Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men SACCHAROMY CEREVISIAE, ứng dụng lên men vang táo mèo

Lời cảm ơn
Nghiên cứu khoa học là một công việc cần thiết của thế hệ trẻ, đặc biệt với
mỗi sinh viên. Để đạt được mục đích và hoàn thành nội dung của đề tài không
thể tự bản thân mỗi sinh viên thực hiện, mà cần có sự tạo điều kiện của nhà
trường, của khoa và sự hướng dẫn tận tình của thầy giáo, cô giáo.
Bằng tấm lòng thành kính em xin được bày tỏ tấm lòng biết ơn sâu sắc tới
cô giáo, tiến sĩ Đinh Thị Kim Nhung. Qua đây em cũng xin chân thành cảm ơn
các thầy cô giáo trong bộ môn vi sinh vật học trường ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ
em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2007

Sinh viên
Trần Thị Thu Huyền


LờI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, căn cứ kết
quả thực nghiệm nêu trong khoá luận là trung thực.
Đề tài này chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác.
Hà Nội, tháng 5 năm 2007

Trần Thị Thu Huyền


Danh mục các chữ viết tắt, kí hiệu, bảng, biểu đồ
1. Danh mục các chữ viết tắt, kí hiệu
- TB: tế bào

- S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae
- HL: hàm lượng
- TN: thí nghiệm
2. Danh mục các bảng
Bảng 3.1.2.1. Hàm lượng CO2 giải phóng sau 72 giờ của chủng nấm men
S. cerevisiae
Bảng 3.1.2.3. Khả năng lên men của chủng S. cerevisiae
Bảng 3.3.1. ảnh hưởng của pH đến sinh sản và phát triển của chủng
S. cerevisiae (x106 TB/ml)
Bảng 3.3.2. ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh sản và phát triển của chủng
S. cerevisiae
Bảng 3.3.3. ảnh hưởng của tỉ lện dịch quả và hàm lượng đường đến sự
sinh trưởng và phát triển của chủng S. cerevisiae D1
Bảng 3.3.4. ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến sự sinh trưởng và phát
triển của chủng S. cerevisiae D1 (x106TB/ml)
Bảng 3.3.5. ảnh hưởng của peptôn đến sự sinh trưởng và phát triển của
chủng S. cerevisiae D1 (x106TB/ml) sau 24 giờ
Bảng 3.3.6. ảnh hưởng của nông độ NaCl đến sự sinh trưởng và phát triển
của chủng S. cerevisiae D1 (x106TB/ml) sau 96 giờ


Bảng 3.3.7. ảnh hưởng của KH2PO4 đến sự sinh trưởng và phát triển của
chủng S. cerevisiae D1
Bảng 3.3.8. ảnh hưởng của hàm lượng men giống đến quá trình lên men
vang táo mèo
Bảng 3.4.1. Kết quả nghiên cứu rượu thành phẩm
3. Danh mục các đồ thị, biểu đồ
Đồ thị 3.1.2.2. Động thái phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae
Đồ thị 3.3.6. Biểu diễn biến động số lượng tế bào của chủng đến sự sinh
trưởng và phát triển chủa chủng S. cerevisiae D1 ở các nồng độ NaCl

khác nhau
Đồ thị 3.4.1. Động thái của quá trình lên men vang táo mèo
Biểu đồ 3.1.2.4 biểu diễn hàm lượng CO2 thoát ra của chủng nấm men
S. cerevisiae
Biểu đồ 3.3.6. Biểu diễn hàm lượng đường sót và hàm lượng cồn của chủng
S. cerevisiae D1 sau 96 giờ lên men của chủng ở các nồng độ NaCl
khác nhau
Đồ thị 3.3.7. Biểu diễn hàm lượng đường sót và hàm lượng cồn của chủng
S. cerevisiae D1 sau 96 giờ lên men ở các nồng độ KH2PO4 khác nhau
4. Danh mục các ảnh
ảnh 1: Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae trên môi trường thạch đĩa
ảnh 2: Hình thái tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trên kính hiển
vi quang học x1000 lần


