Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất bằng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (spongia sp )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

VÕ THỊ ĐẦM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN
CHIẾT XUẤT BẰNG NƯỚC CẤT VỚI SỰ HỖ TR
CỦA SIÊU ÂM ĐẾN HOẠT TÍNH CHỐNG OXY
HÓA VÀ HÀM LƯNG PROTEIN CỦA DỊCH
CHIẾT TỪ HẢI MIÊN (Spongia sp.)
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Chế biến Thủy sản

KHÁNH HÒA, 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

VÕ THỊ ĐẦM
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN
CHIẾT XUẤT BẰNG NƯỚC CẤT VỚI SỰ HỖ TR
CỦA SIÊU ÂM ĐẾN HOẠT TÍNH CHỐNG OXY
HÓA VÀ HÀM LƯNG PROTEIN CỦA DỊCH
CHIẾT TỪ HẢI MIÊN (Spongia sp.)
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Chế biến Thủy sản

GVHD: TS. HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO

KHÁNH HÒA, 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Được sự phân công của Khoa Công nghệ Thực phẩm –Trường Đại Học Nha
Trang, và sự đồng ý của Thầy giáo hướng dẫn TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo em đã
thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất bằng nước cất
với sự hỗ trợ của siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của
dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.)”.
Để hoàn thành đề tài này, trước tiên, em muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Khoa Công Nghệ Thực phẩm, Trung tâm TNTH,
các thầy cô giáo đã tận tình hướng dẫn, giảng dậy trong suốt quá trình học tập, định
hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian
nghiên cứu và rèn luyện ở Trường Đại học Nha Trang.
Xin chân thành cảm ơn Thầy TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo – người thầy đã
trực tiếp hướng dẫn tận tình, hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến ban lãnh đạo Khoa Công nghệ
Thực phẩm, Trung tâm TNTH, Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận
lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất giúp em hoàn thành nghiên cứu này.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sau sắc đến gia đình, bạn bè, những
người đã cổ vũ, động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất.
Song do buổi đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực
tế sản xuất cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi
những thiếu sót nhất định mà bản thân chưa thấy được. Em rất mong được sự góp ý
của quý Thầy giáo và các bạn để đề tài được hoàn chỉnh hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 28 tháng 06 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Võ Thị Đầm


ii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i
MỤC LỤC.................................................................................................................. ii
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ viii
LỜI NÓI ĐẦU ............................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN ...........................................................................................4
1.1. Tổng quan về hải miên. ....................................................................................4
1.1.1. Giới thiệu chung về nguồn gốc. .................................................................4
1.1.2. Đặc điểm của ngành thân lỗ .......................................................................5
1.1.3. Phân loại khoa học .....................................................................................5
1.1.4. Đặc tính của hải miên.................................................................................7
1.1.5. Phân bố và sinh thái ..................................................................................8
1.1.6. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của hải miên ...........................................10
1.1.7. Thành phần hóa học của loài:...................................................................12
1.1.8. Ứng dụng của hải miên ............................................................................13
1.2. Tổng quan về quá trình oxy hóa và chất chống oxy hóa. ...............................21
1.2.1. Quá trình oxy hóa. ....................................................................................21
1.2.2. Chất chống oxy hóa..................................................................................23
1.2.3. Đặc điểm các nhóm hợp chất sinh học có trong hải miên........................24

1.2.3.1. Nhóm hợp chất phenol ........................................................................................ 24
1.2.3.2. Nhóm hợp chất sterol........................................................................................... 25
1.2.3.3. Nhóm hợp chất flavonoid.................................................................................... 25
1.2.3.4. Nhóm hợp chất saponin....................................................................................... 25
1.2.3.5. Nhóm hợp chất polypeptide................................................................................ 26
1.2.3.6. Nhóm hợp chất glycoside.................................................................................... 26
1.2.3.7. Protein.................................................................................................................... 26


iii

1.2.4. Các phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa ..............................27
1.2.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự
do DPPH l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl .......................................................................... 27
1.2.4.2. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử28
1.3. Các phương pháp tách chiết xuất các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học
từ hải miên. ............................................................................................................29
1.3.1. Nguyên lý .................................................................................................29
1.3.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất:..................................29
1.3.3. Những yếu tố thuộc về dung môi: ............................................................30
1.3.4. Những yếu tố thuộc về kỹ thuật: ..............................................................31
1.3.5. Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm (Elma, S 300H, Elmasnonis, Germany) 32
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................34
2.1. Nguyên liệu và hóa chất .................................................................................34
2.1.1. Nguyên liệu ..............................................................................................34
2.1.2. Hóa chất....................................................................................................34
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................34
2.2.1. Bố trí thí nghiệm..........................................................................................34
2.2.1.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất (tỷ lệ dung
môi/nguyên liệu, thời gian, nhiệt độ, số lần chiết) bằng nước cất với sự hỗ trợ của siêu

âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên
(Spongia sp.)....................................................................................................................... 35
2.2.1.2. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết xuất để thu được dịch chiết có
hoạt tính chống oxy hóa cao từ hải miên (Spongia sp.)................................................. 43
2.2.2. Các phương pháp phân tích......................................................................50
2.2.2.1. Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH .................................. 50
2.2.2.2. Phương pháp phân tích tổng năng lực khử........................................................ 50
2.2.2.3. Phương pháp phân tích hàm lượng protein ....................................................... 51
2.3. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm .........................................................51
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN..................................52


iv

3.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất bằng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm đến
hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hả miên (Spongia sp.) 52
3.1.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL (ml/g) đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm
lượng protein từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.) ............................................52
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chổng oxy hóa của dịch chiết
từ hải miên (Spongia sp.) ...................................................................................56
3.1.3. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy
hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên ........................................60
3.1.4. Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ
hải miên. .............................................................................................................64
3.2. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết hoạt chất chống oxy hóa từ
dịch chiết hải miên (Spongia sp.). .........................................................................68
3.2.1. Xây dựng mô tả toán học cho hàm mục tiêu giá trị IC50 cho khả năng khử
gốc tự do DPPH..................................................................................................69
3.2.1.1. Tính hệ số bj .......................................................................................................... 69
3.2.1.2. Kiểm định mức ý nghĩa hệ số bj ......................................................................... 69

3.2.1.3. Kiểm định sự phù hợp của phương trình hồi quy với thực nghiệm................ 70
3.2.2. Xây dựng mô tả toán học cho hàm mục tiêu giá trị IC50 cho khả năng khử gốc tự
do tổng năng lực khử ............................................................................................72
3.2.2.1. Tính hệ số bj .......................................................................................................... 72
3.2.2.2. Kiểm định mức ý nghĩa hệ số bj.......................................................................... 72
3.2.2.3. Kiểm định sự phù hợp của phương trình hồi quy với thực nghiệm................ 73
3.2.2.4. Tối ưu hóa thực nghiệm để thu được hàm lượng IC50 là thấp nhất (Y1Min) 74
3.2.3. Tối ưu hóa hàm đa mục tiêu bằng phương pháp chập tuyến tính ............75
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................78
1. Kết luận..............................................................................................................78
2. Kiến nghị ...........................................................................................................78
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................80
PHỤ LỤC..................................................................................................................82


v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Điều kiện thí nghệm được chọn................................................................44
Bảng 2.2. Ma trận thực nghiệm trực giao cấp I, k = 2 và hàm mục tiêu...................45
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm tìm hàm tuyến tính .......................................................45
Bảng 2.4. Thí nghiệm ở tâm......................................................................................46
Bảng 2.5. Kết quả bước chuyển động phụ thuộc vào các yếu tố ..............................49
Bảng 2.6. Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc....................................................49
Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm trực giao cấp I, k=2 và kết quả...............................68
Bảng 3.2. Kết quả bố trí thí nghiệm hàm tuyến tính.................................................69
Bảng 3.3. Bảng hệ số bj .............................................................................................69
Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm tại tâm .......................................................................69
Bảng 3.5 Kết quả tính Sbj .........................................................................................70
Bảng 3.6. Kết quả tính tj ............................................................................................70

Bảng 3.7: Kết quả kiểm định sự tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher...... 70
Bảng 3.8 : Kết quả bước chuyển động phụ thuộc vào các yếu tố .............................71
Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm leo dốc.......................................................................71
Bảng 3.10. Kết quả bố trí thí nghiệm hàm tuyến tính...............................................72
Bảng 3.11. Bảng hệ số bj ...........................................................................................72
Bảng 3.12. Kết quả thí nghiệm tại tâm .....................................................................73
Bảng 3.13 Kết quả tính Sbj .......................................................................................73
Bảng 3.14. Kết quả tính tj ..........................................................................................73
Bảng 3.15: Kết quả kiểm định sự tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher.. 74
Bảng 3.16 : Kết quả bước chuyển động phụ thuộc vào các yếu tố ...........................74
Bảng 3.17. Kết quả thí nghiệm leo dốc.....................................................................75
Bảng 3.18. Tính hệ số phương trình hồi quy ............................................................75
Bảng 3.19. Tính bước chuyển động của các mức yếu tố. .........................................76
Bảng 3.20. Kết quả thí nghiệm leo dốc của hàm chập YL ........................................76
Bảng 3.21. Kết quả giá trị leo dốc của từng hàm mục tiêu .......................................77


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hải miên Spongia sp. ở vùng biển Phú Quốc .............................................4
Hình 1.2. Loại tế bào chính của ngành thân lỗ. ..........................................................5
Hình 1.3. Sinh sản vô tính của hải miên [3]................................................................9
Hình 1.4. Cấu trúc thân lỗ [3] ...................................................................................10
Hình 1.5. Các kiểu gai xương thân lỗ [3]..................................................................11
Hình 1.6. Cấu trúc của hải miên................................................................................12
Hình 1.7.Hoạt dộng chuyển hóa của các chất có trong hải miên [1] ........................13
Hình.1.8. Sự hình thành các gốc tự do. .....................................................................22
Hình 1.9. Cơ chết hoạt động của chất chống oxy hóa [17].......................................23
Hình 1.11. Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH ...............27

Hình 2.1. Loài hải miên Spongia s,lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc .........................34
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến
hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên.......................... 36
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt
tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên. .....................38
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt
tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên. .....................40
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng số lần chiết đến hoạt tính
chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên. ............................42
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm để tìm hàm tuyến tính và thí nghiệm tại tâm. .....48
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL (ml/g) đến khả năng khử gốc tự do (a), tổng
năng lực khử dịch (b) và hàm lượng protein (c) của dịch chiết hải miên (Spongia sp.). .... 53
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL (ml/g) đến hoạt tính chống oxy hóa của
dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) thể hiện qua giá trị IC50; (a): khả năng khử
gốc tự do DPPH, (b): khả năng khử tổng năng lực khử............................................55


vii

Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết (phút) đến khả năng khử gố tự do
DPPH (a), tổng năng lực khử dịch (b) và hàm lượng protein (c) của dịch chiết hải
miên (Spongia sp.). ...................................................................................................57
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ
hải miên (Spongia sp.) thể hiện qua giá trị IC50, (a): khả năng khử gốc tự do
DPPH, (b): Tổng năng lực khử. ................................................................................59
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết khác nhau đến khả năng khử gốc tự do
DPPH (a), tổng năng lực khử(b) và hàm lượng protein (c) của dịch chiết hải
miên (Spongia sp.). ...................................................................................................61
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ
hải miên (Spongia sp.) thể hiện qua giá trị IC50 (a): Khả năng khử gốc tự do

DPPH, (b): Tổng năng lực khử. ................................................................................63
Hình 3.7. Ảnh hưởng của số lần chiết khác nhau đến khả năng khử gố tự do
DPPH (a), tổng năng lực khử (b) và hàm lượng protein (c) của dịch chiết hải
miên (Spogia sp.). .....................................................................................................65
Hình 3.8. Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch
chiết từ hải miên (Spongia sp.) thể hiện qua giá trị IC50 (a): Khả năng khử gốc tự
do DPPH, (b): Tổng năng lực khử. ...........................................................................67


viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DM/NL: Dung môi/Nghiên liệu
UV-Vis ( Ultraviolet – Visite ): Tử ngoại - khả kiến
TN: Thí nghiệm
STD: Độ lệch chuẩn
TB: Trung bình


1

LỜI NÓI ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ.
Đại dương là một nguồn tài nguyên vô cùng lớn, nơi chiếm 70% diện tích bề
mặt trái đất. Đại dương là nơi sinh sống của 34 trong 36 ngành sinh vật trên trái đất
và với hơn 300.000 loài động thực vật đã được biết đến [14].
Việt Nam được mệnh danh là nước giàu tài nguyên thiên nhiên nhất, dân
gian xưa có câu nước ta có “Rừng vàng, biển bạc”. Vùng biển Việt Nam trải dài
trên 15 vĩ độ, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á. Vị trí địa lý cũng
như những đặc trưng về lịch sử phát triển địa chất, điều kiện khí hậu, thủy lý hóa

học… đã tạo nơi đây một môi trường sống riêng cho từng loài sinh vật biển, là điều
kiện thích hợp cho các công trình nghiên cứu, phát triển đất nước.
Trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, chăm sóc và bảo vệ sức khỏe
là vấn đề người người, nhà nhà ai cũng mong muốn. Nhưng, cuộc sống không như
ta mong đợi, không một con người nào luôn có sự hoàn hảo, những căn bệnh nguy
hiểm luôn rình rập chúng ta, nó làm ta đau, sức khỏe suy yếu. Kể từ đó, các hợp
chất thiên nhiên biển ngày càng được thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà
khoa học về cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của chúng. Những công trình
nghiên cứu sinh vật biển Việt Nam đầu tiên đã có từ cuối thế kỷ XVIII, với những
khảo sát về trai ốc ở vùng biển côn đảo, kết quả được công bố từ năm 1784. Bên
cạnh đó không thể bỏ sót lòai sinh vật vô cùng có ích cho công cuộc nghiên cứu
hoạt tính sinh học, đó là hải miên.
Hải miên được xếp đầu danh sách đối với việc phát hiện các hợp chất có hoạt
tính sinh học và khả năng ứng dụng trong dược phẩm do sự đa dạng trong các cấu
trúc hóa học của chất chuyển hóa có trong hải miên.
Chúng đã được coi như một mỏ vàng trong suốt 50 năm qua, nhờ sự đa dạng
của các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng. Tác động sinh học của các chất chuyển
hóa mới từ hải miên đã được báo cáo trong hàng trăm bài báo khoa học. [9]
Trong tương lai, hải miên có khả năng cung cấp các loại thuốc chống lại


2

bệnh quan trọng, chẳng hạn như ung thư, một loạt các bệnh do virus, sốt rét và
viêm, kháng virus và kháng HIV. Một số chất chuyển hóa có nguồn gốc từ loài hải
miên như polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và các hợp chất phenol
cho thấy có khả năng chống oxy hóa mạnh so với vitamin E và vitamin C. Nghiên
cứu của Li và cộng sự (1994) cho thấy các hoạt chất sinh học chiết xuất từ hải miên
Aspergillus có khả năng chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với hydroxytoluene
butylated (BHT). Ngoài ra Sato và cộng sự (2006) cũng đã tìm thấy các hợp chất

carotenoids, polyphenol, glutathione trong một số loài hải miên, đây là những hợp
chất có hoạt tính chống oxy hóa cao.
Trong những năm gần đây có một số các hợp chất thiên nhiên mới trong hải
miên được dùng để đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I-III để điều
trị các bệnh ung thư khác nhau. Một chương trình hợp tác đã được khởi xướng vào
năm 1990 giữa một phòng thí nghiệm hóa học sản phẩm tự nhiên (Đại học
California Santa Cruz và một phòng thí nghiệm thử nghiệm phương pháp điều trị
của Bệnh viện Henry Ford ở Detroit) tập trung vào việc phát hiện và phát triển các
loại thuốc chống ung thư được chiết xuất từ hải miên.
Các protein có hoạt tính sinh học đang ngày càng được sử dụng rộng rãi để
làm thuốc. Ngày nay, với những bước tiến lớn trong công nghệ hiện đại nên việc
tách chiết protein ngày càng dễ dàng.
Với những mong muốn chinh phục thiên nhiên, lại tạo ra các loại thuốc trị
bệnh không nguy hại đến sức khỏe. Vì thế nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa từ
dịch chiết hải miên là một vấn đề rất nóng và mới ở Việt Nam. Khi nói đến hải miên
nhiều người vẫn chưa biết đến, cũng chưa hình dung ra chúng như thế nào, dịch
chiết sẽ là chất có hoạt tính sinh học cao không, đó là vấn đề mà nhiều người muốn biết.
Xuất phát từ những điều kiện thực tế trên với sự hướng dẫn của TS. Huỳnh
Nguyễn Duy Bảo, em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện
chiết xuất bằng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa
và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.)”. Nhằm tìm ra điều
kiện chiết hoạt chất chống oxy hóa và hàm lượng protein từ hải miên là tốt nhất,
nhằm góp phần nào đó vào nền y học hiện tại.


3

2. MỤC ĐÍCH VÀ Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI.
1.1. Mục đích đề tài:
Xác định ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lương

protein từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.).
Xác định ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng
protein từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.).
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa và ham lượng
protein từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.) .
Xác định ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm
lượng protein từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.).
Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất để thu được dịch chiết có hoạt tính chống
oxy hóa cao từ hải miên (Spongia sp.).
1.2. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.
Là cơ sở để áp dụng vào việc nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính
chống oxy hóa từ các loài hải miên nói chung và các sinh vật biển nói riêng.
Thành công của đề tài sẽ tạo ra chấtc có hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng
trong ngành công y học.
Trong quá trình thực hiện đề tài với những nổ lực và cố gắng hết mình để
hoàn thành đề tài, song do bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học,
những khó khăn về điều kiện thực nghiệm và kiện thức còn hạn chế nên không thể
tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong sự chỉ bảo của quý thầy cô và sự đóng góp
của các bạn sinh viên để đề tài có thể hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn !


4

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về hải miên.
1.1.1. Giới thiệu chung về nguồn gốc.
Hải miên (spongia sp.) hay còn gọi bọt biển thuộc ngành thân lỗ (Porifera),
có nguồn gốc từ quần thể trùng roi cổ áo, độc lập về nguồn gốc với động vật đa bào
khác. Hỉa miên là một ngành động vật đa bào nguyên thuỷ, có cấu trúc tế bào tách

biệt và phần lớn là sinh sống ở biển, được tìm thấy ở Đại dương sâu nhất. Chúng có
lịch sử địa chất cổ xưa nhất trong thời kỳ tiền Cambri (khoảng 750 triệu năm trước).
Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 5.000 loài hải miên, nhưng
người ta cho rằng có hơn 8.000 loài hải miên trên Trái đất.
Hải miên là một dạng sống chính ở đáy biển, bao gồm hệ sinh thái rạn san
hô. Hỉa miên thường khó được biết đến vì thường ẩn trong các rạn san hô nổi bật
hơn, hoặc sống trong vùng nước sâu và trầm tích mềm. Tuy nhiên, có rất nhiều loài
hải miên hơn san hô.
Tốc độ tăng trưởng của hải miên và tuổi thọ của chúng rất khác nhau. Một số
loài thân mềm đang phát triển rất nhanh chóng và chúng được đo với số tuổi là hơn
1000 năm tuổi.

Hình 1.1. Hải miên Spongia sp. ở vùng biển Phú Quốc


5

1.1.2. Đặc điểm của ngành thân lỗ
Động vật thuộc ngành thân lỗ không có đối xứng xác định, thân đa bào, vài
mô, bộ phận cơ thể không có. Các tế bào và các mô bao quanh một không gian chứa
đầy nước nhưng không có khoang cơ thể thật. Tất cả đều không cuống, sống gắn
trên cơ thể khác, không có hệ thống thần kinh,tất cả ăn bằng cách lọc, thường có
một bộ xương của gai.

Mesohyl

Tế bào trứng

Pinacocyte

Archeocyte

Choanocyte

Sclerocyte

Lophocyte

Spicule

Porocyte

Lưu lượng nước

Hình 1.2. Loại tế bào chính của ngành thân lỗ.
1.1.3. Phân loại khoa học
-

Ngành Porifera (bọt biển)
Thủy sản nguyên thủy không xương động vật; khoảng 5.000 loài trong tất cả

các vùng biển; gắn vào bề mặt từ khu vực bãi triều đến độ sâu 8.500 m (29.000 ft)
trở lên; đẩy nước có chứa các hạt lương thực thông qua một hệ thống kênh rạch
trong cơ thể (ăn lọc); gồm nhiều loại tế bào (archaeocytes các loại, pinacocytes,
collencytes); cấu trúc của hệ thống biến nước hiện nay (Ascon, sycon,
leucon); skeleton hoặc khoáng chất (canxi cacbonat hoặc axit silicic), spongin, đôi
khi không có, hoặc các thành phần hỗn hợp; đơn vị xương (spicules) biến dạng; cả


6

tình dục và sinh sản vô tính sinh sản (gemmulation); khả năng tái tạo các bộ phận bị
mất; chứa nhiều hợp chất hóa học độc đáo; hình thành các mối quan hệ cộng sinh
với nhiều loại khác của các sinh vật.
Dựa trên hình thái và thành phần hóa học của bộ xương. Ngành thân lỗ được
xắp xếp thành 3 lớp:
Thân lỗ đá vôi (calcarea) sống ở biển nông.
Thân lỗ mềm (demospongiae) lớp lớn chiếm khoảng 80% thân lỗ hiện đại.
sống ở biển và nước ngọt
Lớp thân lỗ (hexactinellida). Thân lỗ đơn độc, thân cao, sống ở biển sâu từ
cực tới xích đạo còn gọi là thân lỗ thủy tinh do có cấu trúc cơ thể tinh tế và đối xứng.
Phân loại Hải miên rất khó khăn. Việc phân loại hiện tại của Ngành Porifera
dựa chủ yếu vào các tính năng của bộ xương hữu cơ và vô cơ, đó là không chính
xác và do đó có rất nhiều trường hợp ngoại lệ cho quy tắc.
-

Lớp Calcarea
Skeleton của spicules canxi cacbonat; loài hoặc bình hình cấu trúc nhỏ gọn,

mạng lưới lỏng lẻo của các ống mỏng, hoặc thuộc địa lớn không thường xuyên; chủ
yếu là ở quy mô nhỏ; sống vùng nước nông của biển cả, từ các vùng bãi triều đến độ
sâu 200 m (660 ft); một vài loài đến 800 m (2.600 ft); khoảng 300 loài.
-

Lớp phụ Calcinea
Larva gọi parenchymella (rắn, nhỏ gọn, với lớp ngoài của tế bào hình roi,

khối lượng bên trong của tế bào); roi của choanocytes (tế bào cổ áo) phát sinh độc
lập của nhân; một số spicules 3-quang trong hầu hết các loài; nước hiện nay hệ
thống Ascon, sycon, hoặc loại leucon; bao gồm bọt biển pharetronid với bộ xương

cứng nhắc của spicules nung chảy hoặc của một mạng vôi; chi bao gồm Clathrina,
Leucetta, Petrobiona (một pharetronid).
-

Lớp phụ Calcaronea
Larva gọi amphiblastula (hình bầu dục với nửa phía trước của các tế bào hình

roi, một nửa phía sau mà không có tế bào hình roi); roi của choanocytes phát sinh
trực tiếp từ hạt nhân; spicules 3-quang, với một ray đặc trưng còn hơn hai khác; hệ


7

thống nước hiện Ascon, sycon, hoặc loại leucon; Leucosolenia, Scypha (trước đây
gọi là Sycon), Grantia, Lelapia (với một bộ xương cứng bao gồm các bó spicules
quang sửa đổi).
-

Lớp Hexactinellida (Hyalospongiae)
Skeleton cơ bản của hexactinal (6-quang) spicules silic và thiếu spongin; độc

quyền biển, trong vùng nước sâu của biển cả, độ sâu từ 25 đến 8.500 m (80-29,000
ft);thường được cố định vững chắc cho một bề mặt cứng, một số loài neo trong trầm
tích đáy mềm; Hexactinella, Aphrocallistes, Farrea, Dactylocalyx, Euplectella,
Rhabdocalyptus; khoảng 500 loài.
-

Lớp Demospongiae
Skeleton của một trong hai spicules 1 hoặc 4-quang silic, sợi spongin, hoặc

cả hai; bộ xương thiếu một vài chi nguyên thủy; nhóm phong phú nhất và phân bố
rộng rãi của bọt biển; xảy ra từ vùng triều đến độ sâu khoảng 5.500 m (18.000 ft)
trong vùng biển; Spongillidae các miếng bọt biển nước ngọt trong gia đình. Loài
khác nhau rất nhiều về hình thức và kích thước; phạm vi từ encrustations mỏng vài
cm đường kính đối với các loài bánh hình lớn 2 m (6.6 ft), đường kính; nhiều loài
có desmas (phát triển như là một kết quả của các khoản tiền gửi trung học của silica
quanh spicules bình thường); tiến hóa độc lập giữa một số đơn đặt hàng của lồng
vào nhau của desmas liền kề để tạo thành một bộ xương đá (bọt biển lithistid); hình
thức ăn thịt (bọt biển cladorhizid) thiếu một hệ thống nước hiện hành. Khoảng
4.200 loài.
Phân loại phân loài được dựa chủ yếu vào cấu trúc xương và thành phần,
nhưng ngày càng nhiều vào các nhân vật không xương như phương thức sinh sản,
nhân vật di động, hình thái của ấu trùng, vvv.
Sự đa dạng của các loài khác nhau cho thấy những đặc tính khác nhau.
1.1.4. Đặc tính của hải miên
Màu sắc trong hải miên có thể thay đổi. Hải miên nước sâu này thường hiển
thị một màu trung tính, màu nâu xám hoặc nâu; Hải miên nước nông, thường có
màu sắc rực rỡ, phạm vi từ màu đỏ, vàng, và màu cam sang tím và đôi khi màu đen.


