Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa cúa nhân trần (adenosma caeruleum br ) và một số dược liệu khác

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HOÁ CỦA
NHÂN TRAN (Adenosma caeruleum R.Br.)
VÀ MỘT SỐ DƯỢC LIỆU KHÁC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC
KHOÁ 50 (1995-2000)

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Hoàng Tuấn
Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Duy Thuần
TS. Nguyễn Hoàng
Nơi thực hiện
: Bộ môn Dược Liệu
Trường đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện : 1/ 19ậ9.--5/. 2000

'ý . } ‘5ti" -/


Lời cám ơn

(ĩ)ấi lòíUị Uínti tirũễiạ úìí hiêỉ úễt sảu sắeý tài r á t
hủụ ỈÁ Lồi eám đít eliứỉi thành tồi :
& S. Qlgxiạễ^L 0)íiij ^/Ítíííiễi
rĩcS. OtgxtíỊMSL ^ỗ o à n q

(ìlhữíUị ttạưèi ĩtủ tí'Uừ tiỉịt hưâễiụ ilảíi oỉí ừhí
húí) t ê ỉ hoỉiiĩ t h à n h U hoá lu ă n. tết tiụ h iêp Ểiàí/. Cjế)i eíiiiq

^Diíổe £1ỀU ĩtủ nhiỀt lình (ịlÚỊr (tẻ DÙ taú ĩtỉêu Uiỉti eíiú tồi
tifi)íi(Ị quá tiriỉih thưa hi en LliíXÍ Íuậíi ti à y
'UÔỈL Qlồi, ỉtqàụ

cS^7J. OlíỊUịỊỈn ^ùúùng, ^ u iín


ị,

MỤC LỤC
I. ĐẶT VẤN ĐỂ............................................................................

1

II TỔNG QUAN...........................................................................
2.1. Khái niệm về gốc tự do, sự hình thành các dạng oxy hoạt
động (DOXHĐ) và hệ thống các chất chống oxy hoá trong cơ thể.
2.1.1. Khái niệm về gốc tự do........................................................
2.1.2 Sự hình thành của các dạng oxy hoạt động...........................
2.1.3. Hệ thống các chất chống oxy hoá trong cơ thể:..................
2.2. Sự liên quan giữa gốc tự do với một số quá trình bệnh lý.......
2.2.1. Gốc tự do với một số quá trình viêm....................................
2.2.2. Gốc tự do với các bệnh tim mạch.........................................
2.2.3. Gốc tự do với quá trình ung thư............................................
2.3. Các phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hoá...............
2.3.1. Phương pháp S.G.Blagodorop...............................................
2.3.2. Phương pháp xác định HĐCOXH bằng xác định chỉ số Iod.
2.3.3. Phương pháp sàng lọc (Screening test).................................
2.4. Sơ lược về tình hình nghiên cứu về CCOXH trong thuốc đông

dược và tân dược................................................................................
2.5. Những nghiên cứu về thành phần hoá học của cây nhân trần
Adenosma caeruleum.....................................................................
2.4.1. Chất chống oxy hoá trong thuốc tân dược.............................
2.4.2. Chất chống oxy hoá trong thuốc đông dược..........................

3

10
11

2.5. Những kết quả đã nghiên cứu về thành phần hoá học của cây
nhân trần (Adenosma caeruleum)...................................................

14

3
3
3
4
4
4
5
6
6
6
8
8
10

III. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU................................................................................................
3.1. Nguyên liệu.............................................................................

15
15

3.2. Phương pháp nghiên cứu.........................................................

15

3.2.1. Xác định hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp
Blagodorop.....................................................................................
3.2.2. Xác định hoạt độ chống oxy hoá bằng phương pháp xác định

15


chỉ số Iod.........................................................................................
3.2.3. Phương pháp Screening test..................................................
3.2.4. Phương pháp chiết tách.........................................................

16
16
16

IV.THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ...........................................
4.1. Khảo sát hoạt độ chống oxy hoá của nước sắc của các dược
liệu nghiên cứu...............................................................................
4.1.1. Xác định hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp

đo quang..........................................................................................
4.1.2. Xác định hoạt độ chống oxy hoá bằng phương pháp xác
định chỉsố Iod..................................................................................

17
17
17
19

4.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của các nhóm hoạt chất
tách ra từ nhân trần.........................................................................

21

4.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất trong cây nhân trần..........

22

4.2.2. Quy trình chiết tách Flavonoid từ cây nhân trần..................

26

4.2.3. Phân tích hỗn hợp Flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng và sắc
ký giấy............................................................................................
28
4.2.4. Phân lập Flavonoid bằng sắc ký cột phối hợp với sắc ký giấy
chế hoá...........................................................................................
29
4.2.5. Nhận dạng FA,.....................................................................
30

4.2.6. Xác định tác dụng chống oxy hoá trong các dịch chiết dược liệu
bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy (phương pháp
Screening test)................................................................................
32
4.2.7. Xác định hoạt độ chống oxy hoá của Flavonoid toàn
phần, Flavonoid tinh khiết, dịch chiết nước còn lại theo phương pháp
đo quang và theo phương pháp xác định chỉ số Iod.......................
33
V.
KẾT LUẬN VÀĐỂNGHỊ...........................................
5.1. Kết luận...................................................................................
5.2. Đề nghị...................................................................................

36
36
36


CHÚ GIẢI
CCOXH
CT
DOXHĐ
GSH
GSH-PO
HĐCOXH
LDL
LOOH
MDA
POL
SOD

TMCB
TMTL
TT

Chất chống oxy hoá
Chất thử
Dạng oxy hoạt động
Glutathion
Glutathion peroxydaza
Hoạt độ chống oxy hoá
Lipoprotein tỷ trọng thấp
Hydroperoxyd lipid
Malon^l dialdehyd
Peroxy hoá lipid
!
Supẽroxyd dimutaza
Thiếu máu cục bộ
Tưới máu trở lại
Thuốc thử


I. ĐẶT VÂN ĐỂ
Trong những năm gần đây, với sự phát triển của khoa học Y- Dược,
được sự hỗ trợ của các phương tiện khoa học và kỹ thuật hiện đại, các nhà
khoa học đã chứng minh sự có mặt của gốc tự do trong các hệ sinh học [3,4].
Việc khám phá ra các gốc tự do của oxy và dạng oxy hoạt động
(DOXHĐ) nói chung gắn liền với những phát hiện các chất có khả năng phân
huỷ, loại bỏ các DOXHĐ này, chúng được gọi là các chất chống oxy hoá
(CCOXH)-antioxydant-enzym superoxyd dimutaza (SOD); glutathion
peroxydaza (GSH-PO); glutation (GSH)..

Mặc dù với nồng độ rất thấp nhưng do có tính oxy hoá mạnh các gốc tự
do dễ dàng tương tác với hầu hết các chất hữu cơ ở nơi sinh ra tạo ra các hợp
chất peroxyd. Qúa trình biến 1 phân tử hữu cơ (chủ yếu là các acid béo chưa
no) ở các tổ chức này thành peroxyd lipid được gọi là quá trình peroxỵ hoá.
Bình thường quá trình peroxy hoá chỉ xảy ra ở mức độ sinh lý nhất định
để tham gia điều hoà các hoạt động của tế bào và tổng hợp ra nhiều chất mới.
Lẽ đương nhiên lượng antioxydant trong cơ thể bình thường luôn đáp ứng đầy
đủ khả năng phân giải các DOXHĐ để cho cân bằng giữa các DOXHĐ và các
CCOXH luôn tồn tại ở mức sinh lý.
Vì một lý do nào đó, thường là do ảnh hưởng của các tác nhân gây bệnh
thì các DOXHĐ gia tăng, các CCOXH giảm kết quả là tạo ra trong cơ thể
nhiều gốc tự do của oxy dẫn đến tổn thữơng màng tế bào, do quá trình
peroxyd hoá lipid gia tăng làm nhiễm độc và huỷ hoại tế bào và xa hơn là dẫn
đến các quá trình bệnh lý khác ( lão hoá, viêm hoại tử, ung thư...). Trong các
trường hợp này người ta đã nghĩ đến việc đưa thêm các CCOXH từ ngoài vào,
thuộc loại này chúng ta đã biết đến vitamin c, vitamin E, các Aavonoid, các
thiol...
Gần đây nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã nghiên cứu
về khả năng chống oxy hoá của các cây thuốc và vị thuốc cổ truyền và thấy
rằng nhiều cây thuốc và vị thuốc dùng trong y học dân tộc có hoạt tính chống
oxy hoá cao. Phương pháp đo quang đã từng được áp dụng để xác định
HĐCOXH các chất tinh khiết, khi thực hiện đối với các dược liệu có màu
thường cho kết quả không ổn định (thậm chí có trường hợp còn ngược lại).

1


Nhằm góp phần nghiên cứu phương pháp và khả năng chống oxy hoá của các
cây thuốc và vị thuốc dùng trong y học dân tộc chúng tôi thực thực hiện đề tài:

“NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HOÁ CỦA
NHÂN TRAN {Adenosma caeruleum R.Br.) VÀ MỘT s ố
DƯỢC LIỆU KHÁC”

Nhằm mục đích:
• Xác định nhóm chất nào là hoạt chất chống oxy hoá trong cây nhân
trần
• Khảo nghiệm phương pháp đo quang và đo chỉ sô Iod của Tween 80
trong việc đánh giá HĐCOXH của dược liệu

2


II. TỔNG QUAN
2.1. Khái niệm về gốc tự do, sự hình thành các dạng oxy
hoạt động (DOXHĐ) và hệ thống các chất chống oxy hoá trong
cơ th ể [14,16].

2.1.1. Khái niệm về gốc tự do.
Gốc tự do là những tiểu phân hoá học ( nguyên tử, phân tử, ion.. ) có
điện tử không cặp đôi ở orbital hoá trị. Ví dụ: gốc metyl 'CH3, gốc hydro H,
gốc Cl\ gốc superoxyd 0 2 '
Đặc trưng của gốc tự do:
*Do có điện tử độc thân (tức là một tiểu phân mang điện, luôn chuyển
động), nên gốc tự do có mô men từ spin.
*Các gốc tự do có khả năng phản ứng cao

2.1.2 Sự hình thành của các dạng oxy hoạt động.
Oxy được hít thở theo đường hô hấp vào máu rồi tới tận các tế bào,
tham gia nhiều các phản ứng sinh hoá học cơ bản để duy trì sự sống. Những

phản ứng sinh hoá học quan trọng nhất có sự tham gia của oxy là một loạt các
phản ứng oxy hoá-khử liên tiếp nhau xảy ra ở chuỗi hô hấp tế bào. úng với
mỗi giai đoạn oxy nhận một điện tử, tạo ra một trạng thái gốc trung gian. Đầu
tiên oxy nhận một điện tử từ phân tử cytocrom, tạo ra gốc superoxyd (0 2')>
gốc superoxyd này nhanh chóng được các enzyme superoxyd dismutase
(SOD) phân huỷ, tạo ra hydroperoxyd (H20 2) theo phản ứng:
0 2• + 0 2 • + 2H+ SOD ►
H20 2 + 0 2
Ở những nấc tiếp theo là những tiểu phân trung gian như hydroperoxyd
(H20 2), gốc hydroxyl ('OH). Những tiểu phân này rất dễ nhường hoặc nhận
điện tử. Vì thế người ta gọi chúng là những tiểu phân có khả năng phản ứng
cao.
Một số ion kim loại chuyển tiếp: Fe2+,Cu2+ có thể xúc tác cho quá trình
tạo ra nhiều gốc hydroxyl trong phản ứng của c v với Ho02 (phản ứng Fenton)
0 2- + H20 2 —í—► OH + OH + '0 2
Các gốc ‘OH có khả năng phản ứng nhanh với các acid béo chưa no tạo
ra các hydroperoxyd lipid (LOOH). Sự phân huỷ các LOOH tiếp theo tạo ra
những gốc mới như : gốc alKoxyl (LO'), gốc peroxyl (LOO ). Những tiểu phân

3


gốc này cũng có tính oxy hoá mạnh, dễ dàng tương tác với các phân tử bên
cạnh tạo ra các phân tử mới.
Tất cả những tiểu phân chứa oxy có hoạt tính cao này ( 0 2 •, OH, H20 2,
LO', LOO'..) được gọi là các dạng oxy hoạt động (DOXHĐ).

2.1.3. Hệ thông các chất chống oxy hoá trong cơ thể:
Người ta cũng thấy cơ thể có những chất có khả năng phân huỷ, loại bỏ
các dạng oxy hoạt động này, chúng được gọi là những chất chống oxy hoá

(CCOXH) điển hình có trong cơ thể như:
* SOD: xúc tác cho phản ứng phân huỷ gốc 0 2''
0 2- + 0 2" + 2H+ S°D ►H A + 0 2
* Glutathionperoxydase (GSH-PO) xúc tác cho phản ứng phân huỷ Ho02
và LOOH
HOOH + 2GSH ------►GSSG + 2H20
LOOH + 2GSH ------►GSSG + LOH + H20
* Catalase: xúc tác cho phản ứng phân huỷ H20 2
2H20 2 -Ca_talase... ►2H2Q + 0 2
* Vitamin E: loại bỏ các gốc peroxyd lipid (LOO)
* Vitamin C: phân huỷ 0 2 ‘OH, H20 2
* Các protein giữ Fe2+, Cu2+ ở dạng phức chất (không cho Fe2+, Cu2+ ở
trạng thái tự do xúc tác cho phản ứng Fenton). Transíerin lactoíerin (phức hoá
Fe2+), ceruloplasmin (phức hoá Cu2+)..
Chính nhờ các chất chống oxy hoá này mà việc sản sinh ra các dạng
oxy hoạt động trong trao đổi bình thường để thực hiện các chức năng sinh lý
vẫn được duy trì cân bằng thích hợp. Vì một lý do nào đó, sự sản sinh ra các
dạng oxy hoạt động tăng lên, số lượng và hoạt tính các chất chống oxy hoá
trong cơ thể giảm xuống dẫn tới rối loạn quá trình trao đổi chất trong các tế
bào và dẫn tới quá trình bệnh lý.

2.2.Sự liên quan giữa gốc tự do với một số quá trình bệnh lý
[16].

2.2.1. Gốc tự do với một sô quá trình viêm.
Khi một tác nhân gây viêm ( vi khuẩn, dị vật..) từ ngoài xâm nhập vào
cơ thể thì các tế bào ở đó bị kích thích phát ra yếu tố hoá ứng động kéo bạch
cầu đến làm nhiệm vụ thực bào. Khi tiếp xúc với vi khuẩn hoặc dị vật bạch
cầu mọc ra các giả túc, bao lấy chúng. Khi màng bao quanh đã được khép kín,

4


ở bạch cầu có sự tăng đột ngột chuyển hoá tiêu thụ oxy để sinh ra 0 2 HọOọ,
'OH.. nhằm tiêu huỷ các tác nhân này. Để bảo vệ mình, bạch cầu cũng sinh ra
rất nhiều các chất chống oxy hoá như SOD, GSH, GSH-PO, Catalase. Song
vẫn có 10% bạch cẩu bị chết do chính DOXHĐ mà nó sinh ra. Khi bạch cầu
bị phân huỷ, các gốc tự do của oxy thoát ra ngoài, tấn công vào các tế bào
xung quanh gây tổn thương, làm cho sự đáp ứng kích thích của tế bào ở khu
vực đó càng xảy ra mạnh hơn. Các gốc tự do được giải phóng ra ngoại bào góp
phần tạo nên các hiện tượng sưng, nóng, đỏ, đau là biểu hiện của viêm.

2.2.2. Gốc tự do với các bệnh tim mạch.
Bệnh tim mạch thường là bệnh của người già. Bởi vì khi già thì các
DOXHĐ tăng, các CCOXH giảm. Chính sự chuyển dịch cân bằng các
DOXHĐ với các CCOXH này làm cho lượng các gốc tự do có nhiều khả năng
oxy hoá các hạt lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL).
Các hạt LDL bị oxy hoá không còn ở trạng thái tự nhiên, không còn vai
trò cung cấp cholesterol cho tế bào, trở thành chất lạ bị các đại thực bào hay
các bạch cầu thực bào. Khi nó trầm lắng xuống thành mạch, mỗi hạt LDL bị
oxy hoá, bị bạch cầu hay các đại thực bào ăn theo cơ chế sinh ra các gốc tự do
cứ lớn dần, phát triển thành đám tế bào bọt. Và từ đó các đám tế bào bọt phát
triển thành các mảng vữa xơ thành mạch. Thành mạch tích tụ nhiều tế bào bọt,
cứ phình to dần, làm hẹp dần lòng động mạch. Khi lòng động mạch bị thu hẹp
tới 70%-80% so với bình thường là lúc máu lưu thông tới các tổ chức không
đủ nhu cầu. Đặc biệt ở động mạch vành, khi đó bắt đầu xuất hiện những cơn
co thắt ngực và tiếp theo sẽ dẫn tới nhồi máu cơ tim.
Hiện tượng các mảng vữa xơ bong ra, lang thang theo dòng máu và có
thể bít một mao mạch nào đó trên đường di chuyển, gây ra tắc mạch, dẫn đến
nhũn não và các tai biến mạch máu não.

Quá trình nhồi máu, nhũn não., đều do máu không được cung cấp đủ
lượng máu so với nhu cầu. Thời gian máu không được cung cấp đủ lượng máu
theo yêu cầu gây ra tình trạng thiếu máu cục bộ (TMCB). Người ta thấy
TMCB có thể do tắc mạch hay chèn ép thành mạch gây ra. Hiện tượng này có
thể nhất thời, cũng có thể khá lâu. Khi dòng máu lưu thông lại được đưa tới thì
gọi là tưới máu trở lại (TMTL).
Người ta thấy rằng các gốc tự do của oxy tăng lên rất nhanh ngay trong
thời gian TMCB và đặc biệt tăng vọt lên ngay khi TMTL. Chính sự gia tăng
các gốc tự do khi TMCB & TMTL (hay xảy ra khi phẫu thuật, choáng, sốc..)

5


đã góp phần phá huỷ thành mạch, cơ tim và các tổ chức của cơ thể, làm cho
các triệu chứng bệnh tim mạch thêm nặng nề.

2.2.3. Gốc tự do với quá trình ung thư.
Ngày nay bản chất gốc tự do của các tác nhân ung thư đã dần sáng tỏ.
Mặc dù các tác nhân gây ung thư có bản chất hết sức khác nhau: có thể là các
tác nhân vật lý (tia phóng xạ, tia X..), có thể là do tác nhân hoá học (có hàng
nghìn chất hoá học có thể gây ung thư) và cũng có thể là tác nhân sinh học
(virus, ghép tế bào ung thư). Song nhìn chung tất cả các tác nhân này khi xâm
nhập vào cơ thể, bị chuyển hoá và kết cục đều dẫn đến hậu quả làm cho các
DOXHĐ gia tăng.
Sự gia tăng của các gốc tự do, điển hình là gốc 'OH , sẽ tạo ra điều kiện
cho các gốc này tấn công vào các AND, gây ra những tổn thương về cấu trúc.
Những tổn thương này không được sửa chữa, di truyền lại tức là đột biến xuất
hiện. Làm cho tế bào bình thường phát triển dần thành bất thường. Các tế bào
bất thường phát triển mạnh thành u lành và cuối cùng thành u ác tính với các
biểu hiện ung thư lâm sàng.

2.3. Các phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hoá. [13]
Tốc độ của quá trình POL nói chung quan hệ đồng biến với các sản
phẩm hình thành ở từng giai đoạn của quá trình POL tạo ra như:
- Lượng các dien liên hợp.
- Lượng các gốc tự do (L\ LO', LOO ..)
- Các sản phẩm (như MDA: malonyldialdehyd) có khả năng phản ứng
với acid thiobarbituric
- Các khí etan, pentan giải phóng ra.
Như vậy đo các sản phẩm này người ta có thể đánh giá được quá trình
POL, từ đó có thể tính được HĐCOXH. Có thể nêu một sô phương pháp sau
đây:

2.3.1. Phương pháp S.G.BIagodorop.
a.
Phương pháp đo HĐCOXH trên invitro [22].
Trong phương pháp invitro việc chọn cơ chất rất quan trọng, người ta
đã chọn các cơ chất như |3-caroten, acid oleic, cumen,.. làm cơ chất oxy hoá.
Dựa vào sự mất màu khi thêm chất COXH để làm căn cứ đánh giá HĐCOXH
của chất đem thử. Blagodorop và cộng sự đã sử dụng Tween 80 làm cơ chất

6


oxy hoá, cùng với sự có mặt của muối sắt II, acid ascorbic và không khí để
tiến hành phản ứng. Phương pháp này được áp dụng với nguyên tắc:
Tiến hành peroxỵ hoá acid béo chưa no ở một nhiệt độ nhất định. Sau
một khoảng thời gian phản ứng tạo ra MDA (malonyl dialdehyd). MDA phản
ứng với acid thiobarbituric tạo ra phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng
Ằ=532 nm. Đo cường độ màu biết lượng MDA trong mẫu đo. Mẫu thử có

CCOXH thì MDA thấp hơn mẫu đối chứng (không có chất chống oxy hoá).
Hoạt độ chống oxy hoá được biểu thị bằng giá trị phần trăm MDA bị
ức chế ở mẫu thử so với mẫu đối chứng.
Ở Việt Nam phương pháp này được áp dụng rộng rãi. GS. Đàm Trung
Bảo và TS. Nguyễn Quang Thường cùng một số tác giả đã đo HĐCOXH của
một số thuốc chống viêm, thuốc bảo vệ gan, thuốc chống lão hoá..
Nhưng khi áp dụng phương pháp này làm thực nghiệm trên nhiều loại
dược liệu khác nhau, tác giả đã nhận thấy
Màu của các mẫu thử là màu vàng đậm đến màu vàng nhạt không có
màu hồng như mẫu đối chứng (màu của phức tạo ra do phản ứng giữa MDA
với acid thiobarbituric).
Khi đo quang thấy mật độ quang của mẫu chứng thấp hơn nhiều so với
mẫu thử, mà theo lý thuyết phải cao hơn.
Như vậy ở dung dịch thử có thể có nhiều chất phản ứng được với acid
thiobarbituric ngoài MDA, và cũng có thể các chất đó tương tác với các chất
trong thành phần hỗn họp ủ. Vì thế màu tạo ra không đồng nhất với màu của
phức giữa MDA với acid thiobarbituric.

b. Phương pháp đo HĐCOXH invivo[17].
Chuột nhắt có trọng lượng 18-22g, loài swiss được nuôi trong cùng
điều kiện. Gây hoại tử viêm gan bằng cách tiêm CC14 10% trong dầu thực vật.
Đồng thời cho uống thuốc thử. Toàn bộ chuột được cách ly hoàn toàn với thức
ăn. Sau 14 giờ giết chuột thật nhanh, lấy gan rửa sạch máu bằng nước muối
sinh lý. Cân chính xác 100 mg gan, làm homogenat. Sau đó thêm 5 ml dung
dịch đệm tris pH=7,4 nghiền kỹ. ủ hỗn hợp trên ở 37°c trong 15 phút, sau đó
thêm vào lml acid trichloacetic 30%, lắc kỹ, ly tâm 4000 v/ph . Lấy 2ml dịch
sau ly tâm thêm vào đó 2 ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25%. Lắc kỹ, đun
ở nhiệt độ 100°c trong 15 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng, đo quang ở
bước sóng Ằ=532nm. Từ đó tính ra hàm lượng MDA.

7


2.3.2. Phương pháp xác định HĐCOXH bằng xác định chỉ
số Iod[7].
Nguyên tắc của phương pháp:
Tiến hành peroxy hoá Tween 80 ở một nhiệt độ và thời gian nhất định
(thí nghiệm được tiến hành trong các lọ màu nâu), acid oleic trong Tween 80
bị cắt giảm dây nối đôi, vì vậy chỉ số Iod của acid oleic bị giảm. Ta xác định
chỉ số Iod của Tween 80 sau phản ứng peroxy hoá khi ủ dịch chiết thuốc và
không có dịch chiết thuốc.
Nếu mẫu thử ( mẫu có dịch chiết thuốc) có CCOXH thì chỉ số Iod bị
giảm ít hơn mẫu chứng (không có dịch chiết thuốc).

2.3.3. Phương pháp sàng lọc (Screening test) [6,18]
Để phát hiện CCOXH trong thực vật, một số tác giả đã xây dựng
phương pháp sàng lọc-Screening test, thực chất đó là phương pháp sắc ký lớp
mỏng với quy trình như sau:
- Cho 2 gam nguyên liệu vào lọ penicillin, thêm đầy cồn 90°( khoảng 6
ml), nút kín. Để 2 tuần trong bóng tối. Rút 0,02ml dịch chiết chấm lên bảng
sắc ký siluíol đã rửa sạch bằng cồn 96° và sấy ở 150°c. Tuỳ theo thành phần
của hỗn hợp cần phân tích mà dung mô triển khai có thể là một trong các hệ
sau.
- Toluen-aceton
(95:5)
- Benzen-methanol
(4:1)
- Benzen-methanol-aceton
(4:1:5)
- Butanol-acid acetic-nước

(4:1:5)
Sau khi dung môi chạy được 100 mm, sấy nhanh bản sắc ký sau đó
phun lên bản mỏng dung dịch linetol (acid béo của dầu “lanh”), thành phần
chính của linetol gồm các este của acid oleic, linoleic, linoic, ủ 20 đến 25 phút
ở nhiệt độ 60°-70°C và sau đó hiện màu bắng các thuốc thử sau:
- 30 ml hỗn hơp etanol-acid acetic-cloroíòrm (5:3:2) thêm 1 ml Natri
Iodid bão hoà trong nước. Các bản sắc ký được phun thuốc thử thì lập tức có
màu nâu của iod được giải phóng ra dưới tác dụng của peroxyd. Khi sử dụng
các lốfp mỏng “suluíol” có chứa tinh bột dính màu sẽ dần dần thành màu nâu
tối và trên nền của nó hiện rõ những vết trắng hoặc kem ở những chỗ có
CCOXH. Khi sử dụng các chất hấp phụ khác thì cần phải phun thêm dung
dịch tinh bột 1%.

8


- Dung dịch N, N’ -dimetyl - n phenyldiamin trong hexan (0,3%). Khi
phun dung dịch này lên bản sắc ký đã được ủ với linetol thì xuất hiện màu nâu
hồng, trên nền đó hiện lên vết sáng ở những chỗ có CCOXH (màu không bền
vì vậy phải dùng giấy can để vẽ lại vị trí các vết ngay).
- Sau khi chạy sắc ký xong, sấy nhanh và phun dung dịch P-caroten 0,1%
trong cồn hoặc hexan. Đặt các bản sắc ký vào tủ ấm 60°-70°C hoặc cho tác
dụng tia tử ngoại thì nền bản mỏng sẽ bị mất màu, ngoài những điểm có các
CCOXH các vết vàng nhạt còn lại có thể được làm rõ hơn bằng cách phun
dung dịch (l%-3%) S bơ 3 trong chloroíorm. Kết quả rõ hơn khi hiện màu
bằng dung dịch có chứa (3-caroten và linetol (0,1% và 3%) do sự phân huỷ Ị3caroten sẽ nhanh hơn dưới ảnh hưởng của các sản phẩm peroxyd của linetol.
- Thuốc thử Emery-Angel: là thuốc thử dùng trong các phương pháp đo
màu để định lượng tocoferol cũng có thể dùng để phát hiện CCOXH. Khi
phun hỗn hợp F e ơ 3 0,2% trong cồn và a .a dipiridin 0,5% trong cồn (cùng thể
tích) thì các vết CCOXH sẽ có màu đỏ và dễ dàng phát hiện trên nền màu

trắng nhạt
Các phương pháp Screening test đã được vận dụng ở nước ta như sau [6]
- Lớp mỏng tráng bằng Silicagen G trên phiến kính 7,5 X 2,5 cm, hoạt
hoá ở 120° c trong 2 giờ.
- Dịch chiết để chấm sắc ký là nước sắc các vị thuốc đông dược.
- Hệ dung môi: Butanol - acid acetic - nước (4:1:5).
- Dung dịch phun: Dầu gấc tinh chế qua cột oxyd nhôm, lấy đoạn Ị3caroten (là chất có màu và dễ bị oxy hoá mất màu ).
- Mỗi mẫu dịch chiết khi nào cũng chấm đổng thời 2 bản sắc ký. Sau khi
triển khai xong, để khô dung môi, một bản được phun dung dịch dầu gấc tinh
chế, bản kia không phun. Để cả hai bản mỏng vào tủ sấy 60°-70°C trong 30
phút. Toàn bộ nền bản mỏng có phun dầu gấc lúc đầu có màu vàng, sau khi
sấy màu vàng mất đi (do ị3-caroten bị peroxy hoá) nếu trên nền trắng còn lại
một hoặc nhiều chất màu vàng thì chứng tỏ trong nước chiết thuốc có
CCOXH, nếu không tạm coi không có. Nếu bản mỏng không phun dầu gấc
không có vết màu vàng nào của dịch chiết tự nhiên thì việc xét kết quả có
phần đơn giản, còn nếu trên bản mỏng đó có vết mầu vàng ( mầu của hợp chất
tự nhiên trong thuốc) thì việc phân tích kết quả phải thận trọng, thí nghiệm
phải lặp lại nhiều lần để đối chiếu.

9


Đối với phương pháp này kết quả chỉ mang tính chất phát hiện hay
định tính, không có ý nghĩa đánh giá về mặt định lượng.
* Ngoài ra người ta còn dùng một số phương pháp khác như phương
pháp xác định HĐCOXH bằng cách đo các dien liên hợp, phương pháp phát
hiện gốc tự do tạo ra trong quá trình POL, phương pháp đo pentan và etan
[13].

2.4.

Sơ lược về tình hình nghiên cứu về CCOXH trong thuốc
đông dược và tân dược.
2.4.1. Chất chống oxy hoá trong thuốc tân dược.
a. Thuốc chống viêm[l].
Người ta đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng của thuốc chống
viêm kinh điển với các DOXHĐ invivo thì thấy rằng có thể xếp thuốc này
thành 3 nhóm.
Nhóm 1: Những chất có tác dụng làm giảm các gốc CV', ‘OH, H20 2: gồm
có: Aspirin, Indometacin, Isobuprofen..
Nhóm 2: Thuốc làm giảm OH ít, nhưng làm giảm mạnh 0 2 H20 2 gồm
có Hydrocotison, 2-3 dihydroxybenzoic..
Nhóm 3: Thuốc làm giảm OH ở nồng độ 10'4-10'6 có Phenylbutazon.

b. Thuốc tim mạch.
* LESCOL
-Thành phần: Fuvastatin.
-Tác dụng: Giảm đáng kể LDL-cholesterol (LDL-C), tăng HDL-C, giảm
tỷ lệ LDL-C/HDL-C và triglycerid.
-Chỉ định: Điều trị chứng cholesterol máu cao ở bệnh nhân không đáp
ứng với chế độ ăn kiêng.
*PROBUCOL[ 2]
-Biệt dược: Lurselle (Pháp), Lorelco (Mỹ)
-Tác dụng: Probucol có thể làm hạ lượng cholesterol từ 10-20%, trong đó
giảm cả cholesterol-LDL và cholesterol-HDL. Gần đây Probucol được chú ý
về tính chất chống oxy hoá của nó có khả năng làm chậm sự tiến triển của vữa
xơ động mạch nhờ ngăn cản quá trình oxy hoá các hạt LDL.
* MILURIT.
-Thành phần: 100-300 mg Allopurinol.

10

-Tác dụng: Allopurinol và chất chuyển hoá chính của nó là oxypurinol là
những chất ức chế mạnh men oxy hoá xanthine (XO).
Như ta biết, khi tưới máu trở lại trong chuyển hoá cơ tim:
Xanthin
xo ► Xanthine dạng oxy hoá + ’0 2
Phản ứng này sinh ra '0 2 rất nguy hiểm. Để ngăn chặn phản ứng này
không xảy ra thì allopurinol và oxypurinol ức chế mạnh men x o , giảm đáng
kể diện tích tim bị tổn thương. Nhờ vậy dùng allopurinol trong nhồi máu cơ
tim trước khi tưới máu trở lại rất có hiệu quả.
Ngoài ra còn có một số thuốc như: VASTAREL (trimetazidine), AMOR
(amlodipine), ADALAT (niíedipin).

c. Thuốc chống lão hoá.
TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Tên thuốc
L-cystin
Saylom
Belaf

Celium
Protecton
Oyster
Plenyl
Venomin
Eisen
10 Các hormon

Thành phần
Acid amin chứa SH, S-S
Vitamin E,C,A+Selen trong nấm men
Vitamin E ,C ,A + S elen trong nấm men..
Selen trong vi nấm men+ Vitamin E
Selen trong vi nấm men+ Vitamin E
Selen + thảo dược
Polyvitamin+Selen
Dầu tỏi, VitaminA, B, E, Allicin
Cao tỏi, Vitamin E, B2 Ỵ-orzanol
Metalonin, Dehydroepiandrosteron
Ostrogen/cho phụ nữ

2.4.2. Chất chống oxy hoá trong

Hãng sản xuất
Nam Triều Tiên
Nam Triều Tiên
Nam Triều Tiên
Pháp
Tây Đức
Trung Quốc

UPSA Pháp
Nam Triều Tiên
Nam Triều Tiên
Mỹ

dược liệu.

Trong thiên nhiên có rất nhiều nguyên liệu chứa CCOXH như:
• Vitamin E
Vitamin E có nhiều trong đậu xanh, cà rốt, xà lách, dầu thực vật., và
trong mầm ngũ cốc. Tác dụng chính của vitamin E là chống oxy hoá. Thiếu
vitamin E xảy ra quá trình oxy hoá mạnh các lipid đưa đến tổn thương các tổ
chức. Vitamin E có vai trò ức chế phản ứng oxy hoá lipid và bảo vệ vitamin A,
caroten khỏi bị oxy hoá. Nó còn có tác dụng ngăn ngừa trạng thái già nua, kéo
dài tuổi thọ của con người, vì sản phẩm của sự peroxy hoá là chất độc đối với
tế bào.
• Vitamin p

11


Vitamin p có trong nước trái cây, đặc biệt là chi Citras (chanh, cam..),
trong lá chè xanh, hoa hoè.. nó tồn tại dưới dạng glycosid. Vitamin p cũng là
một CCOXH, bằng tác dụng chống oxy hoá của mình vitamin p bảo vệ hoạt
tính của vitamin c trong rau quả. Ngày nay người ta đã tìm ra một số chất
thuộc chất màu flavon, nên tất cả chúng được gọi chung flavonoid có hoạt tính
vitamin p như: catechin trong lá chè, antoxyan trong nho..[6]
• Các Flavonoid
Hoạt tính chống oxy hoá của Aavonoid cũng được nghiên cứu khá nhiều.
Rất nhiều Aavonoid có tác dụng chống oxy hoá như: Aavonoid trong hoa hoè,

Aavonoid trong cây cỏ phúc thọ (Adonis vemalis )..
Do cấu trúc hoá học khác nhau nên việc hướng tính chất chống oxy hoá
của các Flavonoid cũng khác nhau. Flavonoid trong hoa hoè có tác dụng
chống oxy hoá trong huyết thanh, bảo vệ thành mạch. Flavonoid trong cỏ linh
lăng, cỏ ba lá đỏ, cây su si lại có tác dụng hướng gan..
• Các Steroid
Kinchia đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của một số steroid:
Glucosid của hecogenin, diosgenin, sarsasapogenin, neotigogenin, các đổng
đẳng íurostan của chúng trong một số cây thuộc chi: Agave, Digitalis,
Solanum. Tác giả đã xử lý kết quả bằng phương pháp thống kê và cho thấy tất
cả các glycosid thí nghiêm đều có hoạt tính chống oxy hoá ở mức độ khác
nhau [23].
• Các chất khác
- Từ lá cây Rosmarinus officinalis người ta đã tách được các polyphenol
đa vòng chống oxy hoá [21]
- Các polyphenol được chiết từ dịch chiết lá chè xanh có tác dụng làm
tăng hoạt tính chống oxy hoá của các enzym có tác dụng chống oxy hoá [12]
- Các curcuminoid chiết từ thân rễ của một số loài thuộc họ
Zingiberaceae có hoạt tính chống oxy hoá khá mạnh.[19]
• Khi nghiên cứu CCOXH ở nhiều họ thực vật khác nhau Macximôp
[24] đã thu được kết quả:
Thực vật thuộc các họ Papaveraceae, Crassulaceae, Rosaceae,
Euphorbiaceae có nhiều CCOXH. Đặc biệt 4 loài đã được nghiên cứu thuộc họ
Pyrolaceae có rất nhiều CCOXH.

12


* Khi nghiên cứu mối liên quan giữa CCOXH và tính năng của thuốc
đông dược trên cơ sở phương pháp Screening test cải tiến với 52 vị thuốc, tác

giả đã rút ra kết luận:
- Trong số 52 vị thuốc đã được khảo sát có 36 vị có và 16 vị không có vết
CCOXH và đa số các CCOXH là các chất phân cực mạnh (theo giá trị Rf trên
sắc ký lớp mỏng).[6]
- Nếu so sánh hai nhóm thuốc lớn dương dược và âm dược thì số liệu
thực nghiệm cho thấy các thuốc âm dược thường có CCOXH hơn là thuốc
dương dược: 3/5 vị thuốc bổ huyết, 16/19 vị thuốc thanh nhiệt, 3/5 vị thuốc tân
lương giải biểu, 1/1 vị thuốc bổ âm có CCOXH, trong lúc đó chỉ có 1/3 vị
thuốc bổ dương, 0/2 vị thuốc tân ôn giải biểu và 4/8 vị thuốc bổ khí có
CCOXH. Đặc biệt các vị thuốc thanh nhiệt giải độc cho những vết CCOXH rõ
hơn nhiều so với các vị thuốc khác, kế đến là các vị thanh nhiệt lương huyết.
Ngoài ra với mục đích so sánh sự khác nhau về chất và lượng CCOXH
trong những vị thuốc cùng nguồn gốc mà khác nhau về mức độ âm, dương,
hàn, nhiệt, tác giả đã khảo sát từng cặp vị thuốc và đi đến kết luận:
Sự thay đổi về chất và lượng CCOXH trong một số vị thuốc trong quá
trình chế biến thuận chiều với sự thay đổi tính dương hoặc âm của vị thuốc đó:
lượng và chất của CCOXH trong thục địa (vị thuốc dương trong âm) giảm đi
so với sinh địa (âm dược) , Hà thủ ô chế so với Hà thủ ô sống, Hương phụ chê
so với Hương phụ sống, Hắc táo nhân so với táo nhân sống đều có chất và
lượng CCOXH tăng lên.
Một sô vị thuốc khi chế biến thường bỏ lõi (mẫu đơn bì, địa cốt bì,
mạch môn), nói chung trong lõi chất và lượng CCOXH ít hơn trong vỏ hoặc
không có.[6]
* Lục vị hoàn là phương thuốc cổ truyền gồm 6 vị thuốc: Thục địa, Hoài
sơn, Bạch linh, Đơn bì, Trạch tả, Sơn thù kết hợp hài hoà với nhau, có tác
dụng bổ can thận âm. Khảo sát CCOXH trong hoàn lục vị để từ đó tìm kiếm
khả năng đưa những đặc điểm về chất và lượng CCOXH vào tiêu chuẩn của
phương pháp này, tác giả đã rút ra nhận xét:
■ Khảo sát CCOXH trong 6 vị dược liệu riêng rẽ thì thấy trừ Bạch linh
ngoài ra các vị thuốc khác đều có CCOXH.

■ Trong 6 loại hoàn lục vị được khảo sát thì có 5 loại có 3 vết CCOXH
và 1 loại có 2 vết CCOXH.

13


■
Đa số các vết CCOXH trong các loại hoàn đều là chất phân cực mạnh
(Rf<0,2 với hệ n-Butanol-acid acetic-nước 4:1:5)
Các vị thuốc âm dược (bổ âm, bổ huyết, thanh nhiệt, tân lương giải biểu ..)
là những vị thuốc giúp cơ thể lập lại cân bằng trong trường hợp dương thịnh,
nhiệt thịnh. Quá trình oxy hoá bình thường là quá trình tạo ra năng lượng cần
thiết cho cơ thể, nhưng nếu quá trình đó mạnh hơn bình thường thì sẽ phá huỷ
một cách không cần thiết chất dự trữ của cơ thể và tạo ra năng lượng (nhiệt
lượng ) thừa . Phải chăng quá trình oxy hoá mạnh và hiện tượng dương thịnh,
nhiệt thịnh theo y học cổ truyền là một. Do vậy sự có mặt phổ biến các
CCOXH trong thuốc âm dược là có cơ sở khoa học.
•
Những năm gần đây một số nhà nghiên cứu đã chú ý đến khả năng
chống oxy hoá của nhân trần ( Adenosma caeruleum R.Br. họ Hoa mõm chó
Scrophulariaceae) là một vị thuốc vị đắng, tính bình, hơi hàn quy kinh bàng
quang. Có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp dùng để chữa thân thể nóng, da vàng,
tiểu tiện không tốt. Trong nhân dân, nhân trần dùng cho phụ nữ sau khi sinh
nở để giúp cho ăn ngon, chóng hồi phục cơ thể. Còn dùng làm thuốc chữa sốt,
ra mồ hôi, thông tiểu tiện, chữa bệnh vàng da, bệnh gan[ll]. Do mùi thơm
mát, vị ít đắng, có tác dụng thanh nhiệt nên nhân trần được sử dụng làm chè
uống hàng ngày. Chè nhân trần gồm: Nhân trần (A . caeruleum), thảo quyết
minh ( Cassia tura L.), Cam thảo (Glyeirrhiĩa uralensis).
Ngoài những tác dụng và công dụng cổ truyền, gần đây nhân trần được
các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến hoạt tính chống oxy hoá, bảo vệ tế

bào gan dưới dạng hỗn hợp dịch chiết nước của nhân trần và tảo[10].

2.5. Những kết quả đã nghiên cứu về thành phần hoá học
của cây nhân trần (Adenosma caeruleum).
Theo một số tài liệu[ 11,15] trong nhân trần có saponin tritecpic, Aavon,
acid nhân thơm, cumarin, tinh dầu. Tinh dầu có 1% trong cây, thành phẩn
gồm có: paraxymen, limonen, a-pinen, cineol, 1 sesquitecpen oxyd C]5H240
và 1 sesquitecpen C]5H24

14


III. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên liệu:
Nguyên liệu nghiên cứu là 7 dược liệu:
• Hoè:
Là hoa chưa nở phơi hay sấy khô của cây hoè: Sophora ìaponica L.,
thuộc họ Đậu Fabaceae.
• Kim ngân:
Là hoa phơi hay sấy khô của cây Kim ngân: Lonicera sp.,thuộc họ kim
ngân Capripoliaceae.
• Mạch môn:
Là rễ củ phơi hay sấy khô của cây mạch môn: Ophiopogon
ịaponỉcus Wall., thuộc họ Hành Liliaceae.
• Tam thất:
Là củ phơi khô của cây tam thất: Panax pseudo-ginseng Waỉl., thuộc họ
Ngũ gia bì Araliaceae.
• Hoàng cầm:
Là thân rễ phơi hay sấy khô của cây hoàng cầm: Scutellaria baicalensis

Georg., thuộc họ Hoa môi Lamiaceae.
• Sinh địa:
Là rễ củ phơi hay sấy khô của cây sinh địa: Rehmannia glutinosa
Libosch., thuộc họ Hoa mõm chó Scrophulariaceae.
• Nhân trần:
Là bộ phận trên mặt đất đã phơi hay sấy khô của cây nhân trần:
Adenosma caeruleum R.Br, thuộc họ Hoa mõm chó Scrophulariaceae.
Những nguyên liệu trên đây mua tại các cơ sở buôn bán dược liệu, đối
chiếu theo tiêu chuẩn DĐVN I, tập 2. [8]

3.2. Phương pháp nghiên cứu:
3.2.1.
Xác định hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp
Blagodorop [22].

15


Nguyên tắc của phương pháp:
Tiến hành peroxy hoá acid béo chưa no (Tween80) ở một nhiệt độ nhất
định. Sau một khoảng thời gian, phản ứng tạo ra MDA(malonyl dialdehyd).
MDA phản ứng với acid thiobarbituric tạo ra họp chất màu hồng. Đo cường độ
màu biết lượng MDA nhiều hay ít, mẫu thử có chất chống oxy hoá thì lượng
MDA thấp hơn so với mẫu đối chứng không có chất chống oxy hoá.
Hoạt độ chống oxy hoá biểu diễn bằng giá trị phần trăm(%) MDA bị ức
chế ở mẫu thử so với mẫu đối chứng.

3.2.2. Xác định hoạt độ chống oxy hoá bằng phương pháp
xác định chỉ sô Iod [7].
Nguyên tắc của phương pháp:

Tiến hành peroxy hoá Tween 80 ở nhiệt độ và thời gian nhất định. Xác
định chỉ số Iod của Tvveen 80 sau phản ứng peroxy hoá khi ủ với dịch chiết
thuốc và không có dịch chiết thuốc. Nếu mẫu thử với dịch chiết thuốc có
CCOXH thì chỉ sổ Iod giảm ít hơn mẫu chứng không có dịch chiết thuốc

3.2.3. Phương pháp Screening test [6,18].
Nguyên tắc của phương pháp:
Hỗn hợp carotenoid trong dầu gấc khi phun lên bản mỏng sắc ký hoặc
giấy sắc ký, nếu không có chất chống oxy hoá màu vàng sẽ bị mất khi để
ngoài không khí 6-12 giờ do bị oxy hoá. Dựa vào đó, ta chỉ việc chấm dịch
chiết dược liệu lên bản sắc ký và khai triển với hệ dung môi thích hợp, sau đó
để khô dung môi và phun dung dịch dầu gấc lên, để 6-12 giờ nếu trên nền bản
sắc ký có một hoặc nhiều vết màu vàng chứng tỏ có chất chống oxy hoá, nếu
không có màu vàng coi như không có chất chống oxy hoá. Song song làm một
bản sắc ký không phun dầu gấc làm đối chứng.
Nếu các vết chất tự nhiên ở bản chứng không có màu vàng thì việc xét
kết quả đơn giản, nếu có màu vàng thì thí nghiệm cần lặp lại nhiều lần để
đánh giá chính xác.
3.2.4. Sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng Silicagel 60 F954, MERCK; sắc ký
cột với chất hấp phụ là cellulose, sắc ký giấy trên giấy Whatman N°2; Các hệ
dung môi: Ethanol-nước với các tỷ lệ khác nhau; Acid acetic - nước (15 : 85)
(hệ I); n-buthanol - acid acetic - nước ( 4 : 1 : 5) (hệ II); acid acetic - nước (
60 : 40) (hệ III); ethylacetat bão hoà nước (hệ IV); Các thuốc thử: Hơi
amoniac, dung dịch FeCl3 3%/ethanol...

16


IV.THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
4.1. Khảo sát hoạt độ chống oxy hoá của nước sắc của các

dược liệu nghiên cứu:
4.1.1. Xác định hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp
đo quang:
• Chuẩn bị dịch chiết:
Cân chính xác lg dược liệu cho vào bình nón 50 ml thêm 15 ml nước,
đun sôi 20 phút. Sau đó lọc lấy dịch chiết, thêm nước vừa đủ 10 ml. Dịch chiết
thu được tiến hành thí nghiệm sau:
• Tiến hành:
Trong những lọ mầu nâu, nút kín, cùng loại cho hỗn hợp phản ứng gồm:
- 2ml Tween 80 1%
- 0,2 ml dung dịch FeS04 10'3M
- 0,2 ml dung dịch acid ascorbic 10'2M
- 0,6 ml dịch chiết thuốc(mẫu đối chứng thay bằng 0,6 ml nước cất)
Đậy nút kín, lắc kỹ, ủ nhiệt độ 40°c trong 48 giờ. Lấy 2 ml hỗn hợp sau
khi ủ, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid tricloracetic 30%. Để yên 1 giờ. Ly
tâm 5 phút với tốc độ 4200 vòng/phút. Lấy 2 ml dịch trong sau ly tâm, thêm 2
ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25%. Đun cách thuỷ 100°c trong 15 phút,
để nguội đến nhiệt độ phòng. Đo mầu của phức tạo thành ở bước sóng
Ầ=532nm.Tính lượng MDA với hệ số tắt mol 8=l,56.105M'1c m 1.
Nếu trong mẫu thử có CCOXH thì lượng MDA tạo thànhphải ít hơn mẫu
chứng, tức mật độ quang của mẫu thử phải thấp hơn mẫu chứng. Kết quả thực
nghiệm được nêu ra ở bảng 1.

iẹ i ị í

17


Bảng 1: Kết quả đo hoạt độ chống oxy hoá của các vị thuốc với
dịch chiết nước 1H0

N°

MDA.10_5M của các mẫu thử sau phản ứng

Nhân
trần
1
0,095
2
0,090
0,092
3
4
0,096
5
0,093
0,092
6
Giá trị 0,093
thực
±
0,003
Hđ%
41,50

Hoè
0,046
0,044
0,055
0,048

0,044
0,055
0,047
+
0,005
70,44

Kim
ngân
0,081
0,082
0,080
0,081
0,082
0,082
0,081
±
0,001
48,84

Mạch
môn
0,235
0,219
0,288
0,227
0,228
0,228
0,228
±

0,006
-

Tam
thất
0,131
0,137
0,139
0,136
0,136
0,137
0,136
±
0,003
14,46

Hoàng
cầm
0,051
0,081
0,070
0,067
0,070
0,067
0,068
±
0,011
57,44

Sinh

đia
0,391
0,327
0,339
0,352
0,390
0,327
0,354
+
0,034
-

Chứng
0,165
0,152
0,156
0,158
0,156
0,165
0,158
+
0,006
0

HĐCOXH = D ' Dt xioo
Dc
♦ Công thức tính Hđ% (HĐCOXH):
Dc: Mật độ đo quang của mẫu chứng.
Dt: Mật độ đo quang của mẫu thử.
♦ Giá trị thực được tính theo công thức:

..
|J — X _ ta

s
ị—

vn
Trong đó:
|0,: Giá trị thực.
x: Giá tĩị trung bình
Với a= 0,95.
ta: Là một hệ số phụ thuộc vào số bậc tự do k=n-l và phụ thuộc vào độ
kỳ vọng a
S: Đô lêch chuẩn:


n: Số lần lặp lại thí nghiệm .
♦ Nhận xét:
-Tất cả các vị thuốc trừ sinh địa và mạch môn đều có tác dụng chống
oxy hoá
Đối với sinh địa và mạch môn lượng MDA ở mẫu thử lớn hơn mẫu
chứng và màu tạo ra sau phản ứng không giống mầu hồng của mẫu chứng
Như vậy đối với những vị thuốc mà dịch chiết có màu hoặc chứa các chất
sau phản ứng tạo ra các sản phẩm có mầu có bước sóng hấp thụ cực đại trùng
với bước sóng hấp thu cực đại của phức tạo mầu giữa acid thiobarbituric và
MDA ( x=532 nm) thì chưa thể xác định hoạt độ chống oxy hoá theo phương
S.G.Blagodorop.

4.1.2.

Xác định hoạt độ chống oxy hoá bằng phương pháp
xác định chỉ sô Iod
♦ Tiến hành thí nghiệm:
♦ Chuẩn bị dịch chiết
Cân mỗi mẫu 1 gam dược liệu cho vào bình nón 50 ml. Thêm 15 ml
nước, đun sôi 20 phút, lọc lấy dịch chiết và thêm nước vừa đủ 10 ml, thu được
dịch chiết 1/10.
♦ Tiến hành thí nghiệm:
Trong các lọ kín màu nâu cùng loại, cho vào đó hỗn hợp gồm:
- Mẫu thử :
15 ml Tween 80 1%
1 ml FeS04 10'3 M
1 ml acid Ascorbic 10'2 M
2 ml dịch chiết thuốc 1/10
- Mẫu chứng: Giống mẫu thử nhưng thay 2 ml dịch chiết thuốc
1/10 bằng 2ml nước cất
- Mẫu trắng của mẫu thử:
15 ml nước cất
1 ml FeS04 10'3 M
1 ml acid Ascorbic 10'2 M
2 ml dịch chiết thuốc 1/10

19


Mẫu trắng của mẫu chứng: Giống như mẫu trắng của mẫu thử nhưng
thay 2 ml dịch chiết thuốc 1/10 bằng 2 ml nước cất.
Đậy nắp kín, lắc kỹ, ủ ở 40°c trong 48 giờ, sau đó xác định chỉ số Iod
của các mẫu theo DĐVN II tập 3 [9]. Cách tiến hành như sau:
Hỗn hợp sau khi ủ cho vào bình nón khô, nút mài, dung tích 25CM-300 ml,

hoà tan trong 3 ml ether mê, thêm chính xác 25 ml Iod Clorid 0,2 N và lắc
trong 1 phút. Để yên 30 phút ở chỗ tối.
Tiếp tục thêm lần lượt 10 ml dung dịch KI 10% và 50 ml nước cất. Chuẩn
độ bằng Natri thiosulfat 0,1 N đến khi dung dịch có mầu vàng nhạt. Thêm hồ
tinh bột (CT) và 2-Ỉ-3 ml chloroform (TT). Chuẩn độ tiếp đến hết màu chỉ thị.
Chỉ số Iod được xác định bằng công thức sau:
Trong đó:
l,2 6 9 (a-b )
c
I: Chỉ số iod.
a: Số ml Natri thiosulfat của mẫu trắng tương ứng với mẫu thử hoặc
mẫu chứng.
b: Số ml Natri thiosulíat của mẫu thử hoặc mẫu chứng.
c: Số gam Tween 80 cần xác định chỉ số iod
*l*Kết quả thực nghiệm ở bảng 2
Bảng 2: Chỉ sốỉod của Tween 80 trong các mẫu thử
N°
1
2
3
4
5
6
Giá trị
thực
Hđ%

CSI ban
đầu của Nhân
Tween

trần
80
29,61
20,30
29,61
21,99
28,76 20,30
29,61
19,45
27,67
20,30
29,61
21,99
29.15
20,72
±0,92 ±1,19
56,17

Chỉ sô Iod của Tween 80 trong các mẫu thử
Hoè

Kim
ngân

Mạch
môn

Tam
thất

Hoàng
cầm

Sinh
địa

Chứng

17,80
18,61
18,61
17,76
19,45
19,45
18,61
±0,86
45,21

16,92
16,92
16,92
17,76
16,92
17,76
17,02
± 0,5
37,86

12,69
12,69

13,53
14,38
13,53
12,69
13.25
±0,79
17,33

16,92
15,22
16,07
16,07
16,07
15,22
15,93
±0,74
31,24

14,38
15,22
15,22
14,38
15,22
16,07
15,08
±0,73
26,84

16,07
16,07

16,07
16,92
16,92
16,07
16,35
±0,50
33,45

10,99
9,03
10,99
9,03
8,46
10,99
9,96
±1,37

20