Luận văn thạc sỹ xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn hà nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LCMSMS
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.1 MB, 77 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
TRẦN THỊ HỒNG
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG
KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG
MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN
ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
TRẦN THỊ HỒNG
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG
KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT
SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN
HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ LC/MS/MS
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số:
60 44 29
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO
Hà Nội – 2012
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1.
Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran ....................................................... 3
1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì? ...................................................................................... 3
1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran ................................................................................. 3
1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran……………………… …….6
1.3. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm ..................................... 6
1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV ....................................................... 6
1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assayELISA) ........................................................................................................................ 7
1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS .............................................. 8
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 11
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu..................................................... 11
2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu...................................................................... 11
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 11
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................... 12
2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ ................................................................. 12
2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu .................................................................................. 18
2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 23
2.3.1. Dụng cụ, thiết bị .............................................................................................. 23
2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn ........................................................................................ 24
2.3.3 Pha chế chất chuẩn ........................................................................................... 25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 27
3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS ......... 27
3.1.1. Khảo sát các điều kiện khối phổ ..................................................................... 27
3.1.2. Lựa chọn cột tách ............................................................................................ 29
3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient ....................................................................... 30
3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu .......................................................................... 33
3.2. Thẩ m đinh
̣ phƣơng pháp .................................................................................... 38
3.2.1 Tính đặc hiệu .................................................................................................... 38
3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn ............................................................................... 38
3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ......................... 43
3.2.3. Độ lặp lại và độ thu hồi ................................................................................... 46
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Bảng 1.1
Nội dung
Cấ u trúc hóa ho ̣c của mô ̣t số chấ t nhóm nitrofuran
Trang
4
đƣơ ̣c xác đinh
̣ trong đề tai
Bảng 3.1
Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI
27
Bảng 3.2
Kết quả bắn phá các ion mẹ
28
Năng lƣợng bắn phá và các ion con của các chất
29
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
chuyển hóa nitrofuran
Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng
35
chiết lỏng – lỏng
Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng
37
chiết pha rắn
Bảng 3.6
So sánh độ thu hồi của 2 quá trình chiết
37
Bảng 3.7
Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuẩn
41
Bảng 3.8
Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran không sử dụng nội
43
chuẩn
Bảng 3.9
Giới hạn phát hiện của AOZ trên nền mẫu thịt
44
Bảng 3.10
Giới hạn phát hiện của AMOZ trên nền mẫu thịt
45
Bảng 3.11
Giới hạn phát hiện của AHD trên nền mẫu thịt
45
Bảng 3.12
Giới hạn phát hiện của SEM trên nền mẫu thịt
46
Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền
47
Bảng 3.13
Bảng 3.14
Bảng 3.15
mẫu thịt lợn tại 1 ppb
Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền
48
mẫu thịt lợn tại 1,5 ppb
Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền
mẫu thịt lợn tại 2 ppb
49
Bảng 3.16
Kết quả phân tích trên mẫu thực
51
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Nội dung
Trang
Hình 2.1
Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ
13
Hình 2.2
Sơ đồ phân tích khối phổ 3 tứ cực
16
Hình 2.3
Các bƣớc của quá trình chiết pha rắn
19
Hình 3.1
Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient
30
1 ở nồng đồ 20 ng/ml
Hình 3.2
Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient
31
2 ở nồng đồ 20 ng/ml
Hình 3.3
Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient
31
3 ở nồng đồ 20 ng/ml
Hình 3.4
Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient
32
4 ở nồng đồ 20 ng/ml
Hình 3.5
Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient
32
5 ở nồng đồ 20 ng/ml
Hình 3.6
Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p
35
nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 20 ng/ml sƣ̉ du ̣ng
quy triǹ h chiế t lỏng - lỏng
Hình 3.7
Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p
38
nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 20 ng/ml sƣ̉ du ̣ng
quy trình chiế t pha rắ n
Hình 3.8
Đƣờng chuẩn AOZ sử dụng nội chuẩn
39
Hình 3.9
Đƣờng chuẩn AMOZ sử dụng nội chuẩn
39
Hình 3.10
Đƣờng chuẩn SEM sử dụng nội chuẩn
40
Hình 3.11
Đƣờng chuẩn AHD sử dụng nội chuẩn
40
Hình 3.12
Đƣờng chuẩn AOZ không sử dụng nội chuẩn
41
Hình 3.13
Đƣờng chuẩn AMOZ không sử dụng nội chuẩn
42
Hình 3.14
Đƣờng chuẩn AHD không sử dụng nội chuẩn
42
Hình 3.15
Đƣờng chuẩn SEM không sử dụng nội chuẩn
43
Hình 3.16
Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p
47
nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 1 ng/g
Hình 3.17
Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p
48
nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 1,5 ng/g
Hình 3.18
Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p
nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 2 ng/g
49
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
CAD
Collision Gas Presure
Áp suất khí mang trong tứ cực Q2
CE
Collision Energy
Thế áp vào tứ cực Q
CUR
Curtain Gas
Khí mang
CXP
Collision Cell Exit Potential
Thế áp giữa tứ cực Q2 và Q3
DP
Declustering Potential
Thế đầu vào áp vào màn chắn
EP
Entrance Potential
Thế áp vào nguồn ion mẹ
ESI
Electrospray Ionization
Ion hóa phun điện tử
EU
European Union
Liên minh châu Âu
GS1
Ion Source Gas 1
Áp suất khí hai bên đầu phun
GS2
Ion Source Gas 2
Áp suất của luồng khí nóng
HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc kí lỏng hiệu năng cao
IP
Identification point
Điể m nhâ ̣n da ̣ng
IS
IonSpray Voltage
Thế ion hóa
LC – MS
Liquid chromatography –
mass spectrometry
Sắc kí lỏng khối phổ
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of quality
Giới hạn định lƣợng
MeOH
Methanol
Methanol
Minimum required
Yêu cầu giới hạn hiệu năng nhỏ nhất
performance limit
của phƣơng pháp
Relative standard deviation
Độ lệch chuẩn tƣơng đối
MRPL
RSD%
SPE
Solid phase extraction
Chiết pha rắn
TEM
Temperature
Nhiệt độ của nguồn khí nóng thổi vào
MỞ ĐẦU
An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang đƣợc cả xã hội quan tâm, đặc biệt
là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát
hiện trong thực phẩm khiến dƣ luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh
doanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề
đáng lo ngại, nhƣ việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sử
dụng các chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dƣ các hóa
chất, kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức
khỏe ngƣời tiêu dùng.
Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thƣờng đƣợc sử dụng cho vào
thức ăn gia súc để kích thích tăng trƣởng và là phƣơng pháp điều trị dự phòng, điều
trị các bệnh nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong
chăn nuôi gia súc, gia cầm. Chúng cũng đã đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm trùng do
vi khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồng thủy sản...Vì vậy sự tồn dƣ của
chúng gây tác hại cho sức khỏe con ngƣời, đặc biệt là gây ung thƣ và đột biến ở
ngƣời. Năm 2002 – 2003 phát hiện dƣ lƣợng chất chuyển hóa của nitrofuran trong
số lƣợng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thủy sản các sản phẩm nhập khẩu
vào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nƣớc Nam Mỹ. Từ đó đã dẫn
đến lệnh cấm sử dụng nitrofuran trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc
gia bao gồm Mỹ, Canada và EU... Các nƣớc này đã đặt lệnh cấm trên tất cả các loại
thực phẩm nhập khẩu có chứa dƣ lƣợng nitrofuran. Tháng 3 năm 2003 EU đã quy
định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất
chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông
nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm sản xuất, nhập khẩu, lƣu thông và
sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh TACN trong
đó có nitrofuran [9].
Hiện nay việc sử dụng dƣ lƣợng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động
ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời và động vật. Vì vậy với nhu cầu bức thiết về vấn
1
đề đảm bảo VSATTP, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp
“Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại
thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối
phổ LC/MS/MS”.
2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran
1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì?
Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có chứa nhóm 5-nitro, thƣờng
đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trƣởng, chủ yếu đối với gia súc
(nhƣ gia cầm, lợn), nuôi trồng thủy sản (cá, tôm) và nuôi ong để điều trị các vi
khuẩn và sinh vật đơn bào nhiễm trùng nhƣ viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi
Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầu
[12].
1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran
Các chất nhóm n itrofuran bao gồ m Furazolidone, furaltadone, furazolidone,
nitrofurazone, khi đi vào cơ thể sinh vâ ̣t
nó tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng
ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kế t trong các mô tồ n ta ̣i trong nhiề u tuầ n sau
khi sƣ̉ du ̣ng [12]. Ví dụ nhƣ quá trình chuyển hóa của nitrofurazone nhƣ sau :
3
Bảng 1.1: Cấ u trúc hóa ho ̣c của mô ̣t số chấ t nhóm nitrofuran đƣơ ̣c xác đinh
̣ trong đề tài
Khố i
STT
Các chất nitrofuran
Công thƣ́c
phân tƣ̉
lƣơ ̣ng
phân
tƣ̉
(g/mol)
1
AOZ
3-amoni-2-oxazolidinone
C3H6N2O2
102,09
C10H9N3O4
235,2
C8H15N3O3
201,22
C15H18N4O5
334,33
C3H5N3O2
116,05
C10H8N4O4
248,19
NPAOZ
2
3-(2-nitrobenzylidenamino)2-oxazolidinone)
AMOZ
3
3-amoni-5-morpholinomethyl
-1,3-oxazolidinone
NPAMOZ
5-(morpholinomethyl)-3-(2-
4
nitrobenzylidenamino)-2oxazolidinone
5
AHD
1-aminohydantoin
NPAHD
6
[3-(2-nitrobenzylidenamino)
-2,4-imidazolidinedione]
4
Công thƣ́c cấ u ta ̣o
7
SEM
CH5N3O
semicarbazide
75,08
NPSEM
8
3[(2-nitrophenyl)methylene]-
C8H8N4O3
208,174
hydrazinecarboxamide
1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran
McCracken và các cô ̣ng sƣ̣ 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các
hợp chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng
ứng liên kết trong các mô.
Về mặt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa tƣ̀ nitrofuran đã kìm hãm hoặc
phá hủy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không
phát triển và không sinh sản đƣợc nữa. Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram
dƣơng. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác
dụng tố t trong viê ̣c giê ̣t trƣ̀ giun đũa [7].
Với n ồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác
dụng diệt khuẩn.
Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong viê ̣c diê ̣t khuẩ n
salmonellosis, colisepticeamia. Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dƣỡng.
Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho gà và lợn còn tăng trọng
nhanh.
Nitrofuran ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và đột biến
[7], khi thƣ̣c phẩ m có tồ n dƣ nitrofuran và các dẫn xuấ t của nó .
Do đó hầ u hế t các nƣớc trên thế giới đã cấ m sƣ̉ du ̣ng kháng sinh nhóm
nitrofuran trong chăn nuôi. Ở Việt Nam, bô ̣ Nông nghiê ̣p và phát triể n nông thôn đã
quyế t đinh
̣ cấ m sƣ̉ du ̣ng ni trofuran cho vào trong thƣ́c ăn chăn nuôi [9]. EU đã quy
5
định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất
chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29].
1.3. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm
Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thƣờng xuyên đƣơ ̣c phát hiện thấ y trong thịt
gia cầm và các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nhập khẩu vào các nƣớc EU từ Thái
Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25].
Hơn nữa, dƣ lƣợng nitrofuran cũng đƣợc tìm thấy trong sản phẩm gia súc và
gia cầm ở Châu Âu nhƣ: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạp, Romania và Bulgari. Sau đó EU
đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn
9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc
(37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm
tôm, mật ong và thịt hộp [25].
Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập
khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê,
cá ba sa..cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran
trong tôm [11].
Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS
. Nguyễn Quố c Ân , phó trƣởng
phòng quản lý thuốc , cục thú y vào năm 2007 đã phát hiện 5 mẫu thủy sản nuôi lấ y
tại ao nuôi nhiễm SEM (3 mẫu tôm, 1 mẫu cá và 1 mẫu cua lô ̣t) với hàm lƣơ ̣ng tƣ̀ 0
– 3,55 ng/g. Năm 2008 phát hiện 1 mẫu tôm thẻ chân trắ ng ta ̣i Phú Mỹ – Bình Định
nhiễm AOZ với hàm lƣơ ̣ng 12,6 ng/g; 2/754 mẫu cua lô ̣t ta ̣i Cầ n Guô ̣c – Long An
nhiễm SEM với hàm lƣơ ̣ng tƣ̀ 2 – 2,2 ng/g [1].
1.4.
Các phƣơng pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran
Hiê ̣n nay có nhiề u phƣơng pháp để xác đinh
̣ kháng sinh nhóm nitrofuran , bao
gồ m: phƣơng pháp sắ c ký lỏng v ới detector UV , phƣơng pháp vi sinh (kỹ thuật
Elisa), phƣơng pháp sắ c ký lỏng với detector MS/MS.
1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV
Một số tác giả đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector tử ngoại khả
kiến (HPLC-UV-VIS) để phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất của
6
nó trong một số đối tƣợng thực phẩm. Horne và cộng sự, đã xây dựng phƣơng pháp
xác định AOZ, AMOZ trong gan lợn sử dụng HPLC – UV. Phƣơng pháp dựa trên
sự dẫn xuất các nitrofuran với 2-nitrobenzaldehyde, sau đó chiết với ethyl acetate,
làm sạch bằng n-hexan và phân tích bằng HPLC-UV sử dụng cột C18 kế t hơ ̣p với
detector UV ở bƣớc sóng 275nm. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 5 và 10
µg/kg tƣơng ứng cho AOZ và AMOZ với độ thu hồi trong khoảng 71-101% [18].
Tác giả Cooper và cộng sự cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định AOZ,
AMOZ, AHD, SEM trong gan và thận của lợn dùng HPLC-UV đã tách đƣợc 4 chất
chuyển hóa nhóm nitrofuran. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là từ 2 – 5 µg/kg
[21].
Phƣơng pháp HPLC -UV có ƣu điể m là dễ thực hiện , và có thể ứng dụng
phân tić h rô ̣ng raĩ . Tuy nhiên phƣơng pháp la ̣i không đáp ƣ́ng đƣơ ̣c yêu cầ u về đô ̣
nhạy để phân tích các nitrofuran trong thực phẩm vì hiện nay giới hạn cần phải đạ t
tới (MRPL) là 1 µg/kg.
1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assayELISA)
Hiện nay, ELISA đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ
y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợng
các sản phẩm sinh học. Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa
kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme, enzyme
sẽ thủy phân thành một chất có màu .
Phòng thí nghiệm randox của Anh đã nghiên cứu xác định các chất chuyển
hóa nhóm nitrofuran sử dụng phƣơng pháp Elisa: mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân
và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trƣờng axit HCl , trung hòa axit bằng NaOH,
chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện của
phƣơng pháp từ 0,2 – 0,6 ng/g [28].
Vass và cộng sự (2008) sử dụng kỹ thuật Elisa trực tiếp sử dụng kháng thể
đặc hiệu cho NPSEM, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định SEM trong trứng
với quy trình xử lý mẫu: mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA
7
trong môi trƣờng axit HCl , sau đó trung hòa bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu
bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,13 µg/kg,
CCα = 0,3 µg/kg [25].
Diblikova và cộng sự (2005) giới thiê ̣u kỹ thuật Elisa trực tiếp, sử dụng
kháng thể đặc hiệu cho NPAOZ, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định AOZ
trong tôm, thịt gà, thịt lợn, thịt bò với CCβ là 0,4 µg/kg, độ thu hồi từ 66 – 119%
[20].
Lui và cộng sự (2007) giới thiê ̣u kỹ thuật Elisa gián tiếp, sử dụng kháng thể
NFT, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định AHD trong nƣớc. Giới hạn phát
hiện là 0,2 µg/l, độ thu hồi từ 88 – 103% [31].
Tƣơng tự Chang và cộng sự (2008) xác định trong gan lợn, gan gà và cá với
giới hạn phát hiện lần lƣợt là 0,19; 0,24; 0,18 µg/kg [15].
Phƣơng pháp Elisa đáp ƣ́ ng đƣơ ̣c yêu cầ u về đô ̣ nha ̣y , đơn giản dễ thƣ̣c hiê ̣n ,
tuy nhiên đô ̣ đă ̣c hiê ̣u bi ̣giới ha ̣n vì phải đánh dấ u cho tƣ̀ng kháng thể chuyên biê ̣t
cho tƣ̀ng đố i tƣơ ̣ng.
1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS
Đây là một phƣơng pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời dƣ lƣơ ̣ng
nitrofuran. Sau khi qua cột tách, chất phân tích đƣợc hóa hơi, các hợp chất hữu cơ
trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện
dƣơng hoặc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đƣa sang bộ phận tách theo
khối lƣợng. Từ các tín hiệu thu đƣợc, dựa vào khối lƣợng ion phân tử, dựa vào đồng
vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ
liệu các ion và mảnh ion, ngƣời ta định tính và định lƣợng đƣợc chất phân tích một
cách chính xác.
Ở Việt Nam năm 2004, Bộ Thủy sản (nay là Bộ Nông nghiệp và phát triển
nông thôn) đã ban hành TCN 194:2004 xác định các chất chuyển hóa thuộc nhóm
nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối
phổ phân tích dƣ lƣợng liên kết với mô của các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran
trong sản phẩm thủy sản đƣợc thủy phân bằng axit clohydric loãng để thu đƣợc
8
mạch nhánh của các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này đƣợc dẫn xuất bằng
2-nitrobenzaldehyde, sau đó đƣa pH đến 7 và đƣợc chiết bằng ethyl axetat. Dịch
chiết đƣợc thổi khô bằng N2 đến cạn, hòa tan cặn, sau đó đo dung dich
̣ mẫu này
bằ ng hệ thống LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là axit acetic , kênh B là acetonitril .
Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 1 µg/kg [10].
Năm 2002 phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi của Thái Lan đƣa ra quy
trình phân tích 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM)
bằng LC/MS/MS giới hạn phát hiện lần lƣợt của từng chất là AHD 0,1 µg/kg; AOZ
0,04 µg/kg; SEM 0,15 µg/kg; AMOZ 0,02 µg/kg [29].
Tác giả Pascal Mottier và cộng sự, xác định 4 chất chuyển hóa nhóm
nitrofuran trong thịt bằng LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là axit acetic
0,025%,
kênh B là acetonitril , sƣ̉ du ̣ng quy trin
̀ h làm sạch bằng cột chiết pha rắn polymeric
trƣớc khi phân tích bằ ng LC/MS/MS và thu đƣợc CCα từ 0,11 – 0,21 µg/kg, CCβ từ
0,19 – 0,36 µg/kg [26].
Trong tài liê ̣u [25] của tác giả M.Vass, tác giả Boket và cộng sự (2007) xác
định các chất chuyển hóa nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS, CCα lần lƣợt của
từng chất AOZ, AMOZ, AHD, SEM là 0,03; 0,05; 0,22; 0,2. Độ thu hồi từ 95,2 –
102,1 %.
Leitner và cộng sự xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt
gia súc, gia cầm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS với pha đô ̣ng
kênh A là amoniacetat 10mM, kênh B là methanol, sƣ̉ du ̣ng quá trình làm sa ̣ch bằng
cột chiết pha rắn SPE với chất hấp thụ polystyrene đƣợc kết hợp bằng cách thủy
phân các chất chuyển hóa hình thành liên kết trong các mô và đƣợc dẫn xuất bằng
2-nitrobenzaldehyde. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,5 – 5 ng/g; giới hạn
định lƣợng từ 2,5 – 10 ng/g [12].
Verdon và cộng sự năm 2007 cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định các
chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt lợn bằng LC/MS/MS với cô ̣t C 18, pha
đô ̣ng kênh A là amonifomiat 1mM, kênh B là methanol, sử dụng phƣơng pháp chiế t
lỏng – lỏng thu đƣơ ̣c CCα = 0,08 – 0,54 µg/kg và CCβ = 0,10 – 0,66 µg/kg [19].
9
Tác giả C.Bock và cộng sự đã thẩm định phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng 4
chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS với CCα từ 0,03 –
0,22 µg/kg [14].
Các t ác giả Chung-Wei Tsai, Chuan-ho Tang và Wei-Hsien Wang đã xác
định các chất chuyển hóa nitrofuran trên LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là
amoniacetat 20mM, kênh B là methanol có giới hạn định lƣợng 1 µg/kg với CCα =
0,19 – 0,43 µg/kg. Khoảng tuyến tính từ 1 – 10 µg/kg [16].
Tác giả Lech Rodziewicz (2008), xác định các chất chuyển hóa nitrofuran
trong sữa bằng LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là amoniacet at 0,5mM, kênh B là
methanol. Phƣơng pháp có hê ̣ số biế n thiên nhỏ hơn 9,3%, độ tái lập nội bộ nhỏ hơn
13%, CCα từ 0,12 – 0,29 µg/kg, CCβ từ 0,15 – 0,37 µg/kg [22].
Tác giả Caroline Douny và cộng sự (2012), đã xác định các chất chuyển
hóa nhóm nitrofuran, nghiên cứu ứng dụng để đánh giá furanzolidone trong tôm sú
ở Việt Nam. Mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte,
chiết lỏng – lỏng bằng etylacetat trƣớc khi xác định bằ ng hệ thống LC/MS/MS với
pha đô ̣ng kênh A là axit acet ic 0,1%, kênh B là acetonitril thu đƣơ ̣c CCα từ 0,08 –
0,36 µg/kg, CCβ từ 0,12 – 0,61 µg/kg [13].
Tóm lại: Các phƣơng pháp (phƣơng pháp sắ c ký lỏng với detector UV -VIS, phƣơng
pháp hóa sinh Elisa , phƣơng pháp s ắc ký lỏng với detector MS /MS) đều có điểm
chung là thủy phân để đƣa các chất chuyển hóa nitrofuran liên kết trong các mô
thành dạng tự do sau đó sử dụng 2-nitrobenzaldehyde để chuyển nitrofuran thành
các dẫn xuất tƣơng ứng. Các dẫn xuất này sau đó đƣợc chiết lỏng lỏng hoặc chiết
pha rắn và phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ. Phƣơng pháp này có
ƣu điểm là có độ nhạy rất tốt, thƣờng từ 0,1 µg/kg có độ chọn lọc cao và có độ
chính xác đáp ứng để xác định nitrofuran trong thực phẩm. Do đó trong nghiên cứu
đề tài chúng tôi thống nhất lựa chọn phƣơng pháp LC-MS/MS với quá trình thủy
phân bằng axit clohydric và dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde để xác định các chất
chuyển hóa của nitrofuran.
10
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu là các chất chuyển hóa của nitrofuran, bao gồm: AOZ,
AMOZ, SEM và AHD.
Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tƣơi sống bao gồm thịt và gan
của gia súc gia cầm.
Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu xây dƣ̣ng phƣơng pháp xác định
đồng thời 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thực
phẩm tƣơi sống bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS. Các mục tiêu cụ
thể nhƣ sau:
- Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa của nitrofuran trong
thực phẩm tƣơi sống bằng LC-MS/MS.
- Ứng dụng phƣơng pháp để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực
phẩm tƣơi sống cụ thể trong thịt lợn, thịt bò, thịt gà, gan.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp
Khảo sát phƣơng pháp bao gồm:
Điều kiện và thông số vận hành máy LC/MS/MS,
Điều kiện tách chiết lấ y chấ t phân tić h.
Thẩm định phƣơng pháp:
Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ,
Khoảng tuyến tính,
Độ chụm (độ lặp lại),
Độ đúng (độ thu hồi, độ chệch).
2.1.2.2. Ứng dụng phƣơng pháp
Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng kháng sinh nhóm
nitrofuran cụ thể là các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống
đang bán trên địa bàn Hà Nội.
11
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ
2.2.1.1. Nguyên tắc chung về phƣơng pháp sắc kí lỏng HPLC
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và
pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn). Mẫu phân tích đƣợc chuyển lên cột tách
dƣới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phan tích đƣợc phân bố
liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc
phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tƣơng tác của
chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ
khác nhau và tách ra khỏi nhau thành từng lớp của mỗi chất.
2.2.1.2. Pha tĩnh trong HPLC [8]
Trong LC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ
tách hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thƣớc hạt rất nhỏ, từ
3-7µm. Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc ký lỏng pha liên kết
thƣờng chia làm 2 loại: sắc ký pha thƣờng (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RPHPLC). Khi dùng chất nhồi cột có cỡ hạt nhỏ hơn đƣờng kính hạt 1,7 µm, chịu
đƣợc áp suất cao lên tới 700 atm làm tăng độ phân giải và giảm thời gian phân tích
đó là những ƣu điểm của sắc ký lỏng UPLC (Ultra Performance Liquid
Chromatography).
2.2.1.3. Pha động trong HPLC [8]
Có thể chia pha động làm hai loại: là pha động có độ phân cực cao và pha
động có độ phân cực thấp.
Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chất
hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực. Pha động loại này đƣợc dùng
trong sắc ký pha ngƣợc.
Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực nhƣ cychlorpentan, n-pentan, nheptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…Tuy nhiên
pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợc khả năng rửa giải, ngƣời ta
12
thƣờng phối hợp 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung môi có độ phân cực từ thấp đến
cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra
theo thời gian, trƣờng hợp này ngƣời ta gọi là chƣơng trình rửa giải gradient.
2.2.1.4. Detector trong HPLC [5]
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp. Đối
với các chấ t chuyể n hóa nhóm nitrofuran có khố i lƣơ ̣ng phân tƣ̉ thấ p không có khả
năng hấ p thu ̣ tia UV , có thể tạo dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde ta ̣o sản phẩ m có
khả năng hấp thụ tia UV và đƣợc xác định bằng detector HPLC -UV.
Hiê ̣n nay, detector có thể cung cấp thông tin định tính, định lƣợng và cấu trúc
của các chất phân tích là detector khối phổ.
2.2.1.5. Hệ thống detector khối phổ (Mass Spectrometry)
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử của
các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợng
và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích
của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa,…Các ion tạo thành này đƣợc tách theo
tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân
tử của hợp chất.
Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị
phân tích khối và bộ phận phát hiện. Trƣớc hết, các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn
ion, sau đó đƣa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín
hiệu thu đƣợc sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lƣu trữ.
Ƣu điểm của phƣơng pháp là:
Giúp phát hiện hầu hết các chất tan
13
Độ nhạy cao
Có thể giúp xác định đƣợc các chất tan ngay khi độ phân giải chƣa tốt.
Hữu hiệu cho nghiên cứu các hợp chất.
Cung cấp đầy đủ thông tin về cấu trúc và khối lƣợng
2.2.1.5.1. Bô ̣ nguồn ion (Ion sources)
Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây là
phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi. Theo kỹ thuật ion hoá của
LC/MS, năng lƣợng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thành
ion ở thể hơi. Trong máy khối phổ, có rất nhiều cách để ion hoá phân tử và nguyên
tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi. Sau đây là một số kỹ thuật thƣờng dùng:
a) Ion hóa bằng dòng electron (Electron Ionization – EI):
Trong phổ EI-MS, dòng electron có năng lƣợng cao đƣợc phát ra từ sợi dây
catot vonfram hoặc reni đƣợc đốt nóng sinh ra dòng electron chuyển động vuông
góc với mẫu về phía anot xảy ra sự va chạm biến các mẫu thành các ion phân tử
hoặc ion mảnh. Thông thƣờng các hợp chất hữu cơ có thế ion hóa nằm trong khoảng
8 eV đến 15 eV nhƣng để đạt đƣợc hiệu quả cao thƣờng áp dụng dòng 70 eV .
ABC + e → ABC+● + 2e
(1) (ion phân tử)
ABC+● → A+ + BC●
(2) (ion mảnh, gốc tự do, mảnh trung hòa)
ABC+● → A+ + B +C●
Ƣu điểm: áp dụng cho phân tử nhỏ, cho cơ sở dữ liệu phổ. Tuy nhiên, một số
hợp chất dễ phân mảnh thì thời gian sống ngắn, nhiều mảnh nhỏ hay ít hoặc không
thu đƣợc ion phân tử và đòi hỏi hợp chất phải dễ bay hơi.
b) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization- ESI)
Nguyên tắc: biến đổi ion ở thể lỏng thành ion ở thể hơi, dung dịch mẫu đƣợc
dẫn vào điện trƣờng mạnh và duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch
mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào của bộ
14
phân tích khối phổ. Các giọt tích điện trƣớc khi vào bộ phân tích khối phổ sẽ kết
hợp với dòng khí khô để làm bay hơi hết dung môi.
Ƣu điểm của ESI là có hai chế độ bắn phá: bắn phá chế độ ion dƣơng và ion
âm, ESI-MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu)
cũng nhƣ phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi,
không bền nhiệt, phân cực và không phân cực.
c) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical
Ionization-APCI)
Sự ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va chạm của dòng ion dƣơng hay
âm với phân tử, mẫu bị ion hóa bởi phản ứng với các ion đƣợc tạo ra từ các chất khí
nhƣ methan (ở dạng CH5+), amoniac (ở dạng NH4+)...
Khi sử dụng khí methan làm chất khí phản ứng ta có các quá trình ion hóa
nhƣ sau:
Quá trình 1:
CH4 + e → CH4+● + CH3+ + CH2+
CH4+● + CH4 → CH5+ + CH3●
CH3+ + CH4 → C2H5+ + H2
Quá trình 2: ion mảnh va chạm trực tiếp với phân tử mẫu.
CH5+ + M → CH4 + (MH)+ (chuyển proton thành dƣơng m/z = M+1)
C2H5+ + M → (MH)+ + C2H4 (chuyển proton thành dƣơng m/z = M+1)
C2H5+ + M → (MC2H5)+ (thêm ái lực điện tử thành dạng m/z = M+29)
C2H5+ + M → (M-H)+ (hydrua chuyển thành dạng m/z = M-1)
Sự thay đổi chất khí trong phản ứng APCI-MS cho phép thay đổi tính chọn
lọc của sự ion hóa và mức độ phân mảnh. Đây là phƣơng pháp có độ nhạy cao cho
15
phép phân tích định lƣợng ở mức picomol tới femtomol, thích hợp cho những chất
có phân tử khối 1000 đơn vị nhƣng đòi hỏi chất phân tích phải dễ dàng bay hơi.
2.2.1.5.2. Bộ phận phân giải khối
Sau khi đƣợc ion hóa, chất phân tích đƣợc đƣa vào bộ phận phân giải khối.
Tại đây, các ion đƣợc tách ra khỏi nhau theo tỉ số m/z. Bộ phận phân tích khối đƣợc
chia thành 4 loại: bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích bẫy ion tứ cực
và bộ phân tích thời gian bay. Trong đó bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)
và bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) đƣợc sử dụng
phổ biến.
a) Bộ phân giải tứ cực (Quadrupole Analyser)
Tứ cực đƣợc cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng
trống để các ion bay qua. Một trƣờng điện từ đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng
một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực đƣợc đóng vai trò nhƣ một
bộ lọc khối. Khi một trƣờng điện từ đƣợc áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ
dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trƣờng RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z
phù hợp mới có thể có thể đi qua đƣợc bộ lọc này.
Bộ phân giải tứ cực đƣợc phát triển và cho ra đời bộ phận phân giải khối phổ
ba tứ cực (Triple Quadrupole).
Hình 2.2: Sơ đồ bộ phân giải khối phổ ba tứ cực
16
