nghiên cứu về chủng Streptomyces 40.16

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

ADN : axit Deoxyribonucleic
B.cereus : Bacillus cereus ATCC 9946
B.pumilus : Bacillus pumilus ATCC 10441
B.subtilis : Bacillus subtilis ATCC 6633
D : Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Dmhc : Dung môi hữu cơ
E.Coli : Escheriachia Coli ATCC 25922
P.aeruginosa: Pseudomonas Nhiễm sắc thể aeruginosa VM 201
P.mirabilis : Proteus mirabilis BV 108
S(Spiral) : Xoắn lò xo
s : độ lệch chuẩn đã hiệu chỉnh
S.typhi : Salmonella typhi DT220
S.flexneri : Shigella flexneri DT 122
S.lutea : Sarcina lutea ATCC 9314
Sm(smooth) : Nhẵn
S.aureus : Staphylococus aureus ATCC 1228
VSV : Vi sinh vật
ISP : Chương trình Streptomyces Quốc tế
MT : Môi trường
dd : Dung dịch
VK : Vi khuẩn




THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN

T VN

Hin nay cựng vi s phỏt trin ca cụng ngh thụng tin thỡ cụng ngh
sinh hc cng c coi l mt trong nhng ngnh cụng ngh hng u ca th
gii. Trong ú phi k n cụng ngh sinh hc vi sinh vt sn xut khỏng sinh,
vitamin v cỏc hot cht ng dng trong y hc cng nh cỏc lnh vc khỏc phc
v i sng con ngi ang cú nhng phỏt trin vt bc.
T nhng phng phỏp sinh tng hp v bỏn tng hp thỡ cụng ngh vi
sinh sinh tng hp khỏng sinh tip tc khng nh vai trũ ca mỡnh. Trong s
hn 10.000 cht khỏng sinh c tỡm ra thỡ cú khong 2.000 cht do thc vt to
ra cũn khong 8.000 cht l khỏng sinh do vi sinh vt tng hp, trong ú x
khun tng hp hn 60%. Cỏc cụng trỡnh nghiờn cu ó chng minh
Streptomyces l mt chi x khun gm nhiu loi cú kh nng sinh tng hp
khỏng sinh a dng v cu trỳc v c im khỏng khun. c bit mt s loi
trong chi ny cú kh nng tng hp cỏc cht chng ung th v iu tr HIV-
AIDS.
Tuy nhiờn cú mt vn gõy lo õu ln i vi cỏc nh nghiờn cu, ú l
s xut hin ca cỏc vi sinh vt khỏng khỏng sinh v cỏc cht húa tr liu khỏc.
Do ú cỏc nh khoa hc v cỏc chuyờn gia y t ó khụng ngng tỡm kim nhng
phng sỏch chng li hin tng ny.
Ti b mụn Vi sinh v Sinh hc trng i hc Dc H Ni, chỳng tụi tin
hnh phõn lp v nghiờn cu v chng Streptomyces 40.16 vi cỏc mc ớch sau:
+ T chng Streptomyces ó c phõn lp, chn ging sinh tng hp
khỏng sinh tt nht bng chn lc ngu nhiờn v t bin,
+ Nghiờn cu mụi trng nuụi cy v iu kin lờn men ti u,
+ Nghiờn cu c im, hỡnh thỏi v sinh lý nhm xỏc nh tờn khoa hc
ca chng Streptomyces 40.16 theo khúa phõn loi ISP,
+ Nghiờn cu xõy dng quy trỡnh chit, tỏch sn phm v cỏc c tớnh ca
khỏng sinh do x khun Streptomyces 40.16 tng hp lờn.
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN

PHẦN 1
TỔNG QUAN

1.1. VÀI NẪT VỀ KHÁNG SINH [5][6][8][11]
1.1.1.LỊCH SỬ
Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Fleming trong khi
nghiên cứu tụ cầu khuẩn ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm
vào hộp peptri nuôi tụ CẦU TẠO THàNH VŨNG VỤ KHUẨN. HIỆN Tượng
kỠ LẠ NàY đÓ được Fleming nghiên cứu và phân lập thuần khiết và xác định
được mốc xanh đó là Penicillium notatum một chủng tạo ra penixilin.
Năm 1941 penixilin được nghiên cứu sản xuất phục vụ điều trị cho
thương binh trong đại chiến thế giới thứ II và kỷ nguyên của chất kháng sinh
được thừa nhận. Cho đến nay người ta đÓ PHỎT HIỆN Và MỤ TẢ KHOẢNG
Hơn 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn và vi
khuẩn. Thuật ngữ kháng sinh (antibiotic) được Waksman N.A gọi từ 1944 KHI
ỤNG PHỎT MINH RA STREPTOMYCIN TỪ MỤI trường nuôi cấy
STREPTOMYCES GRISEUS
1.1.2 Định nghĩa
KHỎNG SINH Là NHỮNG HỢP CHẤT HOỎ HỌC DO VI SINH VẬT
TIẾT RA CÚ TỎC DỤNG ỨC CHẾ SỰ PHỎT TRIỂN HAY TIỜU DIỆT
MỘT CỎCH CHọn lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, xạ
khuẩn, protozoa, virus) hay cả tế bào ung thư ở nồng độ thấp.
1.1.3.Cơ chế tác dụng của kháng sinh.
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính
xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi
chất. Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong
nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức tác dụng
khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: Tác dụng LỜN THàNH TẾ BàO,
TỎC DỤNG LỜN MàNG NGUYỜN SINH CHẤT, TỎC DỤNG LỜN QUỎ

