Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu vực xuân hòa, phúc yên, vĩnh phúc

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN



TRẦN THỊ DUNG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME
CELLULASE TRONG ĐẤT ĐỒI TẠI KHU VỰC
XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học






HÀ NỘI, 2014
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN



TRẦN THỊ DUNG



PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME
CELLULASE TRONG ĐẤT ĐỒI TẠI KHU VỰC
XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG
HÀ NỘI, 2014
LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình sống và học tập tại Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2
em đã nhận đƣợc sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các thầy cô trong trƣờng và
các thầy cô trong khoa Sinh – KTNN. Em cảm ơn thầy cô đã truyền đạt
những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt 4 năm học vừa qua.
Đặc biệt với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn
PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung ngƣời hƣớng dẫn trực tiếp em, đã tận tình
hƣớng dẫn em thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật học
đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian làm đề tài.
Qua đây, em xin chân thành cảm ơn tất cả những ngƣời thân trong gia
đình, bạn bè đã ủng hộ va động viên em hoàn thành tốt khóa luận.
Do thời gian và điều kiện có hạn nên trong khóa luận không thể tránh
khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận đƣợc sự góp ý của các thầy cô cùng các
bạn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Trần Thị Dung



LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp với đề tài “ Phân lập và tuyển
chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu
vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc” là công trình nghiên cứu của riêng tôi
dƣới sự hƣớng dẫn của cô giáo PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung. Các kết quả
nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không
trùng với công trình của các tác giả khác.
Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Trần Thị Dung

CÁC TỪ VIẾT TẮT
ADP : Diaminopimelic Acid
CFU : Colony Forming Unit
CMC : Cacboxyl methyl cellulose
DNA : Deoxyribonucleic Acid
HSCC : Hệ sợi cơ chất
HSKS : Hệ sợi khí sinh
ISP : International Streptomyces Project
RNA : Ribonucleic Acid
rRAN : Riboxom Ribonucleic Acid
m : meso
PG : PeptidoGlycan
VSV : Vi sinh vật












MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu đề tài 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2
5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3
7. Điểm mới của đề tài 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn 4
1.1.1. Một số phƣơng pháp trong phân loại xạ khuẩn 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 10
1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn 14
1.2.1. Cellulose 15
1.2.2. Cellulase 15
1.2.3. Hệ enzyme phân giải cellulose 16
1.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose ở Việt Nam và
trên thế giới 17
1.3.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose trên thế giới 17
1.3.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose ở Việt Nam 17
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật 20
2.1.1. Vi sinh vật 20
2.1.2. Hóa chất và thiết bị 20
2.2. Môi trƣờng 20
2.2.1. Môi trƣờng phân lập 20
2.2.2. Môi trƣờng bảo quản và giữ giông 21
2.2.3. Môi trƣờng thử hoạt tính enzyme 22
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 23
2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 23

2.3.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất 23
2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống 25
2.3.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 25
2.3.5. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn 26
2.3.6. Phƣơng pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu. 27
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa,
Phúc Yên, Vĩnh Phúc 28
3.1.1. Phân lập xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên,
Vĩnh Phúc 28
3.1.2. Tuyển chọn xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc
Yên, Vĩnh Phúc có khả năng sinh cellulase cao 38
3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử và tính
chất nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc 43
3.2.1. Cuống sinh bào tử và bào tử 43
3.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của 3 chủng xạ khuẩn
tuyển chọn Đ3, Đ7, Đ9 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Bản đồ khu vực đất đồi Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc 23
Hình 2.2. Hình ảnh về pha loãng dịch huyền phù đất 24
Hình 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của xạ khuẩn, nấm mốc 31
Hình 3.4. Khuẩn lạc xạ khuẩn 32
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ các chủng xạ khuẩn theo độ sâu 34
Hình 3.6. Một số chủng xạ khuẩn phân lập trong đất đồi 35
Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 35
Hình 3.7. Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập 38
Hình 3.8. Hoạt tính cellulase của một số chủng xạ khuẩn nghiên cứu 42

Hình 3.9. Hình ảnh hệ sợi, hình dạng tế bào và cuống sinh bào tử của
các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 45
Hình 3. 10. Hình thái chủng Đ3 46
Hình 3. 11. Hình thái chủng Đ7 47
Hình 3. 12. Hình thái chủng Đ9 48
DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập trong đất đồi Xuân Hòa, Phúc
Yên, Vĩnh Phúc 30
Bảng 3.2. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo độ sâu 33
Bảng 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của 18 chủng xạ khuẩn phân lập trong đất
đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 36
Bảng 3.4. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 37
Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa CMC 39
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa bột giấy 40
Bảng 3.7. Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn đã phân lập 41
Bảng 3.8. Hình dạng cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn 44


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cellulose là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực
vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân huỷ
cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến
tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp.
Enzyme cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên
kết β-1,4-0-glycoside trong phân tử cellulose, olygosaccharide, disaccharide
và một số cơ chất tƣơng tự khác. Hiện nay việc sử dụng các enzyme nhƣ

cellulase trong một số ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công
nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giấy sản xuất dung môi
hữu cơ và đặc biệt trong xử lý rác thải hữu cơ là vấn đề đang đƣợc con ngƣời
đặc biệt quan tâm. Rác thải ở Việt Nam đang là một hiện trạng đáng lo ngại.
Cùng với sự phát triển kinh tế, gia tăng dân số cộng với sự lãng phí tài nguyên
trong thói quen sinh hoạt của con ngƣời, rác thải hữu cơ có số lƣợng ngày
càng tăng, tiềm ẩn ngày càng nhiều nguy cơ độc hại với môi trƣờng và sức
khỏe con ngƣời. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh đƣợc enzyme cellulase có
nhiều khả năng và triển vọng giải quyết vấn đề nêu trên trong giám định và xử
lý ô nhiễm môi trƣờng. Chúng có thể hoạt động trên chất thải khó xử lý, làm
thay đổi đặc tính của chất thải và đƣa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển
thành các sản phẩm có giá trị hơn.
Enzyme cellulase đƣợc sinh tổng hợp bởi nhiều loài khác nhau nhƣ:
các loài xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và động vật nguyên sinh.
Ngoài ra cellulase còn có ở các loài sinh vật khác nhƣ thực vật và động
vật.Trong số các nhóm vi sinh vật nêu trên thì xạ khuẩn phân giải cellulose là
một trong những đối tƣợng đã và đang đƣợc các nhà khoa học đặc biệt quan
tâm. Phƣờng Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có diện tích tự nhiên là 423,9
2

ha, trong đó đất diện tích đất đồi khá lớn. Do vậy, việc khảo sát các chủng xạ
khuẩn trong đất đồi có khả năng phân hủy cellulose cao là việc có ý nghĩa hết
sức quan trọng trong việc cải tạo đất và bảo vệ môi trƣờng. Xuất phát từ
những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số
chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase trong đất đồi khu vực
Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc”.
2. Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh
cellulase cao trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc
Yên, Vĩnh Phúc
3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử và tính chất
nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu
vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc”.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
5.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn
5.3. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống
5.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn
5.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn
5.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả
3

6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
6.1. Ý nghĩa khoa học
Các kết quả nghiên cứu vê xạ khuân góp phần đem lại cho con ngƣời
những hiểu biết về đời sống tự nhiên của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn
nói riêng. Đề tài cho phép hiểu rõ hơn vai trò của xạ khuẩn trong môi trƣờng
đất, khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn. Từ đó tạo cơ sở khoa học cho
các phƣơng thức canh tác (cày xới, cải tạo đất, bón phân…) theo hƣớng lợi
dụng vi sinh vật phân giải cellulose tăng cƣờng các quá trình phân giải hợp
chất hữu cơ để làm giàu dinh dƣỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng.
6.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao, ứng
dụng các chủng xạ khuẩn này vào đời sống (trong chăn nuôi, môi trƣờng). Từ
các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao này có thể tạo ra các chế phẩm
vi sinh vật phục vụ cho việc xử lý rác thải (ủ rác thải sinh hoạt), chế biến thức

ăn gia súc probiotic, chế biến phân bón vi sinh…
7. Điểm mới của đề tài
Qua nghiên cứu, chúng tôi đã tuyển chọn đƣợc 3 chủng xạ khuẩn Đ3,
Đ7, Đ9, có khả năng sinh cellulase cao trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa,
Phúc Yên, Vĩnh Phúc.



4

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nƣớc,
rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn, nấm mốc
không phát triển đƣợc. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành
phần đất, mức độ canh tác của thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000
mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [19]. Sự phân bố của xạ khuẩn
còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trƣờng. Chúng có nhiều trong các lớp đất
trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít trong lớp
đất kiềm hoặc acid và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lƣợng xạ
khuẩn cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Xạ khuẩn tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất
trong đất, nƣớc, dùng để sản xuất nhiều enzyme nhƣ protease, amylase,
cellulase… một số acid amin và acid hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây
bệnh cho ngƣời, động vật [4].
1.1.1. Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn
Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý

sinh học … nên việc định tên một chủng xạ khuẩn đƣợc tiến hành tƣơng đối
nhanh chóng và chính xác với nhiều phƣơng pháp nhƣ phân loại số, nghiên
cứu chủng loại phát sinh… Song ngƣời ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm
hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học
phân tử.
5

1.1.1.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin
quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định
loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, ngƣời ta thƣờng xuyên nuôi cấy chúng
trên môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian
nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình
thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và
bề mặt bào tử. Dựa vào đặc điểm hình thái, ngƣời ta chia xạ khuẩn thành 4
nhóm chính:
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và
phân hóa thành HSKS và HSCC.
Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo
hƣớng vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tƣơng tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân
đốt hệ sợi.
Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào
có hình chữ V,T thƣờng không có hệ sợi.
Dựa vào nghiên cứu các xạ khuẩn trên các môi trƣờng khác nhau,
ngƣời ta chia hình chuỗi bào tử thành 6 kiểu:
+ Kiểu S (Spira): chuỗi bào tử xoắn.
+ Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng
móc câu hay xoắn không hoàn toàn.
+ Kiểu SRF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử xoắn, cong đến

thẳng.
+ Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa.
+ Kiểu RA – RF (Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis): chuỗi
bào tử có móc hay xoắn không hoàn toàn.
6

+ Kiểu RF (Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng lƣợn sóng.
Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là
những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên, nhƣ ta đã
biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thƣờng xuyên xảy ra sự
sắp xếp lại trong trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện
khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt
hình thái. Vì vậy, để phân loại đƣợc chính xác, ngày nay ngƣời ta cần nghiên
cứu thêm các chỉ tiêu khác bổ sung nhƣ đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch
học hay sinh học phân tử [20].
1.1.1.2. Đặc điểm hóa phân loại( Chemotaxonomy)
Đặc điểm hóa phân loại đƣợc sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng
20 năm trở lại đây. Đây là phƣơng pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc
định tính và định lƣợng thành phần hóa học của tế bào VSV.
Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:
Type thành phần tế bào dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành
phần pettide và đƣờng trong thành phần tế bào hay các polysaccaride gắn vào
thành tế bào.
Type peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu
trúc của mạch tetrapeptide của PG cầu nối peptide và các liên kết giữa các
mắt xích của PG.
Acid mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và Corynebacterium. Đây là đặc
điểm phân loại cơ bản cho các chi đó.
Acid béo thƣờng đƣợc sử dụng trong phân loại là acid béo bão hòa

mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl
hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của acid 10 – metylloctade canoit
(acid tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [3].
7

Phospholipid có 5 type (P
I
, P
II
, P
III
, P
IV
, P
V
) có thành phần đặc trƣng, có
ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.
Trong phân loại xạ khuẩn thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng
nhất. Khi muốn đƣa một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó,
ngƣời ta không thể nào không xác định thành tế bào.
1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài, ngƣời ta sử dụng hàng loạt các đặc
điểm sinh lý, sinh hóa khác nhau nhƣ khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và
nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trƣởng, khả năng biến đổi các chất khác
nhau nhờ hệ thống ezyme. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ƣu, khả
năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trƣờng, mối quan hệ với chất kìm
hãm sinh trƣởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với
chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi
chất đặc trƣng khác của xạ khuẩn.
Hopwood (1997) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý, sinh

hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân
loại. Do đó, tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay
những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hoá để phân loại xạ
khuẩn cũng phải thay đổi.
1.1.1.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)
Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh
lý, sinh hóa ngƣời ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số. Phƣơng
pháp này dƣạ trên sự đánh giá về số lƣợng mức độ giống nhau giữa các VSV
theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh
hóa.
8

Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau, ngƣời ta căn cứ vào hệ số
giống nhau (hệ số S – Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay đƣợc sử
dụng.
Công thức của Sokal và Michener (S
SM
)
S
SM (AB)
= (N
s +
+ N
s-
)* 100/ (N
s +
+ N
s-
+ N
d

)

Trong đó: S
SM (AB)
: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%).
N
s +
: Số các tính trạng giống nhau
N
d
: Số các tính trạng khác nhau
N
s-
: Số các tính trạng đối lập nhau
Công thức của Jacard (S
J
)
S
J(AB)
= N
s
* 100/ (N
s
+ N
d
)
Trong đó: S
J(AB)
: mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%).
N

s
: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng so sánh.
N
d
: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính của
chủng này và âm tính của chủng kia).
Kết quả của phân loại số là vẽ đƣợc sơ đồ phân nhánh (kiểu “rễ cây”)
của các thông số. Dựa vào sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất
đƣợc xếp vào một nhóm. Bằng phân loại số ngƣời ta chia xạ khuẩn chi
Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện
nhất định [21].
1.1.1.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao đƣợc Waksman và
Hernici đặt tên năm 1943 [19]. Đây là chi có số lƣợng loài đƣợc mô tả lớn
nhất. Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh. Đƣờng
kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thƣờng không lớn có đƣờng
kính khoảng 1 – 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề
mặt khuẩn lạc thƣờng đƣợc phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi
khi có kỵ nƣớc.
9

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử, trên đầu sợi
khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có
những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lƣợn sóng, xoắn, có móc, vòng…
Bào tử đƣợc hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phƣơng pháp phân
đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình
nhăn… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trƣờng nuôi cấy.
Thƣờng trên môi trƣờng có nguồn đạm vô cơ và glucose, các bào tử
biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng
rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi

khi nuôi cấy trên môi trƣờng khác nhau. Vì vậy, Ủy ban Quốc tế về phân loại
xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trƣờng và phƣơng pháp chung để phân loại
nhóm VSV này.
Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gr
+
, hiếu khí, dị dƣỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ƣu thƣờng là 25 - 30
o
C,
pH tối ƣu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp
hơn (xạ khuẩn ƣa nhiệt và ƣa lạnh).
Bên cạnh các đặc điểm hình thái, nuôi cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này
còn có đặc điểm hóa phân loại sau:
Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin
Type Peptidoglycan
Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15 - 17 C với số lƣợng
ít và số lƣợng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15 - 17 Canteiso
Dạng menaquinon: MK-9 (H
6
) hoặc MK-9 (H
9
)
Dạng photpholipit : P
II

Không có axit mycolic [5].
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lƣợng lớn các chất kháng
sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thƣ, virus và nguyên sinh động
10

vật. Cho đến nay để xác định cho thành phần loài của chi Streptomyces, các
nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác
nhau [19].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ
sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đƣờng kính thay đổi trong khoảng
0,2 – 1,0 µm đến 2,0 – 3,0 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [1],[5].
Kích thƣớc và khối lƣợng hệ sợi thƣờng không ổn định và phụ thuộc
vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thƣớc của hệ sợi xạ khuẩn là một
trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm
mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đƣờng kính rất lớn, thay đổi từ 5 – 50 µm, dễ
quan sát bằng mắt thƣờng.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thƣờng chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,
da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Kích thƣớc và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy vào loài và tùy vào
điều kiện nuôi cấy nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, độ ẩm… Đƣờng kính
mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 – 2 nm nhƣng cũng có khuẩn lạc đạt tới đƣờng
kính 1 cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bền
chặt, lớp trong tƣơng đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản
phẩm trong quá trình trao đổi chất nhƣ: chất kháng sinh, độc tố, enzyme,
vitamin, acid hữu cơ có thể đƣợc tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn
hay đƣợc tiết ra trong môi trƣờng.
11

* Khuẩn ty

Trên môi trƣờng đặc biệt, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại:
một loại cắm sâu vào trong môi trƣờng gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất
substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dƣỡng. Một loại phát triển
trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty sinh khí aerial mycelium)
với chức năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhƣng cũng có loại (nhƣ chi
Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh
sản vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng.
1.1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu tạo tƣơng đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào,
màng tế bào, vật chất nhân sơ, các hạt dữ trữ. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh
vật Gram ( +). Thành tế bào đà khoảng 20 nm có vai trò duy trì hình dạng hệ
sợi và bảo vệ tế bào, đƣợc cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glucopeptide gồm các
gốc N-Acetylglucosamine liên kết với N-Acetylmuramic ( hoặc N-
Glycolylmuramic, ví
Căn cứ vào kết cấu hóa học có thể chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4
nhóm sau:
Nhóm 1 (Type I ): có chứa L- ADP (L- diaminopimelic và glixin). Gồm các
chi Streptomyces, Norcarsioider
Nhóm 2 (Type II): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic) và glixin. Gồm
các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella
Nhóm 3 ( Type III): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic). Gồm có
Actinomadura, Actinobigfida, Micromobispora
Nhóm 4 ( Type IV): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic), đƣờng
araninose, galactose. Gồm có Norcardia, Pseudonocardia, Microbacterium
Cấu tạo tế bào xạ khuẩn
12

Khuẩn lạc xạ khuẩn tuy có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau
nhƣng toàn bộ hệ sợi chỉ là một tế bào có nhiều nhân, không có vách ngăn

ngang. Giống nhƣ vi khuẩn, nhân thuộc loại đơn giản, không có màng nhân.
Thành tế bào xạ khuẩn giống thành tế bào vi khuẩn Gram (+). Màng tế bào
chất dày khoảng 50nm và có cấu trúc tƣơng tự màng tế bào chất của vi khuẩn.
Nhân không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có
màng. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thế sau đó hình thành
nhiều hạt rải rác trong toàn bộ khuẩn ty ( gọi là hạt Cromatin) [16].
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng, rƣợu,
axit hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon.
Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt để là nguồn nitơ. Ở các
loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là khác nhau. Phần lớn
xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ƣa ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng và
phát triển là 25- 30
0
C. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt nhất trong môi trƣờng pH
là 6,8 – 7, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trƣờng kiềm[18].
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với các vi sinh vật
khác của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao ( trên 70%), trong khi đó vi khuẩn
khá thấp ( 25- 45%). Một trong những đặc điểm đáng lƣu ý của xạ khuẩn là
chúng không bền vững về mặt di truyền và thƣờng xảy ra sự sắp xếp lại trong
phân tử DNA. Điều này gây ra tính đa dạng về hình thái, tính chất sinh lí, sinh
hóa của xạ khuẩn ( khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng
sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose ) [18].
Đặc điểm của chi xạ khuẩn Streptomyces
Chi Streptomyces có số lƣợng loài mô tả lớn nhất, chi này có HSKS,
HSCC phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thƣờng không lớn, đƣờng kính
khuẩn lạc từ 1- 5 mm. Khuẩn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề
13

mặt khuẩn lạc thƣờng đƣợc phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi

khi không thấm nƣớc. Chuỗi bào tử đƣợc tạo thành trên cuống sinh bào tử,
chúng có thể thẳng, lƣợn song hoặc xoắn. Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì,
có thể long hoặc có gai. Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác
nhau, sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi
trƣờng.
Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo thành giống thành của vi
khuẩn Gram (+), là vi sinh vật hiếu khí, dị dƣỡng. Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu
từ 25- 30
0
C, pH tối ƣu là 6,5 – 8. Một số loài có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ
cao hơn hoặc thấp hơn ( xạ khuẩn ƣa nhiệt và xạ khuẩn ƣa ẩm). Bên cạnh các
đặc điểm hình thái, nuôi cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này còn có đặc điểm hóa
phân loại sau:
Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin
Type Peptidoglucan: A
3

Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15- 17 C với số lƣợng ít và
số lƣợng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15- 17 Canteiso
Dạng menaquinon: MK-9 (H
6
) hoặc MK-9 (H
9
)
Dạng photpholipit : P
II

Không có axit mycolic [13].
1.1.2.4. Sinh sản của xạ khuẩn
Xạ khuẩn sinh sản sinh dƣỡng bằng bào tử. Bào tử đƣợc hình thành trên

các nhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh
bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thƣớc và hình dạng khác nhau. Có loài dài
tới 100 - 200nm, có loài chỉ dài 20 - 30nm. Có cấu trúc theo hình lƣợn song,
có loài hình lò xo hay xoắn ốc. Sắp xếp các cuống sinh bào tử cũng khác nhau
mọc đơn, mọc đối, mọc vòng hoặc từng chùm. Bào tử đƣợc hình thành từ
cuống sinh bào tử theo kiểu kết đoạn ( fragmentation) hoặc cắt khúc
14

(segmentation). Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có hình
thức sinh sản bằng khuẩn ty. Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trƣờng phát triển
thành hệ khuẩn ty [16].
1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ
phì nhiêu cho đất. Chúng đảm nhận nhiều chức năng khác nhau trong việc
làm màu mỡ cho đất bằng cách tham gia tích cực vào các quá trình chuyển
hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững nhƣ cellulose,
mùn, kitin, ketratin, lignin [5].
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì
có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [3]. Trong đó có trên 15% có nguồn gốc từ
các xạ khuẩn hiếm nhƣ: Actinomadura, Micromonospora,
Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium, Điều đáng chú ý là
các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng
trong y học, thú y học, bảo vệ thực vật nhƣ gentamycin, tobramycin,
vancomycin, rosamycin, tetraxycline Bên cạnh đó trong quá trình trao đổi
chất, xạ khuẩn có thể sản sinh ra nhiều chất hữu cơ. Trong đó, điển hình là
các enzyme ngoại bào (cellulase, protease ), vitamin nhóm B (B
1
, B
2
, B

5
,B
6,

B
12
), một số acid hữu cơ (acid lactate, acid acetate ) [5].
Ngày nay xạ khuẩn còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong ngành công
nghiệp lên men, chế tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này
vào đời sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào
nhƣ protease, amylase, kitinase Một số khác còn có khả năng tạo thành
chất kích thích sinh trƣởng cho thực vật.
15

1.2. Cellulose và Cellulase
1.2.1. Cellulose
Cellulose là một polysaccarite mạch thẳng gồm từ 1400 – 12000 gốc β-
D- glucose liên kết với nhau bởi các liên kết β- 1,4- glucozit. Trong phân tử
cellulose các phan tử β- D- glucose có cấu trúc không gian dạng ghế bành.
Hai phân tử khác nhau góc quay 180
0
. Cellulose là loại hợp chất hữu cơ dồi
dào trong tự nhiên chiếm tới 40-50% hydratcacbon.
Cellulose có cấu trúc dạng sợi song song, dài khoảng 5μm với đƣờng
kính 3nm. Các sợi này liên kết với nhau bởi các liên kết hydro và các liên kết
Vandervan tạo thành các bó sợi nhỏ có đƣờng kính 10 - 40nm gọi là các vi sợi
(microfibrin). Các vi sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen
của cellulose. Cellulose dạng mixen gồm 2 vùng:
Vùng kết tinh (Crystolline regions): có các sợi chặt chẽ, đậm đặc ngăn cản
sự hấp thụ nƣớc và ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm ¾ cấu trúc

Cellulose
Vùng vô định hình (Amorphous regions): có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ bị
trƣơng lên và dễ bị phân giải.
Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và không bị trƣơng lên
khi hấp thụ nƣớc. Cellulose bị phân hủy khi đun nóng với axit kiềm ở nồng độ
khá cao, hoặc bị phân giải bởi các cellulasesinh ra từ nhiều loại sinh vật [12].
1.2.2. Cellulase
Enzyme cellulase xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành các
sản phẩm hòa tan dễ sử dụng. Hệ thống cellulase gồm 3 loại chính sau:
Endo- β- glucanase hay 1,4- β-D- glucanhydronase, cellobiohydrolase
(CBH), CMC-ase (C
x
): enzyme này tấn công vào các điểm khác nhau trên
chuỗi cellulose của CMC, cellulose trƣơng phồng, các cello- oligosaccarit.
Chúng phân cắt các chuỗi cellulose một cách ngẫu nhiên, sản phẩm tạo thành
16

là glucose và các oligosaccarit ( có thể từ 3-6 C hoặc nhiều hơn). Sự phân cắt
này hình thành các đầu khử tự do, tạo điều kiện cho exo glucanase hoạt động.
Bởi vậy cellulose vùng kết tinh đƣợc phân giải triệt để và hiệu quả.
Exo- β- glucanase hay 1,4- β-D- glucan cellobiohydrolase, Avicelase:
enzyme này tấn công vào những đầu không khử (non- reducing end) của
cellulose và kết quả là tạo ra các cellobiose.
B- glucosidase hay cellobiose: thủy phân cellobiose và một vài cello-
oligosaccarit thành glucose. Hoạt tính của β- glucosidase mạnh nhất trên
cellobiose và giảm dần theo chiều dài của chuỗi [12].
1.2.3. Hệ enzyme phân giải cellulose
Một số vi sinh vật phân giải đƣợc cellulose là nhờ phức hệ enzyme
cellulose gồm 4 enzyme khác nhau tác dụng với các mối liên kết của
cellulose.

Đầu tiên enzyme cellobiohydrolase có tác dụng cắt đứt liên kết hydro, biến
cellulose tự nhiên có cấu hình không gian dạng cellulose vô định hình không
có cấu trúc lớp.
Enzyme thứ hai là endogluconase có khả năng cắt đứt liên kết β-1,4-
glucozit tạo thành những chuỗi dài.
Enzyme thứ ba là exogluconase tiến hành phân giải các chuỗi trên thành
di saccarit gọi là cellbinose.
Enzyme thứ tƣ là β- glucosidase tiến hành thủy phân cellobinose thành
glucose.
Hệ enzyme cellulase còn gọi là enzyme thủy phân vì nó tiến hành thủy
phân cellulose. Mặt khác nó còn đƣợc goi là enzyme ngoại bào, vì trong quá
trình sống của vi sinh vật phân giải cellulose, enzyme này đƣợc tổng hợp bên
trong tế bào và đƣợc tiết ra bên ngoài, tiến hành thủy phân cellulose bên ngoài