Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da

Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

trờng đại học s phạm h nội 2
khoa sinh - ktnn
-------------o0o--------------

nguyễn thị thanh tuyền

tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho
vi khuẩn acetobacter xylinum,
chế tạo mặt nạ dỡng da

khoá luận tốt nghiệp đại học
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngời hớng dẫn khoa học :
PGS. TS. đinh thị kim nhung

Hà Nội - 2009

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

1

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

lời cảm ơn

Trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành đề tài này, em đã nhận
đợc sự giúp đỡ chỉ bảo tận tình của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung cùng các
thầy cô giáo trong tổ bộ môn Vi sinh khoa Sinh - KTNN Trờng ĐHSP Hà
Nội 2, sự giúp đỡ động viên của gia đình và bạn bè. Vì vậy em xin bày tỏ
lòng cảm ơn sâu sắc vì sự giúp đỡ quý báu đó.
Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thuỳ Vân và PGS.
TS. Đinh Thị Kim Nhung đã hớng dẫn em cách tìm những kiến thức, tài liệu
để em có hớng đi đúng đắn trong quá trình nghiên cứu. Đặc biệt em xin gửi
lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, cô
đã chỉ bảo em một cách tận tình giúp em có những tài liệu giá trị và hoàn
thành đề tài.
Đồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô
giáo, các anh chị trong phòng Vi sinh khoa Sinh - KTNN Trờng ĐHSP Hà
Nội đã tạo điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất và tinh thần để em hoàn thành
đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, Ngày 20 tháng 04 năm 2009
Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Thị Thanh Tuyền
K31 B Sinh

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

2

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền

Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

lời cam đoan

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này là kết quả nghiên
cứu của cá nhân tôi, đề tài nghiên cứu này không trùng với công trình nghiên
cứu của các tác giả khác. Trong đề tài này tôi có trích dẫn một số dẫn liệu của
một số tác giả khác. Tôi xin phép tác giả đợc trích dẫn để bổ sung cho phần
tổng quan tài liệu trong khoá luận của mình.

Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Thị Thanh Tuyền
K31 B Sinh

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

3

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

Mục lục

Trang
Danh mục hình v bảng biểu
Danh mục từ viết tắt
Mở đầu
Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Lợc sử phân loại vi khuẩn Acetobacter
1.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter
1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter
1.2.2. Lợc sử phân loại Acetobacter
1.3. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter
1.3.1. Đặc điểm về hình thái
1.3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.3.3. Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trờng
lỏng
1.3.4. Nhu cầu dinh dỡng của vi khuẩn Acetobacter
1.3.5. Con đờng chuyển hóa cacbon
1.3.6. Đặc điểm của một số loài Acetobacter quan trọng
Chơng 2. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
2.1.Vật liệu và thiết bị
2.1.1. Vi sinh vật
2.1.2. Máy móc thiết bị
2.1.3. Hóa chất
2.1.4. Môi trờng
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phơng pháp vi sinh vật
2.2.2. Xác định khả năng tổng hợp axit axetic bằng chuẩn độ
2.2.3. Phơng pháp hóa sinh
2.2.4. Phơng pháp toán học
2.2.5. Phơng pháp thống kê và xử lý kết quả
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

4

1
4
4
5
5
5
7
7
8
8
9
9
10
14
14
14
14
15
15
16
16
20
20
23
28

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền

Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

Chơng 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn axetic từ một số nguồn nguyên
liệu
3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter thuần khiết
3.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng
mỏng, dai, bề mặt nhẵn
3.4. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng Acetobacter
xylinum M5
3.4.1. Nghiên cứu động thái sinh trởng và phát triển của chủng
Acetobacter xylinum M5
3.4.2. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trờng nuôi cấy khác
nhau
3.4.3. Khảo sát khả năng tạo màng ở các điều kiện nuôi cấy khác
nhau
3.5. Bớc đầu xử lý màng BC và thử nghiệm làm mặt nạ dỡng da
3.5.1. Thu hoạch, xử lý và thử khả năng kháng khuẩn của màng BC
3.5.2. Thử nghiệm màng BC làm mặt nạ dỡng da

29
29
31
32
40
40

43
45

kết luận v đề nghị

49
49
51
54

ti liệu tham khảo

55

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

5

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

danh mục hình v bảng biểu

hình
Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum
Hình 3.1. ảnh khuẩn lạc vi khuẩn axetic của 3 mẫu phân lập

Hình 3.2. Chuyển hóa rợu etylic thành axit axetic của vi khuẩn axetic
Hình 3.3. Khả năng oxy hóa axetat của vi khuẩn axetic
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng Acetobacter
Hình 3.5. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trờng khác nhau
Hình 3.6. Khả năng kháng khuẩn của màng BC tẩm mật ong
Bảng
Bảng 1.1. Phân loại các nhóm vi khuẩn axetic theo Frateur (1950)
Bảng 2.1. Thành phần môi trờng lên men
Bảng 3.1. Nguồn gốc, đặc điểm của các chủng vi khuẩn axetic trong mẫu phân
lập đợc
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thành màng cellulose của 8 chủng Acetobacter
Bảng 3.3. Hàm lợng axit axetic hình thành của 8 chủng Acetobacter
Bảng 3.4. Một số đặc điểm về hình thái khuẩn lạc và tế bào của 4 chủng
Acetobacter
Bảng 3.5. Đặc điểm sinh hóa của chủng Acetobacter
Bảng 3.6. Giá trị OD đo đợc ở bớc sóng 610nm của 4 chủng Acetobacter
Bảng 3.7. Động thái sinh trởng và tổng hợp cellulose của chủng Acetobacter
xylinum M5
Bảng 3.8. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trờng khác nhau
Bảng 3.9. ảnh hởng của pH đến hình thành màng BC
Bảng 3.10. ảnh hởng của thời gian nuôi cấy đến hình thành màng BC
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

6

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

Bảng 3.11. ảnh hởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC
Bảng 3.12. Đánh giá sản phẩm màng BC tẩm mật ong làm mặt nạ dỡng da
Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lợng axit axetic theo thời gian nuôi cấy của
chủng Acetobacter xylinum M5.

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

7

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

danh mục các từ viết tắt

BC: Bacterial Cellulose (màng sinh học thu đợc từ quá trình lên men
trên môi trờng lỏng có sự tham gia của vi khuẩn Acetobacter xylinum)
cs: cộng sự
OD: Optical Density
STT: số thứ tự
CFU: Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)
g/l: gam trên lit
CNSH: Công nghệ sinh học

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

8

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

Mở đầu
1. Lý do chọn đề tài
Trong tự nhiên có một số vi khuẩn có khả năng sản sinh ra màng
cellulose. Khi nuôi cấy những vi khuẩn này trong môi trờng chứa glucose,
glycerol hoặc một số nguồn cacbon hữu cơ khác nhau chúng có khả năng
hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và đợc
gọi là màng sinh học Bacterial Cellulose (BC).
Cho đến nay, Acetobacter xylinum đợc đánh giá là loài vi khuẩn có
khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên. Loài vi khuẩn gram âm
này sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những loài tiến
hoá nhất của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi tế bào Acetobacter xylinum có thể
chuyển hoá tới 108 phân tử glucose vào phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả
năng tổng hợp cellulose là rất lớn [17], [34].
Nét cấu trúc quan trọng trong cơ chế kết tinh khác hẳn với cellulose ở
thực vật (PC) ở chỗ chúng không có sự kết hợp hemicellulose, lignin hay
những thành phần phụ khác, mà đợc cấu tạo từ những sợi microfibril tạo nên
những bó sợi song song cấu thành mạng lới cellulose với độ bền cơ học cao,
độ tinh khiết cao, khả năng thấm hút nớc lớn, đờng kính sợi nhỏ, khả năng
polymer hoá và trạng thái kết tinh lớn [17], [34]. Ngoài ra màng BC còn chứa
nhiều dỡng chất, axit hữu cơ đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh

vật khác, ngăn cản sự phân huỷ các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác
động của tia UV
Nhờ những đặc tính độc đáo trên mà màng BC đợc coi là một nguồn
polymer mới, là một giải pháp trên con đờng tìm nguồn nguyên liệu mới hiện
nay. Nó đã và đang thu hút đợc sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa
sau thế kỷ XIX và hiện đợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nh:
Trong công nghiệp giấy màng BC đợc dùng để sản xuất giấy điện tử chất
lợng cao [24]; Trong công nghệ môi trờng đã sử dụng màng BC làm màng
9
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung
SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

phân tách để xử lý nớc và biến đổi độ nhớt của nớc (Brown, 1989, Jonas và
Fonah, 1998). Ngoài ra màng BC còn đợc dùng làm chất mang đặc biệt cho
các sợi pin và tế bào năng lợng (Brown, 1989) [21], làm các sợi truyền
quang, là môi trờng cơ chất trong sinh học sử dụng để cố định protêin hay
cho sắc ký [25]. Trong công nghệ thực phẩm ngời ta đã sử dụng vi khuẩn
Acetobacter xylinum nuôi trên môi trờng nớc dừa tạo màng BC để sản xuất
thạch dừa [33]. Trong lĩnh vực mỹ phẩm và dợc phẩm, lợi dụng những đặc
tính quý báu của màng BC nh: thông thoáng, kháng khuẩn, tính tơng đồng
về cấu trúc với sợi collagen trong da nên màng BC đợc xem là nguyên liệu
mới quý giá dùng để làm mặt nạ, da nhân tạo, thay thế da tạm thời.
ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC mới đợc quan tâm
gần đây và đã đạt đợc kết quả bớc đầu. Nhu cầu về các loại màng dùng để
đắp vết thơng hở, dùng làm mặt nạ dỡng da trong nớc lớn và đều phải nhập

ngoại với giá thành cao. Trong khi đó, màng BC hoàn toàn có thể sản xuất
trong nớc bằng phơng pháp lên men tĩnh vi khuẩn Acetobacter xylinum
trong môi trờng lỏng. Việc nghiên cứu, tuyển chọn màng BC mỏng, nhẵn,
dai trong thời gian nuôi cấy ngắn là một đòi hỏi cần thiết cho công nghệ sản
xuất màng BC dùng làm mặt nạ dỡng da.
Từ lý do trên chúng tôi quyết định tiến hành đề tài nghiên cứu: Tìm
điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum, chế
tạo mặt nạ dỡng da.
2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập, tuyển chọn và tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp về thời gian
nuôi cấy, nhiệt độ, độ pH cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả
năng sản xuất màng BC mỏng, dai, bề mặt nhẵn dùng làm mặt nạ dỡng da.

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

10

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, tuyển chọn chủng Acetobacter xylinum có khả năng hình
thành màng BC mỏng, dai, bề mặt nhẵn từ các nguồn vật liệu: dịch giấm, nớc
uống lên men, màng BC (từ phòng thí nghiệm CNSH - Vi sinh).
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn.
- Nghiên cứu ảnh hởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình hình

thành màng BC của chủng tuyển chọn.
- Bớc đầu xử lý màng BC và thử nghiệm làm mặt nạ dỡng da.
4. ý nghĩa của đề tài
Tuyển chọn đợc 1 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng
hình thành màng BC mỏng, dai, bề mặt nhẵn dùng làm mặt nạ dỡng da từ
nguồn nguyên liệu tự nhiên với giá thành thấp.

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

11

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN
chơng 1
tổng quan ti liệu

1.1. Lợc sử nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn giấm, vi khuẩn
axetic)
Từ rất lâu trong lịch sử, con ngời đã biết cách làm giấm bằng kinh
nghiệm thực tiễn của mình song cha hiểu rõ cơ sở khoa học của quá trình tạo
giấm, càng không thể giải thích đợc vì sao rợu loãng lại có thể chuyển
thành giấm. Chỉ đến khi khoa học phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính
hiển vi, thế giới vi sinh vật đợc khám phá thì vấn đề này mới đợc sáng tỏ.
Ngày nay, chúng ta khẳng định đợc rằng tác nhân của quá trình tạo giấm là
vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn giấm, vi khuẩn axetic.
Công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn axetic là của Person (1822).

Ông đã chú ý đến lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và chứng minh
đó là một loài vi sinh vật có tên gọi Mycoderma aceti.
Đến năm 1937, Kiitzing từ những thí nghiệm của mình đa ra kết luận:
quá trình lên men giấm đợc thực hiện khi có sự tham gia của vi khuẩn. Cùng
năm đó, nhà bác học nổi tiếng ngời Đan Mạch là Hansen đã tách đợc từ
màng giấm 2 loại vi khuẩn thuần khiết ông gọi đó là: Mycoderma aceti và
Mycoderma pasteuriamum.
Từ năm 1862 đến năm 1868, nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi,
Pasteur đã chứng minh nhận xét của Kiitzing và Hansen là hoàn toàn đúng
đắn. Ông nghiên cứu lớp màng xuất hiện trên bia, rợu vang và khẳng định:
màng đó đợc tạo thành từ vi khuẩn Mycoderma aceti.
Các nghiên cứu tiếp theo đều nhằm hoàn thiện, làm rõ cơ chế của quá
trình lên men giấm và từng bớc phân loại vi khuẩn giấm thành các nhóm,
loài khác nhau dựa trên những đặc tính sinh lý, sinh hóa và ứng dụng của
chúng.
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

12

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

1.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter
1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter
Để phân loại Acetobacter, ngời ta dựa vào những tiêu chuẩn sau:
- Địa điểm nơi phân lập: có liên quan đến điều kiện môi trờng sống.

- Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, màu sắc tế
bào khi nhuộm gram, khả năng di động, có tiên mao hay không, vỏ nhầy
- Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố: nhiệt độ, độ pH của
môi trờng, khả năng hình thành sắc tố, mối quan hệ với oxy, khả năng lên
men axetic, khả năng sử dụng hợp chất vô cơ và hữu cơ
- Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, tính chất, màu sắc của
khuẩn lạc trên môi trờng thạch. Khi nuôi cấy trên môi trờng lỏng chú ý sự
biến đổi của môi trờng sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay
không mùi, màu sắc môi trờng có biến đổi hay không)
1.2.2. Lợc sử phân loại Acetobacter
Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter đợc tiến hành từ thế kỷ
XIX. Trong đó có một số khoá phân loại đáng chú ý nh sau: khoá phân loại
của Beijerinck năm 1899, ông đã tiến hành phân lập vi khuẩn axetic thuần
khiết và chia chúng thành 4 nhóm cơ bản. Năm 1916, Janke đã tiếp theo công
trình nghiên cứu của Beijerinck. Ông đã phân loại dựa trên 2 dấu hiệu:
Một là: Sử dụng muối amoni làm nguồn cung cấp nitơ trong quá trình
sinh 2trởng và phát triển.
Hai là: Không có hoặc có khả năng di động trong quá trình phát triển.
Năm 1926, Henneberg dựa vào nơi sống mà chia vi khuẩn axetic làm 4
nhóm sau:
Nhóm 1: Vi khuẩn không sinh trởng trên bia, vì hoa huplon độc với
chúng.
Nhóm 2: Vi khuẩn sinh trởng trên bia.
Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển trên dịch rợu vang.
13
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung
SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

Nhóm 4: Vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phơng pháp nhanh.
Năm 1934, các nhà khoa học Hoa Kỳ đã nghiên cứu thành phần dinh
dỡng của vi khuẩn giấm thấy chúng có khả năng sử dụng các hợp chất tơng
đối đơn giản làm nguồn nitơ và nguồn cacbon nên đã xếp chúng vào họ
Nitrobacteriaceae. Từ đó vi khuẩn axetic có tên gọi là vi khuẩn Acetobacter
[12].
Năm 1936, Kenyver, Wanneil và Staniel nghiên cứu khả năng di động
của chúng thấy có hiện tợng ghép cực xoắn ở phần di động nên xếp chúng
vào họ Pseudomonadaceae. Mời hai năm sau (năm 1948) Vanghn tiến hành
nghiên cứu khả năng di động của một số loài Acetobacter (Acetobacter aceti,
Acetobacter melanoginum, Acetobacter zances, Acetobacter pasteurianum,
Acetobacter oxydans) nhờ đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn
axetic trong họ Pseudomonadaceae.
Năm 1949, Krassilnicov nghiên cứu trên xạ khuẩn và vi khuẩn cùng
một số tác giả ngời Mỹ trong các bài báo cáo của mình đều thống nhất xếp vi
khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonadaceae.
Theo khoá phân loại mới của Bergey và nhiều tác giả khác thì vi khuẩn
Acetobacter và

Gluconobacter - các vi khuẩn axetic đợc xếp vào họ

Acetobacteriaceae [2].
Dựa vào khả năng oxy hoá axit axetic, Bergey (1914) phân chia các loài
trong Acetobacter thành 2 nhóm:
Nhóm 1: Có khả năng oxy hoá axit axetic thành CO2 và H2O
+ Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (Sinh trởng trên môi
trờng Hoyer) nh: Acetobacter aceti.

+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất.
- Trên bề mặt môi trờng dịch thể không tạo thành màng nhầy chứa
cellulose nh: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus,
Acetobacter kneizigianus.
14
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

- Trên bề mặt môi trờng dịch thể tạo thành màng nhầy chứa
cellulose nh: Acetobacter xylinum.
Nhóm 2: Không có khả năng oxy hoá axit axetic.
+ Tạo thành sắc tố trên môi trờng glucose: sắc tố nâu tối đến đen nhạt
(Acetobacter melanogenus); sắc tố hồng (Acetobacter recens).
+ Không tạo thành sắc tố: nhiệt độ thích hợp trong khoảng 30 - 35oC
(Acetobacter suboxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 18 - 21oC
(Acetobacter oxydans).
Năm 1950, Frateur chính thức đa ra một khoá phân loại mới dựa trên
các tiêu chuẩn cụ thể nh [30]:
- Khả năng tạo catalase.
- Khả năng tổng hợp các chất xeto từ rợu bậc cao nh: glycerol,
manitol, sorbitol
- Khả năng oxy hoá axit axetic thành CO2 và H2O
- Khả năng oxy hoá glucose thành axit gluconic.
- Khả năng sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ và rợu etylic làm

nguồn cacbon (Sinh trởng trên môi trờng Hoyer)
- Tạo sắc tố nâu.
- Tổng hợp cellulose.
Trên cơ sở đó, Frateur chia vi khuẩn axetic thành các nhóm theo bảng
sau:

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

15

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

Bảng 1.1. Phân loại các nhóm vi khuẩn axetic theo Frateur (1950)
STT
1

Tên nhóm
Suboxydans

Vi khuẩn đại diện

Đặc điểm cơ bản
Không có khả năng oxy hoá

Acetobacter suboxydans

Acetobacter melanogennum

axit axetic thành CO2 và
H2O

Acetobacter aceti
2

Meroxydans

Acetobacter xylinum

Có đầy đủ các đặc điểm trên

Acetobacter meroxydan

3

4

Oxydans

Peroxydans

Acetobacter ascendans

Không có khả năng tạo các

Acetobacter ransens

hợp chất xeto từ rợu bậc

Acetobacter lovaniens

cao
Không có hoạt tính catalase,

Acetobacter peroxydans

không

Acetobacter paradoxum

oxy

hoá

glucose

thành axit gluconic

1.3. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter
1.3.1. Đặc điểm về hình thái
Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axetic.
Đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học có thể xếp chúng vào 2 giống: vi
khuẩn Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao và Gluconobacter đơn
mao.
Theo Bergey (1989) và Larpent et al (1990), Acetobacter và
Gluconobacter là hai giống vi khuẩn quan trọng nhất trong họ
Acetobacteriaceae. Hai giống này gặp thấy nhiều trong tự nhiên, trên bề mặt

lá cây, hoa quả và đều có khả năng tạo axit từ rợu. Nhng Gluconobacter
không có chu trình tricacboxylic (ATC) nên không có quá trình oxy hoá
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

16

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

axetat thay vào đó có một số chu trình khác nh: chu trình Glyoxylat, quá
trình photphoril hoá, còn Acetobacter lại không xảy ra các quá trình trên.
Đem so sánh 2 vi khuẩn trên với những vi khuẩn thuộc giống
Pseudomonas thấy có nhiều nét tơng đồng. Tuy nhiên chúng khác với
Pseudomonas ở những điểm sau: khả năng chịu độ axit cao hơn, khả năng
chuyển hoá pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di động hơn. Một số loài vi
khuẩn axetic khi sống trên môi trờng nghèo chất dinh dỡng hoặc thời gian
nuôi cấy lâu thì tế bào dễ bị biến đổi hình thái (kéo dài hoặc phình to hay phân
nhánh) [18], [19].
Tế bào vi khuẩn axetic có hình que hoặc hình elip, đứng độc lập hay
xếp thành chuỗi, kích thớc 0,6 - 0,8 m, có thể có tiên mao và có khả năng di
động, sống hiếu khí bắt buộc, hoá dỡng hữu cơ, nhuộm màu gram âm, không
sinh bào tử [12].
Vi khuẩn Acetobacter thích hợp ở pH = 4,4 - 6,8 và nhiệt độ 25 - 30oC,
có khả năng oxy hoá rợu etylic thành axit axetic và có quá trình oxy hoá
hoàn toàn các hợp chất hữu cơ tạo các hợp chất xeton hay axit hữu cơ tơng
ứng.

1.3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter
Trên môi trờng đặc (thạch đĩa) chúng phát triển thành những khuẩn lạc
tròn, đều đặn, không màu, đờng kính trung bình là 3mm. Một số loài nh:
Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum, có khuẩn lạc rất nhỏ (đờng kính
d=1mm), bề mặt trơn bóng, ở giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn
các phần xung quanh. Một số khác có khuẩn lạc lớn (d = 4 - 5mm), bề mặt
trơn bóng không màu, mỏng nh các hạt sơng nhỏ dễ tách khỏi môi trờng
nuôi cấy, một số khác tạo những khuẩn lạc ăn sâu vào môi trờng khó lấy
bằng que cấy [18].

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

17

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

1.3.3. Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trờng lỏng
Trên môi trờng dịch thể, vi khuẩn axetic sinh trởng tạo thành những
lớp màng BC có độ dày mỏng khác nhau. Một số loài tạo thành màng dày nh
sứa, nhẵn, trơn, khi lắc nhẹ chúng sẽ chìm xuống đáy bình và có thể tiếp tục
hình thành lớp màng mới. Loại thứ 2 có màng mỏng nh tờ giấy cellofan, dai,
nhẵn, bám theo thành bình. Khi quan sát cấu trúc của màng, ngời ta thấy
rằng có nhiều sợi cellulose giống nh sợi bông, chắc khoẻ đuợc đan với nhau
bởi chính các tế bào vi khuẩn tạo thành lớp áo bảo vệ cho chúng tránh khỏi tác
động của điều kiện ngoại cảnh [29].

1.3.4. Nhu cầu dinh dỡng của vi khuẩn Acetobacter
Vi khuẩn axetic có nhu cầu đối với nguồn cacbon, nguồn nitơ và các
chất sinh trởng rất đa dạng. Chúng có thể đồng hoá nhiều loại thức ăn cacbon
khác

nhau

nh:

các

loại

đờng

(monosaccharide,

disaccharide,

polysaccharide), rợu êtylic, axit hữu cơ nhng không sử dụng đợc tinh bột
[20], [22].
Trong quá trình sinh trởng và phát triển vi khuẩn axetic cần cung cấp
một số axit amin nh: valin, alanin, prolin, izolysine. Một số chất kích thích
sinh trởng nh: axit nicotic, axit folic, biotin [31].
Một số vi khuẩn axetic có khả năng tổng hợp polysaccharide phân tử
lớn nh: cellulose, tinh bột, dextran Ngời ta ứng dụng đặc tính này trong
sản xuất công nghiệp. Một số loài tổng hợp đợc những sợi cellulose nh
bông:

Acetobacter

xylinum,

Acetobacter

acetigenum,

Acetobacter

kiitzingianum.
1.3.5. Con đờng chuyển hoá cacbon
Qua sự nghiên cứu về khả năng chuyển hoá cacbon các tác giả đã đi
đến kết luận: vi khuẩn axetic có khả năng oxy hoá gluxit theo các hớng sau:

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

18

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

Hớng 1: Chuyển hoá gluxit theo con đờng hexosemono phosphat
(HMP) hoặc pentose phosphat nhờ sự oxy hoá các cơ chất đã đợc photphoril
hoá [22], [30].
Hớng 2: Theo con đờng Entner - Doudoroff (ED) - chỉ gặp trong loài
có khả năng tổng hợp cellulose [23].

Hớng 3: Theo chu trình Kreps (ATC) hoặc glyoxylat [30].
Hớng 4: Sinh trởng trên môi trờng chứa glycerol.
Hớng 5: Không có sự photphoril hoá cơ chất do thiếu enzyme
phosphofructokinase do đó không tồn tại con đờng glycolysis [17].
1.3.6. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn Acetobacter quan trọng
1.3.6.1. Acetobacter aceti (Pasteur, 1864; Beijerinck, 1898)
Trực khuẩn ngắn dạng hình que, kích thớc 0,4 - 0,8 m x 1,0 - 1,2 m,
không di động, thờng xếp thành chuỗi dài, bắt màu gram âm, bắt màu vàng
với thuốc nhuộm iôt. Chúng tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên môi trờng
geletin. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trởng là 34oC, nếu nhiệt độ cao quá 43oC
thì sẽ gây hiện tợng co tế bào. Giống này có thể phát triển trong nồng độ
rợu cao (11%) và tích luỹ tới 6% axit axetic. Môi trờng bia thích hợp cho sự
phát triển của loài này [31]. Tỷ lệ % (G + C) của ADN là 56,2 - 57,2% [22].
1.3.6.2. Acetobacter pasteurinum (Hansen, 1879; Beijerinck, 1916)
Trực khuẩn ngắn, hình thái gần giống với Acetobacter aceti, bắt màu
xanh với thuốc nhuộm iôt. Tạo váng khô và nhăn nheo. Tế bào xếp rời nhau
thành chuỗi, đôi khi có dạng chuỳ phồng lên. Nhiệt độ thích hợp khoảng 30oC,
chịu độ cồn thấp hơn Acetobacter aceti. Trong điều kiện thuận lợi chúng có
thể tạo 5 - 6% axit axetic [30]. Tỷ lệ % (G + C) của ADN là 51,8 - 53% [22].
1.3.6.3. Acetobacter orleanense (Henneberg, 1906)
Hình thái của vi khuẩn này giống 2 vi khuẩn trên, hình que nhỏ, hai đầu
hơi nhọn, hình thành màng mỏng trên bề mặt môi trờng nuôi cấy. Tế bào bắt
màu vàng khi nhuộm iôt. Giống này có thể sống đợc trong môi trờng chứa
19
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung
SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

10 - 12% rợu và tích luỹ đợc 9,5% axit axetic, thờng dùng chúng để
chuyển hoá rợu vang thành giấm. Sinh trởng ở nhiệt độ 25- 30oC [12]. Tỉ lệ
% (G+C) của AND từ 56,8- 58,7% [22].
1.3.6.4. Acetobacterschiitzenbachii
Trực khuẩn hình que, kích thớc khoảng 0,3- 0,4 m x 1,0- 3,6 m. Nó
có thể tạo váng dày và không bền trong môi trờng nghèo dinh dỡng, tích luỹ
11,5- 12% axit axetic trong dịch nuôi cấy, thờng đợc dùng trong sản xuất
axit axetic theo phơng pháp chìm [13].
1.3.6.5. Acetobacter suboxydans
Hình que ngắn, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi ngắn, không
có khả năng di động, tạo váng mỏng dễ tan. Nó có thể chuyển hoá glucose
thành axit gluconic, sobit thành socbose, chịu đợc nồng độ cồn cao và tích
luỹ đến 13% axit axetic. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trởng là 28 - 30oC. Thời
gian lên men ngắn khoảng 48 giờ, nhu cầu oxy rất ngặt nghèo chỉ cần ngừng
10 - 20 giây thì 1/3 tế bào sẽ chết [13].
1.3.6.6. Acetobacter hoshigaki
Trực khuẩn hình que, kích thớc 0,7 - 0,9 m x 1,5 - 1,8 m, thờng
đứng riêng lẻ không di chuyển. Trên môi trờng thạch đậu tơng: khuẩn lạc
nhỏ, tròn, dạng hạt sáng, sau đó trở thành màu nâu. Trên môi trờng thạch với
dịnh lên men: khuẩn lạc tròn màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hoá
nâu, phía ngoài màu vàng nhạt. Chúng có khả năng chuyển hoá dextran thành
axit gluconic. Nhiệt độ thích hợp từ 30 - 35oC [12].
1.3.6.7. Acetobacter curiculum
Có đặc điểm tơng tự Acetobacter schiitzenbachii. Trong môi trờng
lên men thuận lợi, chúng có thể tạo 10 - 12% axit axetic, tạo váng chắc trên bề
mặt môi trờng. Nhiệt độ lên men tối u từ 35 - 37oC [13].
1.3.6.8. Acetobacter plancatum
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

20

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

Trực khuẩn ngắn, kích thớc từ 0,4 - 0,6 m x 1,4 - 1,6 m. Trong
khoảng nhiệt độ từ 28- 32oC chúng tạo thành những tế bào phình to, kéo dài,
không di động. Trên môi trờng gelatin, rợu vang tạo thành khuẩn lạc tròn
trịa, hơi nhô lên, sáng, ẩm ớt, nhớt. Nhiệt độ sinh trởng tối u là 25 - 30oC
[13].
1.3.6.9. Acetobacter ascendens
Trực khuẩn không di động, trên môi trờng thạch glucose, gelatin tạo
thành những khuẩn lạc khô, trắng với màu sáng chói. Trên môi trờng lỏng
tạo thành màng nhầy, dày, hớng lên theo thành bình. Nhiệt độ thích hợp cho
sinh trởng là 25oC [12].
1.3.6.10. Acetobacter xylinum
Acetobacter xylinum là trực khuẩn hình que, kích thớc khoảng 2 m,
đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động. Chúng
tích luỹ khoảng 4,5% axit axetic, khi nồng độ axit axetic trong môi trờng quá
cao nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn.

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum.

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

21

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

Vi khuẩn Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hiếu khí
bắt buộc, không sinh bào tử. Tế bào của chúng thờng tìm thấy trong giấm,
dịch rợu, nớc ép hoa quả, trong đất [17], [19].
Theo Bergey, pH tối u cho vi khuẩn Acetobacter xylinum là từ 5,4- 6,2,
nhiệt độ thích hợp là từ 25 - 30oC. Nghiên cứu của Maccormick và cs (1996)
cho thấy Acetobacter xylinum có thể sinh trởng đợc ở nhiệt độ 12 - 35oC,
pH = 3 - 8, trong đó pH tối u là 6 [20], [22].
Trên môi trờng thạch đĩa, vi khuẩn Acetobacter xylinum hình thành
khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu
trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi
trờng [20].
Trên môi trờng dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, chúng sẽ hình
thành trên bề mặt môi trờng một lớp màng cellulose. Màng này đợc hình
thành từ tập hợp các sợi microfibril [17]. Nó bao bọc xung quanh tế bào vi
khuẩn có chức năng bảo vệ khỏi tác động bên ngoài môi trờng. Khi nuôi cấy
chúng trong môi trờng dinh dỡng lâu ngày hoặc môi trờng bất lợi chúng có
thể bị biến đổi hình dạng nh: căng phồng, thon dài dạng sợi nhỏ, không có
khả năng hình thành màng BC. Dới điều kiện nuôi cấy thích hợp (đặc biệt có
bổ sung 2% rợu etylic vào môi trờng), chúng có khả năng khôi phục lại
hình dạng ban đầu và tổng hợp cellulose [17].