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN

TRNH TNG HP ADN, TC DNG LN QU TRNH TNG HP
PROTEIN, TC DNG LN S TRAO i cht hụ hp v cui cựng l tỏc
dng lờn s trao i cht trung gian.
1.1.4.PHếN LOI KHNG SINH
PHõn loi khỏng sinh cú th theo nhiu cỏch, nhng theo cu trỳc húa hc
l khoa hc nht.Bng 1 gii thiu mt s nhúm khỏng sinh quan trng.

Bng 1: Cỏc cht khỏng sinh c phõn loi theo cu trỳc hoỏ hc
PHếN LOI NHM KHNG SINH KHNG SINH C
TH
1. Cỏc khỏng sinh cú cha
ng trong phõn t
AMINOGLYCOSID
ORRTHSOMYCIN
N-GLYCOSID
C-GLYCOSID
GLYCOLIPID
STREPTOMYCIN,
NEOMYCIN
EVERNINOMYCIN
STREPTOTHRICIN
VANCOMYCIN
MOENOMYCIN
2. KHNG SINH CHA
VNG LACTON LN
(MACROCYCLIC
LACTON)
KHNG SINH MACROLID

KHNG SINH POLYEN
ANSAMYCIN
MACROTETROLID
ERYTHROMYCIN
CANDICIDIN,
NISTATIN
RIFAMICIN
TETRANACTIN
3. QUINON V CC
KHNG SINH CNG
H
ANTHRACYCLIN
NAPHTHOQUINON
BENZOQUINON
CC TETRACYCLIN
ADRIAMYCIN
ACTINORHODIN
MITOMYCIN
TETRACYCLIN,
TERAMYCIN
4. CC KHNG SINH
AMINOACID V
PEPTID
DN XUT AMINOACID
KHNG SINH
BETALACTAM
KHNG SINH PEPTID
CHROMOPEPTID
DEPSIPEPTID
CYCLOSERIN

PENICILIN,
CEPHALOSPORIN
BACITRAXIN,
POLYMYCIN
ACTINOMYCIN
VALINOMYCIN
5. KHNG SINH D
VNG CHA NIT
CC KHNG SINH
NUCLEOSID
POLYOXIN
6.KHNG SINH D
VNG CHA OXY
CC KHNG SINH
POLYETHER
MONENSIN
7. Cỏc Khỏng sinh nhõn
thm
DN XUT benzen, cỏc ờte
thm
CLORAMFENICOL
NOVOBIOCIN

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN

1.1.5 KHỎI NIỆM VỀ KHỎNG KHỎNG SINH
Kháng kháng sinh là hiện tượng VSV mất đi tính nhậy cảm ban đầu của
nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hố trị liệu.
Kháng sinh chủ yếu mất tác dụng theo 3 cơ chế: Thay đổi vị trí đích, giảm
tính thấm của thuốc hoặc do tác động của eNZYM LàM MẤT HOẠT TỚNH

CỦA KHỎNG sinh. Tính kháng kháng sinh được di truyền cho các thế hệ tiếp
theo. Bản chất di truyền tính kháng thuốc được khẳng định nhờ tác nhân gây đột
biến và plasmid. CỎC QUỎ TRỠNH NàY lan truyền tính kháng thuốc ngồi
nhiễm sắc thể xảy ra ở mức độ phân tử, tải nạP NHỜ bACTERIOPHAGE Và
BIẾN NẠP VàO VI KHUẨN và tiếp hợp.
1.1.6 Sơ đồ mơ tả quy trỠNH SẢN XUẤT KHỎNG SINH
Tinh chÕ
Gièng trun đ trong phßng thÝ nghiƯm
Sinh khèi
Sinh khèi kh«
DÞch
chiÕt sinh khèi
S¶n phÈm
Tinh chÕ
B×nh nh©n gièng C1, C2,C3
B×nh lªn men t¹o kh¸ng sinh
Tinh chÕ
DÞch läc
DÞch chiÕt KS
®Ëm ®Ỉc
S¶n phÈm ®· kiĨm
nghiƯm
nghiƯm
S
¶n
phÈm ®ãng gãi
S¶n phÈm
Tinh chÕ
Läc
DÞch sau lªn men