8

Hầu hết các loại hải miên đá vôi có màu trắng.
Spongia officinalis tất cả trung gian giữa màu đen và trắng, đen hơn khi tiếp
xúc với ánh sáng trực tiếp, ánh sáng khi trồng trong bóng tối.
Một số hải miên (ví dụ, các Spongillidae) thường là màu xanh lục vì tảo xanh
sống trong một mối quan hệ cộng sinh trong chúng; những người khác có màu tím
hay hồng nhạt, vì họ còn nuôi dưỡng loài tảo màu xanh-màu xanh lá cây cộng sinh.
Những vật cộng sinh phú cho các bọt biển với màu miễn là ánh sáng có sẵn; các Hải
miên trở thành màu trắng trong.

Hải miên sản xuất hóa chất phòng thủ chống lại kẻ thù. Tuy nhiên, nó không
nguy hiểm đến các sinh vật biển, chủ yếu là để đe dọa các loài gây hại cho chúng.
1.1.5. Phân bố và sinh thái
Hải miên phân bố trên toàn thế giới, sống trong các môi trường sống đại
dương, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới. Có thể được tìm thấy từ mức thủy
triều đến độ sâu khoảng 200 feet, thường được thu hoạch bằng cách gắn hoặc
harpooning trong vùng nước nông, bằng cách lặn nước sâu.
Hải miên có giá trị nhất được tìm thấy ở khu vực Địa Trung Hải phía đông,
tuy nhiên chúng cũng được thu hoạch ngoài khơi bờ biển phía tây của Florida và
Florida Keys, ở Tây Ấn, ngoài khơi Mexico và Belize, và ở một mức độ giới hạn,
ngoài khơi Philippines. Bởi vì họ có khả năng tái tạo các bộ phận bị mất và có thể
được trồng từ những mảnh nhỏ.
Trong số khoảng 15.000 loài bọt biển, hầu hết xảy ra trong môi trường biển.
Chỉ có khoảng 1% các loài cá sống ở nước ngọt [10].
Hải miên sống trong một loạt các môi trường sống đại dương, từ các vùng
cực đến các vùng nhiệt đới . Hầu hết chúng sống trong vùng nước yên tĩnh bởi vì
sóng hoặc các dòng nước sẽ khuấy động lớp trầm tích làm chặn các lỗ hút nước gây
khó khăn cho chúng ăn và hô hấp. Phần lớn hải miên được tìm thấy trên bề mặt
vững chắc như đá, một số loài hải miên gắn vào trầm tích mềm.
Hải miên ở vùng biển ôn đới dồi dào nhưng ít đa dạng hơn hải miên ở vùng
biển nhiệt đới, có thể vì nguồn thức ăn của hải miên ở vùng biển nhiệt đới có nhiều


9

loại và phong phú hơn. Hải miên trong vùng ôn đới sinh sống trong ít nhất một vài
năm, nhưng một số loài nhiệt đới và một số loài ở những đại dương sâu có thể sống
200 năm hoặc hơn.
Hải miên thủy tinh sống phổ biến nhất ở vùng biển Bắc cực và nơi sâu của
vùng biển ôn đới và nhiệt đới. Hải miên đá vôi rất phong phú và đa dạng ở các vùng

nước nông hơn.
Ở Việt Nam, đã biết 160 loài, gặp nhiều ở vùng biển phía nam, nhất là Nam
Trung Bộ, đảo Phú Quốc, Côn Đảo.
Hầu hết hải miên là loài lưỡng tính (có chức năng như cả hai giới cùng một
lúc), mặc dù hải miên không có tuyến sinh dục (cơ quan sinh sản).
Hải miên có hai hình thức sinh sản là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính.
Trong đó sinh sản vô tính bằng cách phân mảnh, mọc chồi, và bằng cách sản
xuất gemmules .

Hình 1.3. Sinh sản vô tính của hải miên [3]
Những mảnh vỡ của hải miên được tách ra và đi theo dòng chảy hoặc sóng
vỗ, chúng sử dụng đặc tính di chuyển của mình gắn vào một bề mặt phù hợp nào đó,
hình thành nên hải miên mới và ổn định lại chức năng sau quá trình trôi dạc. Hải
miên có khả năng tái sinh cao. Từ một mảnh cơ thể tách rời hoặc từ một đám tế bào
sau khi nghiền nát hoặc sàng qua lưới vẫn có thể phát triển thành một cơ thể toàn vẹn.


