Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo

TRƯỜNG ĐAỊ HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN


NGUYỄN THỊ HÀO

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN
CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN VANG TÁO MÈO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

Hà Nội, tháng 5 năm 2010


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN

Trong những năm gần đây công nghệ vi sinh đã được ứng dụng một cách
rộng rãi và có hiệu quả trên nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống. Nhận biết được
vai trò quan trọng của công nghệ vi sinh trong cuộc sống em đã tìm hiểu, nghiên
cứu về lĩnh vực này. Dưới sự hướng dẫn tận tình chu đáo của cô Đinh Thị Kim
Nhung cùng các thầy cô trong bộ môn vi sinh học Trường ĐHSP Hà Nội 2. Do
vậy em đã hoàn thành tốt đề tài: “Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả
năng lên men vang táo mèo”.

Bằng tấm lòng thành kính của mình em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
các thầy cô giáo đã tận tình chỉ bảo em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành
luận văn này.
Xuân Hòa, ngày 28 tháng 4 năm 2010
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Hào


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

STT: Số thứ tự
Nxb: Nhà xuất bản
ĐHSP: Đại học sư phạm


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC
1.

Danh mục bảng
Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3

Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8

2.

6

Số lượng tế bào nấm men x10
Hoạt lực lên men của 4 chủng nấm men
Khả năng lên men của 4 chủng nấm men
Khả năng kết lắng của 4 chủng nấm men
Động thái quá trình lên men
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến lên men vang
Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Ảnh hưởng của độ pH

Trang
19
19
20
21
24
26
27
29

Danh mục biểu đồ và hình

2.1. Danh mục biểu đồ
Biểu đồ 3.1
Biểuđồ 3.2
Biểu đồ 3.3
Biểu đồ 3.4
Biểu đồ 3.5
Biểu đồ 3.6

Hoạt lực lên men của 4 chủng nấm men
Hàm lượng ethanol của 4 chủng nấm men
Biến đổi hàm lượng ethanol, đường sót và số lượng tế bào
trong quá trình lên men vang táo mèo
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sự biến đổi hàm lượng ethanol ở các hàm lượng đường
khác nhau
Ảnh hưởng của pH

Trang
20
21
25
26
28
29

2.2. Danh mục hình
Hình 3.1
Hình 3.2
Hình 3.3

Khuẩn lạc chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae
TM4
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae TM4 trên
kính hiển vi quang học x1000
Tế bào nấm men Saccharomyces cervisiae TM4 trên môi
trường thạch nghiêng

22
23
23


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
PHẦN NỘI DUNG
Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Cây táo mèo (Docynia indica)
1.1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái của cây táo mèo
1.1.2. Tình hình chế biến táo mèo
1.2. Hệ vi sinh vật của vang
1.2.1. Nấm men (yeast)
1.2.2. Vi khuẩn
1.2.3. Nấm mốc
1.3. Công nghệ sản xuất vang
1.3.1. Khái quát chung về vang
1.3.2. Một số biến đổi trong quá trình lên men

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men vang
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Dụng cụ - Thiết bị
2.2. Môi trường
2.3. Nguyên liệu
2.4. Đối tượng nghiên cứu
2.5. Phương pháp nghiên cứu
Chương 3. Kết quả nghiên cứu và biện luận
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men lên vang táo mèo
3.1.1. Chỉ tiêu cơ bản để tuyển chọn nấm men
3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men
3.2. Xác định tên của chủng nấm men
3.2.1. Hình thái tế bào khuẩn lạc
3.2.2. Xác định tên khoa học
3.3. Lên men vang táo mèo trên qui mô phòng thí nghiệm
3.3.1. Động thái quá trình lên men
3.3.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men vang táo mèo
3.4. Qui trình sản xuất vang táo mèo ở qui mô phòng thí nghiệm
3.4.1. Sơ đồ quá trình sản xuất vang táo mèo
3.4.2. Thuyết minh quá trình
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang
1
3
3
3
3
4

4
4
7
7
7
7
8
9
13
13
13
13
13
14
17
17
17
17
22
22
23
24
26
27
30
31
32
33
34

Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHỤ LỤC
Phụ lục 1
STT

Chỉ tiêu đánh giá

Điểm tối đa

1.

Độ trong1

2

2.

Màu sắc2

2

3.

Vị chua

2

4.
5.
6.

Vị chát
Vị ngọt
Mức độ hài hòa

2
2
3

7.

Tính đặc trưng

4

8.

Đánh giá chung

3

Tổng điểm

Mức độ yêu cầu
Trong ánh, không cặn lắng
và cặn lơ lửng.

Màu tự nhiên
Vị chua của axit trong mẫu
thử.
Vị của tanin
Vị ngọt của đường
Cho các chỉ tiêu về vị.
Hương và bouquet của sản
phẩm.
Cho các chỉ tiêu đánh giá
chung của sản phẩm.

20

Phụ lục 2
STT

Chỉ tiêu đánh giá

9.
Độ trong1
10.
Màu sắc2
11.
Vị chua
12.
Vị chát
13.
Vị ngọt
14. Mức độ hài hòa
15. Tính đặc trưng

16. Đánh giá chung
Tổng điểm

TM1
1,5
1
1
2
1
1
2
2
11,5

Chủng nấm men
TM2
TM3
1,5
2
1
1,5
1,5
2
1,5
2
2
2
2
2
2

3
2
2,5
13,5
17

TM4
2
2
1,5
2
2
2,5
4
3
19


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài

1.

Trên thế giới hiện nay có rất nhiều loại đồ uống được làm từ hoa quả
nhưng không một loại đồ uống nào được ưa chuộng và được sản xuất với số
lượng lớn như vang, hầu hết các nước trên thế giới đều có xưởng sản xuất

vang. Vang là một loại đồ uống có cồn được làm từ hoa quả và không qua
trưng cất, trong đó vang nho là một loại đồ uống quan trọng và kinh tế nhất.
Nó được chế biến theo một qui trình công nghiệp và được kiểm tra một cách
nghiêm ngặt. Vang có hương, vị đặc trưng vì vậy nó là một loại đồ uống được
ưa chuộng ở khắp nơi trên thế giới.
Vang có thành phần hóa học rất phức tạp, hàm lượng các chất trong
vang tùy thuộc vào môi trường, nguồn nguyên liệu và vào qui trình lên men.
Thành phần hóa học chính của vang là: alcol, axit, tanin, đường và các sắc tố.
Ngoài những thành phần này vang còn có đầy đủ các loại axit amin, vitamin
và muối khoáng. Vì vậy vang được coi là loại đồ uống có giá trị dinh dưỡng cao.
Nguồn nguyên liệu truyền thống cho sản xuất vang là quả nho, vang
được sản xuất từ loại quả này được gọi là vang nho. Đây là một loại vang
được ưa chuộng nhất, ở các nước phương Tây chúng là thứ đồ uống không thể
thiếu cho bữa ăn hàng ngày. Sở dĩ vang nho lại được ưa chuộng như vậy là vì
không những đạt được điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động của các vi
sinh vật mà nó còn chứa các thành phần tạo nên hương, vị đặc trưng cho sản
phẩm.
Trên thực tế thì vang có thể sản xuất từ rất nhiều nguồn nguyên liệu khác
nhau bất kì một loại quả nào có chứa đường, axit, vitamin, khoáng... và không
độc hại thì đều có thể làm nguyên liệu để sản xuất vang. Tuy vậy ở Việt Nam
hiện nay ngành sản xuất vang thực sự chưa chú ý đến những nguồn nguyên
liệu khác mà vẫn dùng những nguồn nguyên liệu chính là nho, mơ, mận. Điều

Nguyễn Thị Hào

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

này quả là bất hợp lí đối với một nước nhiệt đới phong phú về chủng loại hoa
quả, giá thành rẻ, đặc biệt là táo mèo. Hiện nay, ngành sản xuất vang của Việt
Nam đang phát triển mạnh và có nhiều sản phẩm được bán ra thị trường (vang
Thăng Long, Thanh Ba, Gia Lâm...) nhưng lại thiếu nguồn nguyên liệu phù
hợp để sản xuất vang, vì vậy việc tìm hiểu, nghiên cứu sử dụng táo mèo để
sản xuất vang theo chúng tôi là cần thiết, có triển vọng và phù hợp với điều
kiện thực tiễn Việt Nam. Chính vì vậy tôi đã chọn đề tài: “Phân lập, tuyển
chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo”.
2.

Mục tiêu đề tài
Do thời gian có hạn nên chúng tôi đề ra nhiệm vụ của luận văn như sau:
+ Phân lập, tuyển chọn được chủng nấm men có khả năng lên vang
men táo mèo.
+ Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men tuyển chọn
được lên men vang táo mèo.
+ Xây dựng qui trình sản xuất vang ở qui mô phòng thí nghiệm.

3.

Nội dung đề tài
- Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men lên vang táo mèo
- Xác định tên của chủng nấm men
- Lên men vang táo mèo trên qui mô phòng thí nghiệm
- Qui trình sản xuất vang táo mèo ở qui mô phòng thí nghiệm

4.

Ý nghĩa đề tài

Ý nghĩa khoa học: Nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc tính sinh
lý, sinh hóa của chúng nấm men Saccharomyces cerevisiae TM4 có khả năng
lên men vang táo mèo.
Ý nghĩa thực tiễn: Nghiên cứu góp phần tìm hiểu quá trình sản
xuất vang từ táo mèo, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam.

Nguyễn Thị Hào

2


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẦN NỘI DUNG

Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1.

Cây táo mèo (Docynia indica)

1.1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái của cây táo mèo
Cây táo mèo thuộc dạng cây tự nhiên, chưa được thuần hóa. Chúng
xuất hiện trong các vùng rừng núi phía Bắc thuộc các tỉnh Sơn La (Mường
La), Yên Bái (Trạm Tấu) và mọc ở độ cao 700-1500m, có khả năng chịu lạnh
tốt.
1.1.1.1. Rễ cây

Rễ cây táo mèo phát triển mạnh, rễ chính có thể ăn sâu 4-5 m, phần lớn
rễ phụ tập trung ở tầng đất mặt 40-50 cm, mức độ ăn xa của rễ thường rộng
hơn tán cây 1,5-2 lần nên có khả năng chống chịu tốt.
1.1.1.2. Thân và cành
Táo mèo có tán rộng, nhiều cành. Cành mới được tạo thành hàng năm,
số lượng cành nhiều, cành nhỏ, có gai. Cây thân gỗ, dẻo, chiều cao trung bình
4 - 5 m.
1.1.1.3. Lá
Hình dạng lá tựa như lá táo ta, nhưng dày hơn, mặt trên xanh xẫm, mặt
dưới trắng sữa và có một lớp lông mỏng, lá mọc cách, được hình thành vào
mùa xuân.
1.1.1.4. Hoa
Hoa nhỏ tựa như hoa táo ta, hoa lưỡng tính, chỉ được hình thành một
lần vào tháng 3-4.
1.1.1.5. Quả và hạt
Kích thước trung bình lớn hơn quả táo ta 1,5-2 lần. Khi quả còn non có
một núm nhỏ ở phía dưới như núm quả hồng. Khi quả chín có màu vàng và
cứng được thu hoạch vào tháng 10-11.

Nguyễn Thị Hào

3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.1.1.6. Biến đổi của quả
Khi còn non quả có màu xanh nhạt, không có hương, vị chua chát. Khi

chín có hương thơm đặc trưng, có vị ngọt, chát, chua giảm.
1.1.2. Tình hình chế biến táo mèo
Cho đến nay, quả táo mèo sau khi chín chủ yếu vẫn được dùng để ăn
tươi chứ chưa có một hình thức chế biến nào. Quả táo mèo có hương thơm rất
đặc trưng, nó còn có tên địa phương là quả Sơn Tra. Theo kinh nghiệm dân
gian quả táo mèo có tác dụng giải nhiệt và chữa các bệnh về đường tiêu hóa,
giảm lượng mỡ trong máu, giảm colesteron. Mặt khác hàm lượng đường trong
quả táo mèo khi chín tương đối cao. Vì vậy mà quả táo mèo khá được ưa
chuộng trên thị trường. Thịt quả táo mèo rất rắn nên có thể cách chế biến hợp
lí nhất vẫn là ngâm đường để thu dịch siro táo mèo.
Từ dịch siro này có thể sử dụng bằng cách cho thêm nước và pha thêm
rượu để uống. Ngày nay dịch siro còn được sử dụng để lên men vang, đây là
một hướng rất mới có triển vọng trong việc nâng cao giá trị kinh tế của quả
táo mèo.
1.2.

Hệ vi sinh vật của vang
Hệ vi sinh vật của vang rất đa dạng và phong phú, bao gồm cả vi sinh

vật có lợi và vi sinh vật có hại. Các vi sinh vật có lợi là nấm men, vi khuẩn
thuần chủng được cấy vào. Còn các vi sinh vật có hại là các nấm men dại, vi
khuẩn gây hỏng vang tồn tại trong tự nhiên trên môi trường vỏ quả.
1.2.1. Nấm men (yeast)
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, thường
sinh sản bằng nảy chồi, cũng có khi theo hình thức phân cắt tế bào. Nấm men
được đặc trưng bởi khả năng phân bố rộng rãi trong môi trường tự nhiên, nhất
là trong môi trường chứa đường và pH thấp: trong đất, nước, không khí, trong
lương thực, thực phẩm, trong hoa quả [5].

Nguyễn Thị Hào

4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.2.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm men
Nấm men là vi sinh vật có cấu tạo đơn bào. Tế bào nấm men đa số có
cấu tạo hình cầu, hình trứng hoặc là hình ôvan... Hình thái nấm men thay đổi
phụ thuộc vào từng loại nấm men, điều kiện nuôi cấy, tuổi nấm men. Kích
thước tế bào nấm men cũng rất khác nhau nó phụ thuộc vào chủng, giống và
điều kiện nuôi cấy. Kích thước tế bào nấm men có ý nghĩa rất lớn trong quá
trình trao đổi chất. Nó ảnh hưởng đến vận tốc khuếch tán của chất dinh dưỡng
vào môi trường.
Các tế bào nấm men khác nhau thì có cấu tạo thành phần khác nhau ít
nhiều nhưng nhìn chung đều gồm: thành tế bào, màng nguyên sinh chất, nhân
tế bào, riboxom, ty lạp thể, không bào, các hạt volutin, glycogen, các giọt
lipit. Thành tế bào có cấu tạo nhiều lớp, là cơ quan bảo vệ tế bào và duy trì
hình dạng tế bào. Thành tế bào còn có khả năng kết dính, có ý nghĩa lớn trong
công nghệ sản xuất bia và rượu. Bên trong là màng chất nguyên sinh, màng
này ăn sâu vào trong tạo màng lưới nội chất. Ty thể của tế bào nấm men có
dạng hạt, có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy cũng như trạng thái
sinh lý của tế bào. Ty thể còn có màng bọc trong suốt, mỏng, có tính thấm
cao. Màng có cấu tạo hai lớp, lớp trong hình thành nếp gấp hình răng lược.
Trong tế bào nấm men có chứa một hoặc hệ thống không bào được hình thành
từ thể golgi hay mạng lưới nội chất, không bào có tính thẩm thấu cao và là nơi
tích lũy các sản phẩm của trao đổi chất. Tế bào nấm men có nhân thật, nhân
có hình ôvan, hình tròn nằm gần không bào trung tâm. Nhân tế bào được bao

bọc bởi hai lớp màng.
Sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces: nấm men có nhiều hình
thức sinh sản (vô tính, hữu tính). Bình thường tế bào nấm men sinh sản nảy
chồi khi gặp điều kiện không thuận lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo
bào tử. Sinh sản nảy chồi ở nấm men là hình thức phổ biến nhất. Khi tế bào
phát triển đến mức độ nhất định thì trên cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ
gọi là mầm (chồi). Các mầm có thể đâm ra ở nhiều phía khác nhau của tế bào
Nguyễn Thị Hào

5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

mẹ. Ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tế
bào mẹ, sau khi nảy mầm tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập,
cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ để tạo ra một tập hợp tế bào nấm men
giống cành cây. Trong điều kiện thuận lợi một tế bào con được hoàn chỉnh và
tách khỏi tế bào mẹ là 20-30 phút.
Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi
được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang (1-8 bào tử). Bào tử túi sau
khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào nấm men,
tiếp theo tế bào này lại sinh sản theo lối nảy chồi.
1.2.1.2. Ứng dụng của nấm men
Nấm men được ứng dụng từ rất sớm trong sản xuất rượu vang. Khoảng
6000 năm trước, loài người đã biết sử dụng nấm men để sản xuất rượu vang.
Nấm men dùng trong sản xuất rượu vang thường là các giống thuần chủng
hoặc là những chủng nấm men tự nhiên có sẵn trên bề mặt quả. Trong công

nghiệp các nhà sản xuất vang thường dùng các giống thuần chủng, chủng nấm
men quan trọng trong sản xuất vang là Saccharomyces cerevisiae. Nấm men
còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất cồn, chủng phổ biến cho lên men
cồn là Saccharomyces cerevisiae.
Lên men etylic là một quá trình sinh học, enzyme cần thiết cho quá
trình chuyển hóa đường được hình thành từ tế bào nấm men sống. Qua một
chuỗi phản ứng, kết quả của lên men etylic là đường được chuyển hóa thành
ethanol và carbondioxide.
Phương trình tổng quát:
C6H12O6  2C2H5OH+ 2CO2 + 27Kcal
Cồn có thể được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như
đường, bột mì, cenllulose.
Nấm men được dùng trong sản xuất cồn phải có khả năng lên men các
đường nhanh và càng triệt để càng tốt; đồng thời tạo ít các sản phẩm trung
gian và phụ. Nấm men được dùng trong sản xuất bia và rượu vang phải cho
Nguyễn Thị Hào

6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

sản phẩm có mùi đặc trưng thơm ngon; đồng thời phải có khả năng lắng tốt và
lên men nhanh chóng. Ngày nay nấm men còn được dùng trong sản xuất
protein đơn bào.
1.2.2. Vi khuẩn
Trong vang có nhiều chủng vi khuẩn, bao gồm những chủng vi khuẩn
có lợi và những chủng vi khuẩn không có lợi gây hỏng vang. Những chủng vi

khuẩn có lợi là những chủng vi khuẩn tạo cho vang có vị, hương thơm đặc
trưng như vi khuẩn lactic và nhiều chủng vi khuẩn khác thuộc giống
Lactobacillus. Ngược lại một số vi khuẩn có thể làm hỏng vang hoặc làm cho
vang có mùi khó chịu. Pasteur đã khám phá ra cơ chế làm hỏng vang của các
vi sinh vật khi rượu vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus.
Trên bề mặt của vang còn là một môi trường thuận lợi cho sự hoạt động
của vi khuẩn acetic. Sự hoạt động của loại vi khuẩn này làm biến đổi alcol
thành acid acetic, dẫn đến làm giảm chất lượng của vang.
1.2.3. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của quá trình sản xuất rượu vang,
thùng chứa thiết bị hoặc do bụi, không khí đưa đến. Ví dụ: Aspergillus.
1.3.

Công nghệ sản xuất vang

1.3.1. Khái quát chung về vang
Vang là một loại đồ uống có cồn nhẹ, có giá trị dinh dưỡng và được
mọi người ưa chuộng. Vang được làm từ dịch trái cây nhờ tác động của các vi
sinh vật, trong đó vai trò quan trọng thuộc về nấm men.Từ thời Ai Cập cổ đại
người ta đã biết đến sản xuất vang, từ đây kỹ thuật sản xuất vang được di
nhập dần sang các quốc gia vùng Địa Trung Hải vào khoảng 600 năm trước
công nguyên vào thế kỉ 15 mới xuất hiện ở châu Âu.
Công nghệ sản xuất vang chỉ được bắt đầu vào năm 1857, khi lần đầu
tiên nhà bác học người Pháp Louis Pasteur công bố kết quả nghiên cứu về quá
trình lên men rượu. Trong đó ông chỉ ra cơ sở khoa học của quá trình lên men
rượu, xác định rõ vai trò của nấm men trong sản cồn. Công trình nghiên cứu
Nguyễn Thị Hào

7

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

của ông đã làm thay đổi mạnh mẽ về nhận thức, kỹ thuật và phương pháp sản
xuất rượu vang. Từ đó chất lượng rượu vang ngày càng tốt hơn. Ngày nay với
sự tiến bộ khoa học kỹ thuật, nhiều biện pháp kỹ thuật và phương tiện mới,
hiện đại được ứng dụng trong sản xuất vang. Nhờ đó ngành sản xuất vang đã
gặt hái được nhiều thành tựu về chất lượng và sản lượng.
Nói đến rượu vang thì nguyên liệu chính là trái cây các loại. Vang là
loại đồ uống có cồn nhẹ, được làm từ dịch trái cây nhờ tác động của vi sinh
vật. Bản chất của quá trình lên men vang là đường trong dịch quả bị biến đổi
thành alcol nhờ tác động của nấm men và vi khuẩn lactic. Điều khác biệt cơ
bản của vang so với các loại rượu khác là vang được làm từ dịch trái cây,
không qua trưng cất và lại được tàng trữ lâu trong điều kiện lạnh nên vang trở
thành một loại đồ uống vừa có giá trị dinh dưỡng cao và vừa có tác dụng chữa
trị một số bệnh [1].
Vang được chia làm 3 nhóm chính, đó là vang thường, vang nổ và vang
bổ. Vang bổ còn gọi là vang không có bọt, nó được dùng cùng với thực phẩm
vì thế nó thường xuất hiện trong các bữa ăn. Vang nổ hay còn gọi là
champagne, nó được dùng trong các bữa tiệc, lễ tết, sinh nhật... Dựa vào màu
sắc của vang thường lại được chia thành vang đỏ, vang trắng, vang hồng.
Hoặc dựa vào tính chất của vang thường còn được chia thành vang nhạt và
vang ngọt.
1.3.2. Một số biến đổi trong quá trình lên men
Lên men rượu là một quá trình sinh lí phức tạp, xảy ra dưới tác dụng
của nhiều enzyme. Theo lí thuyết sự tạo thành rượu từ glucose được trải 5 giai
đoạn sau đây [2]:
- Giai đoạn 1: Biến đổi glucose thành fructose- 1,6-diphosphate. Dưới

xúc tác của enzyme hexokinase và isomerase.

Nguyễn Thị Hào

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

- Giai đoạn 2: Biến đổi fructose - 1,6 - diphosphate thành 3 phosphoglyxeraldehyde và phosphodioxyaceton. Nhờ xúc tác của enzyme
aldolase.
- Giai đoạn 3: Trước hết là 3- phosphoglyxeraldehyde biến đổi thành
photphoglyxerate và tiếp tục biến đổi thành 2-photphoglyxerate nhờ xúc tác
của enzyme photphoglyxeratmutase. Giai đoạn cuối cùng của giai đoạn này là
sự biến đổi 2-phosphoglyxerate thành acid pyruvic nhờ xúc tác của enzyme
aldolase và kinase.
- Giai đoạn 4: Acit pyruvic phân cắt nhờ xúc tác của enzyme
decarboxylase thành acetaldehyde, giải phóng CO2.
- Giai đoạn 5: Tạo thành ethanol từ acetaldehyde nhờ xúc của
alcoldehydrogenase.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men:
C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 → 2C2H5OH + 2ATP + H2O
Như vậy sự lên men chuyển đường thành rượu là một dãy quá trình oxi
hóa khử của enzyme trong tế bào nấm men tham gia. Tốc độ lên men của các
chủng Saccharomyces lên men rượu bia là khác nhau đối với các loại đường.
Tốc độ lên men đường glucose và fructose nhanh hơn đường saccarose. Tốc
độ lên men được xác định bằng lượng CO2 bay ra từ 1 thể tích môi trường
nhất định trong một đơn vị thời gian.

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men vang
1.3.3.1. Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của chúng, đối
với nấm men, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28-320C. Tuy nhiên, nếu bắt
đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt
khác, nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường tới 20-220C sẽ hạn chế sự phát
triển của tạp khuẩn. Ở nhiệt độ cao hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh
nhưng chủ yếu là nhiễm lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 300C, nấm
men hoang dại phát triển nhanh hơn nấm men Saccharomyces 2-3 lần, còn ở
Nguyễn Thị Hào

9


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

nhiệt độ 35-380C chủng phát triển nhanh gấp 6-8 lần. Mặt khác khi lên men ở
nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều este, aldehyt và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng.
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong lên men rượu vang. Nó là một
trong những yếu tố kiểm soát quá trình lên men, nhiệt độ cao dẫn đến làm
tăng tốc độ lên men. Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến thành phần hóa
học của vang, những sản phẩm dễ bay hơi được tạo thành trong suốt quá trình
lên men. Hương vị của vang chịu ảnh hưởng rõ rệt với yếu tố nhiệt độ. Trong
sản xuất để hạn chế được ảnh hưởng xấu, tốt nhất trong quá trình lên men ở
một nhiệt độ, vì như vậy nấm men hoàn toàn thích nghi và không phải thay
đổi để phù hợp với biến đổi nhiệt độ [3].
1.3.3.2. Độ pH
Nồng độ ion H+ có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng

có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm
mức thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên
men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định,
trạng thái này phụ thuộc vào pH của canh trường [7]. Trong điều kiện lên men
rượu, pH tối ưu để tạo ethanol là 4,5-5. Nếu tăng pH thì môi trường dễ bị
nhiễm khuẩn, glicerine sẽ tạo ra nhiều hơn và do đó giảm hiệu suất lên men.
1.3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Nồng độ đường quá cao sẽ dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu và làm mất
cân bằng trạng thái sinh lí của nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến
tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men. Ngược lại nếu nồng độ dịch
đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ giảm năng suất thiết bị lên men [7].
Trong nước quả thường có hàm lượng đường không đều do vậy người
ta thường bổ sung thêm đường saccarose. Đa số cấc loại nấm men hoạt động
bình thường trong môi trường có hàm lượng đường nhỏ hơn 20%. Có một số
chủng hoạt động ở môi trường có hàm lượng đường cao hơn. Khi nhân giống
thường dùng môi trường có hàm lượng đường thấp dưới 10% [6].

Nguyễn Thị Hào

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.3.3.4. Ảnh hưởng của SO2
Ngày nay, việc thêm SO2 đã được dùng phổ biến trong nghành rượu
vang. SO2 được biết đến hầu hết trong thực phẩm. Nó cũng được tạo thành 1
lượng nhỏ trong quá trình lên men rượu. Nó được thêm vào trong hầu hết các

khâu của qui trình lên men vang trắng. Nó được sử dụng rất ít trong lên men
vang đỏ, nhưng được thêm sau khi quá trình lên men phụ kết thúc, SO2 được
thêm vào ở dạng bột. Khi bị phân hủy trong vang SO 2 tồn tại ở dạng ion. Ở
dạng này khả năng chống oxi hóa của nó rất mạnh, SO2 không có khả năng

phản ứng trực tiếp với oxygen, nhưng nó có thể liên kết với các yếu tố
oxi hóa khác tạo thành dạng phức hợp với oxygen. Ở dạng phức hợp này
nó có khả năng ức chế sự hoạt động của enzyme làm nâu vang có sẵn
trong quả nho. Vì vậy SO2 có tác dụng làm cho vang tươi lâu.
SO2 còn có khả năng liên kết với acetaldehyde. Đây là chất làm
cho vang có mùi khó chịu, nó được sản xuất khi vang bị oxi hóa. Khi
SO2 và phân tử acetaldehyde liên kết với nhau sẽ tạo nên phức hợp
không mùi. Khi dư thừa SO2 có thể gây hại đến sức khỏe hoặc làm dừng
quá trình lên men trước khi biến đổi toàn bộ lượng đường trong nho
thành rượu. Vi khuẩn chịu trách nhiệm lên men phụ rất nhạy cảm với
SO2. Việc làm giảm tính kháng với SO2 của vi khuẩn malolactic rất dễ
dàng, nhất là đối với những người chưa có kinh nghiệm làm rượu vang.
Vì thế lượng SO2 đem dùng phải ở một tỷ lệ thích hợp [3].
1.3.3.5. Ảnh hưởng của nitơ
Đa số nước quả có các hợp chất nitơ đủ cung cấp cho nấm men.
Song cũng có trường hợp vì hạn hán tùy từng loại quả không đủ nguồn
nitơ cho nấm men sinh trưởng, hoặc do tiến hành lên men từ dịch siro.
Do đó cần phải bổ sung nguồn nitơ. Trong trường hợp này người ta
thường dùng amoni sunfat (NH4)2SO4 [3].

Nguyễn Thị Hào

11

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.3.3.6. Hàm lượng giống
Tác nhân của quá trình lên men là nấm men vì vậy hàm lượng,
chất lượng men giống ảnh hưởng tới quá trình lên men. Hàm lượng men
tăng quá trình lên men tăng nhưng tăng nhiều quá sẽ xảy ra sự cạnh
tranh của nấm men, ảnh hưởng đến quá trình lên men, thông thường tỷ lệ
men giống vào khoảng 10% [3].

Nguyễn Thị Hào

12


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nhiên cứu
2.1. Dụng cụ - Thiết bị
- Tủ sấy
- Tủ cấy vô trùng
- Cân kỹ thuật và cân phân tích
- Nồi hấp áp lực
- Cồn kế, đường kế, máy đo PH
- Buồng đếm hồng cầu
- Kính hiển vi quang học
- Bình tam giác, hộp lồng (đĩa petri), ống nghiệm

- Pipet, que cấy, bông, đèn cồn, bàn trang thủy tinh, phễu thủy tinh, cốc thủy
tinh.
2.2. Môi trường
2.2.1. Môi trường
Hansen (MT1) g/l
Đường glucose: 50g.
Pepton:
5g.
MgSO4.7H2O: 0,5g.
KH2PO4:
1g.
(NH4)2SO4:
1g.
Thạch agar:
20g.
Nước cất: 1000 ml.

2.2.2.Môi trường nhân
giống (MT2) g/l
Đường glucose: 50g.
Pepton:
5g.
MgSO4.7H2O: 0,5g.
KH2PO4:
1g.
(NH4)2SO4:
1g.
Nước cất: 1000 ml.

2.2.3. Môi trường lên

men (MT3) g/l
Dịch siro : 200ml.
MgSO4.7H2O: 0,5g.
KH2PO4:
1g.
(NH4)2SO4:
1g.
Nước cất: 1000ml.

2.3. Nguyên lệu: Siro táo mèo.
2.4. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae từ dịch siro táo mèo.

Nguyễn Thị Hào

13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp tuyển chọn khuẩn lạc nấm men trên môi trường
thạch đĩa
Để tuyển chọn một tập hợp tế bào nấm men tôi dùng phương pháp phân
lập trên hộp petri. Môi trường để tuyển chọn các khuẩn lạc nấm men là môi
trường Hansen.
Cách tiến hành: Môi trường phân lập được khử trùng và phân bố vào
các hộp vô trùng petri vô trùng để nguội theo phương pháp Pasteur. Dịch hoa

quả đã được pha loãng 10-1 →10-9 bằng nước cất. Nhỏ 1-2 giọt huyền phù với
độ pha loãng 10-9 lên bề mặt thạch dàn đều bằng bàn trang vô trùng. Gói kín
và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 28-300C. Trong 3 ngày trên bề mặt xuất hiện
các khuẩn lạc, với các đặc điểm khuẩn lạc hình tròn, lồi, màu trắng, nhẵn
bóng, đặc trưng cho nấm men.
2.5.2. Phương pháp hoạt hóa giống
Trước khi đưa vào môi trường lên men để có những tế bào to khỏe thì
chúng tôi tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trên môi trường thạch
nghiêng 28-300C trong 24 giờ. Sau đó cấy vào dịch nhân giống trong 24 giờ
được giống cấp 2.
2.5.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
Để xác định hoạt lực lên men so sánh giữa các chủng, chúng tôi dùng
các phương pháp sau:
Phương pháp cân bình trọng lượng:
Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250ml môi trường, cùng
có 1 lượng trung bình nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 giờ lên men
đem cân trọng lượng khi chênh lệch giữa 2 lần là 0,1 thì dừng lại.
Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriaev

Nguyễn Thị Hào

14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.5.4. Phương pháp quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi
Quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ

phóng đại 1000 lần.
2.5.5. Phương pháp phân tích
- Xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế.
- Xác định độ cồn bằng alcol kế và phương pháp hóa học.
- Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH.
- Xác định hàm lượng axit trong dung dịch lên men bằng cách dựa vào
nguyên tắc trung hòa axit bằng dung dịch NaOH 0,1N. Từ số ml NaOH 0,1N
dùng để chuẩn ta suy ra hàm lượng axit trong dich lên men.
2.5.6. Phương pháp cảm quan
Phân tích cảm quan thực phẩm là kỹ thuật sử dụng cơ quan cảm giác
của con người để tìm hiểu, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan vốn có
của sản phẩm, thực phẩm như: màu sắc, hình thái, mùi vị…Cảm quan của
vang được tính theo thang điểm 20 (phụ lục 1).
2.5.7. Xác định khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng của nấm men được xác định dựa trên tốc độ lắng của
sinh khối, phương pháp này được tiến hành như sau: hòa sinh khối nấm men
vào dung dịch đệm acid ( có pH= 4,5) được đựng trong các bình có kích
thước bằng nhau với thể tích dung dịch đệm và số lượng nấm men như nhau.
Lắc kỹ trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút và để lắng
trong 15 phút. Sau đó tiến hành đo chiều cao lớp kết lắng, lớp kết lắng cao
nhất thì chủng tương ứng có khả năng kết lắng cao nhất.

Nguyễn Thị Hào

15


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

2.5.8. Phương pháp xử lý các kết quả bằng thống kê toán học
Xử lý kết quả nghiên cứu và đánh giá theo phương pháp thống kê toán
học thông qua các thông số :
n

- Giá trị trung bình số học: X
i 1

X )2

(Xi

- Độ lệch chuẩn:

nếu n< 30

n 1
(Xi

X )2

nếu n≥ 30

n

-

Sai số trung bình học: m

-

Hệ số biến động: cv %

Xi
n

n

X

.100%

N: số lần lặp lại
Xi: giá trị đo lần thứ i.

Nguyễn Thị Hào

16


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và biện luận
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men lên vang táo mèo
3.1.1. Chỉ tiêu cơ bản để tuyển chọn chủng nấm men
Trong thực tế sản xuất, không có một chủng nấm men nào là toàn
năng. Vì chất lượng của rượu vang phụ thuộc vào chủng nấm men còn phụ

thuộc vào các yếu tố địa phương như: nhiệt độ, độ ẩm, dịch quả. Do đó để sản
xuất vang từ nguyên liệu là dịch siro quả táo mèo thì chủng nấm men chúng
tôi lựa chọn cần phải đạt một số chỉ tiêu cơ bản sau:
-Thời gian khởi đầu lên men ngắn.
- Lên men được ở nồng độ đường và nồng độ axit cao.
- Không sinh độc tố, ổn định lâu dài trong sản xuất.
- Mang lại hương và vị đặc trưng cho vang.
- Khả năng cạnh tranh tốt với các vi sinh vật khác, ổn định lâu dài trong
sản xuất.
3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men
3.1.2.1. Phân lập chủng nấm men từ dịch táo mèo
Chọn những quả táo mèo to, không bị bầm dập, không thối nát, vừa
chín tới rửa sạch làm khô, sau đó cho quả ép đường theo tỉ lệ 1:1. Sau 20 ngày
chúng tôi vớt xác quả ra và lọc dịch nước quả. Khi dịch quả có hiện tượng lên
men thì tiến hành phân lập. Môi trường đã hấp vô trùng, được phân vào đĩa
petri vô trùng.
Chuẩn bị 10 ống nghiệm định mức đến 10ml, cho 10ml nước cất vào
từng ống nghiệm. Đậy nút bông và tiến hành khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt
độ 1200C, áp lực 1 atm trong 20 phút. Sau đó chuyển vào buồng cấy vô trùng.
Dùng pipet vô trùng hút lấy 1ml dịch quả cho vào ống nghiệm thứ nhất và đậy
nút bông lại (đây là ống nghiệm có chứa dịch pha loãng ở mức 10-1). Tiến

Nguyễn Thị Hào

17


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

hành lắc trên máy lắc. Sau đó lại hút 1ml dịch ở ống nghiệm có độ pha loãng
10-1 cho vào ống 2 và các thao tác cũng lặp lại như đã làm sẽ thu được dịch
lên men pha loãng ở mức độ: 10-1, 10-2, 10-3,…10-7. Chúng tôi chọn mẫu có
độ pha loãng 10-5- 10-7 để tiến hành các bước tiếp theo.
Phân lập nấm men trên môi trường thạnh đĩa (đã vô trùng), dùng pipet
vô trùng hút lấy 1 ít dịch lên men đã có sẵn nấm men ở các ống nghiệm (có
độ pha loãng 10-5-10-7) nhỏ vào hộp petri, mỗi hộp 1 giọt dịch lên men, sau đó
dùng que trang dàn đều giọt dịch lên men ra khắp toàn bộ bề mặt thạch. Đặt
ngược các hộp lồng, bao gói lại và đặt vào tủ ấm ở 28-300C. Sau 2-3 ngày lấy
ra quan sát khuẩn lạc (về hình dạng, kích thước, màu sắc, độ dày, bề mặt,
đường viền bao quanh và độ trong của khuẩn lạc). Chọn ra những khuẩn lạc
có kích thước to, đứng riêng rẽ cấy vào các ống thạch nghiêng (trong đó có
môi trường Hansen đã được vô trùng) và chuyển toàn bộ ống nghiệm đã cấy
khuẩn lạc vào tủ ấm 28-300C. Chúng tôi tạm ký hiệu là: TM1, TM2, TM3,
TM4. Sau 2-3 ngày lấy ống nghiệm ra quan sát và làm tiêu bản kiểm tra hình
thái tế bào nấm men trên kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại (60x10) và
(100x10), đồng thời tiến hành các thí nghiệm trên MT2, MT3 để tuyển chọn
chủng nấm men phù hợp với mục đích nghiên cứu.
3.1.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men để lên men vang táo mèo
Sau khi phân lập được các chủng trên, chúng tôi tiếp tục bố trí các thí
nghiệm để xác định xem chủng nào có khả năng cho vang chất lượng cao
nhất.
3.1.2.2.1. Kiểm tra khả năng phát triển của các chủng nấm men
Môi trường nuôi cấy sau khi được khử trùng, được đưa vào các bình
250 ml và đặt lên máy lắc ổn nhiệt (20-300C) tốc độ 150 vòng/ phút. Tiến

Nguyễn Thị Hào

18

Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

hành xác định số lượng tế bào nấm men với khoảng thời gian lấy mẫu là 8 giờ
một lần trong 32 giờ liên tục. Kết quả thu được dưới bảng sau:
Bảng 3.1. Số lượng tế bào nấm men x106
Chủng

TM1

TM2

TM3

TM4

0h

3,2±2

3,2±2

3,2±2

3,3±2

8h

6,2±2

5,4±2

10±2

6,5±2

16h

88±2

66±2

100±2

103±2

24h

240±2

305±2

390±2

406±2

32h

248±2

310±2

390±2

498±2

Thời
gian (giờ)

Kết quả thí nghiệm cho thấy: Chủng có tốc độ sinh sản tế bào cao nhất
là TM4, chủng có tốc độ sinh sản tế bào thấp nhất là TM1.
3.1.2.2.2. Kiểm tra hoạt lực lên men
Môi trường nghiên cứu là dịch siro táo mèo được pha loãng để đạt nồng
độ đường là 15%. Tiến hành lên men trong các bình có thể tích 150ml trong
thời gian 36h. Kết quả nghiên cứu thu được ở bảng sau:
Bảng 3.2. Hoạt lực lên men của 4 chủng nấm men
STT

Chủng

1.
2.
3.
4.

TM1
TM2

TM3
TM4

3,4
+
+
++
++

3,8
+
++
++
++

pH
4,2
+
++
+++
++

4,5
++
+++
++++
++

5
++

++++
++++
++

Trong đó: ++++: Hàm lượng CO2 >32g/l dịch lên men
+++ : Hàm lượng CO2 16÷24g/l dịch lên men
++ : Hàm lượng CO2 8÷16 g/l dịch lên men
+: Hàm lượng CO2 < 8 g/l dịch lên men.

Nguyễn Thị Hào

19