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN


Hình 1. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
1.1.7 ỨNG DỤNG CỦA KHỎNG SINH
Kháng sinh được sử dụng trong y học từ 1940 (penixilin) sau đó một loạt
các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh ra và nhanh chóng được
sử dụng để diều trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo.
BẢNG 2 :MỘT VàI KHỎNG SINH QUAN TRỌNG CÚ GIỎ TRỊ KINH
TẾ CAO
TỜN KHỎNG SINH VI SINH VẬT SẢN XUẤT
KHỎNG SINH
HOẠT PHỔ
PENICILIN G PENICILLIUM
CHRYSOGENUM
KHỎNG KHUẨN
STREPTOMYCIN S. GRISEUS KHỎNG lao
TETRACYCLIN S. AUREOFACIENS KHỎNG KHUẨN
CHLORAMFENICOL S. VENEZUELA KHỎNG KHUẨN
OXYTETRACYCLIN STR. RIMOSUS KHỎNG KHUẨN
CEPHALOSPORIN C CEPHALOSPORIUM
ACREMONIUM
KHỎNG KHUẨN
ACTINOMYCIN D S. ANTIBIOTICUS Kháng ung thư
BLEOMYCIN S. VERTICILLUM Kháng ung thư
DAUNORUBICIN S. PEUCETIUS Kháng ung thư
MITOMYCIN C STREPTOMYCES SP Kháng ung thư
KANAMYCIN S. KANAMYCETICUS KHỎNG KHUẨN
NISTATIN S. NOURSEI KHỎNG NẤM

FUMAGILLIN ASPERGILLUS FUMIGATUS KHỎNG
PROTOZOA
GRISEOFULVIN PENICILLIUM
GRISEOFULVUM
KHỎNG NẤM
NISIN STREPTOCOCCUS SP. BẢO QUẢN
THỰC PHẨM
NATAMYCIN STREPTOCOCCUS SP. BẢO QUẢN
THỰC PHẨM
RIFAMYCIN NOCARDIA MEDITERANEI. KHỎNG LAO
THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN

POLYMYXIN B BACILLUS POLYMYXA KHỎNG KHUẨN
GENTAMYCIN MICROMONOSPORA
PURPUREA.
KHỎNG KHUẨN

KHỎNG SINH CŨN được sử dụng trong thú y để điều trị các bệnh nhiễm
trùng của động vật như viêm phổi ở trâu bŨ, TỤ HUYẾT TRỰNG Ở LỢN,
V.V…TRONG CHăn nuôi kháng sinh được sử dụng làm chất bổ sung vào thức
ăn nhằm kích thích tăng trọng. Rất nhiều chẩt kháng sinh được ứng dụng với
mục đích này (các kháng sinh nhóm tetracyclin, monenzin,…).
KHỎNG SINH CŨN được ứng dụng trong nông nghiệp trước hết để tiêu
diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụi
ở lúa (validamyin, blasticidin S, kasugamyxin, v.v…), bệnh thối cổ rễ ở các cây
có củ,v.v…Kháng sinh cŨN KỚCH THỚCH NẨY MẦM CỦA HẠT. THường
ngâm hạt trong dung dịch kháng sinh trước khi gieo vừa để kích thích nẩy mầm,
vừa tiêu diệt mầm bệnh trong đất.
KHỎNG SINH CŨN được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo
quản thực phẩm đóng hộp.Nếu dùng kháng sinh thực phẩm đóng hộp sẽ bảo

quản được lâu hơn, khử trùng ở nhiệt độ thấp hơn nên chất lượng thực phẩm giữ
được tốt hơn(ví dụ NIZIN).
1.2.ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN [1][9][11][14][15]
1.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn
* Đặc điểm chung của xạ khuẩn: (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn
thật (Eubacteria) có cấu tạo sợi như nấm (nấm tia) nhưng lại có khích thước và
cấu tạo tế bào gần giống vi khuẩn, chúng phân bố rộng rÓI TRONG TỰ
NHIỜN: TRONG đất, nước và trong các chất hữu cơ.
- Những đặc điểm đặc trưng của xạ khuẩn :
+ Kích thước của xạ khuẩn nhỏ bé tương tự như vi kích thước vi khuẩn
+ NHÕN CỦA XẠ KHUẨN là nhân không điển hình
+ MàNG TẾ BàO XẠ KHUẨN KHỤNG CHỨA XENLULO Và KITIN
+ SỰ PHÕN CHIA TẾ BàO CỦA XẠ KHUẨN THEO KIỂU CỦA VI
KHUẨN
THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN

+ X KHUN KHNG C GII TNH
- TUY VY X KHUN LI C HNH thỏi, cu TO SI, PHT
TRIN BNG PHếN NHNH THNH NHNG SI NH, DI GI L
KHUN TI (HIPHA), MI KHUN TI DO MT T BO HNH THNH,
TP HP CA CC KHUN TI NY GI L H KHUN TI.
* c im cu to t bo x khun :
- ng kớnh khun ti x khun khong 0,2 - 3,0 àM
- MU SC CA KHUN TI khớ sinh rt phong phỳ: mu trng, vng,
, lc, tớa, nõu, en
- THNH T BO DY T 7,5-10,0 NM, KHNG C XENLULO V
KITIN
- PHếN CHIA T BO THEO KIU PHếN BO V TNH.
* PHếN LOI:
Actinomycetales

Actinoplanaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae



NOCARDIA STREPTOMYCES
MICROMONOSPORA

Hỡnh 2: S b phõn loi x khun

1.2.2.c im hNH THI V SINH L CA X KHUN chi Streptomyces
* c im hNH THI:
- KHUN LC TO THNH TNG CM, B MT KH RP, X
X, DNG PHN , KHNG TRONG SUT, C CC NP TO RA THEO
HNH PHNG X.
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN

- Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách ra khỏi mơi trường ni
CẤY.
- Khẩn ty cơ chất tiết ra mơi trường một số loại sắc tố, có sắc tố hồ tan
trong nước, có sắc tố chỉ hồ tan trong dung mơi hữu cơ.
+ Khuẩn ty cơ chất mọc trong mơi trường ni cấy, khơng phân cách
trong suốt q trỠNH PHỎT TRIỂN
- KHUẨN TY khí SInh: khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài
trong khơng khí thành những khuẩn ty khí sinh và có đường kính từ 1,0-1,4 µM.
+ Chuỗi bào tử: được hỠNH THàNH TỪ KHUẨN TY KÝ SINH, CÚ
NHIỀU HỠNH DẠNG KHỎC NHAU: thẳng, MÚC CÕU, XOẮN, UỐN
CONG.
+ Bào tử trần: được hỠNH THàNH DO SỰ PHÕN CẮT CỦA SỢI BàO

TỬ, Là Cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bào tử trần có thể hỠNH CẦU,
HỠNH ELIPSOID, HỠNH QUE, HỠNH TRỤ. CỎC BàO TỬ TẬP HỢP VỚI
NHAU THàNH CHUỖI 3- 50 BàO TỬ HOẶC NHIỀU Hơn. Bề mặt của bào tử
có thể có dạng trơn nhẵn (SM), XỰ XỠ (WA), CÚ GAI (SP), HOẶC CÚ TÚC
(HA).
* Đặc điểm sinh lý:
- STREPTOMYCES là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hố cao. Để phát
triển chúng phân giải các hydrat cacbon làm nguồn thức ăn cung cấp vật chất và
nguồn năng lượng đồng thời thuỷ phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh
bột. Chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit.
- STREPTOMYCES Là VI SINH VẬT CÚ THàNH TẾ BàO KIỂU CW1
CÚ CHỨA L-DAP (DIAMINOPIMELAT) Và GLYCIN.
- STREPTOMYCES Là LI XẠ KHUẨN HỤ hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối
ưu của chúng thường là 25-30
0
C, một vài lồi có thể mọc ở nhiệt độ cao hơn, pH
tối ưu thường từ 6,8-7,5.
- Khả năng tạo sắc tố của STREPTOMYCES: SẮC TỐ TẠO THàNH TỪ
STREPTOMYCES được chia thành bốn loại: sắc tố hồ tan, sắc tố khuẩn ty cơ
chất, sắc tố melanoid, sắc tố khuẩn lạc.
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

1.2.3.PHÕN LOẠI STREPTOMYCES
CHI STREPTOMYCES bao gồm một số lượng lớn các xạ khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp ra các kháng sinh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau .Việc phân loại và xác định TỜN XẠ KHUẨN Là RẤT QUAN TRỌNG.
CÚ RẤT NHIỀU KHOỎ PHÕN LOẠI STREPTOMYCES KHỎC NHAU:
PHÕN LOẠI THEO KRASILLKOW, WAKSMAN, GAUZE, SHIRLING &
GOTTLIEB, NGI RA CŨN CÚ THỂ PHÕN LOẠI THEO KIỂU GEN. HỘI
NGHỊ "VI SINH VẬT THẾ GIỚI LẦN X" (được tổ chức tại Mexico vào năm

1970) chọn khố phân loại của E.B.Shirling & Gottlieb làm khố phân loại
chính để phân loại chi STREPTOMYCES và đặt tên quốc tế là International
STREPTOMYCES PROJECT (ISP)
Khố phân loại dựa vào các đặc điểm:
- Đặc điểm hỠNH THỎI HỌC CỦA XẠ KHUẨN :
+ Màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí SINH,
+ HỠNH DẠNG CHUỖI BàO TỬ,
+ BỀ MẶT BàO TỬ.
- Đặc điểm sinh lí học:
+ Khả năng tạo sắc tố hồ tan,
+ Khả năng tạo sắc tố melanoid,
+ Khả năng sử dụng các nguồn đường của xạ khuẩn.
1.2.4 Khả năng sINH TỔNG HỢP KHỎNG SINH CỦA STREPTOMYCES
MỘT SỐ KHỎ LỚN KHỎNG SINH DO các LI STREPTOMYCES
SINH TỔNG HỢp, rất đa dạng, có trong hầu hết các nhóm phân loại kháng sinh.
1.3 CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT [1][5][8][10][11][15]
1.3.1.Mục đích
Trong thực tế khơng thể phân lập được từ tự nhiên một chủng VSV có
khả năng tạo chất kháng sinh mong muốn với hàm lượng đủ để thỏa mãn u
cầu của sản xuất cơng nghiệp. Các VSV phân lập từ cơ chất tự nhiên thường có
hoạt tính thấp đồng thời trong q trình ni cấy, hoạt tính của chúng thường
giảm dần. Vì vậy việc cải tạo giống VSV bằng nhiều biện pháp khác nhau nhằm
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

thu c nhng chng cú hot tớnh cao, n nh l mt trong nhng iu kin
quan trng v cn thit quy mụ phũng thớ nghim trc khi a ra cụng nghip
húa.
1.3.2.Phõn lp ging x khun
Ngi ta thng ly mu t cỏc ngun c cht khỏc nhau: t rung, bựn,
nc cng phõn lp x khun sinh khỏng sinh. T cỏc mu trờn em phõn

lp khit nhng x khun sinh khỏng sinh bng cỏc phng phỏp c trng v
trờn cỏc mụi trng chn lc.
Cỏc phng phỏp phõn lp ging x khun: phng phỏp cy dch chit
trờn b mt thch, phng phỏp cy t trc tip trờn b mt thch ó cha sn
VSV kim nh, phng phỏp lm giu t, phng phỏp thờm khỏng sinh vo
mụi trng phõn lp, phõn lp VSV sinh khỏng sinh chng ung th.
1.3.3. Cỏc phng phỏp ci to ging
A. Phng phỏp chn lc ngu nhiờn:
Chn lc t nhiờn hay cũn gi l sng lc ngu nhiờn l tuyn chn ly
nhng dng chng cú nhng c tớnh sinh tng hp khỏng sinh tt nht, xut
hin ngu nhiờn do s tỏc ng ca cỏc iu kin ngoi cnh.
B.t bin nhõn to
t bin nhõn to l quỏ trỡnh x lý t bo bng cỏc tỏc nhõn gõy t bin
(lý, húa, sinh hc). Cỏc tỏc nhõn ny khi s dng vi liu lng thớch hp s
git cht hu ht cỏc VSV, nhng cỏ th sng xút s cú s bin i NST, gõy
ra t bin gen liờn quan n cu trỳc gen lm thay i 1 hay nhiu nucleotit
trong trỡnh t mó húa gi l t bin im. õy l loi t bin cú ý ngha trong
cụng nghip khỏng sinh, lm thay i tớnh trng cng cú th dn n lm mt
kh nng to khỏng sinh (t bin õm tớnh), hay tng cng.
*nh sỏng UV kh nng õm xuyờn kộm nhng vi nhng t bo VSV cú kớch
thc nh (0,3-3
à
m) thỡ nú cú th xuyờn thu ti nhõn. Vỡ vy c dựng ph
bin trong t bin ci to ging.
*C ch: Tia UV tỏc dng lờn ADN v mnh nht vựng 260nm gõy
dime húa thymin (do lm t cỏc liờn kt hyro trong mch kộp ADN ca t bo
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN

VSV). Mà thymin gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C
5

và C
6
. Hậu quả
là sao chép bị sai lầm vì ADN polymeraza dễ lắp 1 nucleotit khơng chính xác
vào vị trí trên. Đồng thời trên sợi AND cũng xuất hiện một dimepyrimidin khác
gọi là quang sản phẩm 6-4. Ở đây C
6
của 5’ (thymin hoặc cytozin) được liên kết
với C
4
của 3’ (thường là Cytozin). Các sản phẩm này là ngun nhân chủ yếu
của đột biến gây nên bởi ánh sáng UV.
*Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết vầ tần số phát sinh đột biến:
-Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi 3 yếu tố là thời gian chiếu, khoảng
cách chiếu, độ pha lỗng bào tử. Thực nghiệm cho thấy những đột biến dương
thường xuất hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót bào tử từ 0,1-1%, còn
đột biến âm thường xuất hiện ở liều lượng chiếu cao hơn.
-Ánh sáng thường: Sau khi đột biến bằng tia tử ngoại, nếu đem chiếu ánh
sáng thường (bước sóng

