Nghiên cứu phân lập vitexin và isovitexin từ cây bồ kết ( gleditsia australis hemsl )

Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Trường đại học sư phạm hà nội 2
Khoa hóa học

ĐỖ THỊ THOAN

Nghiên cứu phân lập vitexin và isovitixin
từ cây bồ kết
(Gleditsia australis Hemsl.)

khóa luận tốt nghiệp
Chuyên ngành : Hóa hữu cơ
Giáo viên hướng dẫn
TS. Nguyễn Hoài Nam

Hà Nội-2010

Đỗ Thị Thoan

1

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Khoá luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại Phòng Hóa hữu cơ - Viện
Hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS. TS. Châu
Văn Minh, PGS.TS. Phan Văn Kiệm và các anh chị phòng Hóa hữu cơ đã tạo
mọi điều kiện giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp.
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo TS.
Nguyễn Hoài Nam Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học
và công nghệ Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình
thực hiện và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất
thiên nhiên đã tạo điều kiện cho em được học tập và sử dụng các thiết bị tiên
tiến của Viện để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra của khóa luận tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Văn Bằng cùng toàn thể các thầy
cô giáo trong khoa Hoá học, các thầy cô giáo trong Trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2 đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình
học tập tại trường.

Sinh Viên
Đỗ Thị Thoan

Đỗ Thị Thoan

2

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu và kết quả được nếu trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Sinh Viên
Đỗ Thị Thoan

Đỗ Thị Thoan

3

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Mục lục
Danh mục các hình trong khóa luận
Danh mục các bảng trong khóa luận
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Mở đầu

1

Chương 1. TổNG QUAN

3

1. 1. Giới thiệu sơ lược về cây bồ kết (Gleditsia australis Hemsl)

3

1.1.1. Giới thiệu chung

3

1.1.2. Công dụng trong y học cổ truyền của cây bồ kết

4

1.2. Tổng quan các nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của của

5

các loài trong chi Gleditsia
1.2.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học

5

1.2.2. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học các loài trong chi

8

Gleditsia

Chương 2: đối tượng và Phương pháp

10

nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu

10

2.2. Phương pháp chiết xuất

10

2.3. Các phương pháp phân lập

10

2.3.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

10

2.3.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế

11

2.3.3. Sắc kí cột (CC)

11

2.4. Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

2.4.1. Điểm nóng chảy (Mp)

Đỗ Thị Thoan

13
13

4

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

2.4.2. Độ quay cực ([ỏ]D)

13

2.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

14

2.4.4. Phổ khối lượng MS (Mass spectroscopy)

16

2.5. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

16

2.6. Phân lập các hợp chất

17

Chương 3. kết quả và thảo luận

20

3.1. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp 20
chất
3.1.1. Hợp chất BK3C (isovitexin):

20

3.1.2. Hợp chất GF 7.8(vitexin):

20

3.2. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các hợp chất:

21

3.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

21

3.3.1. Hợp chất BK3C (isovitexin)

21

3.3.2. Hợp chất GF 7.8 (vitexin)

26

3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Đỗ Thị Thoan

33

Kết luận

34

Tài liệu tham khảo

35

Phụ lục

38

5

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Danh mục các Hình trong khóa luận

Hình 1.1. Hình ảnh quả và cây bồ kết

4

Hình 3.3.1.1. Phổ 1H-NMR của BK3C

22

Hình 3.3.1.2. Phổ 13C-NMR của BK3C

23

Hình 3.3.1.3. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của BK3C

25

Hình 3.3.1.4. Phổ ESI-MS của BK3C

25

Hình 3.3.1.5. Cấu trúc hóa học của BK3C

26

Hình 3.3.2.1. Phổ 1H-NMR của GF7.8

27

Hình 3.3.2.2. Phổ 13C-NMR của GF7.8

27

Hình 3.3.2.3. Phổ HSQC của GF7.8

28

Hình 3.3.2.4. Phổ HMBC của GF7.8

29

Hình 3.3.2.5. Phổ MS của GF7.8

31

Hình 3.3.2.6. Phổ MS của GF7.8

31

Hình 3.3.2.7. Cấu trúc hóa học của GF7.8

31

Đỗ Thị Thoan

6

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Danh mục các bảng trong khóa luận

Bảng 3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng sinh in vitro của các hợp chất

21

Bảng 3.3.1.1. Kết quả phổ NMR của BK3C.

24

Bảng 3.3.2.1. Kết quả phổ NMR của GF7.8

32

Đỗ Thị Thoan

7

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Danh mục các chữ viết tắt
APCI-MS

Atmospheric

pressure Phổ khối ion hoá học tại áp

chemical ionization

xuất thường

CC

Column Chromatography

Sắc ký cột

13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

C-NMR

Resonance Spectroscopy
DEPT

cacbon 13

Distortionless Enhancement by Phổ DEPT
Polarisation Transfer

ESI-MS

Electronspray Ionization Mas Phổ khối ion hóa phun mù
điện tử

Spectrum
FAB-MS

Fast

Atom

Bombardment Phổ khối lượng bắn phá

Mass Spectrometry
1

H-NMR

nguyên tử nhanh

Proton Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Spectroscopy

HMBC

proton

Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua
Connectivity

HPLC_MS

High

Performance

nhiều liên kết
Liquid Sắc ký lỏng cao áp hiệu năng

Chromatography with Mass- cao kết nối khối phổ
Spectrometry
HSQC

Heteronuclear

Single- Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Quantum Coherence

1 liên kết

IR

Infrared Spectroscopy

Phổ hồng ngoại

IUPAC

International Union of Pure Hiệp hội Hóa học Quốc tế
and Applied Chemistry

Mp

Melting Point

Điểm chảy

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

Đỗ Thị Thoan

8

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

TMS

Khoá luận tốt nghiệp

Tetrametyl Silan

Đỗ Thị Thoan

9

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Mở đầu
Ngày nay thế giới đang phải đối mặt với hàng loạt các căn bệnh nguy
hiểm, đặc biệt là các bệnh lây nhiễm gây nên bởi vi khuẩn, virút, nấm và động
vật kí sinh. Mặc dù khoa học ngày nay đã và đang gặt hái được nhiều tiến bộ
mới, tăng cường các điều kiện sống của con người nhưng các bệnh lây nhiễm
vẫn là những mối đe dọa thường trực đối với sức khỏe. Những vấn đề này là
đặc biệt quan trọng ở các nước đang phát triển do môi trường sống và các
điều kiện y tế không đảm bảo và sự kháng thuốc của các dòng lây nhiễm đang
ngày càng gia tăng. Việc phát triển các thuốc kháng sinh mới đặc hiệu sẽ giúp
giảm thiểu sự lây lan của bệnh dịch, tăng cường công tác chăm sóc sức khỏe
người dân. Chính vì vậy, việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có nguồn
gốc thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng trong y học, nông
nghiệp và các mục đích khác trong đời sống con người là một trong những
nhiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước
quan tâm.

Cây bồ kết (Gleditsia australis Hemsl. Hay Gleditschia australis Hemsl.)
là cây mọc hoang ở cả miền Bắc và miền Nam nước ta với trữ lượng lớn.
Trong y học hiện đại, một số bệnh viện đã dùng bồ kết chữa bí đại, trung tiện
sau khi mổ, tắc ruột, dùng cho cả trẻ em và người lớn. Quả bồ kết còn được
dùng trong các trường hợp trúng phong, hôn mê bất tỉnh, cấm khẩu, hen
suyễn, mụn nhọt, viêm tuyến vú, đau nhức răng. Những nghiên cứu về tác
dụng dược lý cho thấy bồ kết có tác dụng kháng khuẩn mạnh như kháng tràng
cầu khuẩn, trực khuẩn lỵ shigella, trực khuẩn thương hàn, trực khuẩn mủ xanh
và phảy khuẩn tả.
Theo xu hướng nghiên cứu trên, mục tiêu của khóa luận là tập trung
nghiên cứu, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có trong thành phần
hoá học của cây bồ kết nhằm góp phần tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp

Đỗ Thị Thoan

10

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

theo trong lĩnh vực tìm kiếm các hoạt chất quý từ thiên nhiên phục vụ mục
tiêu chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Nhiệm vụ của khóa luận
1. Chiết, tách và phân lập isovitexin và vitexin từ lá cây bồ kết;
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập;

3. Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định isovitexin và

vitexin.

Đỗ Thị Thoan

11

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan
1. 1. Giới thiệu sơ lược về cây bồ kết (Gleditsia australis Hemsl.)
1.1.1. Giới thiệu chung
Chi Bồ kết (danh phỏp khoa học: Gleditsia, cũn viết là Gleditschia) là
một chi chứa cỏc loài bồ kết trong phõn họ Vang (Caesalpinioideae) của họ
Đậu (Fabaceae), có nguồn gốc tại Bắc Mỹ và châu Á. Tên gọi khoa học của
nó là để ghi công Johann Gottlieb Gleditsch, giám đốc Vườn thực vật Berlin,
mất năm 1786. Cú 12 loài trong chi này [23]:


Gleditsia amorphoides (Griseb.) Taub.



Gleditsia aquatica Marshall-Bồ kết nước



Gleditsia australis F. B. Forbes & Hemsl.-Bồ kết quả nhỏ



Gleditsia caspica Desf.-Bồ kết Caspi



Gleditsia delavayi Franchet



Gleditsia fera (Lour.) Merr.-Bồ kết Hoa Nam



Gleditsia ferox Desf.



Gleditsia japonica Miq. - Bồ kết nỳi hay bồ kết Nhật Bản



Gleditsia macracantha Desf.



Gleditsia microphylla H.D.Gordon-Bồ kết dại



Gleditsia sinensis Lam.-Bồ kết Trung Quốc



Gleditsia triacanthos L-Bồ kết ba gai

ở Việt nam, theo tỏc giả Phạm Hoàng Hộ, chi Gleditsia gồm cú 3 loài:
G. rolfei Vidal y Soler (tạo giỏc), G. pachycarpa Bal. ex Gagn. và G.
australis Hemsl. ex Forb. & Hemsl. (chựm kết, bự kết, tạo giỏc) [4].
Cây bồ kết có tên khoa học là Gleditsia australis Hemsl (hình 1.1).
Ngoài tên bồ kết, cây còn có một số tên tiếng Việt khác như: Chùm kết, Tạo
giác, Phắc kết (Tày), Co kết (Thái) [1-4]. Cây bồ kết thường được trồng khắp

Đỗ Thị Thoan

12

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Bắc, Trung, Nam. Cây bồ kết là loại cây gỗ cao 5-10 m, có gai to, cứng, chia

nhánh. Lá mọc so le, thường hai lần kép lông chim, mang 3-4 cặp lá chét bậc
nhất; mỗi lá chét này lại gồm 6-8 cặp lá chét bậc hai; phiến lá chét có lông ở
mặt trên, đầu tròn hay lõm, gốc lá lệch, mép có răng cưa nhỏ. Cụm hoa chùm
ở nách lá hay ở ngọn. Hoa tạp tính có 5 lá đài, 5 cánh hoa có lông dài ở mặt
trong; hoa đực có 10 nhị không có bầu; hoa cái hay hoa lưỡng tính có 5 nhị,
bầu dính, phủ lông sét. Quả cứng, khi chín màu nâu đen, chứa 10-12 hạt màu
nâu.

Hình 1.1. Hình ảnh quả và cây bồ kết
1.1.2. Công dụng trong y học cổ truyền của cây bồ kết
Cây bồ kết là một dược liệu dân gian được dùng phổ biến ở Việt nam.
Cây Bồ kết cung cấp các vị thuốc sau đây: quả Bồ kết-Fructus Gleditsiae,
thường gọi là tạo giác; gai Bồ kết-Spina Gleditsiae, thường gọi là tạo giác
thích; hạt Bồ kết-Semen Gleditsiae, thường gọi là tạo giác tử [1-2]
Quả Bồ kết có vị cay, mặn, tính ôn, hơi có độc, có tác dụng thông
khiếu, khử đờm, tiêu thũng, làm hắt hơi. Hạt Bồ kết có vị cay, tính ôn, có tác
dụng thông đại tiện, bí kết và chữa mụn nhọt. Gai Bồ kết có vị cay, tính ôn, có
tác dụng tiêu thũng, bài nùng, sát trùng [1].
Người ta thường dùng quả Bồ kết ngâm hoặc nấu nước gội đầu, trơn
tóc, dùng giặt quần áo len, dạ, lụa có màu không bị hoen ố và không bị phai

Đỗ Thị Thoan

13

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

màu. Bồ kết thường được dùng làm thuốc tiêu đờm, gây nôn và thông đại,
tiểu, trung tiện, sát trùng; chủ yếu dùng chữa trúng phong cấm khẩu, phong tê,
tiêu đồ ăn, đờm, suyễn thũng, sáng mắt, ích tinh. Liều dùng hàng ngày 0,5-1g
dưới dạng thuốc bột hay đốt ra than để dùng, hoặc thuốc sắc. Hạt Bồ kết dùng
thông đại tiểu tiện và chữa mụn nhọt. Ngày dùng 5-10g dạng thuốc sắc. Gai
Bồ kết dùng chữa ác sang, tiêu ung độc, sưng vú, làm xuống sữa [1].
Các đơn thuốc có chứa bồ kết: chữa trúng phong, cấm khẩu, hôn mê, bất
tỉnh; chữa hen suyễn, nhiều đờm; chữa bí đại tiện, tắc ruột, bụng trướng sau
khi mổ hoặc bệnh phù trướng ứ nước, đại tiểu tiện bí; chữa giun kim; chữa
sâu, nhức răng; chữa lở ngứa có nấm, chốc đầu; chữa quai bị; chữa lỵ amip có
kén, đi lỵ lâu ngày; chữa mụn nhọt bọc không vỡ mủ; chữa sưng vú cho phụ
nữ [2,3].

1.2. Tổng quan các nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học
của của các loài trong chi Gleditsia
1.2.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học
Trong số các loài thuộc chi Gleditsia kể trên hiện mới chỉ có một số
loài G. japonica và G. sinensis được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học.
Có thể tóm tắt như sau:
Năm 1982, từ dịch chiết quả loài G. japonica M., hai hợp chất tritecpen
saponin là gleditsia saponin B (1) và gleditsia saponin C (2) [5].

Đỗ Thị Thoan

14

Lớp K32C – Khoa Hoá Học

Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

O
C
O

O

OH

3

CH2

O

O

O
OH

CH2

OH

O
OH

O

OH

OH

OH

O

OH

CH3

OH

O
O
OH

C

R1

O
O

O
O

O

O
O

O
O

C

CH3

R2
OH

OH
OH

OH

OH

OH

O
OH

6'

6

HO

OH

OH
OH

1 (gleditsia saponin B) R1 = CH2OH R2 = CH2OH
2 (gleditsia saponin C) R1 = CH3
R2 = CH2OH

C O
R1

3

O
OH O
OH

CH2

O

O
OH
OH
OH

HO
R2

O
O
OH
OH

OH

O

O

6

O
OH

O

OH
O
OH
OH
OH

O CH2
O

OH
OH
O
O
O
CH3

3
4
5
6

(gleditsioside A)
(gleditsioside B)
(gleditsioside C)
(gleditsioside D)

R1 = H
R1 = H
R1 = OH
R1 = OH

R2 = CH3
R2 = CH2OH
R2 = CH2OH
R2 = CH3

R3 = H
R3 = H
R3 = Gal

R3 = Gal

OH OR3

Năm 1999, Zhang Z. và các cộng sự đã phân lập từ dịch chiết quả G.
sinensis, các hợp chất gleditsioside A (3), B (4), C (5) và D (6) [6],
gleditsioside E (7), F (8) và G (9) cùng với hai hợp chất đã biết là gleditsia
saponin B và C đã được phân lập và xác định cấu trúc [7].

Đỗ Thị Thoan

15

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

O
C
O

O

R1

3

CH2

O

O

O
OH

O
OH

CH2

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

CH3

OH

O
O
OH

C

R1

O
O

O

O

O

O

O

O C

O

R2

CH3

OH

OH
OH

OH OR3

OH
O
OH

6'

6

HO

OH

OH

OH

7 (gleditsioside E) R1 = OH R2 = CH2OH R3 = CH3
8 (gleditsioside F) R1 = OH R2 = CH3
R3 = CH3
9 (gleditsioside G) R1 = H R2 = CH3
R3 = CH2OH

Tiếp tục các nghiên cứu trên đối tượng G. sinensis, Zhang Z. và các
cộng sự còn tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất tritecpen
saponin mới từ dịch chiết quả của loài G. sinensis là gleditsioside N (10), O
(11), P (12) và Q (13) [8]. Ngoài ra, gleditsioside H (14), I (15), J (16), K (17)
và hai chất lần đầu tiên thu được trong thiên nhiên là gleditsia saponin C (18)
và E (19) [9].

O
C
O
O

3

CH2

O

R2O

O
OH

6'

O
O

OH

6

O

O

OH
6''

HO

OH

R1

OH
OH

O

O

HO

OH

OH

CH2

OH

O
OH
O

O

OH
O
O

O

O

O
CH3

OH

R3

O

O
O

OH

OH

OH

OH

OH OH

10 (gleditsioside N) R1 = CH2OH R2 = H
11 (gleditsioside O) R1 = CH3
R2 = H
12 (gleditsioside P) R1 = CH3
R2 = R3

Đỗ Thị Thoan

16

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

O
OH
O

O

3

CH2

O

O
HO

O
OH

O

CH2

OH

O
OH

C

CH2OH

OH

O
OH

OH
O

O

OH

OH
O

O

OH

O

O
CH3

OH

OH

O

O

OH

OH
OH

OH

OH OH

13 (gleditsioside Q)

c xa Năm 2005, hợp chất C-friedours-7-en-3-on (20) được phân lập từ gai của
loài G. sinensis [10].
Ngoài các hợp chất tritecpen saponin kể trên, các hợp chất phenolic
như: etyl gallat (21), đihyđrokaempferol (22), quercetin (23), 3,3,5,5,7pentahyđroflavanon (24), axit cafeic (25), eriođictyol (26) và (-)-epicatechin
(27) cũng được phân lập và xác định cấu trúc từ loài G. sinensis [11].
Bên cạnh 7 hợp chất phenolic trên, Zhou L. và các cộng sự còn phân
lập và xác định cấu trúc của hai hợp chất axit ellagic glycozyt là axit 3-Ometylellagic-4-(5-acetyl)--L-arabinofuranozyt

(28)

và

axit

3-O-

metylellagic-4’-O--L-rhamnopyranozyt (29) từ phân đoạn etyl axetat có
hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất của loài G. sinensis L.. Hai hợp chất này
đều thể hiện khả năng ức chế loài nấm gạo Magnaporthe grisea [12].
Thành phần hoá học của các loài trong chi Gleditsia chưa được nghiên
cứu nhiều ở Việt nam. Năm 1961, Đỗ Tất Lợi và cộng sự đã chiết được một

chất saponin tinh khiết từ quả Bồ kết Việt Nam với hiệu suất 10%. Chất này
không mùi, vị nhạt, gây hắt hơi mạnh, nhiệt độ nóng chảy 198-202oC, năng

Đỗ Thị Thoan

17

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

suất quay cực -32o. Chất này tan trong rượu và nước. Từ chất saponin này, các
tác giả đã thuỷ phân và kết tinh được một chất sapogenin có tinh thể hình kim,
không tan trong nước, tan trong ete, cồn và clorofoc, độ chảy 298-301oC. Tuy
nhiên, cấu trúc của hai hợp chất này chưa được xác định [1].
Năm 1963, Bùi Đình Sang chiết được từ bồ kết Việt Nam saponin, men
peroxyđaza và hai chất khác có tinh thể chưa xác định được tính chất.
Năm 1969, Ngô Thị Bích Hải đã phân lập được từ quả Bồ kết Việt Nam
8 chất flavonoit và 7 hợp chất tritecpen. Trong số 8 chất flavonoit, có 5 chất
thu được dưới dạng tinh khiết và được xác định là luteolin, saponaretin,
vitexin, homoorientin và orientin. Đối với các hợp chất tritecpen, phần
aglycon là axit oleanolic gắn với glucoza và galactoza. Ngoài ra, tác giả còn
chiết được một saponin mới là australozit [1].

1.2.2. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học các loài trong chi Gleditsia
Nghiên cứu về hoạt tính các loài trong chi Gleditsia chủ yếu tập trung
vào các loại hoạt tính như hoạt tính chống ung thư trên các dòng tế bào LLC

(tế bào ung thư phổi Lewis ở chuột), Panc02 (tế bào ung thư tuyến tuỵ ở
chuột), LNCaP (tế bào ung thư tuyến tuỵ ở người) và MCF-7 (tế bào ung thư
tuyến vú ở người)[13]. Hoạt tính chống bệnh bạch cầu của dịch chiết giàu
saponin từ quả cây G. sinensis L. trên các dòng tế bào ung thư và tế bào tuỷ
xương thu được từ những bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu tuỷ xương mạn và
cấp [14]. Nghiên cứu khả năng ức chế sinh trưởng của dịch chiết quả G.
sinensis L. đối với yếu tố sinh trưởng nguyên bào sợi cơ bản (bFGF) trong
các dòng tế bào ung thư vú (MDA-MB231), ung thư mũi hầu (CNE-2) và ung
thư tuyến tiền liệt (LNCaP) [15].
Konosima T. và các cộng sự tại trường Đại học Dược Kyoto Nhật Bản
đã cho thấy hợp chất tritecpen saponin phân lập từ dịch chiết quả cây G.

Đỗ Thị Thoan

18

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

japonica là gleditsia saponin C (2) có hoạt tính kháng HIV rất tốt. Hợp chất
này có khả năng ức chế sự sao chép của virut HIV trong các tế bào H-9 với
giá trị EC50 là 1,1 uM. Bên cạnh đó, trong công trình này, các tác giả cũng đã
phân lập được một hợp chất tritecpen saponin khác có hoạt tính kháng HIV
tốt là gymnocladus saponin G từ dịch chiết quả cây Gymnocladus chinensis (
với giá trị EC50 là 2,7 uM ) [16].
Gần đây, từ dịch chiết lá cây G. sinensis L., các nhà khoa học tại viện

thực vật Kunming, Viện Hàn Lâm Khoa học Trung Quốc đã phân lập hợp
chất axit lupan mới là axit 2b-cacboxyl-3b-hydroxyl-norlup A (1)20-(29)-en28-oic (30) có hoạt tính kháng HIV rất mạnh với giá trị EC50 < 0,064 ug/ml
[17].
Ngoài ra, các nhà khoa học tại trường Công nghệ sinh học và Nông
nghiệp Trung Quốc đã nghiên cứu theo hướng kháng vi sinh vật của loài G.
sinensis L. trên 2 loài vi khuẩn gram (+) Xanthomonas vexicatoria và vi
khuẩn gram (-) Bacillus subtilis, kết quả đã phân lập được 5 hợp chất phenolic
có

hoạt

tính

kháng

khuẩn

cao,

đó

là:

etyl

gallat,

3,3’,5’,5,7-

pentahydroflavanon, quercetin, axit cafeic và dihydrokaempferol [18].

Chương 2: đối tượng và Phương pháp
nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu thực vật được TS. Trần Huy Thái, Viện Sinh Thái và Tài nguyên
Sinh vật, Viện KH&CN Việt Nam, thu hái và xác định tên khoa học. Lá cây
được sấy khô và nghiền thành bột. Bảo quản trong điều kiện thoáng khí, tránh
nấm mốc và vi sinh.
2.2. Phương pháp chiết xuất

Đỗ Thị Thoan

19

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ
chiết và cách chiết. Mỗi loại hợp chất có độ hoà tan khác nhau trong từng loại
dung môi nên phải áp dụng các phương pháp chiết khác nhau đối với mỗi loại
chất đó. Và chiết lạnh là phương pháp sử dụng thông dụng hơn cả, nguyên tắc
của phương pháp này là sử dụng các loại dung môi thích hợp để hoà tan các
chất có trong nguyên liệu thực vật ở nhiệt độ thường.
2.3. Các phương pháp phân lập
2.3.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Chất cần phân tích được cho tương tác với hai pha tĩnh và pha động.

Pha động ở đây là chất lỏng, chuyển mẫu qua vùng chứa pha tĩnh hấp thụ. Tại
đây chất cần phân tích sẽ tương tác với chất hấp phụ nhờ tính phân cực của
chúng. Do sự tương tác này mà chất cần phân tích sẽ chuyển động chậm hơn
trong hệ thống sắc ký. Chất phân tích có ái lực yếu hơn với pha tĩnh sẽ chuyển
động nhanh hơn và đạt tới khoảng cách dịch chuyển lớn hơn so với chất có ái
lực mạnh hơn. Nhờ vậy mà các chất được phân tách trong quá trình chạy sắc
ký ở các vị trí khác nhau.
Sắc ký lớp mỏng ở đây thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DCAlufolien 60 F254 (Merk 1,05715), RP18 F254 (Merk). Phát hiện chất bằng đèn
tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm, có thể dùng máy ultrachimiscope
(254 nm), đèn tử ngoại để bàn KP-IN (365 nm) hoặc dùng dung dịch thuốc
hiện màu vanilin-sunfuric axit được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ
nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
2.3.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế
Mục đích: dùng để phân lập chất trực tiếp từ bản điều chế
Các thức tiến hành: Sử dụng bản mỏng tráng silicagel dày hơn, có thể
đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, sau khi chạy sắc kí xong có thể cạo riêng

Đỗ Thị Thoan

20

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

phần silicagel có chứa chất cần tách và giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp
để thu được từng chất riêng biệt.

2.3.3. Sắc kí cột (CC)
Sắc kí cột là phương pháp đơn giản, phổ biến nhất, chất hấp là phụ pha
tĩnh gồm các loại silicagel (kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo
YMC, ODS….Phương pháp này sử dụng các công cụ như sau:
Cột sắc kí giống như 1 cái buret gồm 1 ống thuỷ tinh hoặc kim loại
(thường là thuỷ tinh) và 1 cái khoá, không cần vạch chia độ, đôi khi cũng
không cần khoá, kích thước cột có đủ các loại lớn nhỏ.
Chất nhồi cột (pha tĩnh): thường dùng là silicagel pha thường và pha
đảo. Chất nhồi cột quyết định rất lớn đến quá trình sắc kí. Tuỳ theo chất cần
tách mà ta chọn pha thường hay pha đảo.
Dung môi: dung môi chọn thường phụ thuộc chất nhồi cột. Nếu dùng
silicagel pha thường (phân cực) thì chọn dung môi đi từ không phân cực đến
phân cực (Clorofom – Methanol), thông thường dùng hỗn hợp dung môi.
Cách thức tiến hành như sau: Chất hấp phụ được nhồi vào cột. Độ mịn
của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng
tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì khả năng tách
càng cao và ngược lại. Tuy nhiên kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy
càng giảm, có thể gây tắc cột, dung môi không chảy được. Khi đó phải sử
dụng áp suất trung bình MPLC hoặc áp suất cao HPLC. Khả năng tách của
cột phụ thuộc tỉ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L). Tỉ lệ L/D phụ
thuộc vào yêu cầu tách (tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể). Tỉ lệ giữa
quãng đường đi của chất cần tách với quãng đường đi của dung môi (gọi là
Rf) với mỗi chất có giá trị khác nhau. Nhờ sự khác nhau về Rf mà ta có thể
tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với chất hấp phụ cũng rất quan

Đỗ Thị Thoan

21

Lớp K32C – Khoa Hoá Học

Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

trọng. Tuỳ theo yêu cầu mà ta có tỉ lệ chất khác nhau: tách thô thì tỉ lệ này
thấp 1/5 – 1/10, tách tinh thì có thể từ 1/20 – 1/30 tuỳ thuộc vào hệ số tách.
Việc đưa chất hấp phụ lên cột bằng các phương pháp khác nhau tuỳ
thuộc vào lượng chất và dạng chất.
Một số lưu ý khi sử dụng sắc ký cột:
Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì thường tẩm chất vào silicagel rồi
làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột.
Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng
dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Kỹ thuật nhồi cột: chọn cột, rửa sạch, làm khô. Cân silicagel cần dùng (
dùng 1 miếng nhỏ bông gòn nhồi ở đáy cột để chặn silicagel lại, nếu cột quá
dài thì dùng 1 dây kẽm đẩy bông xuống rồi đong silicagel, thường cho vào
trên 2/3 cột), pha dung môi chạy hệ đúng với tỉ lệ đã lấy khi tiến hành với sắc
kí bản mỏng.
Nhồi cột khô: chất hấp phụ được đưa trực tiếp lên cột khi còn khô, dùng
que mềm gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột, sau đó
dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt
Nhồi cột ướt: silicagel đổ vào bình erlen rồi lấy pipet nhỏ hút dung môi
cho vào theo miệng ống để silicagel bám ở thành ống trôi xuống, sau đó đem
dung môi đổ vào bình đựng silicagel bột pha thành dung dịch, dùng đũa thuỷ
tinh để ngoáy đến khi không còn bọt khí (tranh gây nứt cột do silicagel chưa
tan hết nên vẫn còn độ nở) rồi cho vào cột, khoá nút nhám ở dưới lại. Cho đều
từ từ ở thành cột chảy xuống để cho miêng bông không bị bật lên sau đó ta
dùng phễu thuỷ tinh đổ vào đến khi gần đầy thì ta dùng que mềm gõ nhẹ lên

thành cột rồi mở nút nhám để dung môi chảy bớt ra và thu hồi lại. Cứ tiếp tục
làm như vậy đến khi hết lượng silicagel cho vào thì tiến hành rót thêm dung

Đỗ Thị Thoan

22

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

môi thu hồi để ổn định hệ đến khi hệ ổn định, cột không bị nứt thì dừng lại và
khoá cột lại sau đó nạp mẫu chất vào.
2.4. Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của chất phân lập ra được xác định bằng sự kết hợp của nhiều
phương pháp khác nhau. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất
mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau. Cấu trúc càng phức tạp thì
yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao.
2.4.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan
trọng. Thông thường việc phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm
kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ
tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng rất ít mẫu thử. Nếu điểm chảy của
hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá
0,5 ˚C thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh khiết. Khi điểm chảy xác định
được, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể đưa ra kết luận sơ bộ về hợp
chất đang nghiên cứu.

Điểm chảy được đo trên máy Kofler micro- hotstage của Viện Hoá học
các Hợp chất Thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4.2. Độ quay cực ([ỏ]D)
ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đẳng hướng, trong điều
kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện
trường chỉ còn dao động theo một phương nhất định được gọi là ánh sáng
phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần.
Mặt phẳng chứa tia sáng và phương dao động của vectơ điện trường
được gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phẳng chứa tia sáng và vuông góc
với mặt phẳng dao động gọi là mặt phẳng phân cực.

Đỗ Thị Thoan

23

Lớp K32C – Khoa Hoá Học


Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Khi cho ánh sáng phân cực thẳng đi qua dung dịch một chất quang hoạt
thì mặt phẳng phân cực sẽ bị quay một góc ỏ. Tuỳ theo chất quang hoạt mà
góc quay này có thể sang phải (+) hay sang trái (-). Độ lớn của góc quay ỏ
phụ thuộc vào nồng độ C (g/100ml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung
môi) l, nhiệt độ t và chiều dài sóng ở:
ỏ = [ ]t

C.l

100

Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của
Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hoá học các hợp chất hữu
cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng. Với việc sử dụng kết hợp các
kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác
định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ cacbon)
là sự cộng hưởng ở các tần số khác nhau của các hạt nhân từ ( 1 H và 13 C) dưới
tác dụng của từ trường ngoài. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được
biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học. Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn
được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau.
Các số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker
AM500 FT- NMR Spectrometer của Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
Phổ 1 H-NMR: Trong phổ 1 H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (  ) của
các proton được xác định trong thang từ 0 đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ
lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Mỗi loại
proton cộng hưởng ở một trường khác nhau vì vậy chúng được biểu diễn bằng

Đỗ Thị Thoan

24

Lớp K32C – Khoa Hoá Học

Trường đại học sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

một độ dịch chuyển hoá học khác nhau. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch
chuyển hoá học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà
người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
Phổ 13 C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên
tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ
khác nhau. Thang đo cho phổ 13 C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải
thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến 240 ppm).
Phổ DEPT: Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại
cacbon khác nhau. Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất.
Tín hiệu phổ của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 thì nằm về phía đối
diện trên phổ DEPT 135˚. Còn trên phổ DEPT 90˚ thì chỉ xuất hiện tín hiệu
phổ của các CH.
Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định
các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều.
Phổ HMBC: Đõy là phổ biểu diễn cỏc tương tỏcủa C và H trong phân
tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như
toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
Phổ HSQC: Đây là phổ biểu diễn các tương tác của C và H liên kết trực
tiếp với nhau trong phân tử. Như ở phổ HMBC, nhờ vào các tương tác trên
phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định
về cấu trúc.
2.4.4. Phổ khối lượng MS (Mass spectroscopy)
Phổ khối lượng được dùng khá phổ biến để xác định cấu trúc hoá học
của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này là
dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên
ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác dựa vào đó

Đỗ Thị Thoan

25

Lớp K32C – Khoa Hoá Học