Hình 1.2. Hình ảnh vi khuẩn Nocardia .......................................................................4
Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào của Nocardia ............................................................5
Hình 1.5. Khuẩn lạc của Nocardia asteroides phân lập trên cùng một môi trƣờng và
nhiệt độ nhƣng đa dạng về kích thƣớc, màu sắc, hình dạng ...........................7
Hình 1.6. Hình ảnh cá chim vây vàng .........................................................................9
Hình 1.7. Cá hồng đỏ (Lutianus erythopterus) bị bệnh nhiễm trùng hệ thống do vi
khuẩn Nocardia spp. .....................................................................................14
Hình 1.8. Mang bết dính, hạt trắng xuất hiện ở mang và lách của một loài cá đuôi
vàng (Seriola) (Sheppard 2010) ....................................................................14
Hình 1.9. a.Vi khuẩn N.seriolae bắt màu Gram (+) dạng sợi, phân nhánh khi nhuộm
Gram; .............................................................................................................16
Hình 1.10. Loài cá Larimichthy crocea với các dấu hiệu bệnh do vi khuẩn Nocadia
gây ra ở gan, lách, thận (Wang, 2005) ..........................................................17
Hình 1.11. Cá lóc (Ophiocephalusargus cantor) bị nhiễm vi khuẩn Nocardia (Wang,
2007)..............................................................................................................18


1

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài:
Từ ngàn xƣa ông cha ta đã có câu: “chim, thu, nhụ, đé” và cho đến ngày nay
cá chim vây vàng (Tranchinotus blochii) vẫn đƣợc xếp đứng đầu trong hàng tứ quý
về cá biển, vì thịt cá thơm ngon, hấp dẫn, hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, đƣợc ƣa
chuộng rộng rãi trên thị trƣờng.
Trên thế giới cá chim vây vàng là đối tƣợng nuôi quan trọng và đem lại lợi
nhuận lớn ở Hồng Kông, Singapore, Đài Loan, Trung Quốc, Malaysia…
Ở Việt Nam cá chim vây vàng là đối tƣợng nuôi mới, lần đầu tiên đƣợc nuôi
trong lồng với nguồn giống do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I nhập từ Đài
Loan. Năm 2006, Viện cho sinh sản thành công đối tƣợng này. Năm 2009, cá chim
vây vàng đã đƣợc thử nghiệm nuôi và cho đẻ tại trƣờng đại học Nha Trang. Sau
bƣớc chủ động đƣợc nguồn giống, ở một số đại phƣơng trên cá nƣớc đã xuất hiện
mô hình nuôi cá chim vây vàng trong ao đất cho năng suất sau 10 tháng đạt 1 – 1,5
tấn/ha. Hiện nay cá chim vây vàng đã đƣợc nuôi rộng rãi trong cả nƣớc bởi hiệu quả
kinh tế của nó mang lại so với các loài cá khác cao hơn và thị trƣờng xuất khẩu
rộng lớn. Đồng thời với việc chủ động đƣợc công nghệ sản xuất giống, ngƣời nuôi
đã nắm đƣợc quy trình kỹ thuật từ thành công của các mô hình nuôi thí nghiệm,
trong tƣơng lai không xa đây là đối tƣợng nuôi rất có triển vọng. Khánh Hòa là tỉnh
đƣợc sự ƣu ái tự nhiên với khí hậu tốt, đƣờng biển dài, nguồn giống sẵn có vì vậy
nghề cá nuôi cá chim vây vàng phát triển rất nhanh và đem lại lợi nhuận lớn cho
ngƣời nuôi.
Tuy nhiên cùng với sự phát triển mạnh mẽ, nhanh chóng của nghề nuôi cá
chim vây vàng ở Việt Nam cũng nhƣ ở Khánh Hòa thì vấn đề bệnh tật ở đối tƣợng
này ngày càng ra tăng gây thiệt hại về kinh tế cho ngƣời nuôi, đáng chú ý đó là bệnh
đốm trắng nội tạng ở loài cá này theo nghiên của Nguyễn Thị Thùy Giang và cs
(2011) có thể gây chết lên tới 50% sau 15 ngày phát bệnh. Đây là bệnh nguy hiểm,
có khả năng xâm nhiễm và phá hủy hệ thống. Hầu hết những nghiên cứu trƣớc đây
phần lớn là nghiên cứu về giống và thức ăn ở cá chim vây vàng, nghiên cứu về bệnh

2

tật rất hạn chế. Chính vì lẽ đó chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định loài vi
khuẩn Nocardia sp. gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng Trachinotus
blochii (Lacepéde, 1801) tại Khánh Hòa.”
Mục tiêu của đề tài: Xác định loài vi khuẩn Nocardia sp. gây bệnh đốm trắng nội
tạng ở cá chim vây vàng Trachinotus blochii (Lacepéde, 1801) tại Khánh Hòa.
Nội dung của đề tài:
Nội dung 1: Xác định các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng ở nội tạng cá chim
vây vàng.
Nội dung 2: Phát hiện vi khuẩn trên các tiêu bản phết.
Nội dung 3: Kết quả phân lập vi khuẩn từ cá bệnh.
Nội dung 4: Định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp sinh học phân tử hoặc bằng các
phản ứng hóa sinh truyền thống.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
Ý nghĩa khoa học:
Cung cấp tƣ liệu về bệnh cá vây vàng, về vi khuẩn Nocardia gây bệnh trên cá chim
vây vàng tại Khánh Hòa nói riêng và Việt Nam nói chung.
Ý nghĩa thực tiễn:
Kết quả đề tài làm cơ sở khoa học để phòng trị bệnh đốm trắng nội tạng của cá chim
vây vàng tại Khánh Hòa.


3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chi vi khuẩn Nocardia
1.1.1. Đặc điểm phân loại học của Nocardia

Vi khuẩn Nocardia đƣợc nhà khoa học ngƣời Pháp và cũng là bác sĩ thú y
Edmond Nocard (1850 – 1903) phát hiện và phân lập đầu tiên ở bò vào năm 1888.
Sau đó năm 1890, Eppinger phát hiện bệnh do vi khuẩn Nocardia gây ra ở ngƣời.

Hình 1.1. Edmond Nocard (1850 – 1903) - Ngƣời đầu
tiên phát hiện và phân lập vi khuẩn Nocardia
Theo phân loại học, Nocardia đƣợc xếp vào:
Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria
Lớp: Actinomycetales
Bộ: Corynebacterineae
Họ: Nocardiaceae
Chi: Nocardia
Loài:

Nocardia aerocolonigenes
Nocardia africana
…

Chi Nocardia có tổng cộng khoảng 85 loài đã đƣợc phát hiện, định danh
bằng phƣơng pháp truyền thống và sinh học phân tử. Một số loài không gây bệnh


4

trong khi một số loài gây bệnh ở ngƣời và động vật. Nghiên cứu cho thấy có 13 loài
gây bệnh cho ngƣời đó là: Nocardia abscessus, Nocardia africana, Nocardia
asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia brevicatena, Nocardia cyriacigeorgica,
Nocardia farcinica, Nocardia nova, Nocardia otitidiscaviarum, Nocardia
paucivarans, Nocardia pseudobrasiliensis, Nocardia transvalensis, Nocardia

veteran [22,24,25].
Ngoài ra, vi khuẩn Nocardia còn gây bệnh trên loài động vật nhƣ: chó,
trâu, bò, ngựa, dê, cừu. Hiện vẫn chƣa có tài liệu nào cho thấy Nocardia gây bệnh ở
lợn. Bốn loài gây bệnh trên cá đã đƣợc phát hiện là: Nocardia seriola (trƣớc đây là
Nocardia kampachi), Nocardia asteroids, Nocardia salmonicida và Nocardia
crassostreae [15,28].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của chi Nocardia
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái và sinh trƣởng
Chi Nocardia là vi khuẩn hiếu khí, Gram (+), sinh bào tử, các bào tử trần
nằm trên bó sợi (synnema), tƣơng tự bó sợi của nấm (ở Actinosynnema,
Actinomadura...) thƣờng có tỷ lệ G - C trong ADN là 64% - 72%, hình que, dạng
sợi, nhánh. Chúng không di chuyển và thuộc vi sinh vật hoại sinh. Nocardia đƣợc
tìm thấy khắp nơi trên thế giới, rộng rãi trong tự nhiên nhƣ: đất (nhất là đất đồi núi),
cây, cỏ và gỗ mục, vật liệu hữu cơ chết hoặc đang phân hủy. Mô tế bào động vật và
con ngƣời là môi trƣờng lý tƣởng để chúng phát triển và gây bệnh [1, 26].

Hình 1.2. Hình ảnh vi khuẩn Nocardia
( />

5

Nocardia thƣờng đƣợc phân lập và nuôi cấy trên các môi trƣờng khác nhau
nhƣ: thạch Sabouraud có glucose, thạch máu, thạch Lowenstein - Jensen , BHI,
ogawa… Tuy nhiên chúng phát triển khá chậm trong các môi trƣờng nuôi cấy
không chọn lọc [13].
Vi khuẩn Nocardia có thể sinh trƣởng trong phạm vi nhiệt độ rộng từ 15 37ºC. Tùy theo từng loài mà nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng của chúng khác
nhau, ví dụ nhƣ Nocardia asteroid; Nocardia brasiliensis; Nocardia farcinica;
Nocardia caviae gây bệnh trên ngƣời sinh trƣởng tốt ở 37ºC [27, 28].
1.1.2.2. Cấu trúc
Cấu trúc tế bào của vi khuẩn Nocardia gồm: màng nhầy, thành tế bào,

màng nguyên sinh, tế bào chất, thể nhân, các thể ẩn nhập trong nguyên sinh chất.
Đặc biệt trong thành tế bào của Nocardia chứa acid mycolic với 3 liên kết đôi và
chuỗi mạch thẳng 40 – 60 carbon, meso-Acid diamino pimelic (meso-A2pm),
arabinogalactan - là hợp chất đƣợc tổng hợp từ arabinose và galactose (hình 1.3).

Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào của Nocardia
( />

6

Thành phần phospholipid đặc trƣng của vi khuẩn là phosphatidylethanolamine.
Nocardia chứa menaquinone, không chứa ubiquinone. Loại menaquinone chiếm ƣu
thế trong các loài Nocardia là MK-8(H2) (menaquinone chứa một trong số tám đơn
vị isoprene bị hydroxyl hóa) [1,12].
1.1.2.3. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Nocardia
Chi Nocardia thƣờng có khuẩn lạc khô, chắc, xù xì, nhăn nheo hoặc nhẵn
bóng, đa số có dạng vôi, dạng da hoặc dạng màng dẻo. Khuẩn lạc của Nocardia có
màu sắc rất đa dạng nhƣ đỏ, vàng, trắng … tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh.
Khuẩn lạc Nocardia có kích thƣớc không đều nhau, có thể thay đổi tùy từng
loài và điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, độ ẩm…). Đƣờng kính
mỗi khuẩn lạc khoảng 0,5 – 2 mm nhƣng cũng có khuẩn lạc đạt tới đƣờng kính 1
cm hoặc lớn hơn [1,12].

Hình 1.4. Khuẩn lạc N. asteroides (bên trái)
N. brasiliensis (bên phải) trên môi trƣờng thạch đƣờng Sabouraud
(A Concise Manual of Pathogenic Microbiology - Saroj K. Mishra, Dipti Agrawal)


7

Hình 1.5. Khuẩn lạc của Nocardia asteroides phân lập trên cùng một môi
trƣờng và nhiệt độ nhƣng đa dạng về kích thƣớc, màu sắc, hình dạng
( />
1.1.3. Đặc điểm hóa sinh của các loài vikhuẩn thuộc chi Nocardia
1.1.3.1. Nhuộm Acid-fast Ziehl-Neelsen
Vi khuẩn thuộc chi Nocardia có cấu tạo vách tế bào không bình thƣờng, và
có chứa phân tử acid mycolic. Chất nhuộm carbon fuchsin dƣới tác động của nhiệt
độ sẽ gắn hữu cơ với acid mycolic và không bị mất màu, sau khi tẩy màu rồi nhuộm
với xanh methylene trực khuẩn bắt màu hồng đỏ đặc trƣng cho vi khuẩn thuộc chi
Nocardia [29].
1.1.3.2. Nhuộm Gram
Nhuộm Gram là phản ứng dùng để phân biệt vi khuẩn Gram (+), hoặc Gram
(-). Các loài thuộc chi Nocardia đều là vi khuẩn Gram (+) nên khi quan sát dƣới
kính hiển vi chúng sẽ bắt màu tím của thuốc nhuộm.
1.1.3.3. Phản ứng catalase
Các loài thuộc chi Nocardia đều là vi sinh vật hiếu khí, có chứa chuỗi truyền
điện tử cytochrome, đều có enzyme catalase, có khả năng biến dƣỡng năng lƣợng
theo phƣơng thức hô hấp với oxy tạo ra H2O2.
Enzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân
tử có tính độc cao này trong tế bào. Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 đƣợc ghi
nhận qua hiện tƣợng sủi bọt khí .
Trên đây là một số phản ứng hóa sinh chung của vi khuẩn thuộc chi
Nocardia. Ngoài ra, tùy từng loài Nocardia mà còn có phản ứng thủy phân khác


8

nhau để phân loại và định danh chúng, ví dụ nhƣ: Các phản ứng Casein, L-tyrosine
và Xanthine thủy phân để phân biệt chủng Nocardia (Bảng1.1).
Bảng 1.1. Một số phản ứng thủy phân để phân biệt các loài Nocardia

Casein thủy
phân
N. asteroides, N. farcinica

L-tyrosine thủy Xanthine thủy
phân
phân

-

-

-

N. brasiliensis

+

+

-

N. otididis

-

+

-

N. caviae

-

-

+

+

+

+

N. nova

Streptomyces,
Nocardiopsis

( />
1.2. Tổng quan về cá chim vây vàng
1.2.1. Đặc diểm phân loại của cá chim vây vàng
Cá chim vây vàng là loài có giá trị dinh dƣỡng cao, giá trị kinh tế lớn và tiềm
năng thị trƣờng rộng rãi. Hiện nay, cá chim vây vàng là đối tƣợng nuôi quan trọng ở
vùng biển miền Nam Trung Quốc, đƣợc tiêu thụ mạnh ở Nhật Bản Đài Loan, Hồng
Kông, Trung Quốc, Mĩ, Singapore.
Theo phân loại học, cá chim vây vàng đƣợc xếp vào:
Ngành: Vertebrata
Lớp: Osteichthyes
Bộ: Perciformes

Họ: Carangidea
Giống: Trachinotus
Loài: Trachinotus blochii (Lacepède, 1801).
1.2.2. Đặc điểm hình thái của cá chim vây vàng
Hình dạng: Thân hình thoi cao gần nhƣ tròn, dẹp chính giữa, lƣng hình vòng
cung. Đầu to vừa, chiều cao đầu lớn hơn chiều dài. Môi tù về phía trƣớc, hai lỗ mũi


9

nằm gần nhau, lỗ mũi trƣớc hình tròn, lỗ mũi sau to hình bầu dục. Miệng nhỏ xiên,
xƣơng hàm trên lồi, hàm trên và hàm dƣới có răng nhỏ dạng lông nhung, răng phía
sau dần thoái hóa, rìa phía trƣớc xƣơng nắp mang hình cung tƣơng đối to, rìa sau
cong. Phía trƣớc đƣờng bên vảy có hình cung khá lớn, trên đƣờng bên vảy không có
gờ. Vây lƣng thứ 1 hƣớng về phía trƣớc, gai bằng và có 5 - 6 gai ngắn. Vây lƣng
thứ 2 có 1 gai và 19 - 20 tia vây, phần trƣớc của vây kéo dài hình lƣỡi liềm.Vây hậu
môn có 1 gai và 17 - 18 tia vây, phía trƣớc có hai gai ngắn. Vây hậu môn và vây
lƣng thứ 2 hình dạng giống nhau. Vây ngực tƣơng đối ngắn, rộng. Đuôi xẻ thùy,
vây đuôi hình lƣỡi liềm [9].

Hình 1.6. Hình ảnh cá chim vây vàng
( />&CommonName=&Page=11)

Kích thƣớc: Cá chim vây vàng có kích thƣớc tƣơng đối lớn, chiều dài có thể
đạt tới 45 – 60 cm, chiều dài gấp 1,6 - 1,7 lần chiều cao.
Màu sắc: Đầu thân và bụng có màu trắng bạc; đỉnh đầu, lƣng màu xanh xám.
Ở những con trƣởng thành thỉnh thoảng có màu vàng cam đặc biệt trên cơ thể nhất
là vùng miệng và nửa sau của thân. Vây lƣng màu ánh bạc. Vây hậu môn và vây
lƣng thứ 2 màu cam sẫm. Vây ngực tƣơng đối ngắn, rộng, màu tối đen. Vây đuôi
màu tro [3,10,11].

10

1.2.3. Đặc điểm phân bố của cá chim vây vàng
Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepède, 1801) là loài phân bố
tƣơng đối rộng; chúng phân bố tự nhiên trên 69 nƣớc, ở vùng biển nhiệt đới và á
nhiệt đới, ở rạn san hô dƣới độ sâu 7m [8].
Trên thế giới, cá chim vây vàng có ở các vùng biển Ấn Độ Dƣơng, từ bờ
Biển Đỏ, Nam Phi đến miền Nam Australia, Tây Thái Bình Dƣơng, Nhật Bản, Đài
Loan, Indonesia, miền Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, cá phân bố chủ yếu ở vịnh
Bắc Bộ, miền Trung và Nam [8].
1.2.4. Tình hình sản xuất giống và ƣơng nuôi cá chim vây vàng trên thế giới và
ở Việt Nam
Hiện nay cá chim vây vàng đã và đang đƣợc nuôi khá phổ biến ở nhiều nƣớc trên
thế giới bởi chúng có giá trị kinh tế cao dễ nuôi, việc sản xuất giống tƣơng đối đơn
giản.


Trên thế giới
Việc nghiên cứu cho sinh sản nhân tạo cá Chim trắng vây vàng lần đầu tiên trên

thế giới vào năm 1970 bởi Trung tâm sinh vật quốc tế (MTI) có trụ sở đóng tại Oak Hill,
Florida, USA. Năm 1989, Lâm Liệt Đƣờng đã cho sinh sản nhân tạo cá chim vây
vàng thành công và đã phát triển đƣợc đàn cá bố mẹ. Năm 1993, trung tâm chuyển
giao công nghệ thuộc Trƣờng Đại học Trung Sơn đã kết hợp với trại nghiên cứu
giống thủy sản Quảng Đông – Trung Quốc cho sinh sản nhân tạo thành công cá
chim vây vàng ở quy mô nhỏ, ƣơng nuôi cá bột trong các bể xi măng. Năm 1998,
trung tâm này đã kết hợp với Công ty trách nhiệm hữu hạn giống thủy sản Thắng
Lợi – Hải Nam – Trung Quốc sản xuất giống cá chim vây vàng nhân tạo thành công

trên quy mô lớn [3,9,10,11].


Việt Nam
Năm 2006, trại nuôi trồng thủy sản thực nghiệm của Trƣờng Cao Đẳng thủy

sản Bắc Ninh tại Yên Hƣng – Quảng Ninh đã nhập công nghệ sản xuất giống cá
chim vây vàng từ Trung Quốc. Việc di nhập đàn cá bố mẹ và cho đẻ tại Yên Hƣng
đã đạt đƣợc những thành công nhất định với: tỷ lệ cá đẻ trung bình giữa các đợt là


11

87,5%, tỷ lệ thụ tinh trung bình là 60%, tỷ lệ phôi nở trung bình là 80%, tỷ lệ sống
từ cá bột lên cá hƣơng trung bình đạt 30% và sản xuất đƣợc 65 nghìn con giống cỡ
4 - 6 cm [7].
Từ tháng 10/2009 đến 10/2011, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Lại Văn
Hùng ở Khoa Nuôi trồng thủy sản thuộc Trƣờng Đại học Nha Trang đã nghiên cứu
tuyển chọn, nuôi thành thục 129 con cá chim vây vàng bố mẹ cho sinh sản. Qua 12
đợt ƣơng thử nghiệm, đề tài đã tạo đƣợc 23,5 triệu trứng cá thụ tinh, ấp nở 12,6
triệu ấu trùng cá. Từ đó, đã ƣơng đƣợc hơn 400.000 cá giống dài 4 - 5cm, vƣợt gần
300% so với chỉ tiêu đặt ra. Phần lớn số cá giống này đƣợc thả nuôi trong bể xi
măng và gần 20.000 con đƣợc thả nuôi trong lồng bè.
Đầu năm 2011, trung tâm giống hải sản Nam Định đã nuôi thử nghiệm giống
cá chim vây vàng vào trong ao đất và cho hiệu quả cao.
Đầu năm 2012, nhóm nghiên cứu do PGS. TS. Lại Văn Hùng đứng đầu đã
tiếp tục triển khai phần 2 của đề tài nhằm hoàn thiện quy trình kỹ thuật sản xuất
giống cá chim vây vàng để chuyển giao cho ngƣời nuôi. Đến nay, giống cá chim
vây vàng đã đƣợc nhân rộng nuôi thƣơng phẩm cung ứng sản phẩm ra thị trƣờng
nhiều tỉnh thành nhƣ Khánh Hòa, Ninh Thuận, Phú Yên, Bình Thuận, Bạc Liêu, Cà

Mau, Nghệ An, Nam Định, Quảng Ninh,…
Từ giữa năm 2012, nhiều hộ nuôi ở các tỉnh ven biển ĐBSCL đã thực hiện
thí điểm mô hình nuôi cá chim vây vàng theo hình thức công nghiệp và bƣớc đầu
đƣợc đánh giá là một mô hình hay nên nhân rộng [7, 8].
Hiện nay, mô hình nuôi cá chim vây vàng đã đƣợc triển khai ở nhiều địa
phƣơng trong cả nƣớc, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nƣớc và có thể xuất khẩu.
Mặc dù đã có những nghiên cứu thành công về sinh sản nhân tạo cá chim vây
vàng cũng nhƣ việc phát triển nghề nuôi cá chim vây vàng tại Việt Nam. Nhƣng
những nghiên cứu mới chỉ tập trung vào sinh sản nhận tạo và kỹ thuật nuôi cá chim
vây vàng trong khi đó việc nghiên cứu về vấn đề thức ăn và dịch bệnh vẫn còn rất
hạn chế.


12

1.2.5. Các bệnh thƣờng gặp trên cá chim vây vàng
Các tác nhân gây bệnh thƣờng gặp trên động vật thủy sản có thể là virus, vi
khuẩn, ký sinh trùng… Ở cá chim vây vàng các nhà khoa học đã phát hiện ra loài
giáp xác ký sinh là Caligus spp trên cá chim vây vàng (Trachinotus blochii).
Năm 2010, Lee và cs đã có báo cáo về tác nhân vi khuẩn gây bệnh đƣợc
phân lập từ cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) và nghiên cứu khả năng chống
chịu với hàm lƣợng kim loại nặng trong môi trƣờng nƣớc của loài cá này. Nhiều
loại môi trƣờng vi sinh đã đƣợc dùng cho nghiên cứu này: 5% Horse Blood agar
(HAB), Tryptic Soy agar (TSA), Mac Conkey, Thiosulphate Citrate Bile Salt
(TCBS), Eosin Methylene Blue (EMB), Gutamate Starch Pseudomonas (GSP),
Xylose Lysine Deoxycholate (XLD). Các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc xác định
dựa trên các phản ứng sinh hóa thông thƣờng và sử dụng bộ kit để định danh vi
khuẩn. Đã có một số loài vi khuẩn đƣợc phân lập từ 50 mẫu cá chim vây vàng bị
bệnh, nhƣ Streptococcus spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Pseudomonas
spp., và Vibrio spp. [14].

Ở Việt Nam, năm 2010, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Thùy Giang,
Dƣơng Văn Quý Bình và Đỗ Thị Hòa đã bƣớc đầu nghiên cứu về bệnh đốm trắng
nội tạng cá chim vây vàng nuôi ở Vũng Ngán, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh
Hòa. Kết quả cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng đã bị cảm nhiễm hệ
thống trong các cơ quan nội tạng một dạng vi khuẩn hình que, Gram (+), dài từ 2 10 µm, phân nhánh và thƣờng gẫy thành các đoạn ngắn, kháng acid. Chủng vi
khuẩn này đƣợc đặt tên là NLB (Nocardia - like Bacteria) do có các đặc điểm hình
thái, sinh vật và hóa học tƣơng tự với vi khuẩn Nocardia [4].
1.3. Những nghiên cứu về chi Nocardia gây bệnh cá
1.3.1. Nocadiosis - bệnh đốm trắng nội tạng ở cá
Nocadiosis là bệnh nhiễm trùng hệ thống gây ra bởi loài vi khuẩn
Nocardia sp.. Dấu hiệu điển hình bao gồm: nốt sần, u hạt ở mang, hình thành các
vùng áp-xe ở biểu bì, đốm trắng ở lách, thận, gan, lở loét trên da [15].


13

Nocardiosis bắt đầu nhƣ một “căn bệnh thầm lặng” chúng phát triển trong
cơ thể cá con mà không bị phát hiện trong nhiều tháng, thời gian nhiễm trùng là một
hiện tƣợng lâu dài và mãn tính, vi khuẩn Nocardia nhân lên từ từ trong mô cá cho
tới khi có những biểu hiện dấu hiệu ra ngoài mà ta có thể quan sát đƣợc trƣớc khi cá
hôn mê và chết.
Tiếp xúc ban đầu của cá và vi khuẩn Nocardia là qua nguồn thức ăn có chứa
mầm bệnh vi khuẩn hoặc lây lan từ cá đã nhiễm bệnh. Cá cam sọc (Yellowtail
kingfish, yellowtail amberjack) ăn thức ăn tƣơi sống hoặc thức ăn viên không hợp
vệ sinh có khả năng nhiễm bệnh rất cao vì vậy nên sử dụng nguồn thức ăn an toàn
và hợp vệ sinh khi nuôi cá.
Thử nghiệm chỉ ra rằng các loài cá không bị bệnh khi đƣợc nuôi chung với
cá đã lây nhiễm Nocardia trong cùng một bể nuôi, sau 3 tháng cá không nhiễm bệnh
có biểu hiện đốm trắng ở lách dù chƣa biểu hiện dấu hiệu bên ngoài [30].
Trong nuôi trồng thủy sản cụ thể nuôi cá biển, nhiễm trùng Nocardia xuất

hiện và phát triển nhanh trong những tháng mùa hè khi nhiệt độ nƣớc đạt 24ºC trở
lên, nhƣng tỷ lệ tử vong do nhiễm vi khuẩn Nocardia thƣờng tăng vào mùa thu và
đầu mùa đông. Điều này có thể do sau một thời gian vi khẩn xâm nhập vào tế bào
chủ, chúng âm thầm nhân lên và làm hệ thống miễn dịch vật chủ bị suy yếu [30].
Kudo và cs (1988) cho rằng bệnh do vi khuẩn Nocardia gây ra là một trong
những bệnh quan trọng nhất đã ảnh hƣởng đến nghề nuôi cá đuôi vàng (Seriola
quinqueradiata) ở Nhật Bản. Tác nhân gây bệnh này là loài vi khuẩn Nocardia
seriolae, là một trực khuẩn Gram (+), kháng acid và không di động [16].
Nhóm nghiên cứu của Labrie và cs (2008), đã nhận xét rằng cá vây vàng là
loài mẫn cảm với bệnh do vi khuẩn Nocardia gây ra. Vi khuẩn này đƣợc phân lập từ
não, mang, gan, lách và thận của cá vây vàng bị bệnh từ nhiều quốc gia khác nhau:
10 mẫu cá ở Malaysia, 14 mẫu cá ở Trung Quốc và Singapore. Bệnh do Nocardia ở
cá vây vàng và một số loài cá khác đã đƣợc mô tả với dấu hiệu chính nhƣ sau: một
số nốt thƣơng tổn xuất hiện ở da, mang; một số nội tạng nhƣ gan lách và thận xuất
hiện nhiều hạt trắng làm bụng cá trƣớng to (hình 1.8) [15].


14

Hình 1.7. Cá hồng đỏ (Lutianus erythopterus) bị bệnh nhiễm trùng hệ thống do vi
Nocardia
spp. quốc gia thuộc khu vực Châu
Theo nhóm tác giả này,khuẩn
cá CVV
nuôi ở nhiều
a. Các
hạtMalaysia,
trắng tồnSingapore
tại lách cávà
bị Indonesia

nhiễm bệnh
dorất
vi mẫn
khuẩn
Nocardia;
Á nhƣ Trung
Quốc,
đều
cảm
với bệnh
b. Phồng rộp và xuất huyết ở đuôi cá bị nhiễm Nocardia. (Labrie, 2008)
Theo kết quả nghiên cứu Sheppard và cs (2010), bệnh do tác nhân là vi
khuẩn Nocardia gây ra trên cá thƣờng có dấu hiệu bệnh nhƣ: xuất hiện các nốt
phồng rộp lở loét trên thân, và các u xƣơng dọc theo xƣơng sống. Một số cá xuất
hiện các đốm trắng nhỏ trong nội tạng nhƣ: gan, thận, lách và đƣờng kính của hạt
trắng dao động trong khoảng 1 - 2 mm. Các hạt trắng này đôi khi còn bắt gặp trên
màng treo ruột và bóng hơi [17].

Hình 1.8. Mang bết dính, hạt trắng xuất hiện ở mang và lách của một loài cá
đuôi vàng (Seriola) (Sheppard 2010)
Tuy nhiên, việc kiểm soát bệnh do vi khuẩn Nocardia ở cá nuôi vẫn có khả
năng thực hiện đƣợc nếu có một loại vaccine hiệu quả để chống lại vi khuẩn gây
bệnh này. Kusuda và Nakagawa (1978) đã thử ngiệm một loại vaccine chống lại sự
lây nhiễm của Nocardia seriolae. Các tác giả này đã xem xét mức độ hình thành
kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh của cá đã đƣợc tiêm ngừa với các tế bào vi


15

khuẩn Nocardia seriolae đƣợc bất hoạt bởi formalin hoặc đƣợc bất hoạt bởi nhiệt.

Kết quả cho thấy mức độ gây ngƣng kết của huyết thanh ở cá đƣợc chủng ngừa tăng
hơn 1000 lần so với cá không chủng ngừa [23].
Mới đây, Salonius và cs (2005) đã xem xét tính hiệu quả của nhiều dòng
Nocardia khác nhau nhƣ là vaccine sống để chống lại bệnh do vi khuẩn Nocardia
gây ra ở cá đuôi vàng. Thêm vào đó, tác giả cũng tìm hiểu khả năng sống sót của cá
đƣợc tiêm vaccine sống sau đó bị cảm nhiễm bởi vi khuẩn Nocardia seriolae [24].
Năm 2006, Itano và cs đã nghiên cứu hiệu quả của vaccine sống từ các chủng
vi khuẩn Nocardia soli, Nocardia fluminea, Nocardia uniformis khi tiêm vào cá
đuôi vàng (Seriola quinqueradiata) để chống lại bệnh do Nocardia seriolae gây ra ở
cá đuôi vàng. Kết quả cho thấy loại vaccine này có hiệu quả sinh ra kháng thể
chống lại bệnh do vi khuẩn Nocardia seriolae gây ra [21].
3.2 Những nghiên cứu về định danh loài vi khuẩn thuộc chi Nocardia trên cá
3.2.1 Các loài cá nƣớc ngọt và nƣớc mặn ở Châu Á
Nocardia sp. gây bệnh trên cá đƣợc mô tả đầu tiên bởi Rucker (1949)
giống nhƣ Streptomyces salmonicida lây nhiễm ở loài cá hồi (Oncorhynchus nerka).
Sau đó vi khuẩn này đƣợc xếp vào chi Nocardia dựa trên sự có mặt của acid mesodiaminopimelic (meso-DAP), arabinose và galactose trong thành tế bào vi khuẩn và
phân tích tự gene 16S rDNA. Sau đó, bốn loài thuộc chi Nocardia là: Nocardia
asteroides, Nocardia seriolae (trƣớc đây gọi là Nocardia kampachi), Nocardia
salmonicidaand, và Nocardia crassostreae đã đƣợc phân lập từ động vật thủy sản.
Cho đến nay Nocardia seriolae thƣờng xuyên phân lập đƣợc và gây bệnh trên cá
đuôi vàng (Seriolae quinqueridiata) và cá cam (Seriola dumerili) từ 300 đến 1000 g
gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi trồng thủy sản ở Nhật Bản. Ngoài ra còn gây bệnh
trên cá vƣợc Nhật Bản (Lateolabrax japonicus) và cá đù vàng (Larimichthyscrocea)
tại Đài Loan và Trung Quốc gây tử vong hơn 15% mỗi loài [15].
Từ năm 2002 đến năm 2006 nhóm nghiên cứu bao gồm L. Labrie và cs đã
điều tra nguyên nhân tử vong của nhiều loài cá ở Châu Á và đã phân lập đƣợc
chủng vi khuẩn trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ: Ogawa, TSA, thạch máu… ở


16

điều kiện 260C. Sau đó, DNA đƣợc tách chiết bằng bộ kit: QIAamp DNA mini và
đƣợc dùng làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (N5F1
và N5R1), chu trình nhiệt sau:
95ºC

2 phút

95ºC

30 giây

58ºC

1 phút

720C

1 phút

720C

5 phút

Lặp lại 30 chu kỳ

Sản phẩm khuếch đại đƣợc phân tích trên gel agarose 1,2% (w/v) trong
đệm TBE dự kiến có kích thƣớc 1069 bp. Đồng thời, với các tiêu bản phết kính từ
các mẫu bệnh phẩm ở mang và nhiều nội tạng khác nhau nhƣ: gan, lách, thận của cá
bệnh, một loài vi khuẩn dài, phân nhánh, gram dƣơng, kháng acid đã đƣợc phát hiện

[15].

Hình 1.9. a.Vi khuẩn N.seriolae bắt màu Gram (+) dạng sợi, phân nhánh khi
nhuộm Gram;
b.Vi khuẩn N.seriolae bắt màu hồng khi nhuộm Ziehl-Neelsen (1000X)
(Labrie, 2008)

Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống kết hợp với thực hiện các phản
ứng sinh hóa, và phƣơng pháp sinh học phân tử hiện đại các tác giả đã xác định
đƣợc tác nhân gây ra loại bệnh này ở nhiều loài cá nhƣ cá vây vàng ( Trachinotus


17

blochii), cá hồng đỏ (Lutjanus erythopterus), cá mú là 2 loài vi khuẩn Nocardia
seriolae và Nocardia asteriodes [15].
a. Cá Larimichthy crocea

Hình 1.10. Loài cá Larimichthy crocea với các
dấu hiệu bệnh do vi khuẩn Nocadia gây ra ở
gan, lách, thận (Wang, 2005)
Năm 2003, Wang và cs đã nghiên cứu bệnh do loài vi khuẩn Nocardia sp.
gây ra ở Larimichthy crocea tại Trung Quốc, các tác giả đã bắt gặp hiện tƣợng chết
ở loài cá này (Larimichthy crocea), cá bệnh có kích thƣớc 25 – 30 cm. Các dấu hiệu
bệnh lý trên cá đã đƣợc mô tả là tƣơng tự nhƣ dấu hiệu của bệnh do vi khuẩn
Nocardia ở cá vây vàng, đó là xuất hiện các vết lở loét trên da và có các hạt trắng
trong nội tạng cá. Các hạt trắng có kích thƣớc từ 0,1 – 0,2 cm nằm ở các cơ quan
nhƣ thận, lách và gan. Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA và quan sát trên tiêu
bản lame nhuộm Lowenstein – Jensen trên kính hiển vi quang học thấy vi khuẩn ở
dạng sợi mảnh và phân nhánh. Khi tiến hành cảm nhiễm với chủng vi khuẩn đã

phân lập đƣợc, các tác giả nhận thấy tỷ lệ chết tích lũy là 100%, sau đó khi phân lập
lại các tác giả đã xác định đó chính là tác nhân gây bệnh ở loài cá này. Khi tiến
hành giải trình tự DNA và thực hiện các phản ứng sinh hóa thông thƣờng, nhóm
nghiên cứu đã tìm thấy vi khuẩn gây bệnh có trình tự DNA giống vi khuẩn
Nocardia seriolae đến 99,9%. Và đây cũng là báo cáo đầu tiên nghiên cứu định
danh loài vi khuẩn nocardia sp. trên Larimichthys crocea [19, 20].


18

b. Cá lóc (Ophiocephalusargus Cantor)

Hình 1.11. Cá lóc (Ophiocephalusargus cantor) bị
nhiễm vi khuẩn Nocardia (Wang, 2007)
Theo Wang và cs (2007), một loại bệnh đã xảy ra ở cá lóc
(Ophiocephalusargus cantor) nuôi trong ao tại Trung Quốc. Tác nhân gây bệnh
đƣợc xác định là do vi khuẩn Nocardia sp. gây ra. Bênh này đã gây ra tỷ lệ chết
tích lũy trong 30 ngày là 35% (180.000 trong tổng số 500.000 con) ở đàn cá đã có
kích cỡ lớn (30 - 35cm) và đã nuôi đƣợc 18 tháng. Nhiều u hạt trắng có đƣờng kính
từ 0,1 – 0,5 cm đã đƣợc tìm thấy trong nội quan cá bệnh nhƣ: thận, lách và gan. Bệnh
phẩm đã đƣợc phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng Ogawa (môi trƣờng trứng gà) và
môi trƣờng TSA ở nhiệt độ 260C sau 5 - 7 ngày khuẩn lạc của loại vi khuẩn này dạng
sợi, nhỏ dài, phân nhánh, Gram (+) đã đƣợc phát hiện. Khi dùng chủng vi khuẩn này
cảm nhiễm ngƣợc lại trên cá lóc khỏe kết quả sau một tuần cá chết. Bằng kỹ thuật
PCR, giải trình tự, các tác giả đã công bố rằng chủng vi khuẩn gây bệnh ở đàn cá lóc
này có cấu trúc gen tƣơng tự 99,9% nhƣ loài vi khuẩn Nocardia seriolae [20].
1.4. Các phƣơng pháp định danh vi khuẩn
1.4.1. Tổng quan về các phƣơng pháp định danh vi khuẩn
1.4.1.1. Định nghĩa