=320-480nm) trở lại thì sẽ có khoảng 50-80% tế bào
được phục hồi do tác dụng của men photolyase. Hiện tượng này gọi là quang
phục hoạt.
Ngồi ra, các yếu tố nhiệt độ, pH, mơi trường ni cấy, trạng thái sinh lí
của vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng UV.
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn.
Các giống vi sinh vật rất rễ bị thối hóa, nhầm lẫn, mất. Vì vậy việc bảo
quản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng khơng chỉ ở các trung tâm giữ giống
quốc gia mà ngay cả ở phòng thí nghiệm cũng rất cần thiết.
Nhiệm vụ của cơng tác giữ giống vi sinh vật là thực hiện các thao tác kĩ

thuật cần thiết để giữ cho giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di
truyền ổn định và khơng bị tạp nhiễm bởi các VSV khác.
Có rất nhiều phương pháp giữ giống VSV khác nhau. Tùy vào loại VSV
để chúng ta chọn phương pháp giữ giống cho phù hợp. Đối với giữ giống xạ
khuẩn trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên mơi
trường thạch nghiêng để trong tủ lạnh 2
0
C.
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

1.4. DINH DƯỠNG VÀ MƠI TRƯỜNG NI CẤY [5]
Trong q trình sống, tế bào VSV ln ln phải trao đổi chất với mơi
trường xung quanh. Tế bào VSV tuy rất nhỏ nhưng vì hấp thu các chất dinh
dưỡng và thải các sản phẩm chất qua tồn bộ bề mặt, cho nên cường độ trao đổi
chất của chúng là rất lớn. Các chất dinh dưỡng qua màng vào tế bào và được
chuyển hóa thành những chất riêng biệt cho việc xây dựng tế bào. Nhờ q trình
đồng hóa và dị hóa các tế bào mới có thể phát triển, sinh trưởng, đồng thời tạo ra
các sản phẩm trao đổi chất.
Những VSV dùng trong cơng nghiệp vi sinh kháng sinh đều là các VSV
dị dưỡng. Để phát triển VSV cần một lượng đầy đủ các ngun tố C, H, O, N,
P… và một trong những ngun tố vi lượng là Mn, Mo, Zn, Cu… Mơi
trường dinh dưỡng phải chứa tất cả các ngun tố cần thiết cho sinh trưởng và
tạo thành sản phẩm của VSV. Thơng thường các mơi trường ni cấy sử dụng
nước máy thì khơng cần phải bổ sung các ngun tố vi lượng vì các chất này đã
có đủ trong các cơ chất dinh dưỡng ở dạng tạp chất. Trong q trình lên men
người ta có thể thêm một số ngun tố vi lượng đặc biệt hoặc tiền chất là chất
đặc hiệu cho sản phẩm tạo thành như tiền chất axít phenoxyacetic trong q
trình lên men sản xuất penicillin V. Ở đây cũng cần lưu ý, một mơi trường ni
cấy thuận lợi cho sự phát triển của một VSV khơng nhất thiết sẽ là mơi trường
đảm bảo cho sản xuất sản phẩm trao đổi chất tốt nhất. Mơi trường lên men tốt

nhất phải là mơi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong
thời gian ngắn và chi phí thấp với chủng VSV cho trước.
Thành phần mơi trường và chế độ tối ưu hóa được xác định theo hai cách:
tối ưu hóa kinh điển và sử dụng phương pháp tốn học quy hoạch thực nghiệm.
1.5. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH [2][5][8]
1.5.1. Bản chất của q trình lên men
Lên men thực chất là phản ứng ơxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc tác
của các enzim do VSV tự tổng hợp với mục đích cung cấp năng lượng và tạo ra
các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men.
1.5.2. Giống vi sinh vật
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

Trong lên men công nghiệp, kỹ thuật chỉ là công cụ tác động và điều
khiển lên quá trình sinh học còn giống vẫn là khâu quan trọng, quyết định giá trị
kinh tế của quá trình sản xuất. Giống VSV dùng trong quá trình lên men phải là
các tế bào sinh dưỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng
hóa vật chất cao nhất. Do đó trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống.
Giống VSV được tạo ra qua các cấp nhân giống kế tiếp nhau, trên máy lắc tròn
hoặc bình nón, rồi đến bình giống.
1.5.3. Các phương pháp lên men
* Phương pháp lên men bề mặt:
Lên men bề mặt là quá trình nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường rắn,
đặc hay lỏng. VSV hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng ôxi
không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường dinh dưỡng. Vì vậy yêu cầu của
công nghệ lên men bề mặt là bề mặt môi trường phải đủ rộng, lớp môi trường
không quá sâu (5-10cm), đồng thời phải giữ độ ẩm môi trường khoảng 60% (có
trường hợp 90- 100%) để tránh khô bề mặt môi trường.
Lên men bề mặt có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu thấp.
Nhưng có nhược điểm là đòi hỏi mặt bằng lớn, hiệu xuất sử dụng thường thấp,
khó cơ giới hóa và tự động hóa. Chính vì lý do đó mà ngày nay, công nghiệp

kháng sinh không áp dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ áp dụng trong
các phòng thí nghiệm để chọn giống.
* Phương pháp lên men chìm:
Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong
không gian 3 chiều của môi trường lỏng
Trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống
- Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml),
- Giống cấp 2: Nuôi cấy trong bình giống 80l,
- Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1-5m
3
.
Tỷ lệ giống trong môi trường là 1-10%. Tỷ lệ giống phụ thuộc vào quy
mô của bình lên men.
THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN

Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môi
trường: thay đổi pH, nồng độ các thành phần trong môi trường, các sản phẩm
trao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trường. Để đảm bảo những điều kiện tối
ưu cho sự phát triển của VSV trong quá trình lên men người ta đã đưa ra một số
biện pháp như: cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật, chất điều
chỉnh pH hay dùng hệ đệm để ổn định pH). Cũng có thể lấy mẫu dịch lên men
phân tích để đánh giá các tham số và có sự điều chỉnh (nếu cần) quá trình lên
men .
- Ưu điểm của phương pháp lên men chìm là:
+ Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý
của VSV,
+ Hệ số sử dụng không gian cao (3 chiều), hiệu suất lên men cao,
+ Các thiết bị dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít
nhân công.
- Nhược điểm:

Đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dùng (thiết bị chịu áp lực, điều kiện
vô trùng tuyệt đối) do đó chi phí đầu tư lớn.
Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính:
- Lên men gián đoạn (lên men mẻ):
Quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín. Trong suốt
thời gian lên men không tác động hay bổ sung gì thêm vào môi trường lên men,
trừ việc cung cấp ôxi (dưới dạng không khí nén), chất phá bọt (nếu cần), điều
chỉnh pH. Trong quá trình lên men VSV phát triển qua 4 giai đoạn: Pha tiềm
tàng, pha log (lũy thừa), pha dừng, pha suy tàn ( hình 3).
THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN



lnx

Pha dừng
Pha log Pha suy tàn
Pha
tiềm
tàng

t(h)

Hình 3: Đường cong biểu diễn các giai đoạn phát triển của VSV trong MT
lỏng.Với:
x: sinh khối khô VSV trong dịch lên men
t: thời gian lên men.
Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh
tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trưởng của VSV hoặc
khi việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không

mang lại hiệu quả kinh tế.
- Lên men có bổ sung:
Lên men có bổ sung là biến tướng phát triển của lên men mẻ đống kín.
Trong khi lên men, do nồng độ cao của một số chất (glucoza, các hợp chất
nitơ…) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Bởi vậy khi bắt đầu
lên men các thành phần đó được đưa vào với một nồng độ thấp và được bổ sung
vào hệ thống trong quá trình lên men.
- Lên men liên tục: quá trình lên men môi trường dinh dưỡng được bổ
sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên
men. Quá trình này xem như một hệ mở.
- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men việc bổ sung thêm môi
trường dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không xảy ra liên tục mà
định kỳ sau những khoảng thời gian xác định.
THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN


1.6. TCH CHIT V TINH CH [4][7]
Trong hu ht cỏc trng hp thỡ sn phm ớch (khỏng sinh) ch l mt
lng rt nh trong tng s dch lờn men (0,2-30g/l). Khỏng sinh l sn phm
trao i cht th cp, do ú kt thỳc quỏ trỡnh lờn men khỏng sinh cú th nm
trong sinh khi (vớ d: gramicidin, nystatin) hoc trong dch lc (vớ d:
penixilin, streptomycin) tựy thuc vo c im ca loi. Vỡ vy phi chit tỏch
ly khỏng sinh. Vic la chn phng phỏp ph thuc vo bn cht ca
khỏng sinh.
Mt s phng phỏp tỏch chit hay c s dng:
- Phng phỏp chit bng dung mụi hu c,
- Phng phỏp kt ta,
- Phng phỏp dựng nha trao i ion.
Dự la chn phng phỏp no thỡ mc ớch cui cựng vn l thu c mt
sn phm khỏng sinh cú tinh khit cao. Trong cụng nghip sn xut khỏng

sinh thng ỏp dng mt s phng phỏp chit tỏch v tinh ch nh: lc, chit,
hp th v sc ký.
1.6.1. Chit xut
* nh ngha: Chit l phng phỏp dựng dung mụi (n hay hn hp)
khụng ng tan tỏch ly mt cht hay mt nhúm cht t hn hp cn nghiờn
cu.
* Nguyờn tc: Da vo s phõn b cht tan gia hai pha khụng ng tan
vi nhau.
* Cỏc phng phỏp chit lng lng:
- Chit n (chit 1 ln): Thng cho hiu sut thp nhng n gin, tn
ớt thi gian.
- Chit lp (chit nhiu ln): Hiu sut chit cao tuy nhiờn tn thi gian v
cụng sc.
- Chit ngc dũng cho kt qu tt hn.
1.6.2. Tỏch sn phm
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN

* Định nghĩa: Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý
nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp
đơn giản tách riêng từng chất.
* Các phương pháp tách hỗn hợp đồng nhất hay được dùng:
- Phương pháp chia cắt pha: Là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất
(một pha) tách thành hỗn hợp không đồng nhất (hai pha).
- Phương pháp chuyển pha: Trong nhóm này có các phương pháp như là:
chiết, thẩm thấu, các phương pháp sắc ký.
* Sắc ký:
Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của
hỗn hợp. Sự tách sắc kí được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác
nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một
pha động.

Các phương pháp sắc ký:
- Sắc ký lớp mỏng (SKLM):
Nguyên tắc: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ
(là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ở đây
pha tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi. Chọn dung môi và chất hấp phụ tùy
thuộc vào chất cần xác định, nếu chất cần xác định không phân cực thì chọn chất
hấp phụ có hoạt tính cao (hấp phụ mạnh) và dung môi là không hay ít phân cực.
Chất phân cực ta chọn ngược lại.
- Sắc ký trao đổi ion:
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong
dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit.
Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi
anion gọi là anionit. Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lượng.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Nguyên tắc: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố
khác nhau của các chất giữa hai pha. Pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm
THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN

phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ 10 mm)
được nhồi vào cột, pha động là dung mơi thấm qua tồn bộ bề mặt pha tĩnh.
* Cơ đặc: Sản phẩm trao đổi chất ở nồng độ thấp cần phải cơ lại trong
chân khơng trước khi kết tinh.
* Kết tinh: Kết tinh ở nhiệt độ thấp trên cơ sở độ tan của các chất thường
giảm theo nhiệt độ.
* Sấy khơ: Có nhiều phương pháp sấy trên cơ sở dùng nhiệt độ cao, độ
thống khí hoặc hút.
* Nghiền vỡ tế bào VSV: Trường hợp kháng sinh là sản phẩm trao đổi
chất nội bào, để thu được kháng sinh cần phá vỡ tế bào VSV, có thể dùng
phương pháp vật lý, hóa học hoặc sinh học.
1.7. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU MỚI TRONG SẢN XUẤT KHÁNG SINH

[12][13][16][17].
1.7.1. Kháng sinh Boromycin chống HIV từ xạ khuẩn
Boromycin là kháng sinh thuộc nhóm polte-macrolit được STH từ
Streptomyces sp. A-3376, là kháng sinh chống HIV. Boromycin có khả năng
ngăn chặn sự phát triển HIV ở giai đoạn cuối và có thể ngăn cản q trình sao
chép của phân tử HIV trong tiến trình trưởng thành.
Trong lên men Streptomyces sp. A-3376 tạo ra một chất ký hiệu là TMC-
25, sau khi nghiên cứu đã chứng minh được TMC-25 có cấu trúc giống hệt của
boromycin, kháng sinh có chứa một ngun tử Bo. Lên men STH TMC-25
được tiến hành trên máy lắc ở 27
0
C trong 5 ngày.
Dịch lên men thu được lọc loại bỏ sinh khối sau đó chiết bằng n-butanol,
dịch chiết được tinh chế bởi phân đoạn dung mơi cho ta kháng sinh ở dạng tủa
thơ, tiếp tục tinh chế nhờ sắc ký cột đảo pha trên silicagel ODS và Sephadex
LH-20. Sau đó sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để thu được TMC-25 dưới
dạng bột vơ định hình màu trắng. Cứ 24,5 lít dịch lên men đã loại bỏ sinh khối
sau q trình chiết xuất và tinh chế sẽ thu được 24,5mg TMC-25.
1.7.2. Tinh chế và đặc trưng của serine proteinaza thuỷ phân Keratin từ
STREPTOMYCES ALBIDOFLAVUS.
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN