Phân lập một số chủng nấm sợ có khả năng chuyển hoá rơm dạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA SƯ PHẠM
BỘ MÔN SINH










ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG


PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ
NĂNG CHUYỂN HÓA RƠM RẠ TỪ LÚA
LÀM PHÂN HỮU CƠ TRỒNG TRỌT






Chủ nhiệm đề tài:
Ths. KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH

Long Xuyên, tháng 9 năm 2010.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA SƯ PHẠM
BỘ MÔN SINH










ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG


PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ
NĂNG CHUYỂN HÓA RƠM RẠ TỪ LÚA
LÀM PHÂN HỮU CƠ TRỒNG TRỌT




BAN GIÁM HIỆU LÃNH ĐẠO ĐƠN VỊ

THỰC HIỆN ĐỀ TÀI





CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI









Long Xuyên, tháng 9 năm 2010.
TÓM LƯỢC
Ô nhiễm môi trường trong sản xuất nông nghiệp hiện nay đang là vấn đề cấp
bách cần giải quyết. Các chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường được sử dụng
ngày càng rộng rãi và trở thành một giải pháp tối ưu trong nông nghiệp. Các chủng vi
sinh vật như nấm sợi có khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải các thành phần hữu
cơ trong các phế thải nông nghiệp, đặc biệt là cellulose khó phân hủy, để làm phân bón
hữu cơ là hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm. Từ đó đề tài : “Phân lập một số
chủng nấm sợi có khả năng chuyển hóa rơm rạ từ lúa làm phân hữu cơ trồng trọt”
nhằm nghiên cứu về vấn đề này.
Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu vi sinh thông dụng như: phân lập
các chủng nấm sợi từ rơm rạ theo phương pháp phân lập trực tiếp của Uyenco, xác định
hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, xác định hoạt độ enzym
cellulase theo phương pháp định lượng đường khử bằng 3,5-dinitrosalysilic (DNS), định

danh nấm sợi theo phương pháp hình thái.
Kết quả nghiên cứu đã đạt được:
1. Đã phân lập được 54 chủng nấm sợi khác nhau từ rơm rạ ở các ruộng lúa
thuộc 6 xã huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang.
2. Đã xác định được 100% chủng nấm sợi đều có khả năng sinh enzym cellulase.
Tổng số chủng có enzym : 54/54 chiếm 100%
Tuyển chọn 3 chủng có hoạt độ cellulase cao nhất trong 7 chủng được chọn
ban đầu là: Đ1 (10,33mg/ml), Đ2 (9,45mg/ml), Đ4 (9,87mg/ml).
3. Ba chủng nấm sợi tuyển chọn được định danh như sau:
Đ1: Trichoderma viride
Đ2: Curvularia pallescens
Đ4 : Trichoderma harzianum Rifai
4. Đã xác định được điều kiện MT tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp
cellulase của ba chủng nấm sợi Đ1, Đ2, Đ4 là:
- Tỉ lệ nguồn cacbon tốt nhất là MT có tỉ lệ 6C: 4R.
- pH thích hợp nhất để ba chủng nấm sinh trưởng và sinh enzym cellulase mạnh
là 6-7.
- Độ ẩm thích hợp nhất cho sinh tổng hợp enzym cellulase là 55% - 65%.
- Nhiệt độ thích hợp nhất là 30
0
C.
- Thời gian thu nhận enzym tốt nhất là 3-4 ngày
5. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của ba chủng nấm sợi Đ1, Đ2,
Đ4 cho thấy chúng đều có khả năng sinh cả 4 loại enzym là cellulase, protease, amylase,
kitinase và sinh kháng sinh kháng lại một số VSV gây bệnh.


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa

Tóm lược
Mục lục
Danh mục các bảng
Danh mục hình
Danh mục các chữ viết tắt

Chương I : MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Lí do chọn đề tài..................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................. 2
1.3. Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài............................................................................. 2
Chương II : TỔNG QUAN .............................................................................................. 3
2.1. Rơm rạ lúa ở Việt Nam ....................................................................................... 3
2.1.1. Thành phần, ứng dụng và tình hình sử dụng rơm rạ ..................................... 3
2.1.2. Sản xuất phân hữu cơ từ rơm rạ .................................................................... 4
2.2. Nấm sợi sinh enzym phân hủy rơm rạ ................................................................... 5
2.2.1. Đặc điểm hình thái nấm sợi......................................................................... ..5
2.2.2. Đặc điểm phân loại nấm sợi........................................................................ ..7
2.2.3. Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi ........................ 7
2.3. Enzym cellulase từ nấm sợi.................................................................................... 9
2.3.1. Khái quát về enzym ................................................................................... 9
2.3.2. Cellulose và enzym cellulase ........................................................................ 9
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tạo thành
enzym cellulase của nấm sợi trên MT lên men bán rắn ............................ 13
2.3.4. Ứng dụng và sản xuất enzym cellulase....................................................... 14
Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................. 17
3.1. Vật liệu................................................................................................................. 17
3.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 20
3.2.1. Phương pháp phân lập mẫu theo Uyenco, 1988......................................... 20
3.2.2. Phương pháp bảo quản nấm sợi trên MT thạch có lớp dầu khoáng ...…. 21
3.2.3. Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi .................................................... 21

3.2.4. Phương pháp quan sát vi thể nấm sợi ........................................................ 21
3.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzym ngoại bào của nấm sợi
bằng phương pháp khuếch tán trên thạch…………………………….…22
3.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzym cellulase bằng phương pháp
định lượng đường khử bằng 3,5- Dinitrosalycylic acid…………………23
3.2.7. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym cellulase ………. … 24
3.2.8. Phương pháp ly trích enzym cellulase …………………………………… 25
3.2.9. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng của MT đến
khả năng sinh enzym cellulase của nấm sợi………………………………. 25
3.2.10. Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng sinh ………………………….......26
3.2.11. Phương pháp sử dụng phần mềm thống kê để xử lý số liệu thực nghiệm..
……………………………………………………………………...……………26
Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 27
4.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh
enzym cellulase từ rơm, rạ lúa .................................................................. 27
4.1.1. Phân lập các chủng nấm sợi từ rơm, rạ lúa ................................................. 27
4.1.2. Tuyển chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh
enzym cellulase ......................................................................................... 27
4.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và phân loại
bảy chủng nấm sợi..................................................................................... 31
4.3. Khảo sát một số yếu tố MT ảnh hưởng đến hoạt độ cellulase của
ba chủng nấm sợi..................................................................................... 35
4.4. Nghiên cứu đặc tính sinh học khác của ba chủng nấm sợi................................... 42
Chương V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 46
5.1. Kết luận ................................................................................................................ 46
5.2. Kiến nghị.............................................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
trang
Bảng 1