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

22

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

chơng 2
vật liệu v phơng pháp nghiên cứu

2.1. Vật liệu và thiết bị
2.1.1. Vi sinh vật
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành phân lập, nghiên cứu khả năng
hình thành màng BC của các chủng vi khuẩn axetic từ các nguồn sau: mẫu
màng giấm từ kết quả nghiên cứu của thạc sỹ Đặng Thị Hồng 2007 [7], giấm
làm theo phơng pháp thủ công, nớc uống lên men (kombucha).
Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm: Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Escherichial coli (nhận đợc từ phòng Công nghệ
sinh học - Vi sinh - Trờng ĐHSP Hà Nội).
Đối tợng nghiên cứu: chủng vi khuẩn phân lập và tuyển chọn đợc có
khả năng hình thành màng BC.
Đối tợng thử nghiệm: bớc đầu thử nghiệm trên da ngời.
2.1.2. Máy móc thiết bị
Nồi hấp khử trùng (Tomy, Nhật); tủ ấm vi sinh (Haraeus, Đức); tủ sấy
(Haraeus, Đức); Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức); cân điện tử (Precisa XT
320M, Thuỵ Sỹ); micropipet loại 20 l- 10ml (Gilson, Pháp); máy đo pH

(Hana, Bồ Đào Nha); tủ lạnh thờng, tủ lạnh sâu (Tawashi, Nhật); máy li tâm
(Haraeus, Đức); kính hiển vi quang học (Olympus CX41, Nhật); máy đo
quang phổ tử ngoại UV mini 1240; các dụng cụ thông dụng khác...
(Sử dụng tại phòng CNSH - VS khoa Sinh học, Trờng ĐH S Phạm Hà Nội)

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

23

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

2.1.3. Hoá chất
Nguồn cung cấp cacbon: rợu etylic, glucose, glycerol, sacrose,
manitol, lactose, axit axetic.
Nguồn cung cấp nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4
Nguồn cung cấp muối khoáng: KH2PO4, NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O,
NaOH, CuSO4.
Nguồn cung cấp nhân tố sinh trởng: cao nấm men, cao ngô.
Thuốc thử: dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromphenol.
Thuốc nhuộm: tím gentian, fucshin, lugon.
2.1.4. Môi trờng
2.1.4.1. Môi trờng phân lập vi khuẩn (Môi trờng GCP) (g/l)
Glucose: 20 g

CaCO3: 10 g

Cao nấm men: 5 g

KH2PO4: 2 g

pH= 5,5- 6,0

H2O: 1000ml

Thạch aga: 20 g
Pepton: 5 g

Axit xitric monohydrate: 0,115 g
2.1.4.2. Môi trờng giữ giống (g/l)
Glucose: 20g

(NH4)2SO4: 2g

Cao nấm men: 5g

Thạch aga: 20g

Pepton : 5g

KH2PO4: 2,7g

H2O: 1000ml

Axit xitric monohydrate: 1,15g

2.1.4.3. Môi trờng nhân giống vi sinh vật nghiên cứu (g/l)
(NH4)2SO4: 2g

Glucose: 20g

Cao nấm men: 5 g

pH= 5,5- 6,0

Axit axetic: 2%

Nớc dừa: 1000ml

KH2PO4: 2,7g
Pepton: 5g

2.1.4.4. Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định
Cao thịt: 5g

Pepton: 5g

Nớc: 1000ml

NaCl: 5g

Thạch aga: 20g

2.1.4.5. Môi trờng lên men
Chúng tôi đã sử dụng một số môi trờng có thành phần theo bảng sau:
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

24

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền


Khóa luận tốt nghiệp

K31 Khoa Sinh - KTNN

Bảng 2.1 Thành phần môi trờng lên men
STT

Thành phần

MT1

MT2

MT3

MT4

1

Glucose

20g

20g

20g

18g

2

(NH4)2SO4

2g

2g

2g

3g

3

KH2PO4

2g

4

MgSO4.7H2O

2g

5

Cao nấm men

5g

6

Pepton

7

Rợu êtylic

2%

8

Axit axetic

2%

9

Nớc dừa già

10

Nớc máy

11

Nớc cốt dừa

2g

8,744g

1000ml

500ml
1000ml
1000ml

500ml

Chú ý: Axit axetic và rợu etylic bổ sung sau khi hấp môi trờng

2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phơng pháp vi sinh vật
2.2.1.1. Phân lập vi khuẩn axetic theo phơng pháp của Winogradsky và
Beijerinck
Nguồn vật liệu: giấm làm theo phơng pháp cổ truyền sau 10 ngày tạo
thành một lớp màng màu trắng trên bề mặt dịch nuôi cấy. Nớc uống lên men
từ trà xanh sau 12 ngày nuôi cấy tạo thành lớp màng mỏng. Mẫu màng giấm
của thạc sỹ Đặng Thị Hồng.
Từ 3 mẫu màng ở trên chúng tôi đem rửa bằng nớc cất loại bỏ phần
nớc d, sau đó tiến hành thử phản ứng của màng với axit sunfuric 60% và
dung dịch lugon trong ống nghiệm chứa nớc cất thanh trùng, lắc đều bằng
máy vôntex trong 10 phút thu đợc các ống nghiệm chứa mẫu màng gốc.
Tiến hành phân lập: lấy một chút màng đã đợc rửa cho vào ống

nghiệm chứa nớc cất thanh trùng rồi lắc đều bằng máy vôntex trong 10 phút
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

25

SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền