Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy, bảo quản và bước đầu thăm dò khả năng biệt hóa tế bào gốc trung mô từ tủy xương người thành dạng tế bào cơ tim

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
⎯⎯⎯⎯⎯

⎯⎯⎯⎯⎯

TRẦN THỊ THANH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, NUÔI CẤY, BẢO QUẢN
VÀ BƯỚC ĐẦU THĂM DÒ KHẢ NĂNG BIỆT HĨA
TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI
THÀNH DẠNG TẾ BÀO CƠ TIM

Chuyên ngành : Hóa sinh Y học
Mã số
: 62.72.04.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2011


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học :
PGS.TS. Tạ Thành Văn
PGS.TS. Nguyễn Thị Hà

PHẢN BIỆN 1:

PHẢN BIỆN 2:
PHẢN BIỆN 3:
Luận án sẽ được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp Trường tại
Trường Đại học Y Hà Nội. Vào ..........giờ.....ngày......tháng........năm.......

CÓ THỂ TÌM HIỂU LUẬN ÁN TẠI
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội
- Viện Thông tin – Thư viện Y học Trung ương


MỘT SỐ CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
1. Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Đỗ Doãn
Lợi, Tạ Thành Văn, (2010), “Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mơ từ
tủy xương người”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, Tập 66 - số 1, 36 - 41.
2. Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Đỗ Doãn
Lợi, Tạ Thành Văn, (2010), “Nghiên cứu sử dụng 5-azacytidine để biệt
hóa tế bào gốc trung mơ theo hướng cơ tim”, Tạp chí Nghiên cứu Y
học, Tập 69 - số 4,
3. Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành
Văn, Đỗ Doãn Lợi, (2010), “Biểu hiện marker bề mặt tế bào gốc trung
mô nuôi cấy nguồn gốc tủy xương người”, Tạp chí Y học Việt Nam,
Tập 372, Tháng 8 - số 2, 143 – 148.
4. Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Đỗ Doãn
Lợi, Tạ Thành Văn, (2011), “Nghiên cứu biểu hiện một số gen đặc
trưng cho tổ chức tim trên tế bào gốc trung mơ ni cấy trong q trình
biệt hóa theo hướng tế bào cơ tim”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, Tập 72 số 1, 1 - 7.
5. Trần Thị Thanh Hương, Phạm Xuân Thắng, Trần Vân Khánh,
Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn, (2011), “Nghiên cứu sự biến đổi hình

thái cấu trúc của tế bào gốc trung mô trong một số điều kiện biệt hóa in
vitro”, Tạp chí Y học Việt Nam, Tập 378, Tháng 2 - số 1, 9 - 13.


Lời cảm ơn
Tụi xin chõn thnh cm n Th trng Viện 69, Thủ trưởng Bộ
Tư lệnh bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh; Ban giám hiệu, Phịng Đào
tạo Sau Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi
cho tơi trong q trình học tập và hồn thành luận án.
Tơi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
PGS.TS. Tạ Thành Văn, người Thầy đã hướng dẫn, tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án, đồng thời là người
Thầy đã định hướng và truyền cho tơi lịng say mê và những kinh
nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.
PGS.TS. Nguyễn Thị Hà, người Thầy đã chỉ bảo, hướng dẫn tơi
trong suốt q trình học tập và nghiên cứu chun ngành Hóa sinh Y
học, người Thầy khơng chỉ là tấm gương về lao động khoa học mà còn
là tấm gương trong cuộc sống của tôi.
TS. Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu b Gen – Protein,
Trường Đại học Y Hà Nội, người đã giúp đỡ tôi thực hiện nhiều kỹ
thuật trong nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng và chân thành cảm ơn
Khoa Sinh hóa - Viện 69 - Bộ Tư lệnh bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ
Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho
tơi trong suốt q trình học tập.
PGS.TS. Phạm Thiện Ngọc, Trưởng bộ mơn Hóa sinh cùng các
thầy cơ bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều
kiện giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện luận án.
GS.TS. Trịnh Bình, ngun Trưởng bộ mơn Mô phôi, Trường Đại
học Y Hà Nội đã cho tôi nhiều góp ý sâu sắc cho luận án.

TS. Lý Tuấn Khải, Trưởng Khoa Huyết học - Bệnh viện Quân đội
108, đã hỗ trợ cho tôi trong việc thu thập mẫu bệnh phẩm trong nghiên
cứu.
Các cán bộ nhân viên Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, bộ
mơn Hóa sinh, bộ môn Y sinh học Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội
đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và sử dụng các trang thiết bị của
trung tâm, bộ mơn để nghiên cứu và hồn thành đề tài này.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với bố mẹ và anh chị
em trong gia đình, đặc biệt là chồng và các con đã luôn là chỗ dựa
vững chắc của tơi, ln thương u, khuyến khích, động viên và tạo điều
kiện tốt nhất về tình cảm, tinh thần và vật chất cho tơi để hồn thành tốt
chương trình học tập và thực hiện thành cơng luận án này.
Hà Nội, tháng 6 năm 2011


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai cơng bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác

Tác giả luận án


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
cAMP

cycle Adenosin mono phosphat

DNA

Deoxyribonucleic Acid

EGC

Embryonic Germ Cells – Tế bào mầm phôi

ESC

Embryonic Stem Cells –Tế bào gốc phôi

FACS

Fluorescence-activated cell sorting –
(Chọn lựa tế bào bằng huỳnh quang )

HSC

Hematopoietic Stem Cells – Tế bào gốc tạo máu

ICC

Immunocytochemistry – Hóa miễn dịch tế bào

ISCT

International Society for Cellular Therapy –
(Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào)

KHV

Kính hiển vi

MSC

Mesenchymal Stem Cells - Tế bào gốc trung mô

NMCT

Nhồi máu cơ tim

RNA

Ribonucleic Acid

RT – PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi ngược)


DANH MỤC BẢNG, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
Bảng 1.1. Phân loại một số marker bề mặt tế bào gốc trung mô............................ 12
Bảng 1.2. Một số điều kiện nuôi cấy cơ bản tế bào gốc trung mô ......................... 26
Bảng 1.3. Một số loại môi trường và huyết thanh được sử dụng phổ biến
trong nuôi cấy tế bào gốc trung mô......................................................................... 27
Bảng 1.4. Thống kê các thử nghiệm lâm sàng tế bào gốc trung mô đối với bệnh
tim mạch .................................................................................................................. 37
Bảng 2.1. Các cặp mồi của kỹ thuật PCR............................................................... 40
Bảng 3.1. Tỷ lệ áp dụng thành cơng qui trình phân lập, ni cấy và qui trình bảo
quản, phục hồi ni cấy tế bào gốc trung mơ tủy xương người ............................. 57

Bảng 3.2. Kích thước đường kính ngang của nhân tế bào ni cấy (n= 30).......... 62
Bảng 3.3. Biểu hiện marker bề mặt của tập hợp tế bào nuôi cấy, giai đoạn P1 ..... 71
Bảng 3.4. Mức độ biểu hiện marker bề mặt CD13, CD73, CD90 trên tập hợp tế
bào nuôi cấy, giai đoạn P1 bằng kỹ thuật FACS .................................................... 71
Bảng 3.5. Kết quả so sánh mức độ biểu hiện của gen MEF2C giữa MSC khơng
biệt hóa và MSC biệt hóa theo phương pháp của Tomita và cs, sử dụng gen tham
chiếu là β-actin ........................................................................................................ 86
Biểu đồ 2.1. Cường độ tín hiệu huỳnh quang phân tích biểu hiện marker bề mặt
của MSC bằng kỹ thuật FACS ................................................................................ 49
Biểu đồ 3.1. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD34 bề mặt tế bào nuôi cấy
giai đoạn P0 và P1................................................................................................... 63
Biểu đồ 3.2. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD34 bề mặt tế bào ni cấy
giai đoạn P0 và P1................................................................................................... 65
Biểu đồ 3.3. Các biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD13 bề mặt tế bào nuôi
cấy giai đoạn P1 ...................................................................................................... 68
Biểu đồ 3.4. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD73 bề mặt tế bào nuôi cấy
giai đoạn P0 và P1................................................................................................... 69


Biểu đồ 3.5. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD90 bề mặt tế bào nuôi cấy
giai đoạn P0 và P1................................................................................................... 70
Sơ đồ 1.1. Phân loại tế bào gốc tương ứng theo các giai đoạn
hình thành và phát triển ở người ............................................................................. 3
Sơ đồ 2.1. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................... 41


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Sự khác biệt giữa tế bào gốc và tế bào tiền thân .................................... 6
Hình 1.2. Khả năng biệt hóa tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô trong
tủy xương................................................................................................................. 9

Hình 1.3. Khả năng đa biệt hóa in vitro tạo một số dòng tế bào chức năng
của tế bào gốc trung mơ .......................................................................................... 11
Hình 1.4. Nhuộm von Kossa tế bào gốc trung mơ sau biệt hóa tạo ngun bào
xương (C) và đối chứng khơng biệt hóa (D) .......................................................... 17
Hình 1.5. Nhuộm Oil Red O tế bào gốc trung mô sau biệt hóa tạo tế bào mỡ (E)
và đối chứng khơng biệt hóa (F) ............................................................................. 18
Hình 1.6. Nhuộm Collagen typ II tế bào gốc trung mơ sau biệt hóa tạo tế bào
sụn (G) và đối chứng khơng biệt hóa (H) .............................................................. 19
Hình 1.7. Các giai đoạn mơ bệnh học của bệnh nhồi máu cơ tim.......................... 29
Hình 1.8. Minh họa một số tác nhân cảm ứng và thúc đẩy quá trình hình thành
tim của động vật có xương sống ............................................................................. 30
Hình 1.9. Hình ảnh mơ cơ tim dưới kính hiển vi điện tử truyền qua ..................... 34
Hình 2.1. Mơ hình phân lớp tế bào đơn nhân tủy xương bằng kỹ thuật ly tâm
theo gradient tỷ trọng .............................................................................................. 42
Hình 2.2. Dụng cụ hạ nhiệt độ bảo quản tế bào ni cấy....................................... 45
Hình 2.3. Mơ hình ngun lý tạo dịng của thiết bị đếm tế bào dịng chảy .......... 47
Hình 2.4. Mơ hình khuyếch đại tín hiệu phát hiện bằng phức hệ
Enzym - Strepavidin - Biotin trong nhuộm hóa miễn dịch tế bào .......................... 50
Hình 3.1. Hình ảnh tế bào bám dính và phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy,
ngày thứ 15, giai đoạn P0, HE x 100 ...................................................................... 58
Hình 3.2. Hình ảnh tế bào bám dính và phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy,
ngày thứ 20, giai đoạn P0, HE x 100 ...................................................................... 59
Hình 3.3. Hình thái và mật độ tế bào sau khi cấy chuyển ở giai đoạn nhân nuôi,
HE x200................................................................................................................... 60


Hình 3.4. Hình ảnh tế bào ni cấy dạng hình sao, hình sợi. HE x100 ................. 61
Hình 3.5. Hình ảnh tế bào ni cấy dạng hình thoi. HE x 100 .............................. 61
Hình 3.6. Nhuộm kháng thể đơn dịng kháng CD34 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi
cấy ở giai đoạn P1, ICC x200 ................................................................................. 64

Hình 3.7. Nhuộm kháng thể đơn dịng kháng CD34 trên lát cắt mẫu tế bào ni
cấy ở giai đoạn P3, ICC x 200 ................................................................................ 64
Hình 3.8. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD45 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi
cấy ở giai đoạn P1, ICC x200 ................................................................................. 66
Hình 3.9. Nhuộm kháng thể đơn dịng kháng CD45 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi
cấy ở giai đoạn P3, ICC x 200 ................................................................................ 67
Hình 3.10. Tế bào ni cấy biệt hóa theo hướng tạo tế bào mỡ,
sau biệt hóa 10 ngày, nhuộm bằng phương pháp Oil – Red – O x 100 ................. 72
Hình 3.11. Tế bào ni cấy biệt hóa theo hướng tạo tế bào mỡ, sau 10 ngày biệt
hóa, nhuộm bằng phương pháp Oil – Red – O x200 .............................................. 73
Hình 3.12. Tế bào gốc trung mô phát triển sau bảo quản và phục hồi nuôi cấy,
HE x 100.................................................................................................................. 74
Hình 3.13. Hình ảnh siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô sau bảo quản phục hồi ni cấy, TEM x3 000.............................................................................. 74
Hình 3.14. Tế bào gốc trung mơ khơng biệt hóa dưới kính hiển vi đối pha x200 . 76
Hình 3.15. Tế bào gốc trung mơ biệt hóa bằng 5- azacitidine 4 tuần dưới kính
hiển vi đối pha x200 ................................................................................................ 77
Hình 3.16. Hình ảnh siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô
không biệt hóa. TEM x2 500................................................................................... 78
Hình 3.17. Hình ảnh siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô biệt hóa
theo hướng tạo tế bào cơ tim theo phương pháp của Tomita và cs ........................ 79
Hình 3.18. Hình ảnh siêu cấu trúc xơ trung gian của tế bào gốc trung mơ biệt
hóa sau 4 tuần theo phương pháp của Tomita và cs ............................................... 80
Hình 3.19. Nhuộm kháng thể kháng Desmin tế bào gốc trung mơ biệt hóa sau 4
tuần theo phương pháp của Tomita và cs. ICC x 400........................................... 81


Hình 3.20. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR biểu hiện một số gen đặc trưng
tế bào cơ tim của tế bào gốc trung mơ biệt hóa sau 4 tuần theo phương pháp của
Tomita và cs ............................................................................................................ 82
Hình 3.21. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR biểu hiện gen MEF2C

của tế bào gốc trung mơ biệt hóa sau 2 - 4 tuần theo phương pháp của Tomita và
cs.............................................................................................................................. 83
Hình 3.22. Hình ảnh kết quả Real-time PCR gen MEF2C của tế bào gốc trung
mơ khơng định hướng biệt hóa và sau biệt hóa 2 ÷ 4 tuần ..................................... 84
Hình 3.23. Hình ảnh kết quả Real-time PCR gen β - actin của tế bào gốc trung
mơ khơng định hướng biệt hóa và sau biệt hóa 2 ÷ 4 tuần ..................................... 85
Hình 3.24. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR biểu hiện các gen đặc trưng biệt
hóa tế bào cơ tim của MSC biệt hóa 7 ngày theo phương pháp của Shim và cs .... 87
Hình 4.1. Sự khác biệt về siêu cấu trúc giữa tế bào gốc trung mơ khơng biệt hóa
và tế bào gốc trung mơ biệt hóa theo hướng tạo tế bào cơ tim bằng 5 – azacitidin
– TEM...................................................................................................................... 106


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Danh mục các chữ viết tắt
Mục lục
Danh mục các bảng, biểu đồ
Danh mục các hình vẽ, hình ảnh
ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................3
1.1. Những hiểu biết cơ bản về tế bào gốc.............................................................3
1.1.1. Tế bào gốc và cách gọi tên....................................................................3
1.1.2. Những đặc điểm chung của tế bào gốc .................................................5
1.1.3. Tế bào gốc của tủy xương.....................................................................7
1.2. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells)........................................ 10
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu.............................................................................. 10
1.2.2. Những đặc điểm cơ bản của tế bào gốc trung mô .............................. 11

1.2.3. Khả năng biệt hóa in vitro của tế bào gốc trung mô........................... 16
1.2.4. Tiêu chuẩn tối thiểu của tập hợp tế bào gốc trung mô nuôi cấy......... 19
1.2.5. Tiềm năng tái tạo phục hồi mô cơ tim của tế bào gốc trung mô ........ 20
1.3. Phương pháp phân lập và điều kiện nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy
xương người ........................................................................................................... 23
1.3.1. Phân lập tế bào gốc trung mô ............................................................. 23
1.3.2. Nuôi cấy tế bào gốc trung mô............................................................. 26
1.4. Liệu pháp tế bào đối với một số bệnh lý tim mạch ..................................... 28
1.4.1 Những vấn đề cơ bản của liệu pháp tế bào đối với bệnh lý tim mạch. 28
1.4.2. Sự hình thành tim thời kỳ phơi thai và tín hiệu điều tiết .................... 29


1.4.3. Hình thái học tế bào cơ tim và mơ cơ tim trưởng thành..................... 33
1.4.4. Các thử nghiệm lâm sàng tế bào gốc trong điều trị bệnh tim mạch ... 35
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 38
2.1. Đối tượng và chất liệu nghiên cứu ................................................................ 38
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 38
2.1.2. Chất liệu nghiên cứu ........................................................................... 38
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất .............................................................. 38
2.2.1. Dụng cụ ............................................................................................... 38
2.2.2. Trang thiết bị....................................................................................... 38
2.2.3. Hóa chất, thuốc thử ............................................................................. 39
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 40
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................ 40
2.3.2. Các quy trình phân lập, nhân ni, bảo quản và biệt hóa tế bào gốc
trung mô tủy xương người theo hướng dạng tế bào cơ tim ......................... 42
2.3.3. Kỹ thuật đánh giá sự thành cơng của các quy trình được áp dụng..... 46
2.4. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 55
2.5. Đạo đức trong nghiên cứu ............................................................................. 56
2.6. Xử lý số liệu..................................................................................................... 56

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ .................................................................................... 57
3.1. Kết quả phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô
tủy xương................................................................................................................ 57
3.1.1. Tỷ lệ áp dụng thành cơng quy trình phân lập – nhân ni và quy
trình bảo quản, phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy xương người.... 57
3.1.2. Kết quả định danh tế bào gốc trung mô sau phân lập – nuôi cấy ...... 57
3.1.3. Kết quả phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô sau bảo quản. .......... 73
3.2. Kết quả nghiên cứu biệt hóa in vitro tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo
hướng dạng tế bào cơ tim ..................................................................................... 75
3.2.1. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mơ theo trình của Tomita và cs ... 75
3.2.2. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mơ theo quy trình của Shim và cs 87


CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN .................................................................................. 88
Phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô từ tủy
xương người ........................................................................................................... 89
Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người .................................. 89
Định danh tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người ..... 94
Bảo quản tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người........ 102
Biệt hóa tế bào gốc trung mơ ni cấy theo hướng dạng tế bào cơ tim ........... 102
Quy trình biệt hóa invitro tế bào gốc trung mơ ni cấy theo hướng tạo dạng tế
bào cơ tim ................................................................................................................ 103
Kết quả biệt hóa theo hướng dạng tế bào cơ tim .................................................... 105
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 113
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤCs


ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, y học tái tạo (regenerative medicine) đã và đang trở thành một
lĩnh vực mũi nhọn của y học hiện đại. Một trong những phương hướng của y
học tái tạo là nghiên cứu việc cấy ghép mô, tế bào vào cơ thể trưởng thành nhằm
phục hồi một phần hay tồn bộ chức năng của mơ, tế bào sau những thương tổn
bệnh lý hay lão hóa, sau những sang chấn cơ học hay do những khuyết tật bẩm
sinh. Cùng với những tiến bộ về sinh học tế bào, y học tái tạo đang hướng tới
các nghiên cứu nhằm khai thác tiềm năng của tế bào gốc trưởng thành đối với
q trình phục hồi của các mơ có tính biệt hóa cao (thần kinh, mơ cơ tim). Liệu
pháp tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) đã và đang được sử dụng trong
điều trị các loại bệnh lý khác nhau, trong đó có một số bệnh tim mạch [90]. Tế
bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell - MSC) là một trong ba loại tế bào
gốc trưởng thành có trong tủy xương, có khả năng biệt hóa đa dạng và những
đặc tính sinh học vượt trội, đang là ứng cử viên sáng giá cho các nghiên cứu tái
tạo phục hồi mô cơ tim [74],[116]. Việc sử dụng MSC trong nghiên cứu và điều
trị không vi phạm pháp luật và đạo đức y học. Tuy nhiên, MSC là một quần thể
tế bào gốc hiếm, tồn tại rải rác, xen kẽ trong nhiều mô với tỷ lệ rất thấp, do vậy
những nghiên cứu về MSC đều được tiến hành trên các tập hợp MSC hình thành
sau các q trình phân lập, ni cấy ngoài cơ thể.
Từ đầu thế kỷ XX cho đến nay, bệnh tim mạch là một bệnh lý phổ biến trên
thế giới, tỷ lệ mắc bệnh cao trong cộng đồng. Hàng năm tại Hoa Kỳ có khoảng 1
triệu ca nhồi máu cơ tim (NMCT) với tỷ lệ tử vong là 25% trong ba năm; có xấp
xỉ 5 triệu bệnh nhân suy tim với tỷ lệ tử vong hàng năm là 20% [47]. Ở Việt
Nam, số lượng bệnh nhân tim mạch cũng ngày một tăng cao do tuổi thọ được cải
thiện cũng như sự gia tăng các yếu tố nguy cơ. Kỹ thuật ghép tim không chỉ hạn
chế về nguồn hiến tặng, mà hiện nay vẫn tồn tại những vấn đề về kỹ thuật ghép
và chi phí sau ghép. Liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh lý cơ tim nói chung và
NMCT nói riêng được cho là có thể khắc phục được cả hai vấn đề nêu trên.
1

Hàng loạt thử nghiệm lâm sàng đối với liệu pháp tế bào gốc tủy xương không
chọn lọc, tiếp theo là liệu pháp MSC chọn lọc từ tủy xương đã được tiến hành,
cho thấy tính hiệu quả và tính an tồn của các liệu pháp này đối với bệnh tim
mạch.
Tại Việt Nam, sử dụng tế bào gốc của tủy xương hướng tới việc điều trị
bệnh tim mạch đã được bắt đầu. Kết quả điều trị cấy ghép tế bào gốc tủy xương
đầu tiên trên 6 bệnh nhân suy tim nặng sau NMCT được thực hiện tại Viện Tim
mạch Quốc gia là rất đáng khích lệ [4],[6]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu phân
lập nhằm tạo ra một tập hợp MSC từ tủy xương với đầy đủ các bằng chứng về
tiêu chuẩn nhận biết là hết sức cần thiết, sẵn sàng cho các nghiên cứu thử
nghiệm lâm sàng sử dụng chọn lọc MSC sau này. Các bằng chứng về khả năng
biệt hóa in vitro theo hướng tạo tế bào cơ tim của tập hợp MSC nuôi cấy vừa
chứng minh khả năng đa biệt hóa của MSC, vừa góp phần giải thích cơ chế tác
dụng cải thiện chức năng tim thu được sau liệu pháp tế bào gốc trên 6 bệnh nhân
NMCT như đã trình bày ở trên.
Mục tiêu của đề tài:
1. Áp dụng quy trình phân lập, ni cấy và bảo quản tế bào gốc trung mô
từ tủy xương người.
2. Nghiên cứu áp dụng một số quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô
thành dạng tế bào cơ tim.

2


CHƢƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MỘT SỐ VẤN ĐỀ CƠ BẢN VỀ TẾ BÀO GỐC VÀ SỰ BIỆT HÓA
1.1.1. Tế bào gốc và phân loại
Tế bào gốc đầu tiên của cơ thể xuất hiện từ khi trứng được thụ tinh với tinh

trùng. Các tế bào gốc được hình thành tương ứng với từng thời kỳ phát triển của
cá thể. Quá trình hình thành và phát triển của cá thể khiến cho các tế bào gốc
giảm dần về khả năng biệt hóa, từ tổng năng (totipotent) của hợp tử, tồn năng
(pluripotent) của các tế bào gốc phôi, đến đa năng (multipotent) của tế bào gốc
trưởng thành và cuối cùng là đơn năng (unipotent) của các tế bào tiền thân.
TẾ BÀO GỐC NGƯỜI

Phôi

Mầm phôi
(5-6 ngày)

Mào
sinh dục

Trưởng thành

Sơ sinh

Thai

Mô thai

Máu
dây rốn

Tế bào gốc
thai

Tế bào gốc

máu
dây rốn

Tế bào gốc
trung mơ
dây rốn

Tế bào gốc
dịng
sinh dục

Trung mô
dây rốn

(6 tuần)

Tế bào gốc
phôi

Tế bào
mầm
sinh dục

Tế bào
máu

Tế bào
trung mô

Gan

Trứng

Biểu bì
(Da, tóc)

Tế bào gốc
dịng
sinh dưỡng

Tinh trùng

Thần kinh

Mắt

Sơ đồ 1.1. Phân loại tế bào gốc tương ứng theo các giai đoạn
hình thành và phát triển ở người

3

Tụy


1.1.1.1. Theo khả năng biệt hóa
- Tế bào gốc tồn năng (totipotent): là loại tế bào gốc xuất hiện đầu tiên của cơ
thể sinh vật khi trứng được thụ tinh với tinh trùng, ở giai đoạn phôi dâu
(blastomeres). Các tế bào này có tiềm năng biệt hóa cao nhất, là nguồn gốc hình
thành tất cả các loại tế bào của một bào thai hoàn chỉnh.
- Tế bào gốc toàn năng (pluripotent): là các tế bào được phân lập từ lớp sinh

khối tế bào bên trong (inner cell mass) ở giai đoạn phôi nang (blastocyst). Trừ tế
bào màng nuôi, tế bào gốc tồn năng có khả năng biệt hóa thành những tế bào
thuộc ba lá phơi (trung bì, nội bì và ngoại bì) - nguồn gốc của tất cả tế bào có
chức năng chuyên biệt của cơ thể sau này. Các tế bào gốc tồn năng khơng biệt
hóa tạo ra tế bào màng nuôi, nên từ các tế bào gốc này khơng có khả năng hình
thành một bào thai hồn chỉnh.
- Tế bào gốc đa năng (multipotent): là các tế bào có khả năng biệt hóa thành
nhiều loại tế bào khác nhau, được phân lập từ mơ đã biệt hóa nguồn gốc thai
hoặc cơ thể trưởng thành, ví dụ: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc trung mô...
- Tế bào gốc tiềm năng (oligopotent), tứ năng (quartpotent), đơn năng
(unipotent): là các tế bào gốc định cư hoặc các tế bào tiền thân tồn tại trong các
mô của thai hoặc cơ thể trưởng thành. Các tế bào này có tiềm năng biệt hóa hạn
chế, chỉ tạo ra một hoặc vài dịng tế bào nhất định. Ví dụ: tế bào tiền thân dòng
tủy, tiền thân dòng lympho là các tế bào gốc tiềm năng, tiền thân tế bào mast là
tế bào gốc đơn năng.
1.1.1.2. Theo vị trí phân lập tế bào
- Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cells – ESC): là tế bào gốc được phân lập ở
ngày thứ 6 của giai đoạn phơi nang (blastocyst), tại vị trí lớp sinh khối tế bào
bên trong (inner cell mass). Tế bào gốc phôi là tế bào gốc vạn năng có khả năng
phân chia vơ hạn trong ni cấy và biệt hóa tạo ra tất cả các tế bào thuộc ba lá
phôi.
- Tế bào mầm sinh dục (Embryonic Germ Cells – EGC): là các tế bào gốc được
phân lập từ mào sinh dục (genital ridge) của phôi tuần thứ 6, là tế bào gốc vạn
4


năng và được coi là nguồn gốc biệt hóa thành các tế bào sinh dục sau này (trứng,
tinh trùng).
- Tế bào gốc trưởng thành (Adult Stem Cells): là tế bào gốc được phân lập từ
nhiều mô trưởng thành của cơ thể: tủy xương, máu tuần hoàn, máu dây rốn, giác

mạc, võng mạc, tủy răng, gan, da, dạ dày, tụy ..v.v. Tế bào gốc trưởng thành bao
gồm tế bào gốc trưởng thành dòng sinh dưỡng (somatic line) và dòng sinh dục
(germ line).
1.1.1.3. Theo hướng biệt hóa chính
- Tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic Stem Cells – HSC): là loại tế bào gốc đa
năng, có khả năng biệt hóa thành tất cả tế bào thuộc các dòng tế bào máu, bao
gồm bạch cầu dòng tủy, bạch cầu dòng lympho, hồng cầu và tiểu cầu. Tủy
xương là nơi sản sinh ra HSC trong cơ thể trưởng thành.
- Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSC): là loại tế bào gốc đa
năng khơng thuộc dịng tế bào tạo máu. Đầu tiên, các tế bào này được phân lập
từ tủy xương và hiện nay có thể được phân lập ở nhiều mơ khác của bào thai
cũng như cơ thể trưởng thành. Tế bào gốc này có khả năng biệt hóa “mềm dẻo”.
1.1.2. Những đặc điểm chung của tế bào gốc
Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa hoặc biệt hóa chưa hồn tồn ở
các mức độ khác nhau, vì vậy có khả năng hình thành các dịng tế bào chun
biệt. Ngày nay, người ta đã phân lập được các tế bào gốc từ các mơ đã biệt hóa
của cơ thể trưởng thành - tế bào gốc trưởng thành. Nếu như tế bào gốc phơi và tế
bào gốc của bào thai đóng vai trị hình thành cá thể thì tế bào gốc trưởng thành
có vai trị chính trong hệ thống tái tạo, sửa chữa mơ; tạo ra các tế bào có chức
năng thay thế cho các tế bào bị thiếu hụt do các q trình sinh lý cũng như bệnh
lý của mơ sau khi cá thể chào đời. Các tế bào gốc trưởng thành do vậy có khả
năng tự làm mới (renewal) và tồn tại trong suốt quá trình sống của cá thể.
1.1.2.1. Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa
Một trong những đặc tính căn bản của tế bào gốc là khơng có cấu trúc đặc
hiệu mơ, cấu trúc mà nhờ đó các tế bào thực hiện các chức năng chuyên biệt của
5


từng mơ (ví dụ: chức năng co bóp để bơm máu từ tim ra các động mạch của tế
bào cơ tim, chức năng vận chuyển các phân tử oxy của tế bào hồng cầu, chức

năng dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh...).
1.1.2.2. Tế bào gốc có khả năng tự làm mới và bảo tồn kiểu hình khơng biệt hóa
TẾ BÀO GỐC

TẾ BÀO GỐC

TẾ BÀO CHUYÊN BIỆT
vd: Tế bào thần kinh

TẾ BÀO TIỀN THÂN

TẾ BÀO CHUYÊN BIỆT
vd: Bạch cầu hạt trung tính

vd: Tế bào tiền thân dịng tủy

TẾ BÀO CHUYÊN BIỆT
vd: Hồng cầu

Hình 1.1. Sự khác biệt giữa tế bào gốc và tế bào tiền thân
(Nguồn © 2001 Terese Winslow, Lydia Kibiuk stemcells.nih.gov)
Không giống như các tế bào đã biệt hóa cao (tế bào cơ tim hay tế bào thần
kinh), tế bào gốc trưởng thành có khả năng tăng sinh và tự làm mới (selfrenewal) mà vẫn giữ được đặc tính khơng biệt hóa trong suốt q trình tồn tại
của mơ, cơ thể. Q trình tự làm mới thơng qua sự phân chia tế bào một cách
đối xứng (symmetric) tạo ra hai tế bào gốc hoặc phân chia không đối xứng
(asymmetric) tạo ra một tế bào gốc và một tế bào tiền thân bắt đầu có xu hướng
biệt hóa. Trong khi đó, các tế bào tiền thân khơng có khả năng này, chúng phân
chia hình thành hai tế bào biệt hóa có chức năng chun biệt (Hình 1.1). Khả

6

năng tự làm mới là một đặc tính giúp phân biệt giữa tế bào gốc trưởng thành và
tế bào tiền thân định cư tại mơ.
1.1.2.3. Tế bào gốc có thể tạo nên một hoặc vài dịng tế bào có chức năng
chuyên biệt
Quá trình tế bào gốc chuyển thành các tế bào có chức năng riêng biệt (tế
bào cơ tim, tế bào bêta của tụy, tế bào thần kinh...) được gọi là q trình biệt hóa
(differentiation). Q trình này xảy ra khi tế bào gốc đáp ứng các tín hiệu bên
trong và bên ngồi tế bào. Những tín hiệu bên trong được kiểm sốt bởi gen của
nhân tế bào. Những tín hiệu bên ngồi của q trình biệt hóa tế bào là các tác
nhân được tiết ra bởi các tế bào khác (các cytokin, các yếu tố tăng trưởng). Nó
cịn là sự tiếp xúc trực tiếp của tế bào gốc với các tế bào lân cận và mạng lưới
ngoại bào.
1.1.3. Tế bào gốc của tủy xƣơng
Cấu tạo mô học của tủy xương đã được mô tả khá cụ thể [1]. Tủy xương
lấp đầy các ống tủy của xương dài và trong các hốc của xương dẹt. Tổng trọng
lượng của tủy xương ở người trưởng thành trung bình khoảng 2600 gam. Có thể
phân biệt bằng mắt thường tủy đỏ và tủy vàng. Tủy đỏ là vùng tủy tạo huyết hay
tủy hoạt động. Tủy vàng giàu tế bào mỡ và thường không tham gia tạo máu.
Trong trường hợp thiếu máu hoặc thiếu oxy trong máu, tủy vàng nhanh chóng
chuyển thành tủy đỏ. Tủy xương gồm hệ thống những xoang mạch (mao mạch
kiểu xoang) xen kẽ với những khoang tạo máu. Những khoang tạo máu có nền là
mơ võng và các thành phần gian bào.
Trong các lỗ lưới của mô võng chứa một tập hợp các loại tế bào rất đa dạng,
chiếm phần lớn là quần thể các tế bào máu ở các giai đoạn phát triển và biệt hóa
khác nhau, cùng với đó là các tế bào gốc của tủy xương. Cho đến nay đã xác
định được ba loại tế bào gốc tuỷ xương, bao gồm: tế bào gốc tạo máu
(Hematopoietic Stem Cell - HSC), tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem
Cell - MSC) và tế bào tiền thân nội mô (Endothelial Progenitor Cell, EPC) [11].

HSC và MSC là hai quần thể tế bào gốc của tủy xương được nhiều nghiên cứu
7


đề cập tới. Sự phân bố và khả năng biệt hóa của chúng trong tủy xương được mơ
tả ở hình 1.2.
Mơ võng gồm những tế bào võng hình sao tựa trên lưới sợi võng. Những tế
bào này có khả năng thực bào và điều tiết quá trình sinh sản, biệt hóa của các
dịng tế bào tạo máu. MSC tủy xương được xác định là thuộc loại tế bào võng.
Thành phần gian bào ở tủy xương gồm collagen, glycosaminoglycan và
những glycoprotein cấu trúc. Glycosaminoglycan ở tủy xương là hyaluronic
acid. Hai protein cấu trúc được xác định là fibronectin và laminin.
1.1.3.1. Tế bào gốc tạo máu
Ở người trưởng thành, HSC được sản sinh và cư trú chủ yếu tại tủy xương.
Chúng có thể được huy động và có mặt trong máu ngoại vi, nhưng trong các mơ
khác (gan, lách) thì rất hiếm. HSC chiếm tỷ lệ 1:10.000 các tế bào của tủy
xương và nhanh chóng hình thành tất cả các tế bào tiền thân thuộc dòng tế bào
máu in vivo và in vitro [132]. HSC được chia thành HSC dài hạn (long-term
repopulating HSC), là tập hợp HSC có tiềm năng tự làm mới cao và HSC ngắn
hạn (short- term repopulating HSC), là tập hợp HSC có khả năng hình thành một
cách nhanh chóng các tế bào thuộc dịng tế bào máu sau quá trình cấy ghép tủy
xương [86]. Cả hai quần thể HSC này đặc trưng bởi dấu ấn kháng nguyên bề
mặt CD34 và một số kháng nguyên khác chỉ có ở các tế bào máu, như CD38,
CD45, HLA-DR[118] và CD133[81].
1.1.3.2. Tế bào gốc trung mơ
MSC có nhiều đặc tính khác với HSC. Sau khi ly tâm dịch tủy xương với
việc sử dụng dung dịch tỷ trọng 1,077 g/ml (hoặc 1,073 g/ml), một tập hợp tế
bào đơn nhân chứa MSC (tỷ trọng thấp hơn 1,077 g/ml hoặc 1,073 g/ml) sẽ tập
trung thành một lớp ngay trên lớp dung dịch tỷ trọng, được gọi là lớp tế bào
“vòng nhẫn”. Bạch cầu hạt và hồng cầu bị lắng xuống, nằm ở đáy ống ly tâm do

có tỷ trọng cao hơn. Sau một thời gian ni cấy, một tập hợp MSC mới sẽ hình
thành từ tập hợp tế bào đơn nhân thu được ở trên. MSC bám dính vào bề mặt
nhựa ni cấy, cịn HSC bị loại bỏ do khơng bám dính được. MSC tăng sinh và
8


giữ được kiểu hình khơng biệt hóa qua nhiều lần cấy chuyển. Trong điều kiện
biệt hóa in vitro, MSC hình thành tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn. MSC có
khả năng tăng sinh cao, với 35 lần nhân đôi in vitro [24]. Dưới tác dụng của các
chất gây phân bào như PDGF (platelet-derived growth factor), EGF (epidermal
growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor) và IGF-1 (insulin-like
growth factor-1) [19], MSC tăng sinh mà vẫn giữ được trạng thái không biệt
hóa.

Hình 1.2. Khả năng biệt hóa tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô trong
tủy xương (Nguồn © 2001 Terese Winslow, Lydia Kibiuk stemcells.nih.gov)
1.1.3.3. Tế bào tiền thân nội mô
Tập hợp tế bào tiền thân nội mô (Endothelial Progenitor Cells - EPC) còn
gọi là tế bào gốc nội mô (Endothelial Stem Cells). Các tế bào này cùng với HSC
và MSC có mặt trong tập hợp tế bào đơn nhân tủy xương. Ngoài tủy xương,
người ta đã phân lập được EPC từ máu ngoại vi, máu dây rốn. Ở người, EPC sau
9


phân lập biểu hiện một số marker của tế bào tiền thân hay tế bào gốc như CD34,
VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor -2). VEGFR-2 có nhiều
tên gọi khác như: KDR (kinase insert domain receptor), Flk-1 (fetal liver kinase1) và CD309. Sau một thời gian nuôi cấy, EPC biểu hiện các marker đặc trưng
cho tế bào nội mô như: CD34, CD309, CD31, Tie-2 (tyrosine kinase with
immunoglobulin and EGF homology domains) hay CD202 và E- Selectin hay
CD62E [10].

1.2. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MESENCHYMAL STEM CELLS)
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu
Tế bào gốc trung mô đã được giới khoa học biết đến trước khi tên gọi
“MSC” ra đời.
- Năm 1867, Cohnheim phát hiện trong tủy xương có các tế bào gốc khơng
thuộc tế bào gốc tạo máu (non-Hematopoietic Stem Cell).
- Từ 1966 – 1987, Friedenstein và cs được coi là một trong những nhà khoa học
có các nghiên cứu tiên phong về MSC, mở ra một thời kỳ bùng nổ các báo cáo
về loại tế bào gốc này. Từ tủy xương chuột, Friedenstein đã phân lập được một
loại tế bào dạng nguyên bào sợi [44], có khả năng bám dính và tăng sinh mạnh
trong môi trường nuôi cấy. Các tế bào này có khả năng biệt hóa thành tạo cốt
bào (osteoblasts), tế bào mỡ (adipocytes), tế bào sụn (chondrocytes) và được gọi
là tế bào gốc của tủy (marrow stem cells).
- Năm 1991, Caplan đề xuất tên gọi tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem
Cells - MSC) để mô tả các tế bào khơng đồng nhất, có nguồn gốc tủy xương, có
khả năng bám dính vào bề mặt nhựa ni cấy thơng thường, các tế bào này tăng
sinh khi nhân ni ngồi cơ thể và có thể biệt hóa để tạo ra các loại tế bào liên
kết đa dạng [28]. Tuy nhiên theo một số tác giả khác, các tế bào này thuộc loại
tế bào tiền thân và chúng có tên gọi tế bào đệm trung mô (Mesenchymal Stromal
Cells - MSC) [97].
- Năm 2004, lần đầu tiên tập hợp MSC chọn lọc sau phân lập và nuôi cấy được
sử dụng trong thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh nhân NMCT cấp [32].
10