mở đầu
*Lí do chọn đề tài
Rượu vang (wine,vine) là sản phẩm được tạo thành trong quá trình lên men
các loại nước trái cây không qua trưng cất, giữ được mùi thơm và hương vị đặc
trưng của từng loại hoa quả.
Ngành sản xuất rượu vang đã được con người sử dụng và sản xuất từ rất lâu
phổ biến ở Pháp, Trung Quốc. ở Việt Nam ngành sản xuất rượu vang đã được
con người sử dụng nhiều phát triển với tốc độ nhanh nhưng thành phần vẫn khó
được thị trường tiếp nhận, do ứng dụng công nghệ vi sinh và sản xuất vang chưa
được phổ biến nhiều, việc nghiên cứu một số chủng vi khuẩn áp dụng trong lên
men vang đã được đề cập đến nhưng còn ít. Nước ta do có khí hậu nhiệt đới nên
các cây ăn quả rất phong phú, đa dạng, trong đó có nhiều loại quả có thể là
nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất rượu vang. Đặc biệt ở miền núi phía Tây Bắc
nước ta có cây táo mèo cho quả có hương vị rất thơm ngon và đặc trưng.
Nhưng hiện nay số lượng quả táo mèo chủ yếu để ăn tươi, ngoài ra còn

được dùng để ngâm sirô. Tuy nhiên số lượng mang đi tiêu thụ vẫn không đáng kể
so với sản lượng quả hằng năm (30-35%) số lượng còn lại thường bị bỏ phí do
khó vận chuyển hoặc giá thành quá rẻ. Hầu hết người trồng quả táo mèo có thu
nhập không cao, đời sống gặp nhiều khó khăn.
Vì vậy việc nghiên cứu, sử dụng quả táo mèo để sản xuất rượu vang là cần
thiết và có phù hợp với thực tiễn Việt Nam. Chính vì vậy chúng tôi đã tiến hành
đề tài : Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của nấm men lên men vang táo
mèo.
*Mục tiêu của đề tài
- Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo


- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của nấm men lên men vang táo mèo
- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang từ quả táo mèo
*Đối tượng nghiên cứu
Quả táo mèo (Docynia indica), họ hoa hồng (Rosaceae) chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae thuần khiết phân lập được từ quả táo mèo. Chúng tôi
đã tiến hành phân lập được mẫu và chọn ra một chủng Saccharomyces cerevisiae
có khả năng lên men tốt hơn cả, xác định tên khoa học của chủng là
Saccharomyces cerevisiae D1.
*ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài
Đề tài nghiên cứu của chúng tôi nhằm đáp ứng các nhu cầu khoa học về ý
nghĩa lí luận và thực tiễn như sau:
Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá của
chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae D1 có khả năng lên men vang táo
mèo.
Công trình của chúng tôi mang ý nghĩa thực tế đó là tạo nguồn tiêu thụ quả
táo mèo nhằm nâng cao thu nhập cho bà con các dân tộc vùng cao.

Chương 1. Tổng quan về tài liệu
1.1. Khái quát chung về rượu vang
1.1.1. Các loại rượu vang
Rượu vang là loại nước thơm ngon giàu chất bổ dưỡng với hương thơm trái
cây còn giữ được trong rượu. Sự đa dạng về các loại rượu vang là kết quả của sự
biến đổi sinh hoá khi lên men. Người ta thường chia rượu vang thành hai loại
chính là vang không gaz và vang có gaz. Trong hai loại chính này rượu vang lại
được chia thành nhiều loại theo màu sắc và lượng đường có trong rượu.
- Theo màu sắc có vang trắng và vang đỏ
- Theo hàm lượng có vang khô (ít đường), vang ngọt (nhiều đường) và
vang nửa khô.
1.1.2. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Rượu vang theo đúng nghĩa được sản xuất từ nước ép quả nho, cho lên men
không qua trưng cất. ở nước ta với khí hậu nhiệt đới gió mùa không thích hợp
cho cây nho phát triển tốt, nhưng lại là xứ sở của nhiều loại hoa thơm, quả ngọt.
Đây là nguồn nguyên liệu phong phú phục vụ cho ngành công nghiệp chế biến
rượu vang (mơ, táo, dứa, vải).
1.1.3. Thành phần của rượu vang
Thành phần chủ yếu của rượu vang bao gồm:
- Cồn etanol, do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn aldehit,
este. Độ cồn của rượu từ 10-120.
- Chất bổ dưỡng: đường trong rượu vang từ 62g/l 132g/l chủ yếu là
đường fructoz, glucozo và một ít galactoz.
- Axit vô cơ và axit hữu cơ: axit oxalic, axit malic, ...


- Trong rượu vang chứa một lượng phong phú các loại muối với hàm lượng
thấp nhưng giữ vai trò quan trọng, làm tăng hương vị của rượu, tăng giá trị dinh
dưỡng của rượu.
- Rượu vang giàu vitamin: vitamin có trong nước quả không bị quá trình

lên men phân huỷ mà nó chỉ điều chỉnh lại thành phần.
1.2. Một số đặc tính sinh học của tế bào nấm men Saccharomyces
1.2.1. Sơ lược về nấm men
Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh
sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi. Chúng phân bố rộng rãi trong thiên
nhiên như trong đất, trong nước, không khí và đặc biệt có mặt rất nhiều trên bề
mặt nhiều loại quả.
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng. Sinh khối của chúng rất giàu
prôtêin, vitamin, lipid. Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo
thành rượu trong điều kiện yếm khí. Vì vậy, nấm men được ứng dụng rộng rãi
trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản
xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối, gây hương nước chấm, sản xuất
chất béo...Tuy nhiên, một số nấm men độc hại, làm nhiễm các quy trình công
nghệ và gây hư hỏng sản phẩm.
1.2.2. Hình thái, kích thước và cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces
- Tế bào nấm men đa số có cấu tạo hình cầu, hình trứng hoặc hình ô van.
Hình dạng này có thể thay đổi phụ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện
nuôi cấy và tuổi của tế bào.
- Kích thước tế bào khoảng 3-10 m x 5-12 m . Nấm men có màu trắng
đục, vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt tế bào thường khô và căng, có thể dính riêng lẻ
hoặc dính nhau thành chuỗi.
1.2.3. Cấu tạo


Nấm men có cấu tạo đơn bào mang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống.
Chúng có cấu tạo gồm màng, chất nguyên sinh và nhân.
1.2.3.1. Màng
Màng tế bào có cấu tạo chủ yếu là hemi xenluloza chiếm 70% trọng lượng
khô của tế bào, 6- 7% protein. Ngoài ra màng tế bào còn chứa lipid, đường khử,
nitơ, các axit amin và các chất khoáng.

1.2.3.2. Nguyên sinh chất
- Màng nguyên sinh chất: Có chức năng chủ yếu là chủ động điều hoà việc
hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào.
- Chất nguyên sinh của tế bào nấm men:
+ Ribôxôm: bao gồm 2 loại là Ribôxôm 80S (trong tế bào chất) và
Ribôxôm 70S (trong ti thể).
+ Ti thể có dạng hạt. Kích thước khoảng 0.2- 0.6 m có màng bọc trong
suốt, tính thấm cao. Kích thước và hình dáng có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều
kiện nuôi cấy và trạng thái sinh lí của tế bào. Ti thể được bao bọc bởi hai lớp
màng cấu tạo bởi protein và lipid và trên đó có rất nhiều hạt nhỏ gọi là hạt cơ bản
(ôxixôm).
Số lượng ti thể trong tế bào nấm men từ 10-20, chúng tham gia vào quá
trình sinh trưởng tế bào sự hình thành và nảy chồi của bào tử.
- Trong tế bào nấm men có chứa một hệ thống không bào được hình thành
từ thể golgi hay mạng lưới nội chất. Không bào có tính thấm cao và là nơi tích
luỹ các sản phẩm của trao đổi chất. Không bào có chứa một hệ thống keo, trong
đó bao gồm cả điện tử enzim, protit, hidrat cacbon, các muối canxi, photpho,
kali,... Hình dạng của không bào thường thay đổi do sự co rút của chất nguyên
sinh và sự thay đổi sức căng bề mặt giữa không bào và chất nguyên sinh. Trong


không bào thường xảy ra các phản ứng oxi hoá khử, nhờ hệ thống enzim
xitôcrôm oxydase trong không bào.
1.2.3.3. Nhân
Khác với tế bào vi khuẩn tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình ôvan
hoặc hình tròn, được bao bọc bởi lớp màng nhân. Khoảng 1 2.4 m cấu tạo bởi
protein, ADN, ARN và nhiều enzim. Nhân quyết định tính di truyền và tham gia
điều khiển tất cả mọi hoạt động sống của tế bào nấm men.
1.2.3.4. Sinh sản của tế bào nấm men
Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính).

Bình thường tế bào nấm men sinh sản nảy chồi khi gặp điều kiện không thuận lợi
một số có thể sinh sản theo cách tạo bào tử.
Sinh sản vô tính: sinh sản nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất. Khi
tế bào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ gọi
là mầm (hay chồi). Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm trên một đầu của tế
bào mẹ. Cùng một lúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều chồi. ở phía khác nhau, ở
mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tế bào mẹ. Sau
khi nảy mầm tế bào con có thể tách ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập cũng có thể
không tách khỏi tế bào mẹ và tiếp tục nảy mầm tạo ra một lớp tế bào giống nhau
và giống hình cành cây.
Nấm men có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi được sinh ra trong
những túi nhỏ gọi là túi nang. Mỗi túi nang chứa từ 1 đến 8 bào tử. Nấm men
được tạo thành từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử túi gặp điều
kiện thuận lợi sẽ phát triển thành nấm men.
Sinh sản hữu tính là hình thức hợp nhất hai tế bào nấm men thành hợp tử .
Tế bào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành các bào tử.


Nấm men sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc phân đôi giữa quá trình này
có thể sinh sản hữu tính.
1.2.4. Nấm men thuần chủng
Trong tự nhiên nấm men có mặt ở nhiều nơi đặc biệt trên bề mặt trái cây.
Tuy nhiên, không phải các nấm men này đều tốt mà có cả nấm men dại, độc
hại... Hiện nay công nghệ lên men với chủng thuần khiết đang được phổ biến
rộng rãi. Nấm men thuần chủng là nấm men được phát triển từ cùng một tế bào
đã được tuyển chọn trên môi trường HanSen.
* Một số chủng hay dùng cho sản xuất rượu vang Saccharomyces vini
chiếm tới 80% Saccharomyces. Loại nấm men này có khả năng lên men glucozo,
fructoz, mantoz, glactoz, lactoz, peptoz, dextrin.
Saccharomyces ovifomis được tách từ nước nho lên men tự nhiên, đặc biệt

loại này chịu được đường cao. Saccharomyces cereviae dùng sản xuất bánh mì,
bia, rượu vang khi lên men đạt 10 20%V cồn .
* Khả năng lên men đường của Saccharomyces :
Sự lên men : lên men rượu xảy ra qua một số giai đoạn trong thời kì đầu
khi môi trường còn chứa nhiều hàm lượng oxy đã hoà tan, nấm men chủ yếu oxy
hoá đường đến CO2 và H20. Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men, vì đường
còn lại ít trong môi trường nấm men sẽ sử dụng các glicogen trong tế bào giảm
dần .
Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces lên men rượu bia là khác
nhau đối với mỗi loại đường. Tốc độ lên men đường glucoz và fructoz nhanh hơn
saccaroz. Tốc độ lên men được xác định CO2 bay ra từ một thể tích môi trường
nhất định trong một đơn vị thời gian.
Nấm men sử dung rộng rãi trong sản xuất là giống Saccharomyces
cerevisiae. Thành phần gồm 75 % nước, 25% chất khô.


1.3.Các biến động sinh lý, sinh hoá vi sinh khi lên men rượu vang, khả năng
lên men đường của Saccharomyces cerevisiae
Quá trình sản xuất rượu vang bắt đầu bằng công đoạn: đầu tiên nấm men
sinh sản trong môi trường dịch quả. Lúc đầu cần nhiều oxy, sau đó tạo điều kiện
lên men rượu etylic yếm khí nhanh chóng, sự lên men rượu etylic được biểu diễn
theo phương trình :
C H O 2C H OH 2CO Q
6 12 6
2 5
2

Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của tế bào nấm men và
tích luỹ trong sản phẩm rượu.
Quá trình lên men rượu xảy ra qua 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Là con đường biến đổi glucoza thành fructoza 1-6 điphotphat
dưới sự xúc tác của enzim oxi izomêrase.
Giai đoạn 2: Quá trình biến đổi fructoza 1-6 điphotphat tạo thành 3
photpho gloxerat và photphođioxi axêton nhờ xúc tác của enzim aldolase.
Giai đoạn 3: Đầu tiên là 3 photpho glixeraldehit biến đổi thành
3 photphoglixerat và tiếp tục đổi thành 2 photpho glixerat nhờ xúc tác của enzim
photphoglixero mutase. Giai đoạn cuối cùng của giai đoạn này là sự biến đổi 2
photpho glixerat thành axit pirumic nhờ xúc tác của enzim andoza và photpho
pherase
Giai đoạn 4: Axit pirumic phân cắt nhờ xúc tác của enzim cacboxylaza
thành axetal dehyl, giải phóng CO2.
Giai đoạn 5: Tạo thành etanol từ axetal dehil có sự xúc tác của
alcolđêhylđrogennase.
Tốc độ lên men được xác định bằng lượng CO2 bay ra từ một thể tích môi
trường nhất định trong một đơn vị thời gian.


Những rượu bậc cao có trong vang với số lượng không lớn nhưng đóng vai
trò quyết định trong tạo hương rượu vang. Các rượu bậc cao được tạo thành từ sự
biến đổi đường, đạm từ các axit amin tương ứng ví dụ: amylic, propylic,
izobutylic.
1.4. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu vang, bệnh vang
1.4.1. Nấm men
1.4.2. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rượu vang thùng chứa thiết
bị hoặc do bụi, không khí đưa đến như nấm mốc thuộc chi Rhizopus,
Aspergillus...
1.4.3. Vi khuẩn
Trong nước hoa quả và nước rượu vang có thể có những dạng vi khuẩn có
tính ổn định lớn với rượu và axit hữu cơ. Chúng có thể gây ra những biến đổi sâu

sắc trong rượu vang về vị chua, mùi,... Và có loài gây làm đục cho vang, đó
thường là các loài vi khuẩn Acetobater xylium, Acetobater aceti. Một số vi sinh
vật gây ra cơ chế làm lỏng vang khi tiếp xúc với không khí. Do vậy, để bảo quản
rượu vang người ta có thể dùng thanh trùng Pasteus nhưng nó làm giảm chất
lượng rượu vang , phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến
như SO2(75-120mg/l).
1.4.4. Bệnh vang
Xuất hiện khi rượu vang tiếp xúc với không khí, được Pasteus phát hiện ra.
Khi đó nấm men dạng màng và vi khuẩn axetic làm chua rượu vang. Các bệnh
vang cũng có thể do các vi sinh vật lên men trong điều kiện hiếu khí.
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men và lên
men rượu vang
1.5.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men


1.5.1.1. Nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzim
axit nucleic và sản phẩm trao đổi chất. Nguồn thức ăn chủ yếu của nấm men là
hyđrat cacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu của nấm men là:
- Sản sinh năng lượng.
- Tạo thành những tiền chất.
- Thực hiện các quá trình oxy hoá khử để biến những tiền chất này thành
sản phẩm trung gian, để xây dựng tế bào.
1.5.1.2. Nguồn Nitơ và muối khoáng
- Nguồn nitơ: Nấm men cần nitơ để xây dựng tế bào.
- Các nguyên tố của photpho, lưu huỳnh đóng vai trò quan trọng trong các
quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men trong quá trình trao đổi chất ở tế bào
nấm men các ion Ca2+, Mg2+, Fe2+ nằm trong thành phần của enzim hoạt động.
1.5.1.3. Nguồn ôxi
Quá trình lên men trong giai đoạn đầu cần ôxi để giúp nấm men tăng sinh

khối. Để tạo cồn thì lên men rượu trong điều kiện yếm khí.
1.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
1.6.1. pH môi trường
Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trường luôn bị biến đổi dẫn đến sự biến
đổi của nấm men trong quá trình sinh sản. pH tăng trong giai đoạn cuối của quá
trình lúc chất dinh dưỡng khan hiếm và hoạt lực enzim trong tế bào lớn. Khi
pH<3 thì quá trình lên men bị yếu đi . Nếu pH>7 thì quá trình lên men bị dừng
lại. Khả năng lên men vang tốt là pH= 4 5 .
1.6.1.2. ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển của nấm men do các phản
ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào đều chịu sự chi phối của nhiệt độ. Với mỗi loại


nấm men có khoảng nhiệt độ phát triển thích hợp. Quá trình lên men bắt đầu tốt
ở nhiệt độ 200C, ở 250C quá trình lên men xảy ra rõ rệt sau 12h, còn 17-180C xảy
ra sau 24h. Quá trình lên men không diễn ra ở nhiệt độ dưới 100C. Điều kiện
nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển là 20-280C.
1.6.2 ảnh hưởng của nồng độ cồn
Nồng độ cồn thích hợp cho rượu vang phát triển tốt 9-140. Quá trình lên
men chậm lại khi hàm lượng cồn cao. pH thích hợp nhát cho sự lên men là: 4-5.
1.6.3. ảnh hưởng của nồng độ đường và áp suất thẩm thấu
Đường và các chất hoà tan khác trong môi trường tạo áp suất, áp suất thẩm
thấu chênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trường nuôi cấy. Sự chênh lệch này
làm cho các chất dinh dưỡng dễ hoà tan và thấm vào môi trường tế bào qua màng
và sản phẩm của tế bào hoà tan vào môi trường. Tế bào không sinh trưởng được
trong điều kiện nồng độ đường quá cao. Khi nồng độ đường thấp thì tế bào phát
triển chậm và ít nguồn nguyên liệu để nấm men chuyển hoá thành rượu. Nấm
men chỉ có khả năng lên men đường đơn giản monoxacarit. áp lực CO2 cũng ảnh
hưởng tới quá trình lên men .
1.6.4. ảnh hưởng của hàm lượng giống

Men giống là tác nhân của của quá trình lên men. Hàm lượng giống quá ít
gây hiện tượng dễ nhiễm khuẩn hoặc không lên men mạnh, nếu hàm lượng giống
quá cao lên men mạnh nhưng có sự cạnh tranh cơ chất. Hàm lượng giống thích
hợp là từ 8-10%.


Chương 2
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Quả táo mèo (Docyni indica) được thu nhận từ hai vùng trồng nhiều ở
Việt Nam là Yên Bái(Trạm Tấu) và Sơn La.
- Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch quả táo mèo có vị
trí phân loại theo Yelinov N.P(1996) sau đây:
Lớp: Hemiascomycetes.
Bộ: Endomycetales
Họ phụ:Saccharomycetdideae.
Giống: Saccharomyces.
Loài: Cerevisiae.
2.1.2. Hoá chất
Các loại đường: glucoza, saccaroza, fructoza. một số chất vô cơ, hữu cơ:
KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH, HCl, (NH4)2HPO4,(NH4)2SO4. Rượu etylic,
pepton, agar, phenolphtalein, nước máy, cồn.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thuỷ tinh, phễu thuỷ
tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thuỷ tinh.
- Thiết bị lên men: bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, buồng vô trùng, tủ
sấy, cân phân tích, kính hiển vi.
2.1.4. Môi trường
Dựa vào tính chất của nấm men Sacchromyces cerevisiae chúng tôi chọn

môi trường vô cơ theo tỉ lệ sau:


2.1.4.1. Môi trường HanSen (MT1) g/l: môi trường phân lập và sơ tuyển chủng
nấm men.
- Đường glucoz: 50g
- Pepton:

5.0g

- MgSO4.7H2O: 0.5g
- KH2PO4:

1.0g

- (NH4)2SO4 :

1.0g

- Thạch agar:

20g

- Nước cất:

1000ml.

2.1.4.2. Môi trường nhân giống(MT2): g/l
- Đường glucoz: 50g
- Pepton:

5.0g

- MgSO4.7H2O: 0.5g
- KH2PO4:

1.0g

- (NH4)2SO4 :

1.0g

- Nước cất:

1000ml.

2.1.4.3. Môi trường lên men (MT3):g/l
- Dịch siro hoa quả: 50g
- MgSO4.7H2O: 1.0g
- KH2PO4:

1.0g

- (NH4)2SO4 :

1.0g

- Nước cất:

1000ml.

2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Tuyển chọn khuẩn lạc nấm men.
- Xác định hoạt lực lên men bằng:
+ Cân bình trọng lượng.


+ Xác định tế bào trên buồng đếm Goriaev và hoạt hoá giống.
- Xác định hàm lượng đường bằng đường kế.
- Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH.
- Quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại
1000 lần.
- Các phương pháp phân tích:
+ Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ NaOH 0,1N.
+ Xác định độ cân bằng ancol kế rồi quy về độ cồn chuẩn 150C bằng
phương pháp hoá học.
- Xử lý số liệu bằng thống kê toán học.
2.2.1 Phân lập và tuyển chọn khuẩn lạc nấm men trên môi trường thạch đĩa.
Môi trường để tuyển chọn các khuẩn lạc nấm men là môi trường.
HanSen (MT1). Dùng phương pháp phân lập trên hộp petri nhằm tuyển chọn một
tập hợp tế bào nấm men của cùng một nòi có kích thước, hình thái, khả năng lên
men như nhau.
Cách tiến hành: Môi trường phân lập được khử trùng và phân vào các hộp
Petri vô trùng để nguội theo phương pháp Pasteur: Dịch hoa quả đã được pha
loãng 10-1-10-10 bằng nước cất. Nhỏ một hai giọt huyền phù với độ pha loãng
10-9 lên bề mặt thạch dàn đều bằng bàn trang. Gói kín và nuôi trong tủ ấm ở điều
kiện 24-280C trong 4 ngày trên bề mặt xuất hiện các khuẩn lạc, với các đặc điểm
trắng, bóng đặc trưng cho nấm men.
2.2.2. Phương pháp hoạt hoá giống
Trước khi đưa vào môi trường lên men để có những tế bào to khoẻ, chúng

tôi tiến hành hoạt hoá giồng bằng cách nuôi trên môi trường thạch ở 24-280C
trong vòng 24 giờ.


2.2.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
* Phương pháp cân bình trọng lượng.
Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trường, có cùng
một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 giờ lên men đem cân
trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại.
* Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriave.
Cấy giống vào môi trường nhân giống nuôi ở nhiệt độ 280C lắc đều canh
trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường. Tuỳ mức độ giai đoạn phát
triển mà tỉ lệ khác nhau.
Dùng pipet lấy dịch pha loãng cho một giọt vào khe hở giữa lưới đếm kính,
chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên để yên 3-5 phút rồi tiến hành
soi trên kính hiển vi ở vật kính 40 đếm số tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau.
Cách tính số tế bào trong 1ml: M=A.50.B
Trong đó:

M: Số tế bào trong 1ml dịch huyền phù.
A: Số lượng tế bào trung bình trong 1 ô vuông.
B: Hệ số pha loãng.

2.2.4. Phương pháp xử lý các kết quả bằng thống kê toán học
- Giá trị trung bình số học:

n X
X i
i1 n

( X i X )2
- Độ lệch chuẩn:
nếu n <30
n 1
( X i X )2
nếu n 30

n

- Sai số tung bình số học

m=


n




- Hệ số biến động: Cv %
.100% .
X
n: Số lần lặp lại.
Xi: Giá trị đo lần thứ i.
2.3. Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men Saccharomyces trên đối tượng là quả táo mèo được thu từ
Yên Bái và Sơn La.
2.4. Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa sinh trường Đại
học sư phạm Hà Nội 2

Chương 3
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Phân lập, tuyển chọn và định loại chủng nấm men
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Tác nhân chính thực hiện quá trình chuyển hoá đường trong dịch táo mèo
là nấm men. Vì vậy, ta phải phân lập và tuyển chọn để lấy được chủng tốt nhất.
Các chỉ tiêu chúng tôi dựa vào để phân lập và tuyển chọn là:
- Chịu được độ cồn và độ axit cao.
- Tốc độ phát triển nhanh chu kì lên men ngắn.
- Có khả năng lên men tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao.
- Hương thơm tạo este đặc biệt, không sinh độc tố.
- Dễ lắng trong khả năng cạnh tranh tốt với các vi sinh vật khác, ổn định
lâu dài trong sản xuất.
Từ dịch quả táo mèo tự nhiên chúng tôi đưa vào phân lập trên đĩa petri đã
thu được 20 mẫu nấm men khác nhau. 20 mẫu này đem thử hoạt lực lên men
trong dịch táo mèo nhờ lượng CO2 thoát ra. Mẫu nào cho hàm lượng CO.2 thoát ra
càng nhiều thì hoạt lực lên men càng mạnh. Qua nhiều lần tuyển chọn chúng tôi
chọn được một mẫu nấm men có đường kính khuẩn lạc lớn, trắng bóng, lồi, bờ
không răng cưa. Được trình bày ở hình 3.1.a và hình 3.1.b


3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men lên men vang táo mèo
3.1.2.1. Xác định hoạt lực lên men
Trong lên men, hoạt lực của nấm men được biểu thị bằng hàm lượng CO2
sinh ra. Lượng CO2 sinh ra và thoát ra môi trường càng nhiều thì trọng lượng
bình lên men càng giảm, điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Tiến
hành thí nghiệm với chủng S. cerevisiae và thí nghiệm được lặp lại 8 lần kết quả
thu được sau 72 giờ lên men đã dẫn ở bảng 3.1.2.1.
Bảng 3.1.2.1. Hàm lượng CO2 giải phóng sau 72 giờ của chủng nấm men

S. cerevisiae1.
Tên
chủng

Hàm lượng CO2 (g/100ml)
TN1

D1

2.5 0.02

TN2

TN3

TN4

2.3 0.02 2.5 0.02 2.4 0.02

TN5

TN6

TN7

TN8

2.45 0.02 2.45 0.02 2.5 0.02 2.45 0.02

Qua kết quả nghiên cứu cho thấy chủng S. cerevisiae D1 lên men mạnh ,

lượng CO2 thoát ra nhiều (trung bình 2.40g/100ml). Sự phát triển của tế bào nấm
men làm cho vi khuẩn khó phát triển, nấm men dại khó xâm nhập.
Với số lượng CO2 thoát ra đạt trên 2g/100 ml là đạt với yêu cầu dùng cho
lên men rượu vang các loại hoa quả. Vì vậy, chủng này được nghiên cứu tiếp sự
động thái phát triển.
3.1.2.2. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae.
Để nghiên cứu tốc độ phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae. Trên
môi trường nhân giống, chúng tôi tiến hành theo dõi sự sinh trưởng và phát triển
của chủng S. cerevisiae bằng cách xác định số lượng tế bào nấm men/ml canh
trường.


Số lượng tế bào nấm men x 106t

140
120
100
80
60
40
20
0

0

4

8

12 20 24

36 48

thời gian (h)

Đồ thị 3.1.2.2. Động thái phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae
Qua đồ thị chúng tôi thấy rằng chủng S. cerevisiae phát triển tốt ở môi
trường nhân giống. Sau 24-28h số lượng tế bào đạt tối đa, thời gian sau khối
lượng tế bào giảm dần.
Chúng tôi tiếp tục thực hiện các nghiên cứu như xác định khả năng lên
men đường trên môi trường lên men.
3.1.2.3. Khả năng lên men đường
Cấy chủng nấm men S. cerevisiae D1 vào môi trường dịch quả táo mèo có
thể bổ xung hàm lượng đường ở các mức độ khác nhau 150g/ml, 180g/ml,
210g/ml, 240g/ml, 270g/ml, pH= 4, tc = 280C. Số lượng giống ban đầu ( 3.5 0.1 )
x 106 tb/ml. Kết quả thu được dẫn ra ở bảng 3.1.2.3


Bảng 3.1.2.3. Khả năng lên men của chủng S. cerevisiaiae D1
STT

Tiêu

Đơn vị

Hàm lượng đường trong dịch lên men

chuẩn
đánh

150

180

210

240

270

h

120

120

120

120

120

g/l

5.2 0.1

5.6 0.1

6.3 0.1

7.1 0.1

7.6 0.1

%V

7.5 0.1

8.0 0.1

9.5 0.1

10 0.1

9.5 0.1

giá
thời
1

gian lên
men
lượng

2

đường
sót

3

độ
cồn

Qua bảng trên ta thấy khi hàm lượng đường trong dịch lên men cao thì
hàm lượng đường dịch có hàm lượng đường 270g/l thì nấm men phát triển kém.
Hàm lượng đường thích hợp cho quá trình lên men rượu vang là 210- 240g/l vì ở
hàm lượng đường này thì độ cồn và lượng đường sót lại đạt tiêu chuẩn cho phép.
3.1.2.4. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau
pH có ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình lên men của nấm men. Để xác định
ảnh hưởng của độ pH môi trường tới khả năng lên men của chủng S. cerevisiae
D1. Chúng tôi tiến hành môi trường lên men ở nhiệt độ 28- 320C, độ pH biến đổi
ở các mức 2.5; 3; 3.0; 3.5; 4.0; 4.5; 5. Xác định hàm lượng CO2 thoát ra sau 24 h
nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm được diễn ra ở biểu đồ 3.1.2.4.


Hàm lượng CO2 thoát ra (g/l)

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

pH

Biểu đồ 3.1.2.4. Biểu diễn hàm lượng CO2 thoát ra của chủng nấm men
S. cerevisiae
Qua biểu đồ trên cho ta thấy chủng S. cerevisiae có khả năng lên men
mạnh ở độ pH 4 - 4.5 . Vậy khoảng pH thích hợp cho quá trình lên men vang táo
mèo là từ 4 - 4.5.
3.2. Xác định tên khoa học của chủng nấm men S. cerevisiae
Dựa vào khoá phân loại của Lodder năm 1971. Theo khoá phân loại này
mẫu nấm men nghiên cứu có đặc tính :
- Tế bào hình trứng, ovan, hình cầu.
- Lên men glucoza mạnh.
- Lên men được saccaroza, galactoza, mantoza.
- Điều kiện không thuận lợi hình thành 1-4 bào tử.
- Mỗi nang chứa 2-4 bào tử.
Từ đó xác định tên khoa học của mẫu nấm là S. cerevisiae D1