Tuyển chọn, tối ưu hoá môi trường và điều kiện nuôi cấy cho chủng ACETOBACTER XYLINIM, chế tạo màng sinh học

tr­êng ®¹i häc s­ ph¹m hµ néi ii
khoa sinh – ktnn
**********

®µo thÞ n÷

TuyÓn chän, tèi ­u hãa m«i
tr­êng vµ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy
cho chñng Acetobacter xylinum,
chÕ t¹o mµng sinh häc

khãa luËn tèt nghiÖp ®¹i häc
Chuyªn ngµnh: Vi sinh häc

Hµ Néi - 2008


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình hoàn thành đề tài này, em đã nhận được sự giúp đỡ chỉ
bảo tận tình của các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Vi sinh khoa Sinh - KTNN
Trường ĐHSP Hà Nội 2, sự giúp đỡ động viên của gia đình, bạn bè. Em xin
trân trọng gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Khắc Thanh và PGS.TS. Đinh Thị
Kim Nhung các thầy cô là những người đã cung cấp cho em những kiến thức,
những hướng đi đúng trong quá trình nghiên cứu. Đặc biệt em xin gửi lời cảm
ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung, cô không
chỉ hướng dẫn chỉ bảo em một cách tận tình mà còn cung cấp cho em những
tài liệu giá trị để em có hướng đi đúng đắn trong quá trình nghiên cứu, hoàn
thành đề tài. Đồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các
thầy cô giáo, các anh chị trong phòng Vi sinh Khoa Sinh - KTNN Trường
ĐHSP Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất, không chỉ về cơ sở vật chất mà còn cả
sự động viên, khuyến khích em hoàn thành đề tài này.

Do thời gian nghiên cứu còn hạn chế, đề tài của em không tránh khỏi
sai sót, rất mong sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để đề tài của
em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 04 năm 2008
Sinh viên thực hiện

Đào Thị Nữ
K30 B Sinh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Tất
cả những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua sử lí thống kê,
hoàn toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt và không trùng với bất cứ tài liệu
nào.Trong đề tài của tôi có trích dẫn một số dẫn liệu của một số tác giả khác.
Tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khoá luận của mình.


MỤC LỤC
Danh mục hình và bảng biểu

2

ĐẶT VẤN ĐỀ

4

NỘI DUNG

6

Chương 1: Tổng quan tài liệu

6

1.1. Lược sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter

6

1.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter

7

1.3. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter

10

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp

17

2.1. Nguyên liệu

17

2.2. Phương pháp nghiên cứu

19

2.2.1. Phương pháp vi sinh

19

2.2.2. Phương pháp toán học

25

2.2.3. Phương pháp tạo chế phẩm màng sinh học cellulose từ A.xylinum

30

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

33

3.1. Tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter từ một số nguồn nguyên liệu

33

3.2. Tuyển chọn chủng Acetobacter xylinum thuần khiết

34

3.3. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học

38

3.4. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng A.xylinum D13

41

3.5. Khảo sát sự thay đổi pH trong môi trường nuôi cấy của D13

45

3.6. Khảo sát khả năng tạo màng của D13 ở các môi trường nuôi cấy
khác nhau

46

3.7. Tối ưu hoá khả năng tạo màng của chủng A.xylinum D13

48

3.8. Xử lý màng BC và bước đầu dùng màng để đắp lên vết thương
hở ở thỏ

59

KẾT LUẬN

64

TÀI LIỆU THAM KHẢO

65


DANH MỤC HÌNH BẢNG BIỂU

HÌNH
Hình 3.1. Đồ thị diễn hàm lượng axit axetic của một số chủng Acetobacter.
Hình 3.2. Ảnh khuẩn lạc chủng Acetobacter xylinum D13.
Hình 3.3. Vòng phân giải CaCO3 của chủng D13.
Hình 3.4. Màng BC của chủng D13.
Hình 3.5. Tế bào D13 nhuộm Gram
Hình 3.6. Tế bào D13 nhuộm I2 và H2SO4
Hình 3.7. Đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào của chủng D13 với giá trị
OD610.
Hình 3.8. Đồ thị sinh trưởng của chủng D13.
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng axit axetic trong dịch nuôi
cấy theo thời gian của chủng D13.
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương ở thỏ.
Hình 3.11. Tiến trình lành vết thương ở thỏ.
BẢNG
Bảng 1.1. Các đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter
Bảng 3.1. Hàm lượng axit axetic của một số chủng Acetobacter.
Bảng 3.2. Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Bảng 3.3. Thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào, giá trị OD610 của chủng D13.
Bảng 3.4. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trường khác nhau.
Bảng 3.5. Các yếu tố và mức khảo sát của chủng D13.
Bảng 3.6. Ma trận thực nghiệm của chủng D13.
Bảng 3.7. Mô hình thực nghiệm của chủng D13.
Bảng 3.8. Lược đồ tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy của chủng D13.
Bảng 3.9. Các yếu tố và mức khảo sát.
Bảng 3.10. Ma trận thực nghiệm của chủng D13.


Bảng 3.11. Mô hình thực nghiệm của chủng D13.
Bảng 3.12. Lược đồ tối ưu hoá môi trường nuôi cấy của chủng D13.

Bảng 3.13. Các bước xử lý màng BC.
Bảng 3.14. Kết quả theo dõi tình trạng vết thương ở thỏ thí nghiệm.


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong tự nhiên ngoài thực vật có khả năng tổng hợp màng cellulose còn
có rất nhiều loài vi khuẩn có khả năng sản sinh ra màng cellulose gọi là màng
sinh học hay Bacterial Cellulose (BC), đặc biệt là các loài Acetobacter điển
hình là chủng Acetobacter xylinum. Khi nuôi cấy Acetobacter xylinum trên
môi trường dịch lỏng, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sẽ hình thành nên một lớp
màng, màng đó có bản chất là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn
[1]. Do vậy, màng BC vừa có cấu trúc và đặc tính cơ học rất giống với
cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hoá lý đặc biệt như: độ
bền cơ học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng
thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hoá lớn [12] [13].
Màng BC có nhiều đặc tính hoá lý ưu việt nên nó được xem như là một
nguồn polymer sinh học mới và đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau: ngành công nghiệp thực phẩm sản xuất thạch dừa, là nguyên liệu tốt
nhất của công nghiệp sản xuất giấy chất lượng cao, làm môi trường phân tách
cho quá trình xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào
năng lượng, sử dụng như là một nhân tố để biến đổi độ nhớt, làm các sợi
truyền quang, là môi trường cơ chất trong sinh học sử dụng để cố định protein
hay cho sắc kí, làm màng nối mạch máu và màng thẩm tách [11] [17]… Các
nhà khoa học khi nghiên cứu những tính năng đặc biệt như: bám chắc trên bề
mặt ngay khi nước bốc hơi, không cho nước lỏng thấm qua nhưng lại cho hơi
nước di chuyển, có khả năng ngăn cản vi khuẩn, thay thế da tạm thời ... Vì
vậy, màng BC được coi là nguyên liệu trong y học dùng để làm da nhân tạo
[12].
Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hàng ngày.
Ngoài làm tổn thương da, trường hợp bỏng nặng có thể còn gây rối loạn nội

tạng, để lại di chứng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khoẻ của người
bệnh. Ở Việt Nam riêng viện bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận
khoảng 400 ca bỏng. Hiện nay, nguời ta đã có nhiều dược phẩm dùng để điều
trị bỏng như: Madecassol, Polymethan hay các chế phẩm sinh học như: màng
da ếch, màng ối, da lợn ... đã được chứng minh là có hiệu quả tốt [7] [8].
Nhưng sử dụng các chế phẩm trên đều có hạn chế như: thời gian điều trị dài
ngày, chi phí cao, không ngăn được sự xâm nhập của vi khuẩn, gây đau rát
khi sử dụng …
Mặt khác đã từ lâu trong lịch sử y học, người ta đã sử dụng dầu mù u
vào việc săn sóc bảo vệ da chống lại các tác nhân gây tổn hại, nó có tác dụng
mạnh trong điều trị đau dây thần kinh, đau khớp xương; là một thuốc kháng
viêm đắp tại chỗ rất có hiệu quả; chỉ định rộng rãi cho các vùng viêm tấy có
vết thương; là thuốc đắp tuyệt hảo chữa các vết bỏng do kích thích mô hạt
mọc nhanh, tạo một sẹo da mềm mại ... Dầu mù u được sử dụng rộng rãi trong
điều trị các bệnh về da [18] [19].
Trên cơ sở những nghiên cứu về dầu mù u và màng BC đã có trước đó,
với mong muốn tìm hiểu thêm về tác dụng của màng BC - dầu mù u chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn, tối ưu hoá môi trường và điều
kiện nuôi cấy cho chủng Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học”


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lược sử nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter [1]
Từ rất lâu trong lịch sử, con người đã biết cách làm giấm bằng kinh nghiệm
thực tiễn của mình mặc dù họ chưa hiểu rõ được cơ sở của quá trình tạo giấm,
càng không thể giải thích được bằng cách nào mà từ rượu loãng lại có thể
chuyển thành giấm. Cho đến khi khoa học phát triển, đặc biệt với sự ra đời

của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật được khám phá thì việc giải thích cơ sở
của quá trình lên men giấm trở nên đơn giản. Ngày nay, chúng ta đã khẳng
định được rằng tác nhân của quá trình sản xuất giấm ăn là vi khuẩn
Acetobacter (vi khuẩn axetic, vi khuẩn giấm).
Những công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn axetic vào năm 1822
của Person. Ông nghiên cứu lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt dịch giấm,
sau đó tiến hành phân lập và thu được một loại vi sinh vật tên là Mycoderma
aceti. Đến năm 1837, Kiitzing làm thí nghiệm bằng cách loại bỏ hết các vi
sinh vật trong các bình giấm thì giấm sẽ không được tạo thành. Ông đã đi đến
kết luận: quá trình lên men giấm nhất thiết phải có vi sinh vật. Cùng năm
1837, nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch là Hansen đã tách được từ màng
giấm 2 loại vi khuẩn giấm thuần khiết là: Mycoderma aceti và Mycoderma
pasteurinanum.
Những năm 1862 - 1868, Pasteur với sự trợ giúp đắc lực của kính hiển
vi, ông đã chứng minh nhận xét của Kiitzing và Hansen là hoàn toàn đúng
đắn. Pasteur nghiên cứu màng xuất hiện trên bia, rượu vang và khẳng định:
màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn mà ông gọi tên là Mycoderma
aceti.


Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acetobacter, các nghiên
cứu tiếp theo sau này đều nhằm tìm hiểu rõ thêm và cải thiện quá trình lên
men giấm. Hiện nay, người ta đang đi vào những ứng dụng mới của vi khuẩn
Acetobacter bằng cách phân lập các chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu
các đặc điểm cấu tạo sinh lý, sinh hoá nhằm tìm ra những chủng tốt nhất cho
từng ứng dụng, trên cơ sở đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa
ra.
1.2. Phân loại Acetobacter [1]
1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter
Để phân loại Acetobacter, các tác giả dựa vào các tiêu chuẩn sau đây:

- Địa điểm phân lập: có liên quan đến các điều kiện môi trường sống.
- Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, đặc tính, tính chất, màu sắc …
đặc điểm của khuẩn lạc trên môi trường thạch. Khi nuôi cấy trên môi trường
lỏng chú ý sự biến đổi của môi trường sau một thời gian nuôi cấy (môi trường
đục hay trong, có mùi thơm dễ chịu hay không mùi, màu sắc môi trường vàng
nâu hay vàng nhạt …).
- Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng di
động, có tiên mao hay không, vỏ nhầy, màu sắc tế bào khi nhuộm Gram.
- Các đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố nhiệt độ, pH môi
trường, khả năng hình thành sắc tố, quan hệ với oxi, khả năng lên men axetic,
khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ và vô cơ ....
Ngoài các tiêu chuẩn cơ bản ở trên, ngày nay khi định loại Acetobacter
các tác giả còn sử dụng sinh học phân tử để giải trình tự rARN16S.
1.2.2. Lược sử phân loại Acetobacter
Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter được thực hiện từ thế kỷ
XIX. Năm 1898 Rothenback đã tiến hành phân loại, tiếp theo là Hoyer
(1899), Hansen ( 1911), Heneberg (1926), Janike (1931), Vanghn (1948),


Nergey (1948 - 1957), J.Prateur (1950). Trong đó khóa phân loại của
Beijerinck (1899) đã thu hút sự quan tâm của nhiều tác giả. Ông chia vi khuẩn
axetic thành 4 nhóm cơ bản. Đến năm 1916, Janke kế tiếp những nghiên cứu
của Beijerinck, Janke đã phân loại vi khuẩn axetic thành 4 nhóm dựa trên 2
dấu hiệu sau đây:
Một: khả năng sử dụng đạm amoniac giúp cho các giai đoạn sinh trưởng
của vi khuẩn Acetobacter.
Hai: có hay không có giai đoạn di động trong quá trình sinh trưởng và
phát triển.
Khi nghiên cứu nơi sinh sống đặc trưng của vi khuẩn axetic, năm 1926
Henenberg đã phân loại chúng thành 4 nhóm sau đây:

- Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa hublon độc với chúng.
- Nhóm 2: vi khuẩn có khả năng phát triển trên bia.
- Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang.
- Nhóm 4: vi khuẩn để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh.
Đến năm 1934, các nhà nghiên cứu vi khuẩn học Hoa Kỳ dựa vào khả
năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của C và N nên đã xếp vi
khuẩn axetic vào họ Nitrobacteriaceae. Từ đó, vi khuẩn axetic có tên là vi
khuẩn Acetobacter. Đến năm 1936, các tác giả Kenyver,Wanneil, Staniel đã
nêu ý kiến ghép vi khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn Pseudomonas vì chúng
có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động.
Đến năm 1948, theo kết quả nghiên cứu của Vanghn: các vi khuẩn
Acetobacter

aceti,

Acetobacter

pasteurianum,

Acetobacter

zancens,

Acetobacter melanoginum, Acetobacter oxydans đều có khả năng di động.
Vanghn lí giải là: các loài trên thuộc cùng một loại có đơn mao ở cực và ông đề
nghị xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn Pseudomonadaceae.


Cùng năm 1948, Krassilnicov với nghiên cứu về xạ khuẩn và vi khuẩn,
cùng với một số tác giả người Mỹ trong các bài báo của mình đều thống nhất

xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn Pseudomonadaceae
Theo khoá phân loại của Bergeys (1914) và cùng nhiều tác giả khác hiện
nay thì vi khuẩn Acetobacter và Gluconobacter - các vi khuẩn axetic được
xếp vào một họ riêng là Acetobacteriaceae. Trong khoá phân loại của Bergeys
đã phân chia các loài trong giống Acetobacter thành 2 loại:
Loại 1: oxi hóa axit axetic thành CO2 và H2O, bao gồm các nhóm:
a. Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer) đại
diện là: Acetobacter aceti.
b. Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất.
- Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy dầy có chứa cellulose
đại diện là: Acetobacter xylinum.
-Trên môi trường dịch thể không tạo thành màng nhầy có chứa
cellulose: Acetobacter rancens,

Acetobacter pasteurianus, Acetobacter

kneiiziganus
Loại 2: không oxi hóa axit axetic
* Tạo thành sắc tố nâu trên môi trường glucose
Sắc tố nâu tối tới đen nhạt : Acetobacter melanogenus
Sắc tố hồng : Acetobacter resens
* Không tạo thành sắc tố
Nhiệt độ thích hợp nhất là khoảng 30 - 35 0C : Acetobacter suboxydans
Nhiệt độ thích hợp nhất là 18-21 0C : Acetobacter oxydans
Năm 1960, Silwel và Carr nghiên cứu về đặc trưng nuôi cấy, sinh hoá
của chủng Acetobacter đã đưa ra kết luận: không thể có sự phân loại đồng
nhất vi khuẩn Acetobacter.


Những nghiên cứu về đặc điểm, về phân loại vi khuẩn Acetobacter này

đã tạo cơ sở cho nhũng nghiên cứu tiếp theo, đồng thời là cơ sở cho việc ứng
dụng các chủng vi khuẩn này vào đời sống thực tiễn ở giai đoạn về sau. Hiện
nay, người ta đã sử dụng vi khuẩn giấm một cách rộng rãi trên quy mô công
nghiệp tạo ra rất nhiều sản phẩm có ý nghĩa.
1.3. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter [1]
Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axit
axetic. Căn cứ vào tiêu chuẩn phân loại học có thể xếp chúng vào 2 giống:
Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao và Gluconobacter đơn mao.
Theo Bergey (1989) và Larpent et al (1990), Acetobacter và
Gluconobacter là 2 giống vi khuẩn axetic quan trọng nhất của họ
Acetobateriaceae. Hai giống vi khuẩn trên gặp rất nhiều trong tự nhiên như ở
trên bề mặt lá cây, hoa quả. Cả 2 giống đó đều có khả năng tạo axit axetic từ
rượu nhưng trong tế bào Gluconobacter không có chu trình ATC
(tricacboxylic) nên không thể diễn ra quá trình oxi hóa axetat thay vào đó có
một số chu trình khác như chu trình Glyoxilat, quá trình photphoril hóa, còn
Acetobacter lại xảy ra các quá trình trên.
Khi so sánh 2 giống trên với những vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas
thấy có nhiều nét tương đồng. Tuy nhiên chúng cũng khác với Pseudomonas
ở những đặc điểm sau: có thể chịu độ axit cao hơn, khả năng chuyển hóa
pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di dộng hơn. Một số loài vi khuẩn
axetic khi sống trên môi trường nghèo dinh dưỡng hay thời gian nuôi cấy lâu
ngày tế bào dễ bị biến đổi hình thái (kéo dài hay phình to, phân nhánh)[3].
Tế bào vi khuẩn axetic có dạng hình que hay hình elip, đứng độc lập
hay xếp thành chuỗi, kích thước 0,6 - 0,8 m, có thể có tiên mao và có khả


năng di động, sống hiếu khí bắt buộc, hóa dưỡng hữu cơ, nhuộm màu Gram
âm, không sinh bào tử.
Bảng 1.1. Các đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter
( So sánh với Pseudomonas )

Đặc điểm

Gluconobacter

Acetobacter

Pseudomonas
Tiên mao ở cực
_

1. Vị trí tiên mao
2. Phát triển ở pH = 4.5

+
+

+/+

3. Oxi hóa aceton ở pH= 4.5

+

+

_

4. Oxi hóa axit axetic

_

+

+

5. Oxi hóa lactat

_

+

+

6. Glucose  gluconate

+

+/

7. Sử dụng tinh bột. lactose

_

+/
_

8. Sử dụng gelatin

_

_

+/

9. Sắc tố huỳnh quang

_

_

+/

+/

Vi khuẩn Acetobacter thích hợp với pH = 4,2 – 6,8; nhiệt độ thích hợp 25 30 0C, có khả năng oxi hóa rượu etylic thành axit axetic, có quá trình oxi hóa hoàn
toàn các hợp chất hữu cơ (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành
các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ tương ứng.
1.3.1. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter [1] [3]
Trên môi trường đặc vi khuẩn axetic phát triển thành các khuẩn lạc tròn
đều đặn, đường kính khuẩn lạc trung bình khoảng 3 mm, riêng có một số loài
như: Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc nhỏ hơn đường
kính d = 1 mm), bề mặt trơn bóng, ở giữa khuẩn lạc dày hơn và đậm màu hơn
các phần xung quanh. Nhưng với một số loài khác khuẩn lạc lại lớn hơn
(đường kính d = 4 - 5 mm), bề mặt trơn nhẵn không màu, mỏng như những
hạt sương nhỏ, có thể dùng que cấy tách ra khỏi môi trường dễ dàng. Tuy


nhiên cũng có những khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường, khó có thể gạt ra bằng
que cấy.
1.3.2. Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng
Sự hình hành màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường dịch rất đa

dạng, trên bề mặt môi trường dịch có thể tạo nên các loại màng có độ dày
mỏng khác nhau. Có loại màng dày như sứa, nhẵn và trơn, khi lắc nhẹ sẽ chìm
xuống đáy bình và có thể tiếp tục hình thành nên lớp màng mới. Có loại màng
mỏng như các tờ giấy xelofan, dai, nhẵn, khi lắc cũng chìm xuống đáy bình
và tiếp tục hình thành nên lớp màng mới, dịch nuôi cấy trong, có mùi thơm dễ
chịu. Khi nghiên cứu các màng này thấy có nhiều sợi cellulose giống như các
sợi bông, chắc khỏe được đan kết với nhau bởi chính các vi khuẩn
Acetobacter tạo nên độ dẻo dai, tính đàn hồi tốt và độ chắc khỏe của màng.
Có những loại màng khác lại rất mỏng, dễ vỡ, không nhẵn hoặc nhăn nheo,
bám theo thành bình, dịch nuôi cấy thường đục có màu vàng nâu, không
trong, không có mùi thơm dễ chịu [1] [3].
Từ những quan sát về khuẩn lạc và các loại màng ở trên cũng góp phần
sơ bộ định loại các loài của vi khuẩn Acetobacter.
1.3.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter [1] [3] [5]
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi khuẩn Acetobacter có nhu
cầu rất lớn đối với một số chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng. Nguồn cacbon
có thể được cung cấp từ các hợp chất đường, rượu etylic và các axit hữu cơ.
Vi khuẩn Acetobacter có thể sử dụng các muối amôn làm nguồn cung cấp
nitơ. Các chất kích thích sinh trưởng như: các axit amin (izoloxin, alanin,
prolin, valin), -aminobenzoic, axit nicotinic, axit pantotenic, axit folic,
biotin, nicotinamid … đều có vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát
triển của vi khuẩn Acetobacter.


Một số loài (Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti, Acetobacter
kiitzingianum …) có khả năng tự tổng hợp các polisaccarit phân tử lớn như:
cellulose, dextran... Điển hình là vi khuẩn Acetobacter xylinum có thể tổng
hợp được những sợi cellulose giống như những sợi bông.
1.3.4. Con đường chuyển hóa cacbon [1] [3][5]
Nghiên cứu về khả năng chuyển hóa cacbon các tác giả đã đi đến kết

luận vi khuẩn axetic có thể oxi hóa cacbon theo những con đường sau:
Con đường thứ nhất: không có sự photphoril hóa cơ chất và sự tham gia
của các enzim đặc hiệu.
Con đường thứ hai: oxy hóa cơ chất đã được photphoril hóa trong con
đường pentozophôtphát.
Con đường thứ ba: Entner –Doudoroff (E.D)
Con đường thứ tư: chu trình Krebs hoặc Glyoxilat
1.3.5. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn Acetobacter [1]
* Acetobacter aceti
Trực khuẩn ngắn hình que, xếp thành chuỗi dài, kích thước 0,4- 0,8 x
1,0- 1,2 m, không di động, bắt màu Gram âm, bắt màu vàng với thuốc
nhuộm iốt. Khuẩn lạc to sáng trên nền gelatin, dịch lên men chứa 10%
đường saccarozơ, tạo thành màng nhầy nhẵn, không được nâng lên theo
thành bình. Có thể phát triển ở môi trường có nồng độ rượu cao ( 11%), tích
lũy được 6% axit axetic, nhiệt độ thích hợp là 30 0C, môi trường bia thích
hợp cho sự phát triển của loài này.
* Acetobacter suboxydans
Có dạng hình que ngắn, không có khả năng di động, đứng riêng lẻ hay
xếp thành chuỗi ngắn, tạo thành những váng mỏng dễ vỡ. Có khả năng
chuyển hóa glucozơ thành axit gluconic, sobit thành socboza. Để phát triển tốt
cần được cung cấp paraaminobenzoic, axit pantotenic và axit nicotilic.


* Acetobacter hoshigaki
Trực khuẩn có kích thước từ 0,7 - 0,9 x 1,5 - 1,8 m, hay đứng riêng rẽ,
không di động. Khuẩn lạc trên môi trường nước chiết đậu nành dạng hạt nhỏ,
tròn, màu sáng, sau đó chuyển thành màu nâu. Khuẩn lạc trên thạch với dịch
lên men: tròn, màu trắng sữa về sau chuyển hóa thành màu nâu, phía mép
ngoài khuẩn lạc màu vàng nhạt. Có thể chuyển hóa axit gluconic từ dextroza,
nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 30 - 350C .

* Acetobacter orleanense
Trực khuẩn dài vừa phải, không di động, khi gặp nhiệt độ cao có thể sinh
ra các tế bào dị hình: tế bào kéo dài hay phình to hơn. Có khả năng phát triển
được trên môi trường có nồng độ rượu cao từ 10 - 12% và tích lũy được 9,5%
axit axetic, nhiệt độ thích hợp 25 - 30 0C.
* Acetobacter plancatum
Trực khuẩn, kích thước 0,4 - 0,6 x 1,4 - 1,6 m, tế bào có thể tạo thành
những dạng phình to, kéo dài, không di động. Khuẩn lạc tròn đều, hơi lồi lên,
sáng, ẩm ướt, nhớt, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 25 - 30 0C.
* Acetobacter ascendens
Trực khuẩn, không di động, khuẩn lạc trên glucozơ, gelatin khô trắng, có
vầng sáng chói. Trên môi trường lỏng tạo màng dầy, chắc, hướng lên thành
bình, nhiệt độ thích hợp là 25 0C.
* Acetobacter lindrenii
Trực khuẩn đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, không di động, một số tế
bào phồng to như hình cầu. Khuẩn lạc trên gelatin với dịch lên men: nhỏ,
tròn, màu vàng. Ở môi trường lỏng váng màu nâu, nhớt, nhiệt độ thích hợp
cho phát triển là 25 0C.


* Acetobacter acetosum
Trực khuẩn, kích thước từ 0,4 - 0,8 x 1 m. Các tế bào đứng riêng rẽ và xếp
thành chuỗi, không di động, nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 30 - 360C.
* Acetobacter schiitzenbachii
Tế bào hình que: 0,3 - 0,4 x 1,0 - 3,6 m, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành đôi,
có thể tạo thành những tế bào đặc biệt. Ở môi trường già có thể tạo thành váng
dày, không bền vững, axit axetic tích lũy được trong môi trường khoảng 11,5 %.
* Acetobacter xylinum
Trực khuẩn có dạng hình que, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng chuỗi,
không di động được. Các tế bào được bao bởi chất nhầy, tạo màng nhẵn và

khá dai, màng này bắt màu xanh với thuốc nhuộm iốt vì màng có chứa
cellulose, tích lũy được khoảng 4,5% axit axetic trong môi trường,
Acetobacter xylinum thường sống chung với nấm men trong một loại nước
giải khát dân gian làm bằng nước chè đường loãng gọi là “Thủy hoài sâm”,
người Trung Quốc gọi là “Hải bảo” hay “Vị bảo”, người Nga gọi là “Nấm
chè”.
* Acetobacter pasteurianum
Có hình dạng tương tự A. aceti nhưng váng vi khuẩn có dạng khô và
nhăn nheo, bắt màu xanh với thuốc nhuộm I2, tế bào xếp rời nhau thành chuỗi,
đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chùy phồng lên, di động không thường
xuyên; khuẩn lạc trên gelatin nhỏ, tròn, nhiệt độ thích hợp để phát triển là
300C.
*Acetobacter kiitzingianum
Có màng nhày, nhẵn ở mép và được nâng lên theo thành bình. Tế bào
dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động, khuẩn lạc trên gelatin vớt dịch
lên men nhớt, nhỏ tạo thành màng xếp nếp to trên môi trường ẩm, thích hợp
phát triển ở 300C.


* Acetobacter orleanense
Trực khuẩn dài, tế bào, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao có
thể sinh ra tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Tạo váng vi khuẩn rất dày
trên môi trường lỏng, có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu cao
10 - 20 % và tích luỹ 9,5% axit axetic, thưòng đựơc dùng để chuyển hoá rượu
vang thành giấm theo phương pháp chậm, thích hợp phát triển ở 25 - 300C.
Hầu hết các loài Acetobacter phát triển tốt nhất ở 25 - 300C, đều có khả
năng sử dụng muối phôtphat, đa số đòi hỏi cung cấp thêm một số vitamin nhất
định, có khả năng oxi hoá rượu thành axit và trong quá trình sinh trưởng và
phát triển chúng tạo ra một lớp màng dày có bản chất là cellulose trên bề mặt
môi trường nuôi cấy. Với những nghiên cứu hiện nay cho thấy, lớp màng này

có thể được ứng dụng vào rất nhiều ngành quan trọng có ý nghĩa thực tiễn
trong đời sống [7][15]. Đồng thời khả năng tạo màng của các chủng trên rất
khác nhau vì vậy cần phải lựa chọn ra những chủng vi khuẩn có khả năng tạo
màng tốt nhất phù hợp với từng ứng dụng để đạt hiệu quả cao trong sản xuất.


CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Nguyên liệu chính
Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật thuần khiết được phân lập
ở màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm từ: bia, rượu vang,
dịch hoa quả, giấm làm theo phương pháp cổ truyền.
Động vật thử nghiệm: thỏ nhà khỏe mạnh trọng lượng từ 1,4 - 1,6kg.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Các hóa chất thông dụng: glucozơ (C6H12O6), cao nấm men, cao thịt,
pepton, axit axetic, rượu etylic, NaOH, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4,
K2HPO4, CaCO3, agar - agar, phenolphtalein, thuốc nhuộm tím gentian, dung
dịch fucshin, dung dịch lugol…. Tất cả các hóa chất đều tinh sạch ở mức phân
tích.
Nước dừa nguyên chất, nước mía ép nguyên chất, dầu mù u. (Thành
phẩm mua ở hiệu thuốc Viện bỏng Quốc gia).
2.1.2.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Tommy (Nhật), máy lắc Orbital
Shakergallenkump (Anh) , máy li tâm Sorvall (Mỹ), micropipet Jinson (Pháp)
các loại từ 20l - 10ml, máy so màu UV - vis (Nhật), máy đo pH (MP 200 R Thụy Sĩ), cân (Precisa XT 320 M - Thụy Sĩ) máy cất nước hai lần (Hamilton Anh) , kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40, hộp lồng, ống
nghiệm, bình tam giác, que trang, la men, đèn cồn… và nhiều dụng cụ hóa
sinh thông dụng khác.

2.1.3. Các loại môi trường
2.1.3.1. Môi trường phân lập vi khuẩn giấm (MT1) [2] [4]
Glucozơ: 20g

(NH4)2SO4: 3g

KH2PO4: 2g

MgSO4.7H2O: 2g

CaCO3: 7g

Agar agar: 20g

Axit axetic: 2%

Rượu etylic: 2%

(Bổ sung sau khử trùng)

(Bổ sung sau khử trùng)

Nước máy: 1000ml
2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2) [2] [4]
Glucozơ: 20g

(NH4)2SO4:3g

KH2PO4: 2g

MgSO4.7H2O: 2g

Pepton: 6g

Axit axetic: 2%

(Bổ sung sau khử trùng)

Nước máy: 1000ml

Rượu etylic: 2%

(Bổ sung sau khử trùng)

2.1.3.3. Các môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng [6]
TT

Thành phần

MT3

MT4

MT5

MT6

1

Glucozơ

20g

20g

0g

20g

2

(NH4)2SO4

3

3

5

4

3

KH2PO4

2

2

2

1

4

MgSO4.7H2O

2

2

0

0

5

Axit axetic

2%

2%

5ml

2,5ml

6

Rượu etylic

2%

2%

0

0

7

Cao nấm men

0

5g

3g

0

8

Pepton

0

6g

2g

0

9

Nước mía ép

0

0

200ml

0

10

Nước dừa

0

0

0

1000ml

11

Nước máy

1000ml

1000ml

800ml

0


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn giấm) theo
phương pháp của Vinogradski [2] [4]
Để có được chủng vi khuẩn Acetobacter, chúng tôi tiến hành quá trình
phân lập vi khẩn từ các nguồn nguyên liệu: bia, rượu vang, dịch hoa quả theo
phương pháp của Vinogradski. Trước hết thực hiện quá trình lên men giấm từ
các nguồn nguyên liệu trên. Vi khuẩn axetic là loài vi khuẩn hiếu khí nên
chúng phát triển trên môi trường lỏng tạo thành một lớp màng dày, dai, màu
trắng - màng này là tập hợp các vi khuẩn axetic và màng cellulose, lấy màng
đó đưa vào môi trường số 2 ( môi trường số 2 (MT2) đã được hấp khử trùng ở
1atm, nhiệt độ 1210C, thời gian là 15 phút, để nguội, bổ sung rượu và axit sau
khi khử trùng). Sau khi thả màng vào môi trường số 2, giữ trong tủ ấm 28 300C trong thời gian 4 - 7 ngày trên bề mặt môi trường xuất hiện một lớp
màng mới. Từ màng này tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn
Acetobacter.
Phương pháp pha loãng của Pasteur: Chuẩn bị nước cất 2 lần, dùng 10
ống nghiệm định mức 10ml (đậy nút bông, đã được sấy khử trùng) cho 9ml
nước cất đã chuẩn bị ở trên vào; đưa vào hấp khử trùng ở 1210C, áp lực là 1

atm, thời gian 15 phút (các thao tác làm trong box cấy vô trùng). Lấy mẫu
màng từ các nguồn nguyên liệu đưa vào ống nghiệm đã chứa sẵn nước cất
thanh trùng, đem vontex đều, lấy pipét vô trùng hút 1ml dịch từ ống nghiệm
này cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách
vontex trong 5 phút sẽ thu được ống nghiệm chứa dịch pha loãng ở mức 10-1.
Tiếp theo, lại hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm
thứ hai vontex đều thu được dịch pha loãng ở mức 10-2. Với các thao tác lặp


lại như trên, ta sẽ thu được dịch pha loãng ở các mức độ: 10-1; 10-2; 10-3; ...;
10-10. Mức độ pha loãng quyết định bởi số lượng vi sinh vật, căn cứ vào số
lượng vi khuẩn có trong mẫu, chúng tôi chọn mẫu ở độ pha loãng 10-4 - 10-7
để tiến hành phân lập trên môi trường thạch đĩa.
Phương pháp thạch đĩa: chuẩn bị môi trường 1 hấp khử trùng ở 1210C và
1atm, để nguội, bổ sung rượu và axit; tiếp theo đổ vào hộp petri đã vô trùng,
để nguội khi đó bề mặt thạch sẽ đông lại. Dùng pipet vô trùng hút 100l dịch
màng đã chuẩn bị ở trên (có độ pha loãng 10-4-10-7) nhỏ vào lên trên bề mặt
thạch, dùng que trang dàn đều các tế bào vi khuẩn lên trên khắp bề mặt thạch.
Bao gói cẩn thận, cất trong tủ ấm ở 28 - 300C, sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sát
khuẩn lạc (các đặc điểm về hình dạng kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền
mép quanh khuẩn lạc) và vòng phân giải CaCO3 quanh khuẩn lạc. Dựa trên
đặc điểm của khuẩn lạc thu được đối chiếu so sánh với đặc điểm của khuẩn
lạc Acetobacter chọn ra những khuẩn lạc của vi khuẩn axetic để tiến hành các
bước tiếp theo
Chú ý: tất cả các dụng cụ thí nghiệm, dung dịch và môi trường nuôi cấy
trước khi sử dụng đều phải hoàn toàn vô trùng, các thao tác thí nghiệm đều
được làm trong box cấy vô trùng.
2.2.1.2. Tuyển chọn các chủng Acetobacter cho màng cellulose theo
phương pháp Graxinop [1] [2][4]
Trước khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn: môi

trường 1 sau khi vô trùng đổ vào ống nghiệm, đậy nút bông, đặt nghiêng, để
nguội. Dùng que cấy đầu tròn (đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợt
lấy một khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào một ống thạch nghiêng theo đường ziczac,
với mỗi khuẩn lạc sẽ được mã hoá bằng một ký hiệu riêng. Để vào tủ ấm 4 - 6
ngày, các vi khuẩn sẽ phát triển theo đường cấy.


Sau đó, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi trường
oxi hoá (MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng. Cho 1ml nước cất thanh trùng
vào ống giống (ống nghiệm thạch nghiêng chứa các tế bào vi khuẩn đã được
hoạt hoá bằng cách cấy chuyển ống giống được bảo quản trong tủ lạnh sang
ống thạch nghiêng khác, khi tế bào vi khuẩn đã phát triển theo đường cấy sẽ
được sử dụng để kiểm tra khả năng tạo màng), dùng que cấy vô trùng gợt các
tế bào ra đường cấy hoà tan vào nước, dùng pipet vô trùng hút dịch vi khuẩn
đưa sang môi trường oxi hoá để thử khả năng tạo màng. Tiến hành tuyển chọn
liên tiếp 3 lần, chúng tôi thu được chủng có khả năng tạo màng tốt nhất để
dùng cho những nghiên cứu tiếp theo.
Để giữ giống cần cấy chuyển giống theo chu kỳ 2 tháng 1 lần.
2.2.1.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum thuần khiết
a). Phương pháp quan sát tế bào [2] [4]
Sau quá trình sơ tuyển, chúng tôi đã chọn ra một số chủng, các chủng
này cần tiếp tục được xác định bằng phương pháp quan sát hình thái tế bào
dưới kính hiển vi quang học để xác định xem có đúng là chủng vi khuẩn cần
tìm không. Quan sát hình dạng tế bào khi nhuộm Gram: phương pháp này
gồm các bước sau:
- Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCl hoặc H2SO4, rửa
lại bằng cồn hoặc nước cất và lau khô.
- Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy lấy một ít
màng trắng hoặc dịch nuôi cấy hoặc giống vi khuẩn hoà vào giọt nước. Cố
định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn (cách đèn cồn 10 - 15 cm).

- Đặt lên trên vêt bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian, giữ
trong 1 - 2 phút.


- Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho hết thuốc nhuộm chảy xuống chậu
hứng, rửa bằng nước cất, nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi, giữ trong 5 phút.
- Rửa tiêu bản bằng nước, cồn ( trong 20 giây), rửa lại bằng nước cất.
- Nhỏ dung dịch Fucshin lên giữ trong 1 - 2 phút.
- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô tự nhiên. Đưa lên kính quan sát.
Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram
âm (G-) với vi khuẩn Gram dương (G+).Khả năng bắt màu của G+ và G- khác
nhau do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn G+ được cấu tạo từ một loại
protein đặc biệt chứa muối nucleatmagie, có khả năng tạo với tím gentian và
lugol một phức chất bền khó bị rửa trôi, nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế
bào vi khuẩn G+ bắt màu tím của gentiam. Trong khi đó những vi khuẩn Gkhông có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugol nên
dễ bị rửa trôi bởi cồn. Do đó, khi nhỏ fucshin lên tế bào vi khuẩn G- sẽ bắt
màu hồng của Fucshin.
b). Kiểm tra đặc tính sinh học của Acetobacter [2][4]
* Kiểm tra khả năng oxi hoá ethanol thành axit axetic
Như trên đã nói, Acetobacter và Gluconomonas là 2 giống vi khuẩn có
đặc tính hình thái, sinh lý tương tự nhau. Vì vậy cần phải sơ tuyển chọn ra
nhũng chủng Acetobacter thuần khiết bằng phương pháp thử khả năng oxi hoá
ethanol thành axit axetic trên môi trường A và B:
Môi trường A: dịch chiết nấm men: 3%; CaCO3: 2%; rượu etylic: 15% 2ml; agar- agar: 2%. Khi nuôi cấy vi khuẩn axetic trên môi trường A nếu là
Gluconobacter thì có một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là
Acetobacter thi vòng sáng sẽ rõ hơn và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc
hướng về phía vòng sáng - do vi khuẩn sinh trưởng và phát triến sẽ tạo ra axit
axetic - axit này tạo ra sẽ kết hợp với CaCO3 làm vòng sáng rộng hơn và tạo
lớp cặn đục thấy rõ.