Nghiên cứu thành phần loài ký sinh trùng trên cá nước ngọt dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI
TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG
TRÊN CÁ NƯỚC NGỌT DỰA TRÊN
ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Vũ Đặng Hạ Quyên
TS. Đặng Thúy Bình
Sinh viên thực hiện

: Đặng Nguyễn Anh

Tuấn Mã số sinh viên : 53131923

Khánh Hòa: 2015


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI
TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---------------o0o---------------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG
TRÊN CÁ NƯỚC NGỌT DỰA TRÊN
ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Vũ Đặng Hạ Quyên
TS. Đặng Thúy Bình
Sinh viên thực hiện

: Đặng Nguyễn Anh

Tuấn Mã số sinh viên : 53131923

Khánh Hòa, tháng 06/2015


MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Mục đích của đề tài nghiên cứu nhằm cung cấp thông tin về tình hình nhiễm ký sinh
trùng trên các loài cá nước ngọt, gồm cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc đồng
(Channa striata), cá mè vinh (Barbonymus gonionotus), cá rô đồng (Anabas testudineus)
Các nội dung của đề tài bao gồm:
 Thực hiện khảo sát thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá nước ngọt.
 Xác định tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm.
 Định danh các loài ký sinh trùng khảo sát được trên cá nước ngọt dựa vào các đặc
điểm hình thái và kỹ thuật di truyền.
 Xây dựng cây phát sinh loài.


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, trước tiên tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn tới Ban
giám hiệu và Phòng Đào tạo - Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được
học tập và nghiên cứu trong suốt 4 năm đại học.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Đặng Thúy Bình và Th.S Vũ
Đặng Hạ Quyên đã có những tư vấn, chỉ bảo hữu ích trong suốt quá trình nghiên cứu và
thực hiện đồ án tốt nghiệp.
Ngoài ra, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Môi
trường, các thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã giảng dạy, chỉ dẫn trong quá trình học
tập và thực hiện đồ án tốt nghiệp.
Cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, các anh chị 56CHSH, tập thể 53CNSH đã
hỗ trợ và động viên tôi khi thực hiện đồ án.
Trong khoảng thời gian hạn hẹp, bài báo cáo tốt nghiệp của tôi không thể tránh
khỏi thiếu sót, rất mong các thầy cô giáo góp ý giúp luận văn được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, lời chúc sức khỏe, hạnh phúc và
thành công đến tất cả mọi người!
Nha Trang, ngày 20 tháng 06 năm 2015
Sinh Viên
Đặng Nguyễn Anh Tuấn


ii

TÓM TẮT
Nghiên cứu thực hiện phân loại các loài ký sinh trùng trên cá nước ngọt cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc đồng (Channa striata), cá mè vinh (Barbonymus
gonionotus), cá rô đồng (Anabas testudineus).
Kết quả 13 loài ký sinh trùng được ghi nhận, trong đó có 7 loài ký sinh trùng được
phân

loại

đến

mức

campylopterocirrus,

độ

loài

(Bothriocephalus

Thaparocleidus

vietnamensis,

acheilognathi,

Thaparocleidus

Thaparocleidus

siamensis,

Prosorhynchoides ozakii, Cucullanus chabaudi, Trianchoratus gussevi). Tỉ lệ nhiễm cao
nhất là loài Pallisentic sp. (81,67%) trên cá lóc đồng, cường độ nhiễm cao nhất là loài
Thaparocleidus campylopterocirrus (7 trùng/cá) trên cá mè vinh. Loài Ichthyophthyrius
sp. có cùng tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm thấp nhất (2,9%, 1 trùng/cá) trên cá rô đồng.
Nghiên cứu tập trung xây dựng cây phát sinh loài cho 3 loài monogenea (Thaparocleidus
siamensis, T. campylopterocirrus và Trianchoratus gussevi) và 3 loài digenea
(Bucephalus sp., Prosorhynchoides ozakii và Allocreadium sp.) nhằm khảo sát mối quan
hệ phát sinh loài với các loài ký sinh trùng khác được ghi nhận trên cá nước ngọt.

iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... i
TÓM TẮT............................................................................................................................ ii
MỤC LỤC .......................................................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................... v
DANH SÁCH BẢNG BIỂU .............................................................................................. vi
DANH SÁCH HÌNH VẼ................................................................................................... vii
I - TỔNG QUAN ................................................................................................................. 1
1.1. Đặc điểm sinh học của các loài cá khảo sát trong đề tài ............................................ 2
1.1.1. Cá rô đồng (Anabas testudineus) ........................................................................ 2
1.1.2. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ............................................................. 4
1.1.3. Cá lóc đồng (Channa striata) .............................................................................. 5
1.1.4. Cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) ................................................................ 6
1.2. Tình hình nghiên cứu ký sinh trùng trên các loài cá nước ngọt ................................ 7
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................................ 7
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................................ 8
1.3. Đặc điểm hệ gen ribosome DNA ............................................................................ 10
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 12
2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 12
2.2. Sơ đồ khối nghiên cứu ............................................................................................. 13
2.3. Phương pháp thu mẫu .............................................................................................. 13
2.4. Phuơng pháp giải phẫu và kiểm tra ký sinh trùng .................................................... 14
2.5. Phương pháp bảo quản, cố định và nhuộm tiêu bản ................................................ 16
2.6. Phương pháp phân loại hình thái ký sinh trùng ....................................................... 17
2.7. Phương pháp nghiên cứu di truyền .......................................................................... 19
2.7.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ............................................................... 19

2.7.2. Phản ứng PCR ................................................................................................... 19
2.7.3. Phương pháp điện di.......................................................................................... 22
2.7.4. Phương pháp giải trình tự ................................................................................. 22
2.8. Xử lý số liệu ............................................................................................................. 23


iv

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................................................... 24
3.1. Thành phần ký sinh trùng, tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm ..................................... 24
3.2. Mô tả đặc điểm hình thái các loài ký sinh trùng trong nghiên cứu .......................... 26
3.2.1. Ngành Protozoa ................................................................................................. 26
3.2.1.1. Trichodina sp. .............................................................................................. 26
3.2.1.2. Ichthyophthyrius sp. .................................................................................... 27
3.2.2. Lớp Monogenea ................................................................................................. 29
3.2.2.1. Thaparocleidus siamensis ........................................................................... 29
3.2.2.2. Thaparocleidus campylopterocirrus ........................................................... 30
3.2.2.3. Thaparocleidus vietnamensis ...................................................................... 31
3.2.2.4. Trianchoratus gussevi ................................................................................. 32
3.2.3. Lớp Trematoda .................................................................................................. 33
3.2.3.1. Prosorhynchoides ozakii ............................................................................. 33
3.2.3.2. Allocreadium sp........................................................................................... 34
3.2.3.3. Bucephalus sp. ............................................................................................. 36
3.2.4. Lớp Cestoda - Nematoda – Acanthocephala ..................................................... 37
3.2.4.1. Camallanus sp. ............................................................................................ 37
3.2.4.2. Pallisentic sp. .............................................................................................. 38
3.2.4.3. Bothriocephalus acheilognathi ................................................................... 40
3.2.4.4. Cucullanus chabaudi .................................................................................. 41
3.3. Nghiên cứu di truyền các loài ký sinh trùng trên cá nước ngọt ............................... 43
3.3.1. Khuếch đại đoạn gen 28S rDNA ........................................................................ 43

3.3.2. Xây dựng cây phát sinh loài của các loài monogenea và digenea .................... 43
3.3.2.1. Cây phát sinh loài đối với các loài monogenea dựa vào trình tự gen 28S
rDNA ........................................................................................................................ 43
3.3.2.2. Cây phát sinh loài đối với các loài digenea dựa vào trình tự gen 28S rDNA
.................................................................................................................................. 47
KẾT QUẢ VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .................................................................................. 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 53
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 61


v

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu viết tắt

Ý nghĩa

WHO

Tổ chức Y Tế Thế Giới

Bộ NN&PTNT

Bộ Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn

QĐ

Quyết định

bp

Base pairs

µl

Microlit

µm

Micromet

mm

Milimet

cm

Centimet

g

Gram/Gam

rDNA

Recombinant Deoxyribonucleic Acid

ctv

Cộng tác viên

TLN

Tỉ lệ nhiễm

CĐN

Cường độ nhiễm

PCR

Polymerase Chain Reaction

n

Số lượng mẫu kiểm tra

Scale bar

Thanh chia tỉ lệ

GB

Gen Bank

BT

Boostrap

vi

DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Số lượng và kích thước các loài cá trong nghiên cứu ....................................... 14
Bảng 2.2. Ý nghĩa các ký hiệu trong Hình 2.2. ................................................................. 18
Bảng 2.3. Tỉ lệ các thành phần trong Master mix của phản ứng PCR .............................. 20
Bảng 2.4. Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR của nghiên cứu ..... 21
Bảng 3.1. Thành phần ký sinh trùng trên các loài cá ........................................................ 24
Bảng 3.2. So sánh giữa Trichodina nigra và Trichodina sp. ............................................ 27
Bảng 3.3. So sánh giữa Ichthyophthyrius multifillis và Ichthyophthyrius sp. .................. 28
Bảng 3.4. So sánh giữa nghiên cứu Hà Ký và ctv (2007) với nghiên cứu hiện tại ........... 35
Bảng 3.5. So sánh giữa Camallanus anabantis và Camallanus sp. .................................. 38
Bảng 3.6. So sánh giữa Pallisentis ophiocephali, Pallisentis basiri và Pallisentis sp..... 39
Bảng 3.7. So sánh giữa nghiên cứu Choudhury và ctv (2013) với nghiên cứu hiện tại .... 41
Bảng 3.8. Thông tin các trình tự monogenea sử dụng trong nghiên cứu .......................... 44
Bảng 3.9. Trình tự tương đồng của các loài monogenea ................................................... 45
Bảng 3.10. Thông tin các trình tự digenea sử dụng trong nghiên cứu .............................. 47
Bảng 3.11. Trình tự tương đồng của các loài digenea ....................................................... 49


vii

DANH SÁCH HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cá rô đồng (Anabas testudineus)......................................................................... 2
Hình 1.2. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ............................................................. 4
Hình 1.3. Cá lóc đồng (Channa striata) ............................................................................... 5
Hình 1.4. Cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) ................................................................ 6
Hình 1.5. Vùng rDNA (5.8S, 18S và 28S) ........................................................................ 11
Hình 2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu ....................................................................................... 13
Hình 2.2. Các chỉ tiêu đo kích thước của bộ phận bám, cơ quan giao cấu của lớp sán lá

đơn chủ Monogenea .......................................................................................................... 18
Hình 2.3. Các chỉ tiêu đo kích thước của lớp sán lá song chủ Trematoda ........................ 19
Hình 2.4. Chu trình nhiệt dành cho phản ứng PCR sử dụng mồi 28S rDNA (LSU-5,
1500R) ............................................................................................................................... 21
Hình 2.5. Chu trình nhiệt dành cho phản ứng PCR sử dụng mồi 28S rDNA (C1, D2) .... 21
Hình 3.1. Trichodina sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. ............................................................... 26
Hình 3.2. Ichthyophthyrius sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. ...................................................... 28
Hình 3.3. Thaparocleidus siamensis ................................................................................. 30
Hình 3.4. Thaparocleidus campylopterocirrus – Tiêu bản và mẫu vẽ .............................. 31
Hình 3.5. Thaparocleidus vietnamensis............................................................................. 32
Hình 3.6. Trianchoratus gussevi – Tiêu bản và mẫu vẽ .................................................... 33
Hình 3.7. Prosorhynchoides ozakii – Tiêu bản và mẫu vẽ. ............................................... 34
Hình 3.8. Allocreadium sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. ........................................................... 35
Hình 3.9. Bucephalus sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. .............................................................. 36
Hình 3.10. Camallanus sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ............................................................. 37
Hình 3.11. Pallisentic sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. .............................................................. 39
Hình 3.12. Bothriocephalus acheilognathi – Tiêu bản và mẫu vẽ. ................................... 40
Hình 3.13. Cucullanus chabaudi. ....................................................................................... 42
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 28S rDNA. ..................................... 43
Hình 3.15. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rDNA của các loài monogenea
. .......................................................................................................................................... 46
Hình 3.16. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rDNA của các loài digenea. ...... 50


1

I - TỔNG QUAN
Việt Nam có vị trí địa lý thuận lợi, kiểu khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm với lượng mưa
trung bình hằng năm từ 1500 đến 2000 mm. Đồng thời nước ta có lợi thế về diện tích mặt
nước với 653 nghìn hecta sông ngòi, 394 nghìn hecta hồ chứa, 85 nghìn hecta đầm phá

ven biển và 580 nghìn hecta ruộng lúa nước. Các điều kiện tự nhiên thuận lợi tạo cho Việt
Nam có một hệ sinh vật đa dạng có giá trị khai thác cao (Phạm Đình Văn, 2010).
Công nghiệp chế biến thủy sản đã và đang là một trong các mũi nhọn kinh tế, đem về
cho quốc gia nguồn lợi lớn. Năm 2001, ngành chế biến nông, thủy sản và thực phẩm giữ
vị trí hàng đầu, chiếm khoảng 23%, năm 2010 chiếm khoảng 20% gái trị sản xuất công
nghiệp và vị thế này không có sự thay đổi lớn trong 10 năm. Chính phủ định hướng đầu
tư phát triển đưa Việt Nam trở thành quốc gia cung cấp tin cậy và các sản phẩm nông,
thủy sản và thực phẩm an toàn với chất lượng cao (QĐ, 2014). Đồng thời với việc đánh
bắt từ tự nhiên, việc phát triển ngành nuôi trồng thủy sản là một nhu cầu bức thiết nhằm
đảm bảo nguồn nguyên liệu đầu vào ổn định – an toàn cho công nghiệp chế biến. Vấn đề
quan trọng nhất và mang tính quyết định tới sự phát triển của ngành công nghiệp chế biến
là việc nâng cao tính an toàn vệ sinh thực phẩm (QĐ, 2014).
Tuy nhiên, sự phát triển mạnh của ngành nuôi trồng thủy sản hiện nay có nguy cơ làm
tăng các vật chủ trung gian như ốc và cá, dẫn đến nguồn nước bị ô nhiễm, kết quả là tăng
các loài ký sinh trùng. (WHO, 2004) Các loài ký sinh trùng làm giảm giá trị thương phẩm
và quan trọng hơn là ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.
Tại nước ta đã xác định bệnh ung thư đường mật do Clonorchis sinensis chủ yếu ở
miền Bắc với ít nhất 15 tỉnh, tỷ lệ nhiễm trung bình 19%. Trong đó, tỉnh có tỉ lệ nhiễm
cao là Ninh Bình, Nam Định có một số điểm có tỉ lệ nhiễm lên tới 35% - 37%. Bệnh có
liên quan đến tập quán ăn gỏi cá, tại Nam Định tỉ lệ người dân ăn gỏi cá tại một số địa
phương đến 80,4%, Ninh Bình 70%, Thanh Hoá 67,9% (Nguyen, 2004).
Nghiên cứu trên đối tượng sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini, các số liệu điều tra
trong toàn quốc cho thấy sán lá gan nhỏ có tỉ lệ nhiễm 32,7% tại Kỳ Sơn, Hòa Bình,
27,7% tại Ba Vì, Hà Nội, 17,7% tại Nga Sơn, Thanh Hóa, 34,85%-50,55% tại Nam Định,
9,36% tại Gia Viễn, Ninh Bình, 11,1% tại Yên Bình, Yên Bái và tại Tuy Hòa, Phú Yên là
0,4% (Nguyễn Văn Đề và ctv, 2008; Nguyen, 2004). Việc nghiên cứu thành phần loài ký


2

sinh trùng là một nhu cầu cấp bách để góp phần đảm bảo sản lượng – chất lượng nguyên
liệu đầu vào và sức khỏe người tiêu dùng.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, được sự cho phép của Viện Công nghệ Sinh học và
Môi trường – Trường Đại Học Nha Trang. Tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần
loài ký sinh trùng trên cá nước ngọt dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền”.
1.1. Đặc điểm sinh học của các loài cá khảo sát trong đề tài
1.1.1. Cá rô đồng (Anabas testudineus)
Bộ Perciformes
Họ Anabantidae
Giống Anabas
Loài Anabas testudineus Bloch, 1792

Hình 1.1. Cá rô đồng (Anabas testudineus)
(Nguồn: )
Đặc điểm phân bố
Cá rô đồng là loài cá nước ngọt, phân bố khá rộng từ Nam Trung Quốc, Việt Nam,
Lào, Campuchia đến Thái Lan, Mianma, Ấn Độ, Philippin và các quần đảo giữa Ấn Độ
và châu Úc. Ở Việt Nam, cá rô đồng hiện diện khắp các địa phương, với các loại hình mặt
nước như ao, hồ, kênh mương, ruộng lúa, đầm lầy, ruộng trũng, “đặc biệt ở những nơi có
dòng nước chảy chậm” (Taki, 1978). Cá được tìm thấy ở những nơi có thảm thực vật dày
(Rainboth, 1996). Nhiệt độ thích hợp cho cá phát triển tốt nhất từ 26-30oC, pH khoảng
6,5-7 và có khả năng sống trong nước phèn (pH≤4). (Bộ NN & PTNT, 2009)
Đặc điểm hình thái
Cá rô đồng có thân thon dài hình bầu dục, phía sau dẹp ngang, đầu rộng, mõm ngắn và
hơi tròn. Thân cá màu xanh nâu pha hơi vàng nhạt. Mắt to, đỉnh đầu, mặt bên và toàn thân
đều phủ vẩy lược, rìa và nắp mang có răng cưa. Gai vây rất cứng và chắc. Gốc vây lưng


3

rất dài, phần gai bằng bốn lần phần tia mềm. Gốc vây đuôi có đốm đên tròn. Vây lưng,
vây đuôi và hậu môn màu xanh đen, các vây khác màu nâu nhạt. (Bộ NN & PTNT, 2009)
Cá rô có cơ quan hô hấp phụ nằm rên cung mang thứ nhất (gọi là mê lộ hay hoa khế).
Cơ quan hô hấp phụ giúp cho cá sống được trong môi trường nước thiếu oxy. Rô đồng có
khả năng sống rất lâu trong điều kiện thiếu nước và chúng có thể di chuyển trên cạn rất xa
bằng các vây cứng. (Bộ NN & PTNT, 2009) “Khi bị tách ra khỏi nước có thể tồn tại được
vài ngày đến vài tuần nếu như cơ quan hô hấp phụ giữ được hơi ẩm. Có khả năng tồn tại
qua mùa khô bằng cách tự chôn mình trong bùn”. (Rahman, 1989)
Dinh dưỡng - Sinh sản
Cá rô là loài ăn tạp, có tính ăn thiên về động vật. Miệng có nhiều răng, có thể nghiền
những thức ăn là hạt có vỏ cứng. Cá rô thích ăn các loài động vật không xương sống trong
nước hoặc bay trong không khí, sâu bọ, mùn bã hữu cơ, động vật chết và cả các loại rong,
cỏ, hạt. (Bộ NN & PTNT, 2009)
Cá rô đồng có kích thước nhỏ (nặng 50-100g, dài 10-15 cm), tốc độ tăng trưởng chậm
hơn so với nhiều loài cá khác. Tuy vậy, cá dễ thành thục; tại Đồng bằng sông Cửu Long
cá có thể thành thục lần đầu khi đạt trọng lượng thân trung bình 50-60g trở lên. Mùa vụ
sinh sản trong tự nhiên tập trung nhiều nhất là các tháng 6-7. Cá rô đồng có sức sinh sản
khá cao, có thể đạt 1.000.000 trứng/kg cá cái. Trứng cá rô đồng là trứng nổi nên dễ trở
thành cá bột trong điều kiện tự nhiên. (Bộ NN & PTNT, 2009)


4

1.1.2. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
Bộ Siluriformes
Họ Pangasiidae Bleeker, 1858
Giống Pangasianodon
Loài Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878

Hình 1.2. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Đặc điểm phân bố
Cá tra có vùng phân bố tự nhiên ở lưu vực sông MeKong (Thái Lan, Lào, Campuchia
và Việt Nam), có trường hợp được tìm thấy ở Trung Quốc (Poulsen và ctv, 2005). Tại
Việt Nam, cá tra tự nhiên xuất hiện tại vùng hạ lưu sông MeKong. Cá tra phân bố chủ yếu
ở các sông, các phụ lưu, đầm ao của sông Tiền, sông Hậu; ngoài ra còn phân bố ở các
sông Đồng Nai, Vàm Cỏ, La Ngà (Bình Thuận), các hồ ở Đăk Nông, Đăk Lăk, Pleiku, hệ
thống sông Hồng và các sông ở miền Trung Việt Nam. (Nguyễn Chung, 2000) Cá tra
sống chủ yếu ở nước ngọt, hoặc nước lợ 7 ÷ 10% muối. Cá có thể chịu được nước phèn có
pH>5, ngưỡng chịu nhiệt từ 15 – 39oC. (Phạm Văn Khánh, 2000)
Đặc điểm hình thái
Cá tra là loài cá da trơn, có thân dài gấp 4 lần chiều rộng. Lưng cá có màu xám đen,
bụng hơi bạc. Miệng cá rộng, có 2 đôi râu, vây lưng ngắn, gai vây ngực cứng có chứa
răng cưa ở mặt sau. (Phạm Văn Khánh, 2000)
Cá tra có cơ quan hô hấp phụ, cá có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên có thể chịu
đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan. Cá tra có thể sống trên 20 năm trong tự
nhiên. Trong điều kiện nuôi ao, cá bố mẹ có thể đạt tới 25kg đối với cá 10 năm tuổi.
(Nguyễn Văn Thường, 2008)


5

Dinh dưỡng – Sinh sản
Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh. Từ khoảng 2.5 kg trở lên, mức tăng
trọng lượng nhanh hơn nhiều so với sự tăng chiều dài cơ thể cá. Tuổi thành thục của cá
đực là 2 tuổi, cá cái là 3 tuổi, trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2.5 – 3 kg. Cá không
có cấu tạo cơ quan sinh dục phụ nên khó phân biệt đực/cái dựa vào cảm quan bên ngoài.
(Nguyễn Văn Thường, 2008)
1.1.3. Cá lóc đồng (Channa striata)
Bộ Perciformes
Họ Channidae

Giống Channa
Loài Channa striata Bloch, 1793

Hình 1.3. Cá lóc đồng (Channa striata)
(Nguồn: )
Đặc điểm phân bố
Cá lóc - thuộc giống Channa - là một nhóm quan trọng nhất của cá nước ngọt làm thực
phẩm ở khu vực nhiệt đới châu Á (Benziger và ctv, 2011). Cá có nguồn gốc ở Ấn Độ và
cũng được tìm thấy ở Myanmar, Bangladesh, Lào, Việt Nam, Campuchia, Malaysia và
một phần của Indonesia. Cá lóc phân bố trải dài từ Madagaskar tới Phillipines (Gam và
ctv, 2005; Hossain, 2008; Mohsin và ctv, 1983) và được xem là một trong những nguyên
liệu thực phẩm phổ biến ở Thailand, Campuchia, Việt Nam và các nước khác ở Đông
Nam Á (Sinh và Pomeroy, 2010). Channa Striata là loài ăn thịt và là loài cá nước ngọt cá
săn mồi (Pudjirahaju, 1992).
Đặc điểm hình thái
Cá lóc có 42-45 tia vây lưng mềm, 25-29 tia vây hậu môn mềm, vẩy đường bên 55-65,
miệng rộng, hàm thấp, hàm dưới có 4-7 răng nanh. Vây lưng và vây hậu môn có màu tối
hơn màu cơ thể (Vishwananth, 2009).


6

Dinh dưỡng – Sinh sản
Các chất chiết xuất từ Channa striata được coi là một thực phẩm chức năng bởi chúng
có tác dụng trong điều trị vết thương, giảm đau và giảm nguy cơ nhiễm trùng bên trong,
bên cạnh đó là khả năng bổ sung năng lượng cho người cao tuổi trong lúc ốm cũng như sự
hồi phục của phụ nữ sau sinh (Barakbah, 2007; Mat Jais, 1998). Channa Striata còn chứa
một số acid béo như chất oxi hóa chất béo (Dahlan-Daud, 2010; Gam, 2005). Cá lóc bắt
đầu đẻ trứng khi được 1-2 tuổi. Một năm có thể đẻ 5 đợt cách nhau khoảng 15 ngày, đẻ rộ
vào tháng 4-7. Channa strita đẻ nơi yên tĩnh lúc sáng sớm, có nhiều khu thực vật thủy

sinh. Trước khi đẻ, cá thể cái sẽ thu nhặt rong để làm tổ và bảo vệ tổ cho đến khi trứng
nở. Thời gian trứng nở khoảng 72h sau khi được thụ tinh, ở nhiệt độ 20-35oC (Sinh,
2010).
1.1.4. Cá mè vinh (Barbonymus gonionotus)
Bộ Cypriniformes
Họ Cyprinidae
Giống Barbonymus
Loài Barbonymus gonionotus

Hình 1.4. Cá mè vinh (Barbonymus gonionotus)
(Nguồn: a/index.php?p=none&o=sspm&id=26187 )
Đặc điểm phân bố
Cá mè vinh phân bố ở các nước Indonesia, Lào, Campuchia, Thái Lan, ở Việt Nam
gặp nhiều ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long (Bộ Thủy sản, 2007). Cá phân bố ở vùng
nước trung bình và vùng đáy ở các con sông, suối, cửa sông, khu vực hồ chứa nước ngọt.
Cá mè vinh sống chủ yếu ở các khu vực nước tĩnh hơn ở các khu vực có dòng nước chảy


7

mạnh. Trong mùa nước nổi, cá sống ở các khu vực rừng ngập nước (Rainboth, 1996). Cá
mè vinh là loài cá di cư nhưng chỉ trong phạm vi hẹp. Di cư vào các con suối, kênh rạch
nhỏ và các vùng đất ngập nước trong suốt các tháng mùa mưa. Sau đó quay trở lại vào
mùa nước cạn (Sokheng, 1999).
Đặc điểm hình thái
Thân dẹp bên, có dạng hình thoi. Đầu nhỏ dạng hình nón. Phần trán giữa hai mắt rộng
và cong lồi. Mõm tù, ngắn, mõm trước, hẹp bên. Góc miệng chạm với đường thẳng đứng
kẻ từ bờ trước của mắt, rạch miệng xiên. Cá mè vinh có 2 đôi râu: râu mõm và râu mép,
râu kém phát triển, dài tương đương nhau và tương đương với ½ đường kính mắt. Mắt to,
lệch về nửa trên của đầu và gần chót mõm hơn gần điểm cuối của nắp mang. Vảy lớn, phủ

khắp thân, đầu không có vảy. Mặt lưng của đầu và thân có màu xanh rêu, lợt dần xuống
hai bên hông, mặt bụng và thân của đầu có màu trắng bạc. Vây lưng màu xám, phần ngọn
đậm hơn phần gốc. Vây bụng, vây hậu môn màu vàng, ria vây đuôi ửng lên màu vàng
cam, vây ngực màu vàng lợt. (Bộ Thủy sản, 2007)
Dinh dưỡng – Sinh sản
Cá lớn thành thục khi được một năm tuổi, nhưng có thể sớm hơn ( 8 – 10 tháng) khi cơ
thể đạt trọng lượng 9 – 20g, kích thước 8 – 8,5 cm. Con cái đẻ từ 200.000 đến 800.000
trứng/kg. Trứng nở sau 12h ở 25oC. (Mekong River Commission, 2013)
1.2. Tình nghiên cứu ký sinh trùng trên các loài cá nước ngọt
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Bùi Quang Tề và ctv (1976) đã tiến hành nghiên cứu ký sinh trùng hơn 41 loài cá nước
ngọt tại đồng bằng sông Cửu Long và đưa ra biện pháp phòng trị bệnh. Bùi Quang Tề
(2001) đã nghiên cứu ký sinh trùng trên 3210 cá thể thuộc 41 loài cá nước ngọt có giá trị
kinh tế ở đồng bằng sông Cửu Long, nghiên cứu xác định 157 loài ký sinh trùng, 70
giông, 46 họ, 27 bộ thuộc 12 lớp, 8 ngành. Trong 157 loài ký sinh trùng được ghi nhận có
121 loài lần đầu tiên phát hiện được ở Việt Nam.
Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007) tiến hành khảo sát trong giai đoạn cá giống, các loài
ngoại ký sinh (trùng bánh xe, sán lá đơn chủ,…) có nguy cơ gây dịch bệnh cao, làm thiệt
hại cho nghề nuôi. Trong giai đoạn cá nuôi thương phẩm, các bệnh do ký sinh trùng phức


8

tạp hơn, ví dụ: bệnh do trùng bánh xe (Trichodina, Trichodinellosis, Tripartiellosis), bệnh
trùng mỏ neo (Lernaeosis), bệnh trùng quả dưa (Ichthyophthyriosis).
Nguyễn Thị Thu Hằng và ctv (2008) khảo sát ký sinh trùng trên cá tra nuôi thâm canh
ở tỉnh An Giang, nghiên cứu ghi nhận các loài ngoại ký sinh như Acineta sp., Balantidium
polyvacuolum, Ichthyonyctus pangasia, Trichodina sp., … và nội ký sinh như
Dactlogyrus sp., Bucephalosis gracilescens, Cucullanellus minutus.
Phan Thi Van và ctv (2010) tiến hành khảo sát sán lá song chủ (trematodes) trên cá

nước ngọt nuôi và tự nhiên ở Nam Định. Kết quả cho thấy loài Haplorchis pumilo được
tìm thấy với tỷ lệ hơn 50% trong tổng số cá được thu. Nguyễn Văn Đức và ctv (2011) tiến
hành nghiên cứu tình hình ký sinh trùng trên cá sông Lam, huyện Đô Lương, tỉnh Nghệ
An. Kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm sán lá đơn chủ là cao nhất, sau đó là sán lá, các lớp ký
sinh trùng khác có tỉ lệ nhiễm thấp.
Trần Nam Hà và Trương Thị Hoa (2011) tiến hành nghiên cứu một số bệnh phổ biến
do ký sinh trùng gây ra trên cá chẽm Lates calcarifer nuôi tại Thừa Thiên Huế. Kết quả
công bố 3 giống (Vorticalle, Pseudorhabdosynochus, Carassotrema) và 5 loài ký sinh
trùng (Trichodia jadranica, Dactylogyrus minutus, Oceanobdella sexoculata, Caligus
orientalis, Alitropus typus) trên cá chẽm. Hai bệnh phổ biến do ký sinh trùng gây ra đó là
bệnh trùng bánh xe Trichodina và bệnh do sán lá đơn chủ Pseudorhabdosynochus.
Phạm Minh Đức và ctv (2012) đã tiến hành khảo sát mầm bệnh trên cá lóc (Channa
striata) nuôi ao thâm canh ở An Giang và Đông Tháp. Trong nghiên cứu này, các tác giả
đã xác định được 23 giống ký sinh trùng; trong đó có 6 giống Henneguya, Chilodonella,
Epistylis, Tripartiella, Gnathostoma và Capillaria mới được ghi nhận ký sinh trên cá lóc
nuôi ao đất thâm canh.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Ở Thái Lan, Yutisri và Thuhanruksa (1985) thực hiện điều tra khu hệ ký sinh trùng
trên một số loài cá tự nhiên ở một số vùng của Thái Lan. Nghiên cứu đã phát hiện 16 loài
ký sinh trùng, trong đó tác giả đã xác định được 3 loài ngoại ký sinh và 13 loài nội ký
sinh trên cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus).
Ahmed và Ezaz (1997) đã nghiên cứu ký sinh trùng của 17 loài cá da trơn ở
Banglades. Nghiên cứu xác định được 69 loài ký sinh trùng bao gồm 1 loài


9

monogenea, 24

loài

Digenea, 10

loài

Cestoda,

28

loài

Nematoda

và

6

loài Acanthocephala. Cá trê trắng trong nghiên cứu có số lượng giun sán ký sinh nhiều
nhất với 24 loài: 1 loài Monogenea, 5 loài Digenea, 9 loài Cestoda, 2 loài
Acanthocephala, 7 loài Nematoda.
Luangphai và ctv (2004) nghiên cứu trên cá rô đồng tại quận San Sai, tỉnh Chiang Mai
(Thái Lan) cho thấy 7 loài ký sinh trùng, trong đó 1 loài Monogenea (Trianchoratus sp.),
1 loài Acanthocephala (Pallisentis sp.), 1 loài Nematoda (Camallanus sp.), 1 loài
Trematoda (Allocreadium sp.) và 3 loài ở thời kỳ ấu trùng Stellantchasmus falcatus,
Acanthostomum sp., Centrocestus caninus. Chaiyapo và ctv (2007) nghiên cứu trên cá
thuộc giống Channa, trên loài Channa striata ghi nhận Pallisentis nagpurensis và bộ
Proteocephala.
Thuy và Buchmann (2008) ghi nhận trên cá tra nuôi 2 loài Thaparocleidus siamensis
và Thaparocleidus caecus. Trong đó, T. siamensis có tỷ lệ nhiễm 57%, cường độ nhiễm
148; T. caecus có tỷ lệ và cường độ nhiễm thấp hơn. Rahman và Bakri (2008) nghiên cứu

trên cá nước ngọt ở Malaysia, Camallanus yehi và Pallisentis spp. được ghi nhận trên đối
tượng cá lóc đồng (Channa striata).
Dinh Thi Thuy và ctv (2010) đã tiến hành khảo sát tình hình nhiễm ấu trùng sán lá
song chủ metacercariae trên cá tra Việt Nam. Nghiên cứu sử dụng trình tự gen ITS2 để
tiến hành phân loại di truyền. Kết quả cho thấy 17/69 loài metacercariae bắt cặp được với
trình tự gen ITS2.
Binky và ctv (2011) thực hiện khảo sát các loài nematoda ở vùng Karbhala tại Silchar
Assam, Ấn Độ. Nghiên cứu ghi nhận 13 loài nematoda. Tỉ lệ nhiễm cao nhất (20%) thuộc
về 2 loài cá Monopterus cuchia và Channa orientalis. Trong nghiên cứu này, các loài
Camallanus sp., Zeylanema anabantis, Paraquimperia manipurensis được ghi nhận trên
loài Anabas testudineus.
Verma và ctv (2012) tiến hành nghiên cứu ký sinh trùng trên cá leo tại Ấn Độ. Nghiên
cứu thực hiện phản ứng PCR, sử dụng primer 28S rDNA trên đối tượng Thaparocleidus
wallagonius. Kêt quả cho thấy loài nghiên cứu có sự tương đồng 91-98% với giống
Thaparocleidus. Chaudhary và Singh (2012) sử dụng gen 28s để xác định sự gần gũi về
mặt di truyền của các loài monogenea thu thập được trên các loài cá nước ngọt (Anabas


10

testudineus, Mystus vittatus, Puntius sophore,…). Kết quả cho thấy Thaparocleidus
parvulus, Cornudiscoides proximus và Bifurcohaptor indicus có sự gần gũi về mặt di
truyền; loài Trianchoratus agrawalae trên cá rô đồng có mối qaun hệ di truyền gần với
Heteronchocleidus và Mastacembelocleidus indicus.
Bhuiyan và ctv (2014), tiến hành nghiên cứu trên cá rô đồng Anabas testudineus. Kết
quả khảo sát cho thấy thành phần ký sinh trùng bao gồm 5 loài nội ký sinh metazoan, 1
loài trematoda (Neopecoelina saharanpuriensis) và 4 loài nematoda (Ascaridida sp.,
Contracaecum sp., Camallanus anabantis và C. pearsei)
Das và Goswami (2014) tiến hành khảo sát tình trạng nhiễm ký sinh trùng trên cá rô
Anabas testudineus ở ba vùng đất ngập nước thuộc Goalpara, Assam. Ba loài thuộc

treamatoda (Asymphylodora kedarai, Brahamputratrema sp., Neopodocotyl sp.) và 6 loài
thuộc nematoda (Camallanus anabantis, C.trichuris, C.intestinalus, Onchocamallanus
sp., Parascarophis sp., và Cosmoxynemoid nandusi) đã được ghi nhận.
Chaudhary và ctv (2014) khảo sát ký sinh trùng trên cá tra Pangasianodon
hypophthalmus ở Ấn Độ. Khảo sát đã phát hiện loài Thaparocleidus caecus trên các sợi tơ
mang. Các tác giả sử dụng các đặc điểm hình thái và đoạn gen 28s rDNA để phân loại
loài ký sinh trùng và xây dựng cây di truyền với các đoạn gen có liên quan trên GenBank.
1.3. Đặc điểm hệ gen ribosome DNA
Gen ribosome DNA (hay rDNA) là nhóm gen mã hóa của ribosome, đóng vai trò quan
trọng trong các nghiên cứu về phát sinh loài. rDNA có đặc điểm là một gen có nhiều bản
sao và không mã hóa protein. Việc ra đời phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm
PCR tạo thuận lợi lớn cho các nghiên cứu liên quan. (White và ctv, 1989)
Theo White và ctv (1989), rDNA có thể chia làm 2 nhóm là rDNA nhân và rDNA ty
thể. rDNA nhân gồm:
 Nu – SSU – rDNA (17-18S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị nhỏ.
 Nu – SSU – rDNA (26-28S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị lớn.
Trong các nghiên cứu phân loại học thường sử dụng DNA nhân vì các DNA này có
tính alen cao, tần số đột biến thấp, việc truyền tính trạng tuân theo các định luật chặt chẽ.
Ngược lại, DNA ty thể không có được các ưu điểm trên. Đồng thời, việc di truyền theo


11

dòng mẹ khiến các vật chất di truyền không được phân chia đều (Ballard và Whitlock,
2004; Song và ctv, 1998)
Ribosome đước cấu tạo từ rRNA và protein. Các rRNA được đặc trưng bởi hằng số
lắng S. Ở Eukaryote, ribosome có hệ số lắng là 80S, bao gồm 2 đơn vị: lớn (60S) và nhỏ
(40S).
 Đơn vị lớn (60S): 28S; 5,8S; 5S.
 Đơn vị nhỏ (40S):18S.

Hình 1.5. Vùng rDNA (5.8S, 18S và 28S)
(Nguồn: )
Các loại rDNA 5,8S, 18S, 28S thực hiện phiên mã thành các rRNA riêng lẻ và nằm xen
kẽ trong các vùng phiên mã trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS). Trong 3
loại rDNA nêu trên, 28S có vai trò quan trọng trong phân loại học; cạnh đó, vùng ITS
thường được sử dụng trong các nghiên cứu về tiến hóa ở vi sinh vật nhằm xác định mức
độ biệt hóa (Guarro Josep và ctv, 1999)


12

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá nước ngọt ở
tỉnh Khánh Hòa và Đồng Bằng sông Cửu Long.
Địa điểm thu mẫu: ký sinh trùng được thu trên mẫu cá thu tại Nha Trang, Cần Thơ,
Đồng Tháp.
Thời gian thực hiện: từ 02/02/2015 đến 07/06/2015.
Tiến hành thí nghiệm tại Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử - Trung tâm thí nghiệm
thực hành, Trường Đại học Nha Trang.


13

2.2. Sơ đồ khối nghiên cứu

Hình 2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu
2.3. Phương pháp thu mẫu
Các loài cá rô đồng (Anabas testudineus), cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) và cá

lóc đồng (Channa striata) thu tại khu vực chợ Vĩnh Hải, Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Cá
được thu trong tình trạng còn sống hoặc bảo quản tươi tại chợ vận chuyển về phòng thí
nghiệm. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được thu tại các tỉnh Đồng Tháp và
thành phố Cần Thơ, được bảo quản tươi và vận chuyển về địa điểm thí nghiệm. Số lượng
và kích thước các loài cá nghiên cứu được trình bày ở Bảng 2.1.


14

Bảng 2.1. Số lượng và kích thước các loài cá trong nghiên cứu
STT

Loài cá

Số lượng (n)

Chiều dài (cm)

Khối lượng (g)

1

Cá rô đồng

70

9.34 ± 3.01

15.50 ± 8.79

10

24.85 ± 3.55

259.6 ± 37.15

60

15.05 ± 5.2

31.01 ± 35.44

150

29.4 ± 19.2

244.39 ± 358.42

(Anabas testudineus)
2

Cá mè vinh
(Barbonymus gonionotus)

3

Cá lóc đồng
(Channa striata)

4

Cá tra
(Pangasianodon
hypophthalmus)

Giá trị trình bày dưới dạng: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
2.4. Phuơng pháp giải phẫu và kiểm tra ký sinh trùng
 Phương pháp giải phẫu
Đối với nội tạng cá, thực hiện theo quy trình:
Bước 1: Bắt đầu mổ cá từ lỗ hậu môn.
Bước 2: Cắt lên hướng vây lưng.
Bước 3: Tiếp tục cắt theo chiều hướng lên phía mang.
Bước 4: Khi áp sát mang, cắt theo chiều hướng xuống
Bước 5: Dùng kẹp kéo nhẹ nhàng mảng thịt ở khoang bụng ra để lộ phần nội tạng của cá.
Đối với mang cá, thực hiện theo quy trình:
Bước 1: Dùng kéo cắt vào cơ nắp mang ở dưới miệng cá.
Bước 2: Đẩy nắp mang lên, dùng kéo cắt 2 phần gốc của các lá mang.
Bước 3: Dùng kẹp lôi nhẹ nhàng mang cá và cho vào đĩa.
 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng
Trong nghiên cứu, việc kiểm tra ký sinh trùng theo phương pháp của Dogiel (1929) có
sửa chữa, bổ sung thêm của một số tác giả Đỗ Thị Hòa và ctv (2004), Hà Ký và Bùi
Quang Tề (2007).


15

Dụng cụ: Kính hiển vi, kính soi nổi, lam kính, lamel, bộ giải phẫu (kéo, banh kẹp, đèn
cồn, cốc thủy tinh, cân, thước, hộp lồng, khay đựng mẫu)
Hóa chất: Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất, cồn tuyệt đối, các mức thang cồn,
carmin, acid lactic, lactophenol, vaselin để kết dính lamel vào lam kính và một số hóa

chất khác.
Theo Dogiel, có 2 phương pháp kiểm tra và nghiên cứu ký sinh trùng ở cá: kiểm tra
toàn diện (toàn bộ các cơ quan bên trong và ngoài cơ thể cá) và kiểm tra từng phần
(kiểm tra những cơ quan có nguy cơ là đích của các loài ký sinh trùng như: mang, ruột,
vùng mắt, khoang bụng.
Đối với các cơ quan bên ngoài (da, mang)
Bước 1: Trước hết cần quan sát màu sắc da, tình trạng vây và vẩy cá, …
Bước 2: Tiến hành cạo nhớt trên thân, gốc vây, bụng cá cho lên 2-4 lam kính và nhỏ
thêm muối sinh lý, đậy lamel và quan sát ở vật kính 4x sau đó lên 40x để quan sát rõ hình
dạng, cấu trúc ký sinh trùng.
Bước 3: Cân đo chiều dài, cân nặng. Bước cân đo được thực hiện sau khi lấy nhớt để
đảm bảo không có ảnh hưởng tới lượng nhớt trên cá ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Bước 4: Cắt bỏ nắp mang và quan sát màu sắc, hình dạng của mang, cũng như lượng
nhớt mang cá tiết ra.
Bước 5: Để dễ quan sát kĩ càng hơn, có thể cắt rời từng cung mang (cắt cẩn thận tránh
chảy máu làm hạn chế sự quan sát) và quan sát bằng mắt thường, kính lúp tay.
Bước 6: Lấy nhớt mang lên 2-4 lam kính, đậy lame và quan sát trên kính hiển vi.
Trong trường hợp phát hiện nhiều sán lá đơn chủ (giống Dactylogyrus) ta cần tiến hành
định lượng trên toàn bộ mang (cắt nhỏ từng tơ mang, soi dưới kính giải phẫu để đếm số
lượng).
Đối với các cơ quan bên trong của cá (nội tạng)
Tiến hành mổ và tách riêng các bộ phận nội tạng cá ra như: tim, gan, ruột, dạ dày,
thận,…
 Tim cá được ngâm trong nước muối sinh lý và quan sát bằng mắt thường. Tiếp đó
được tiến hành giải phẫu cắt nhỏ cho lên lam kính và quan sát dưới kính hiển vi.