: Khả năng sinh enzym celllase của 54 chủng nấm sợi phân lập
..................
28
Bảng 2 : 7 chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao ..............................29
Bảng 3 : Hoạt độ cellulase của 7 chủng nấm sợi (đơn vị mg/ml) ...............................30
Bảng 4 : Đặc điểm hình thái và phân loại của 7 chủng nấm .......................................31
Bảng 5 : Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ enzym cellulase của 3 chủng nấm .........35
Bảng 6 : Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm ..............37
Bảng 7 : Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm .........................38
Bảng 8 : Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm ...........................40
Bảng 9 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm ........................41
Bảng 10: Khả năng tạo enzym ngoại bào của ba chủng nấm sợi .................................42
Bảng 11: Khả năng sinh kháng sinh của ba chủng nấm sợi.........................................44

DANH MỤC CÁC HÌNH
trang
Hình 1 : Bào tử mọc ra khuẩn ty ................................................................................. 6
Hình 2 : KL nấm ......................................................................................................... 6
Hình 3 : Các dạng bào tử trần của nấm sợi ................................................................. 6
Hình 4 : Sự tiếp hợp của nấm sợi ............................................................................... 6
Hình 5 : Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch................................................. 8
Hình 6 : Cấu trúc đơn vị cellulose ............................................................................. 10
Hình 7 : Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose .................................. 10
Hình 8 : Cấu tạo của phân tử cellulose trong không gian ......................................... 10
Hình 9 : Cấu trúc enzym cellulase trong không gian ................................................ 11
Hình 10 : Cấu trúc tinh thể của endoglucanase .......................................................... 11
Hình 11 : Cấu trúc CBH ............................................................................................ 12
Hình 12 : Vị trí cắt exoglucanase ................................................................................ 12
Hình 13 : Cơ chế tác động của enzym cellulase ......................................................... 12
Hình 14 : Vị trí lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang .................. 20
Hình 15 : Đồ thị hoạt độ cellulase của 7 chủng nấm sợi.................................... ……..30

Hình 16 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ1 ...................................................................... 33

Hình 17 : Hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ1

(x40) ...................................... 33
Hình 18 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ2 ..................................................................... 33
Hình 19 : Hình dạng hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ2 (x40)..................... 33
Hình 20 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ4 ...................................................................... 33
Hình 21 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ4 (x40)........................... 33
Hình 22 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ5 ...................................................................... 34
Hình 23 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ5 (x40)........................... 34
Hình 24 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ8 ...................................................................... 34
Hình 25 : Hình dạng sợi nấm và đầu bông cúc chủng Đ8 (x40)................................ 34
Hình 26 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ9 .................................................................... 34
Hình 27 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ9 (x40).......................... 34
Hình 28 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ11 ................................................................... 35
Hình 29 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ11 (x40)........................ 35
Hình 30 : Đồ thị ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ cellulase của ba
chủng nấm sợi ................................................................................. 36
Hình 31 : Đồ thị ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ cellulase của
ba chủng nấm sợi................................................................................... 38
Hình 32 : Đồ thị ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ cellulase của ba
chủng nấm sợi ..................................................................................... 39
Hình 33 : Đồ thị ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ cellulase của
ba chủng nấm sợi ............................................................................... 40
Hình 34 : Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của
ba chủng nấm sợi ............................................................................... 41
Hình 35 : Đồ thị khả năng tạo enzym ngoại bào của
ba chủng nấm sợi ............................................................................. 43
Hình 36 : Hoạt tính cellulase của ba chủng nấm .................................................... 43

Hình 37 : Hoạt tính amylase của ba chủng nấm ..................................................... 43
Hình 38 : Hoạt tính protease của ba chủng nấm .................................................... 43
Hình 39 : Hoạt tính kitinase của ba chủng nấm ..................................................... 44
Hình 40 : Hoạt tính kháng E. coli của ba chủng nấm ......................................... 44
Hình 41 : Hoạt tính kháng B. subtilis của ba chủng nấm ................................... 45



















DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMP : Adenozin mono photphat
CAP : Cataleolite gene Activator Protein
CMC : Carboxymethyl cellulose
CBH : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase

CBHI : Exoglucanase I
CBH II : Exoglucanase II
ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long
DNS : 3,5-dinitrosalicylic axit
Enzym : Enzyme
EG : Endoglucanase
EGI : Endoglucanase I
EGII : Endoglucanase II
KHV : Kính hiển vi
KL : Khuẩn lạc
MT : Môi trường
PTN : Phòng thí nghiệm
PGA : Potato glucose agar
VSV : Vi sinh vật














CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU

1.1. Lí do chọn đề tài
Nấm sợi là vi sinh vật (VSV) rất đa dạng, phong phú và thích hợp với điều kiện
khí hậu Việt Nam. Nấm sợi có tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym thủy phân ngoại
bào mạnh, phân giải các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên, cung cấp chất
dinh dưỡng và năng lượng cho toàn bộ hệ sinh thái. Nghiên cứu các loại nấm sợi có khả
năng sinh enzym phân hủy rác thải, phế phụ phẩm nông nghiệp thành phân bón hữu cơ
sinh học là góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sinh thái phát triển bền vững, năng
suất cao và thân thiện với môi trường.
Việt Nam là một nước nhiệt đới có nền nông nghiệp rất phong phú, đa dạng và
đang trên đà phát triển, vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp rất dồi dào. Xã hội ngày
càng phát triển, việc sử dụng rơm, rạ làm chất đốt phục vụ sinh hoạt gia đình không còn
phát huy tác dụng như trước đây. Sau khi thu hoạch lúa, người nông dân thường đốt hết
rơm rạ ngay tại ruộng hoặc vứt bừa bãi trên các đường giao thông nội đồng, kênh
mương gây ô nhiễm môi trường và làm ách tắc dòng chảy, rơm rạ trở thành nguồn phế
thải rất lớn. Rơm của các vùng đồng bằng sản xuất lúa gạo ở Việt Nam rất nhiều, thông
thường để sản xuất một tấn hạt lúa, cây lúa phải có 6 tấn rơm. Do đó, hiện nay vấn đề sử
dụng nguốn phế thải nông nghiệp này như thế nào để mang lại lợi ích kinh tế cho xã hội
là rất cần thiết và giảm thiểu các vấn đề ô nhiễm môi trường đã và đang xảy ra. Nhất là
trong các vụ hè thu và vụ thu đông. Hiện nay sử dụng lại nguồn rơm này rất nhỏ so với
lượng rơm phải bỏ đi. Thông thường nông dân phải đốt bỏ, chỉ một số ít được sử dụng
lại cho việc sản xuất nấm rơm, hoặc dùng cho che phủ đất cho cây trồng cạn, cho chăn
nuôi đại gia súc...Cùng với sự công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, ô nhiễm môi
trường đang trở thành nguy cơ thật sự. Thành phần chính trong phế thải rắn trong sinh
hoạt công, nông, lâm nghiệp là cellulose, sản phẩm của quá trình phân hủy chất hữu cơ
trong phế thải là mùn có thể làm phân bón rất tốt cho cây trồng. Do đó, xử lý chất thải
bằng vi sinh vật, đặc biệt là các chủng nấm sợi có khả năng sinh các loại enzym, là
hướng tích cực có nhiều ưu điểm so với các phương pháp lí, hóa, cơ học, đang rất được
quan tâm khai thác (Nguyễn Thị Kim Cúc, 2001).
Phân bón hóa học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị chai sạn, thoái hóa, các
loại giun đất không phát triển được, làm hạn chế độ xốp, lượng không khí cần thiết cho

bộ rễ cây thiếu hụt. Ngoài ra nếu sử dụng thêm các loại thuốc trừ sâu hóa học độc hại,
thì các sinh vật, VSV hữu ích cũng bị tiêu diệt theo, gây ô nhiễm cho môi trường, làm
ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người trồng trọt và người tiêu thụ. Vì vậy, các nước có
nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng sử dụng các phân bón hữu cơ sinh
học, đặc biệt là phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu vi sinh có tác dụng tăng cường dinh
dưỡng, độ xốp cho đất, cây trồng đồng thời có tác dụng phòng trừ các loại bệnh có hại
cho cây và đảm bảo an toàn cho môi trường (theo )
Xử lý chất thải hữu cơ bằng vi sinh vật để làm phân bón hữu cơ là hướng nghiên
cứu đang rất được các nhà khoa học quan tâm vì tính ứng dụng thực tiễn rất cao. Từ cơ
sở khoa học và thực tiễn trên gợi ý cho tôi chọn đề tài : “Phân lập một số chủng nấm
sợi có khả năng chuyển hóa rơm rạ từ lúa làm phân hữu cơ trồng trọt”, nhằm tận
dụng nguồn phế thải nông nghiệp sản xuất phân bón cho cây trồng, góp phần xây dựng
một nền nông nghiệp sạch và bền vững, giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường.

1

1.2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ
nguồn rơm rạ lúa.
- Xác định thành phần môi trường tối ưu sinh tổng hợp enzym cellulase
.
1.3. Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài
- Phân lập các chủng nấm sợi từ rơm rạ lúa ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An
Giang.
- Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao.
- Nghiên cứu các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym
cellulase của các chủng nấm sợi được chọn.
- Định danh các chủng nấm sợi được chọn.

2

CHƯƠNG II.

TỔNG QUAN

2.1. Rơm rạ lúa ở Việt Nam

2.1.1. Thành phần, ứng dụng và tình hình sử dụng rơm, rạ
Cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt Nam. Hình
ảnh đất Việt thường được mô tả như một chiếc đòn gánh khổng lồ với hai đầu là hai vựa
lúa lớn là Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH).
Khoảng 80% trong tổng số 11 triệu hộ nông dân tham gia sản xuất lúa gạo, chủ yếu dựa
vào phương thức canh tác thủ công truyền thống. Việc sản xuất lúa gạo đã tạo ra một
lượng lớn phế phẩm từ cây lúa bao gồm rơm rạ và trấu. Rơm và trấu là hai trong số
nhiều nguồn biomass phổ biến và có nhiều tiềm năng ở Việt Nam, chiếm 62,6% trong
tổng khối lượng biomass ở Việt Nam năm 2000 (Trần Diệu Lý, 2008).
Theo Hồ Sĩ Tráng (2004) các thành phần chính của rơm, rạ là những
hydratcacbon gồm: Cellulose (34% – 38%), hemicellulose (32% – 40%), lignin
(12%), tro (14% – 18%). Rơm rạ thô chứa 44% cellulose, 22% hemicellulose, cả hai
polysaccharide này đều là nguồn nguyên liệu khó phân hủy sinh học, nhưng nếu sử
dụng VSV phân giải thích hợp sẽ tạo nguồn phân hữu cơ sinh học rất tốt.
Rơm ở Việt Nam được sử dụng với rất nhiều mục đích. Ví dụ rơm được sử dụng
trong công nghệ phân bón. Vì trong rơm có chứa rất nhiều kali nên rơm thường được
dùng để ủ phân chuồng. Bón phân chuồng ủ rơm vừa làm tăng kali cho đất và giảm chi
phí vào phân bón. Bón phân hữu cơ rất tốt cho đất, giúp phục hồi đất và chống khô cằn
đất. Ngoài ra, trong chăn nuôi, rơm được dùng để lót chuồng cho vật nuôi (ví dụ như bò
sữa). Lót chuồng bằng rơm rất sạch sẽ và tránh đươc phần nào dịch bệnh cho vật nuôi.
Rơm sẽ thấm nước tiểu của vật và sau đó được ủ, cuối cùng sẽ mang đi bón cây. Dùng
rơm lót chuồng để bón ruộng chúng ta sẽ tận dụng được nitơ trong nước tiểu của vật
nuôi và làm giàu nitơ cho đất. Rơm còn được dùng để trồng nấm rơm sử dụng làm chất
đốt cho các hộ nhà nông, chất đống trồng nấm rơm, làm thức ăn cho gia súc, dùng làm
vật liệu xây dựng, làm bê tông siêu nhẹ, dùng sản xuất điện, làm đệm lót vận chuyển
hàng hóa dễ vỡ, vận chuyển hoa quả, v.v…(http//www.khoahoc.com)
Mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn nhưng không được sử dụng một
cách hiệu quả ở Việt Nam. Sau khi thu hoạch, phần lớn rơm rạ được nông dân đốt gây ô
nhiễm môi trường ảnh hưởng đến người – gia súc, gia cầm – các loại cây trồng khác,
làm mất đi vĩnh viễn nhiều nguyên tố quan trọng mà cây trồng đã lấy đi từ đất. Đặc biệt

là cacbon. Các nhà khoa học cho biết thành phần các chất gây ô nhiễm không khí do đốt
rơm, rạ, tác động đến sức khỏe con người là hydrocacbon thơm đa vòng (viết tắt là
PAH); dibenzo-p-dioxin clo hoá (PCDDs), và dibenzofuran clo hoá (PCDFs), là các dẫn
xuất của dioxin rất độc hại, có thể là tiềm ẩn gây ung thư
(
Việc đốt rơm, rạ trực tiếp ngay trên đồng ruộng gây bất lợi cho đồng ruộng lớn
hơn nhiều lần so với việc làm phân bón. Các chất hữu cơ trong rơm rạ và trong đất biến
thành các chất vô cơ do nhiệt độ cao. Đồng ruộng bị khô, chai cứng, một lượng lớn
nước bị bốc hơi do nhiệt độ hun đốt trong quá trình cháy rơm, rạ. Quá trình đốt rơm, rạ
ngoài trời không kiểm soát được, lượng dioxit cacbon CO
2
, phát thải vào khí quyển
cùng với cacbon monoxit CO; khí metan CH
4
; các oxit nitơ NOx; và một ít dioxit
sunfua SO
2.


3

Phần rơm, rạ sót thường được cày lấp vào trong đất làm phân bón cho mùa vụ
sau. Việc phân hủy gốc rạ và rơm phụ thuộc vào độ ẩm của đất, nó ảnh hưởng trực tiếp
đến khối lượng khí metan CH
4
được giải phóng trong khi ủ. Tuy có cung cấp cho đồng
ruộng một chút dinh dưỡng cho vụ tiếp theo, nhưng rất có thể chứa mầm sâu bệnh cho
cây trồng, ảnh hưởng đến sản lượng do tác động bất lợi ngắn hạn bởi bất ổn định hàm
lượng nitơ.
Nếu tình trạng này cứ tiếp tục tiếp diễn thì cùng với sự lạm dụng phân hóa học

đất sẽ càng ngày càng cằn cỗi và chai cứng. Hậu quả lâu dài sẽ không lường trước được.
Trả lại cho đất những gì đã lấy đi của nó là việc làm cần thiết cấp bách của con người.
Làm được việc này chúng ta sẽ hạn chế được việc lạm dụng phân hóa học và thuốc hóa
học trên đồng ruộng mà vẫn đảm bảo được năng suất và ngày nâng cao chất lượng nông
sản. Dần dần chúng ta sẽ lấy lại được độ phì nhiêu cho đất – làm tăng hàm lượng các
chất khoáng – tăng độ tơi xốp của đất – tăng hàm lượng VSV hữu hiệu trong đất (vi sinh
là yếu tố vô cùng quan trọng trong việc chuyển hóa phân bón thành thức ăn cho cây
trồng) - giảm tối thiểu các loại vi khuẩn có hại các loại mầm mống sâu và nấm gây hại
cho cây. Đây cũng là giải pháp quan trọng tạo nên một nền nông nghiệp sinh thái sạch,
an toàn và bền vững (nguồn từ

)
2.1.2. Sản xuất phân hữu cơ từ rơm rạ
Hàng năm, nông dân đổ xuống đồng ruộng lượng lớn phân hoá học, thuốc bảo vệ
thực vật làm cho cấu trúc đất bị thay đổi. Nếu cứ tiếp tục như vậy, đồng ruộng sẽ mất
dần độ phì nhiêu, môi trường ô nhiễm, sức khoẻ con người bị ảnh hưởng. Do vậy, việc
sử dụng rơm, rạ làm phân bón hữu cơ có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế, xã hội. Phân
hữu cơ sinh học là sản phẩm tạo ra thông qua quá trình lên men vi sinh vật, qua đó các
hợp chất giàu cellulose được phân huỷ, trở thành mùn. Sử dụng rơm rạ đúng mục đích,
không chỉ giúp cải tạo đất, nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất nông nghiệp mà còn
hạn chế ô nhiễm môi trường. Phân bón hữu cơ từ rơm, rạ góp phần gia tăng độ mùn, bổ
sung chất dinh dưỡng, nâng cao chất lượng cây trồng. Việc sản xuất phân hữu cơ từ rơm
rạ đã được triển khai nghiên cứu và sử dụng ở một số nơi và hiệu quả rất cao như: Đề tài
“Dự án xây dựng mô hình xử lý rơm rạ làm phân ủ hữu cơ vi sinh phục vụ sản xuất lúa
gạo an toàn và góp phần giảm ô nhiễm môi trường trên địa bàn”, đã được UBND huyện
Bình Giang (Hải Dương) thực hiện thành công (./). Hội
làm vườn tỉnh Vĩnh Phúc phối hợp với công ty TNHH Thái Việt Mỹ sản xuất và ứng
dụng thành công loại phân bón hữu cơ vi sinh học từ các phế thải nông nghiệp, góp
phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, giảm thiểu ô nhiễm môi trường nông
thôn. Ứng dụng này được triển khai tại 150 hộ của huyện Mê Linh, Tam Dương, Tam

Đảo đại diện cho ba vùng đồng bằng, trung du và miền núi…
(./).
Dùng phân hữu cơ vi sinh có thể thay thế được từ 50% - 100% lượng phân đạm hóa
học (tùy từng loại cây trồng bón phân vi sinh có thể tiết kiệm được nhiều chi phí do giá
phân hạ, giảm lượng phân bón, giảm số lần phun và lượng thuốc BVTV)…Do bón vi
sinh nên sản phẩm rất an toàn, lượng nitrat giảm đáng kể, đất không bị ô nhiễm, khả
năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo đất do các hệ sinh vật có ích hoạt
động mạnh làm cho đất tơi xốp hơn, cây dễ hấp thu dinh dưỡng hơn.
Rơm rạ sau thu hoạch được các hộ nông dân thu gom tập kết vào một địa điểm
thuận lợi cho việc ủ hoặc thu gom về tại các gia đình. Trước khi rơm rạ đưa vào ủ, tiến
hành dùng máy vò đập có gia cố thêm phần băm chặt để rơm rạ được vò nát và nhỏ rồi
đánh đống và ủ. Để xử lý rơm rạ trước hết phải tưới nước để rơm rạ đạt độ ẩm từ 80%

4

đến 90% rồi rải rơm theo từng lớp, mỗi lớp dầy khoảng 30cm đến 40cm và tưới men vi
sinh đều khắp trên mặt đống. Ngoài ra cần bổ sung mỗi tấn rơm rạ thêm 0,1kg phân
đạm urê + 1 kg super lân, cứ như vậy cho đến khi đạt độ cao khoảng từ 1,5m đến 1,6 m,
chiều rộng và chiều dài thì tùy điều kiện cụ thể ủ theo quy mô gia đình hay quy mô liên
gia với số lượng nhiều hay ít để đánh đống. Sau 10 ngày thì tiến hành kiểm tra và đảo
trộn để làm cho rơm rạ vụn ra; vi sinh phân bố đều hơn và tưới bổ sung kịp thời những
chỗ chưa thối. Sau 45 ngày đến 50 ngày rơm rạ phân hủy thành phân ủ hữu cơ thì có thể
sử dụng đem bón lót cho cây trồng.Việc dùng men vi sinh xử lý rơm ra làm phân hữu cơ
phục vụ cho sản xuất lúa gạo an toàn đã tận dụng toàn bộ lượng rơm rạ của nông nghiệp
sau mỗi vụ thu hoạch lúa cùng với chế phẩm sinh học tạo ra nguồn phân ủ bón lót cho
cây trồng, cải tạo đất, đảm bảo năng suất cây trồng, tạo ra sản phẩm lúa an toàn ít tồn dư
hoặc không còn tồn dư các hóa chất độc hại trong sản phẩm lúa, góp phần bảo vệ môi
trường, bảo vệ sức khỏe cộng đồng
Theo nghiên cứu, rơm rạ từ lúa có thành phần NPK như sau (g/kg trọng lượng khô):
•

5,5 N
•
0,9 P
•
23,9 K
Theo ước tính mỗi ha ruộng lúa có trung bình khoảng 250.000 gốc rạ. Mỗi gốc rạ có
trọng lượng khô khoảng 250g, như vậy ta sẽ thu được trên 1 ha chất thải từ rơm rạ trong
đó có chứa:
•
344 kg N
•
56 kg P
•
1494 kg K
(nguồn
2.2. Nấm sợi sinh enzym phân hủy rơm, rạ
Cellulose là một trong những thành phần chủ yếu của tổ chức rơm, rạ. Cellulose
là hợp chất rất vững bền, đó là loại polysaccharide cao phân tử. Trong tự nhiên có nhiều
loại VSV có khả năng sinh ra các men làm xúc tác trong quá trình phân giải cellulose.
Chúng có ý nghĩa rất lớn đối với việc thực hiện vòng tuần hoàn cacbon trong tự nhiên,
góp phần quan trọng trong việc nâng cao độ phì nhiêu của đất. Trong điều kiện tự
thoáng khí cellulose có thể bị phân giải dưới tác dụng của nhiều VSV hiếu khí. Ngoài
ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia tích cực vào quá trình phân giải
cellulose. Các loài vi sinh vật như: Cytophaga, Cellulomonas, giống Bacillus, giống
Clostridium, Aspergillus, Penicillium …(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.2.1. Đặc điểm hình thái của nấm sợi
Nấm sợi là VSV có nhân chuẩn. Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ kitin-
glucan, kitozan. Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha) không vách ngang
hoặc có vách ngang (septum). Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài do tăng trưởng
ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể

(hình 2.1). Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng khuẩn lạc (KL) khác nhau tùy theo cơ
chất rắn, lỏng hay mềm (hình 2.2). KL nấm sợi thường có dạng hình tròn, hoặc gần tròn.
Bề mặt KL có thể mượt, nhẳn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có
những vết khía xuyên tâm, hoặc lồi lõm không đều. Mép KL trơn, răng cưa (Nguyễn
Lân Dũng, 2001).

5


Hình 1. Bào tử mọc ra khuẩn ty Hình 2. KL nấm (nguồn: internet)
Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào môi trường (MT) hoặc tiết chất hữu cơ kết
tinh trên bề mặt sợi nấm.
Các đặc điểm hình thái khác như có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết,
sắc tố hòa tan…, làm KL nấm sợi có tính đặc trưng loài (Bùi Xuân Đồng, 2000).
Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp phụ qua màng, không có cơ quan tiêu
hóa, không có khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một
số gây bệnh trên người và động thực vật.
Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính
hoặc hữu tính (Bùi Xuân Đồng, 2000).
Bào tử vô tính. Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín. Bào tử trần là
dạng bào tử phổ biến nhất.

Hình 3. Các dạng bào tử trần của nấm sợi (nguồn: internet)
Sinh sản hữu tính. Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như: đẳng giao,
dị giao, và tiếp hợp. Ngoài ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản hữu tính bằng bào tử
túi (ascospores) và bào tử đảm (basidiospores).

Hình 4. Sự tiếp hợp của nấm sợi (nguồn: internet)
2.2.2. Đặc điểm phân loại của nấm sợi
Trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên

được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài. Phân
loại vi nấm vẫn đang ở thời kỳ phân loại học hình thái (Phenetic classifications) dựa vào
đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh
sản. Trong những năm gần đây, tiến bộ của sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi

6

điện tử đã đem lại một diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học
nấm (Nguyễn Lân Dũng, 2001).
Hiện nay, tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, chủ
yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973), V.Arx (1981),
Ainsworth & Bisby (1983), Kendrick (1992), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos
& Mins (1996), Robert A. samson (1989), Saccardo P.A (1880- 1886), Barron G.L
(1968), Ellis M.B (1971), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Barnett H.L và cộng sự (1972)
(Đặng Vũ Hồng Miên, 1998).
Trong đề tài này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khóa phân loại:
Ainsworth G.C (1973), Saccardo P.A (cải tiến), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Đặng
Hồng Miên, Nguyễn Đức Lượng (2003), Nguyễn Lân Dũng (2006) để phân loại.
2.2.3. Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi
Nấm sợi được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh
các chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh tế cao như: nguồn
enzym, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất có khả năng phân giải nguồn
cacbonhydro, ứng dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong
lòng đất …..(Nguyễn Lân Dũng, 1973; Nguyễn Xuân Thành, 2000).
- Hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào.
Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong và
ngoài cơ thể. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzym, trong
đó phần lớn là enzym từ thực vật và VSV. Nấm sợi có tiềm năng lớn nhất sinh các loại
enzym ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển hoá các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan
trong tự nhiên. Một số enzym đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến

như: cellulase, protease, amylase, pectinase và kitinase (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Enzym cellulase. Xúc tác phân giải các hợp chất ligno - cellulose thành
glucose. Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose
(30%-40%), hemi-cellulose và lignin (15%-30%). Các chủng nấm sợi Trichoderma,
Penicillium, Aspergillus….có khả năng sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản
xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose…(Hoàng Quốc
Khánh, 2003).
Enzym protease. Protein là các polyme cấu tạo từ các axit amin liên kết nhau
bằng liên kết peptid rất dễ bị cắt đứt tạo thành các chuỗi polypeptid ngắn. Nấm sợi có
khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,…
Được sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp bột giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác như
công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp thực phẩm, xử lý chất
thải…(Đồng Thị Thanh Thu, 2004).
Enzym amylase. Xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của
thực vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase
và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside trong phân
tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. Nấm sợi có khả năng phân giải tinh
bột nhanh chóng như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor….. được
ứng dụng trong sản xuất sirô, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong
chế biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt…(Võ Thị Hạnh, 2004).
Enzym kitinase. Kitin là các biopolyme chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên
kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong đồng ruộng, lượng kitin trong xác,
vỏ tôm, cua, ốc…rất nhiều. Nấm sợi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… sinh

7

enzym kitinase phân giải kitin, đồng thời tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây
bệnh có thành tế bào là kitin, chống các loài côn trùng có vỏ kitin. Như vậy, nấm sợi còn
có vai trò làm tác nhân kiểm soát sinh học chống các VSV gây bệnh và côn trùng có hại
trong nông-lâm- ngư nghiệp (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Các chủng nấm sợi Acremonium, Aspergillus, Penicillium còn có khả năng sinh
enzym phân giải dầu mỏ và khí đốt là hợp chất có cấu tạo phức tạp và khó phân giải,
góp phần xử lý ô nhiễm dầu do các tai nạn chìm tàu dầu.

Hình 5. Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch
- Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi
Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một
VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát
triển của VSV khác.Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm sợi chiếm tỉ lệ khá lớn, đa
số thuộc lớp nấm bất toàn. Chất kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong y học như:
Cephaco-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây
bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu thuật chữa
các bệnh nhiễm trùng vết thương. Chất kháng sinh được sinh ra nếu kết hợp với các
enzym thủy phân protein là một trong những phương thức có nhiều triển vọng nâng cao
hiệu quả điều trị của kháng sinh. Những vấn đề về chất kháng sinh được sinh ra từ VSV
đang là vấn đề quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc
sống ngày nay (Nguyễn Thành Đạt, 2005).
- Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng
Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều. Các axit hữu cơ như
axit axetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong công nghệ
chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh
đã nghiên cứu sản xuất axit xitric bằng nấm sợi A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì.
Ngoài ra, các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng
Giberrelin từ hai chủng nấm sợi F. monoforme và F. oxysporum.
Tuy nhiên, có rất nhiều loài nấm sợi mọc trên các nguyên vật liệu, đồ dùng, thực
phẩm, phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng. Một số nấm sợi tiết độc tố gây
ngộ độc hoặc có thể gây ung thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư
gan. Một số gây bệnh cho người và động vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm tay
chân…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ bông ở lúa….
2.3. Enzym cellulase từ nấm sợi

Ngày nay, nguồn enzym từ VSV như amylase, cellulase, protease,
kitinase…được chú ý nhiều nhất do có những ưu điểm: Có hoạt tính cao; khối lượng
enzym thu được nhiều do tốc độ sinh sản của VSV nhanh; nguyên liệu rẻ tiền; có thể
sản xuất theo quy mô công nghiệp….(Nguyễn Đức Lượng, 2000).
2.3.1. Khái quát về enzym
- Cấu trúc
Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản

8

ứng sinh học. Enzym có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton, được cấu tạo từ
L-axit amin liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là
trung tâm hoạt động của enzym.
Enzym gồm 2 nhóm: Nhóm enzym một cấu tử gồm những enzym có thành phần
hóa học duy nhất là protein và nhóm enzym hai cấu tử gồm những enzym có hai thành
phần: phần protein thuần gọi là apoenzym có vai trò xúc tác, phần thứ hai là coenzym
gồm những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác. Ngoài ra, có một
số kim loại như Fe, Cu, Zn, Mn, …đóng vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, liên kết
giữa apoenzym và coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
- Cơ chế hoạt động
Hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong trung tâm hoạt động. Trung
tâm hoạt động của enzym (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất (S) mà
chúng tham gia. Phản ứng không có sẳn mà được hình thành trong quá trình enzym tiếp
xúc với cơ chất giống như chìa khóa vào ổ khóa tạo thành enzym - cơ chất (E-S).
Cơ chế tác động của enzym vào cơ chất qua ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: Enzym (E) tương tác với cơ chất (S) bằng những liên kết yếu tạo
thành phức enzym - cơ chất (E-S).
Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzym (E) sẽ bị thay đổi cấu hình
không gian và mức độ bền vững các liên kết. Các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm.

Phức enzym cơ chất (E-S) sẽ được tách ra.
Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm và
tách khỏi enzym.
Phản ứng tổng quát:
E + S ←→ E-S → E + P
E- enzym (enzyme) ; S- cơ chất (substracte) ; P- sản phẩm (Products)
2.3.2. Cellulose và enzym cellulase
- Cellulose
Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima, 2002),
được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.10
9
tấn/năm. Hàng năm có khoảng
232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp. Hàng
ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy trong đất do các sản phẩm tổng
hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người
thải ra dưới dạng rác rưởi, giấy vụn, mùn cưa…(Trần Thạnh Phong, 2004).
Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là
cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40%-50% trong gỗ. Cellulose là
polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là cellobiose có cấu trúc từ hai
phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucoside. Cellulose cấu tạo
dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các micrôfibrin có cấu trúc
không đồng nhất. Có những phần đặc gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là phần
vô định hình.

9


Hình 6. Cấu trúc đơn vị cellulose (nguồn: )

Hình 7. Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose (nguồn:

)

Hình 8. Cấu tạo của phân tử cellulose trong không gian (nguồn:
)
- Enzym cellulase
Cấu trúc:
Trong thiên nhiên không gặp cellulase ở dạng tinh khiết. Nó thường tồn tại ở
dạng kết hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase, pentozanase thành hệ
enzym gọi là Citolase. Cellulase là một phức hệ enzym bao gồm các enzym C1, Cx và
β-glucosidase tham gia những phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose tạo thành
glucose (Warzywoda, M.Lacbre, E.Pourqui, E.J .1992).

Hình 9. Cấu trúc enzym cellulase trong không gian
(nguồn: : http://www. CAT. INIST.mht.)

10

+ Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự nhiên thành
cellulose phản ứng (cellulose vô định hình).
+ Enzym Cx: Còn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thuỷ phân cellulose phản ứng
thành cellobiose. Enzym này được chia thành hai loại:
Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Có tác dụng thủy phân
liên kết β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử cellulose. Được chia làm
hai loại EGI, EGII. Cả hai loại enzym này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao.


Hình 10. Cấu trúc tinh thể của endoglucanase
(nguồn:
Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải chuỗi trên thành
disaccarit gọi là cellobiose từ đầu không khử. Bao gồm hai loại CBHI và CBHII:

* CBHI có trọng lượng phân tử khoảng 65KD, chứa khoảng 496 axit amin.
Enzym này tác động lên cellulose vô định hình, ưu tiên liên kết với vùng tinh thể của
cellulose, không tác động lên cellulose biến tính như CMC.
* CBHII có trọng lượng phân tử là 53KD, chứa khoảng 471 axit amin. CBHII
liên kết với cả vùng tinh thể và vùng vô định hình, không tác động lên cellulose biến
tính [52].

Hình 11 . Cấu trúc CBH Hình 12. Vị trí cắt exoglucanase
(nguồn: />)
+ β-glucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21): Thủy phân cellobiose thành
glucose. Là nhóm enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất rộng từ 4,4 đến
8,4. Trọng lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.
Cơ chế hoạt động :

11



Cellulose
phản ứng
Glucose Cellobiose
C1 Cx
β-Glucosidase
Cellulose
Hình 13. Cơ chế tác động của enzym cellulase (Lương Đức Phẩm, 1978)
Theo Mandels và Reese (1964), đầu tiên, enzym C1 phá vỡ liên kết hydrogen
trong phân tử cellulose tạo thành cellulose phản ứng. Sau đó Cx tiếp tục thủy phân
cellulose phản ứng thành các phân tử cellobiose. Cuối cùng, β-glucosidase phân cắt
cellobiose thành glucose.
- Điều hoà sinh tổng hợp enzym cellulase

Khả năng sinh tổng hợp cellulase trong các loài nấm sợi được điều hòa ở mức độ
phiên mã, mức độ mRNA mã hóa cho CBHI luôn cao nhất (Pettila, 1993). Tỷ lệ enzym
CBHI cao nhất chiếm khoảng 50% trong hổn hợp cellulase được tiết ra bởi T.reesei
(theo Gritzali và Brown, 1979), mức độ mã hóa các thành phần khác của enzym
cellulase luôn ở trạng thái ổn định (Trần Thạnh Phong, 2004).
Quá trình sản sinh enzym cellulase được kiểm soát theo cơ chế cảm ứng và ức
chế bởi glucose. Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng trên MT có chứa
cellulose, dẫn xuất của cellulose, lactose, còn trên MT có chứa glucose, fructose hoặc
glycerol thì cellulase không tạo thành enzym cellulase (Biaria và Mishra, 1989).
Hơn nữa, hoạt tính cellulase còn phụ thuộc vào sự có mặt của các chất ức chế
trong MT nuôi cấy. Nhiều hợp chất phenol đã được chứng minh là có tác dụng kìm hãm
sự phát sinh cellulase ở S. commune (Hồ Sĩ Tráng, 2004).
Khi nuôi cấy nấm cũng xảy ra hiện tượng hoạt hóa cellulase. Chẳng hạn, hai loại
proteaza axit được tạo ra trong điều kiện phân hủy cellulose có khả năng làm tăng 10
lần hoạt tính endoglucanase của P. chrysosporium (Hồ Sĩ Tráng, 2004).
Quá trình tổng hợp enzym cellulase cảm ứng còn chịu tác động của AMP vòng
(AMPv) có tác dụng kích thích quá trình sao chép mã của các operon phân giải nhờ một
loại protein đặc biệt làm trung gian gọi là protein nhận AMPv (CAP). Khi AMPv kết
hợp với CAP tạo thành phức hợp có tác dụng hoạt hóa gen operator làm cho RNA-
polymerase dễ dàng kết hợp với chúng để bắt đầu sao chép mã (Nguyễn Đức Lượng,
2001).
Nấm sợi chịu tác động trực tiếp của các yếu tố bên ngoài rất mạnh và phản ứng
lại với tác động đó rất nhanh. Vì thế, có thể sử dụng pH, nhiệt độ và đặc biệt là cơ chất
mà chúng tham gia phân hủy để điều khiển tổng hợp enzym. Khi ta cho cơ chất với liều
lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzym cảm ứng sẽ tăng dần. Nếu cứ tiếp tục tăng
liều lượng cơ chất thì sẽ đến một mức nào đó quá trình này sẽ chựng lại và giảm do tăng
áp suất thẩm thấu bởi cơ chất (Nguyễn Đức Lượng, 2001).
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tạo thành enzym của
nấm sợi trên MT lên men bán rắn
- Nguồn dinh dưỡng cacbon

Trong MT nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase nhất thiết phải có cellulose là
chất cảm ứng và nguồn cacbon. Nấm sợi có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon
khác nhau. Glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình

12

chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff. Cơ
chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzym cellulase thường là giấy lọc, bông, bột
cellulose, cám, lõi ngô, mùn cưa, bã mía, trấu, rơm, than bùn, CMC, …các chủng
Trichoderma nuôi trên MT có nguồn cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzym cao nhất
(Lương Đức Phẩm, 1978).
- Nguồn dinh dưỡng nitơ
Các nguồn nitơ thích hợp nhất đối với các VSV sinh cellulase là muối nitrat.
Natri nirat làm cho MT kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase. Các
hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase tùy vào đặc tính
sinh lý của từng chủng. Cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase, cao ngô
có khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase mạnh hơn nấm men. Nước
chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase, còn cao ngô kích thích
CHBI và CBHII. Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt của các axit
amin, các nguyên tố khoáng và những nhân tố kích thích sinh trưởng (Trần Thạnh
Phong, 2004).
- Nguồn dinh dưỡng khoáng
Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu… có vai trò quan trọng như tham gia
vào quá trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, tham gia vào
thành phần cấu tạo prôtêin, enzym, điều hòa pH MT nuôi cấy nên ảnh hưởng đến khả
năng tổng hợp cellulase. Nồng độ tối thích của Zn là 0,11- 2,2 (mg/l), Fe 2 - 10 (mg/l),
Mn 3,4 - 27,2 (mg/l). Biotin và Tiamin không có ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzym
này (Châu Hoàng Vũ, 2003).
- Ảnh hưởng của độ ẩm
Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất rắn. Các

cơ chất khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30%- 80% (Moo-Young, 1983).
Trong quá trình nuôi cấy nấm sợi thu enzym cellulase độ ẩm có ảnh hưởng rất lớn đến
khả năng sinh enzym và hoạt tính của enzym. Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy nấm sợi là
50%-60%, nếu độ ẩm vượt quá 60% tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, nếu độ ẩm
<60% gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi, hoạt tính của enzym sẽ giảm. Kim
(1985) cho biết tốc độ sinh trưởng tối ưu của T. reesei ở độ ẩm 60%, nhưng khả năng
sinh tổng hợp cellulase ở độ ẩm xấp xỉ 65% (Lê Thị Hồng Nga, 2005).
- Ảnh hưởng của pH
Sự sinh trưởng của nấm sợi sẽ gây ra sự thay đổi pH đáng kể trong cơ chất. Cơ
chất bị oxy hóa không hoàn toàn sẽ sinh ra acid, hoặc hấp thụ ion amonium sẽ làm giảm
pH. Ngược lại, sự giải phóng ammonia qua sự loại nhóm amin của urea hoặc các amin
khác sẽ làm tăng pH. pH tối ưu cho các loài nấm sợi khác nhau được sử dụng trong lên
men bán rắn có giá trị từ thấp nhất là 3 đến cao nhất là 8 (Prior, 1992) tùy vào từng
chủng nấm sợi khác nhau. Nấm sợi Aspergillus, Penicillium và Rhizopus có thể giảm
pH của MT xuống dưới 3, Đối với các chủng nấm Trichoderma, Sporotrichum,
Pleurotus, pH ổn định hơn ở khoảng 4 và 5 (Trần Thạnh Phong, 2004). Trong suốt quá
trình nuôi cấy nấm sợi ta có thể điều chỉnh pH của MT bằng axit HCl, H
2
SO
4
, NaOH,
KOH. Durand (1988) đã điều chỉnh pH trong nuôi cấy T. viride ở qui mô pilot trên MT
hạt cà phê-đường bằng cách phun dung dịch urea, do hoạt động của urease của nấm sợi
làm tăng pH qua việc tạo ammonia (Phạm Ngọc Lan, 2005). Ngoài ra, việc điều chỉnh
pH thích hợp trong quá trình nuôi cấy nấm sợi hạn chế sự tạp nhiễm vi khuẩn làm ảnh
hưởng đến hoạt tính enzym.

13

- Ảnh hưởng nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzym
cellulase. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 28
0
C-32
0
C, tối đa
dưới 50
0
C . Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng thậm
chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzym sẽ bị ức chế. Theo Raimbaut
& Alazard (1989) cho biết nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của A. niger trên MT
bột khoai mì là 35
0
C- 40
0
C, ngược lại ở 45
0
C, sự nảy mầm của sợi nấm bị ức chế, khả
năng sinh enzym giảm (Trần Thạnh Phong, 2004).
- Ảnh hưởng của MT khí
MT không khí quan trọng nhất là khoảng không gian giữa các tiểu phần cơ chất,
vì đây là nơi mà sinh khối nấm sợi sinh trưởng. Trong nuôi cấy nấm sợi sinh enzym
cellulase, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng
khoảng 20%- 25% sẽ làm tăng độ xốp của MT, tạo nên những khoảng trống để không
khí có thể lưu thông trong lòng MT, đồng thời trấu còn là cơ chất cảm ứng cho sự tổng
hợp của enzym cellulase (Lương Bảo Uyên, 2002).
- Ảnh hưởng của cơ chất và các chất kìm hãm
Ở giai đoạn đầu, khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng, nhưng khi
tốc độ phản ứng đạt cực đại, dù ta có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng sẽ
hoàn toàn không có khả năng tăng theo. Nguồn cacbon và nitrogen ảnh hưởng mạnh

đến tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzym. .
Các chất kìm hãm là những chất hóa học có thể làm giảm hoặc mất hoạt tính
enzym, thường là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ… Các chất kìm hãm cạnh tranh
có cấu trúc không gian tương tự cấu trúc không gian của cơ chất nên sẽ kết hợp với
enzym ở trung tâm hoạt động, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất.
Các chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzym ở vị trí ngoài trung tâm hoạt
động của enzym làm giảm tốc độ phản ứng của enzym (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3.4. Ứng dụng và sản xuất enzym cellulase
Enzym cellulase thu hút được sự chú ý của các nhà công nghệ vì chúng có thể
được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực sau:
Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose:
Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất rất khó phân hủy.
Trong điều kiện tự nhiên thời gian phân hủy rất lâu (trên 8 tháng), ở điều kiện khí hậu
nhiệt đới. Thời gian phân hủy các chất thải này càng lâu càng gây ô nhiễm đất, nước,
không khí. Các chất thải này cũng khó tham gia vào dây chuyền chuyển hoá vật chất
của thiên nhiên, gây mất cân bằng sinh thái. Để khắc phục tình trạng này, các nhà khoa
học đã đưa vào khối ủ chế phẩm VSV giàu cellulase, kết quả là các chất thải bị phân
hủy trong thời gian dưới 1 tháng, góp phần hạn chế MT (Lê Thị Thanh Thủy, 2001).
Ứng dụng trong sản xuất sản phẩm thực phẩm, thực phẩm gia súc:
Các sản phẩm thực phẩm được sản xuất từ các nguyên liệu thực vật chứa nhiều
cellulose gây ra hiện tượng khó tiêu hóa ở người. Người và những động vật không nhai
lại thường thiếu VSV phân giải cellulose trong đường tiêu hóa. Do đó, việc chế biến
thực phẩm nhất là một số sản phẩm đồ hộp bằng chế phẩm cellulase có ý nghĩa làm tăng
hiệu suất sử dụng thức ăn. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thêm chế phẩm cellulase vào
thực phẩm gia súc làm tăng trọng đàn lợn và tăng chất lượng thịt (Nguyễn Đức Lượng,
2004).

14

Ứng dụng làm phân bón VSV:

Các chế phẩm VSV có khả năng tổng hợp cellulase mạnh, khi được bón vào đất
trồng có nhiều chất hữu cơ chứa cellulose sẽ phân hủy nhanh các chất hữu cơ tạo thành
mùn, giúp cây trồng phát triển nhanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Ứng dụng trong kỹ thuật di truyền:
Enzym cellulase sẽ phá vỡ thành tế bào thực vật để tạo tế bào trần, rất cần thiết
trong quá trình chuyển gen của tế bào thực vật (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Ứng dụng trong công nghệ bột cellulose và giấy, công nghệ sợi dệt, công
nghiệp chất tẩy rửa:
Đây là hướng được các nhà sản xuất quan tâm nhiều trong những năm gần đây.
Sử dụng enzym cellulase để tách mực khỏi giấy báo và tạp chí cũ, cải thiện tính chất
quang học cũng như độ bền cơ lý của giấy sản xuất từ bột khử mực. Ở Mỹ, hơn 40%
tổng lượng giấy sử dụng là bắt nguồn từ giấy loại, ở Nhật Bản khoảng 55%.
Trong công nghệ sợi dệt, enzym này được sử dụng để xử lý quần áo bò, làm
bóng vải bông, vải sợi nhân tạo giúp vải mềm mại hơn, độ hút ẩm tăng lên, bề mặt vải
đẹp hơn.
Trong công nghiệp chất tẩy rửa, các chất tẩy rửa chứa enzym cellulase làm sạch
các chất bẩn trong lòng xơ bông tốt hơn sử dụng phương pháp tẩy rửa thông thường (Hồ
Sĩ Tráng, 2004).
Một số chế phẩm enzym cellulase trên thế giới và Việt Nam:
Ngày nay, trên thế giới và cả Việt Nam, các chế phẩm sinh học chứa các VSV
có khả năng sinh các loại enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi và phổ
biến trong các lĩnh vực chăn nuôi, trồng trọt,…. Điều này giúp giảm bớt giá thành sản
xuất, hạn chế được tình trạng ô nhiễm MT.
Enzym cellulase kỹ thuật chủ yếu được thu nhận từ Trichoderma reesei,
Aspergillus niger…và gần đây là các chủng vi khuẩn.
Ở Đan Mạch, hãng Novo Nordisk có chế phẩm “Celluclast” dùng trong thức ăn
gia súc.
Ở Pháp, hãng Lyven dùng “Cellulases” từ T. reesei và từ A. niger trong công
nghiệp thực phẩm.
Ở Nhật, hãng Amano hàng năm đã sản xuất trên 8000 tấn chế phẩm enzym các

loại để dùng trong nông nghiệp. Enzym “Panxenlase” chứa cellulase, hemicellulase,
protease và amylase, hoạt tính dùng trong chăn nuôi. Chế phẩm “Cellubrix”,
“Cellusoft”, “Onozuka” dùng trong công nghiệp làm mềm vải, trong thức ăn gia súc .
Ở Canada, hãng Logen sử dụng “Cellulase” trong thức ăn gia súc, công nghiệp
giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol.
Ở Liên Xô (cũ), chế phẩm “Cellolignorin” được sử dụng trong chăn nuôi, hoạt
tính 1-50 đơn vị/g, chứa cellulase, hemicellulase, pectinase .
Ngoài ra, còn có các chế phẩm cellulase khác được tạo ra bởi các nhà sản xuất:
Cellulaset và Novozyme 234 [NO], Econase C15 [AO], Rohament CT [RM], Avizyme
[FR], Sumizyme c [SN], Meicelase MC [MJ], Cellulase TAP [AM], Cytolase [GR] (Lê
Đức Mạnh, 2001).

15

Ở Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII,
BioIII … có dạng bột, chứa các enzym amylase, protease, cellulase và các VSV dùng bổ
sung vào thức ăn cho bò, heo, cá. Chế phẩm có tác dụng phòng chống các chứng rối
loạn tiêu hóa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa
và khí thải ở đáy ao…
Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩm Trichotech
chứa vi nấm Trichoderma, chế phẩm này có dạng rắn, tơi xốp, nhẹ, màu xám nâu đậm,
giúp cây trồng chống được các loại nấm bệnh….
Công ty TNHH TM và sản xuất Mai Xuân (TP. Hồ Chí Minh) sản xuất chế
phẩm TRICHO-MX chứa vi nấm Trichoderma, có dạng bột. Có tác dụng hạn chế nấm
hại, cải tạo đất, ủ phân bón cho cây trồng.
Công ty TNHH TM và sản xuất thuốc thú y- thuốc thủy sản Minh Dũng (Bình
Dương) đã sản xuất nhiều chế phẩm chứa vi nấm Aspergillus sinh enzym cellulase,
dùng xử lý nước ao nuôi tôm cá, kích thích tiêu hóa, ở gia súc…như: MD-Bio-Zemix,
Biofat, Bio vitamin, Biolaczym…(http//www.khoahoc.com).

16