10

Một số sinh sản vô tính bằng mọc chồi hoặc tạo mầm. Chồi là những múm
nhỏ mọc trên thành cơ thể. Mầm là khối tế bào amip được một lớp vỏ kép cách
nhiệt bọc ngoài.
Gemmules là "kén còn sống" mà một vài hải miên biển và nhiều loài cá nước
ngọt sản xuất, thường xuyên sản xuất vào mùa thu. Gemmules từ cùng một loài
nhưng các cá thể khác nhau có thể tham gia hợp thành một miếng hải miên.
Sinh sản hữu tính: phần lớn thân lỗ lưỡng tính. Tế bào sinh dục do tế bào
amip hoặc tế bào cổ áo tạo thành, chúng ở tầng keo và nằm dưới các phòng roi, tinh
trùng chín lọt vào phòng roi theo dòng nước thoát ra ngoài, rồi tới thụ tinh noãn của
một cá thể khác.
Phần lớn thân lỗ sống ở biển, nhất là ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới

có độ sâu dưới 500m, thân lỗ ưa sống ở nền đá, nhóm sống ở đáy bùn thường có gai
dài hoặc thân cao nhô khỏi bùn. Số ít thân lỗ sống ở nước ngọt.
1.1.6. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của hải miên
Vì hải miên thuộc ngành thân lỗ nên mang các đặc điểm của thân lỗ.

Hình 1.4. Cấu trúc thân lỗ [3]
Cơ thể động vật thân lỗ có hình cốc gồm các tế động vật đa bào sớm nhất,
phát triển từ các tập đoàn tế bào. Đây là ngành động vật đơn giản và nguyên thủy
nhất, có những mô khác nhau nhưng không có cơ, hệ thần kinh, cơ quan bên trong,
hay khả năng vận động.
Thân lỗ có nhiều đặc điểm của một nhóm động vật đa bào thấp, không tương


11

đồng với cấu tạo cơ thể của các nhóm động vật đa bào khác: cơ thể chưa có kiểu đối
xứng ổn định, chưa có lỗ miệng, chưa có các mô phân hóa và chưa có tế bào thần kinh.
Cấu trúc chung: nước đưa thức ăn và oxy vào cơ thể qua lỗ hút nước và theo
ống dẫn nước trong thành cơ thể và khoang trung tâm và từ đó theo lỗ thoát nước ra ngoài.
Thành cơ thể của thân lỗ có 2 lớp tế bào và một tầng keo xen giữa (mesohyl).
Lớp tế bào ngoài giới hạn cơ thể với môi trường. lớp tế bào trong ngăn cách với
xoang trung tâm và các phòng roi. Tầng keo có nhiều loại tế bào cùng các gai xương.

Hình 1.5. Các kiểu gai xương thân lỗ [3]
Bộ xương nâng đỡ cơ thể có ở hầu hết các thân lỗ cỡ lớn chúng gồm các
xương gai có thể bằng đá vôi, bằng silic, bằng các sợi hữu cơ sponging do tế bào
sinh xương tạo thành. Có nhiều loại gai xương, có thể có một hoặc nhiều trục, có
thể xếp riêng hoặc thành từng bó. Gai xương và sợi sponging do tế bào sinh xương
tạo thành.

12

Hình 1.6. Cấu trúc của hải miên
1.1.7. Thành phần hóa học của loài:
Theo các tài liệu đã công bố của J. Q. Ronald and J. T. David (1985) [12]; J.
Q. Ronald and J. T. David (1991) [13] và của P. B. Ngoc và cộng sự (1999) [16], thành
phần hóa học chủ yếu của loài hải miên là các acid béo không no và hợp chất steroite.
Theo Nguyễn Xuân Cường và cộng sự [6], đã tìm ra được 8 thành phần hóa
học có trong loài hải miên X. testudinaria. Bao gồm:
- Saringosterol, tinh thể kim màu trắng, điểm chảy từ 1600C – 1610C
- 5,8-Epidioxycholest-6-en-3-ol: Tinh thể kim màu trắng, điểm chảy từ
1020C – 1050C
- Cholest-7-en-3-one: Tinh thể màu trắng, điểm chảy từ 1470C – 1480C
- Cholesterol: Tinh thể kim màu trắng, điểm chảy từ 1480C – 1490C
- Thymidine: Tinh thể màu trắng, điểm chảy từ 1860C – 1870C
- Thymine: Tinh thể màu trắng, điểm chảy từ 3260C
- Batitol: Tinh thể màu trắng, điểm chảy từ 700C – 710C
- Chimyl alcohol: Tinh thể màu trắng, điểm chảy từ 640C – 650C


13

1.1.8. Ứng dụng của hải miên
Ứng dụng trong y học
Hải miên chịu trách nhiệm cho hơn 5.300 sản phẩm khác nhau, và mỗi năm
có hàng trăm hợp chất mới được phát hiện. Hầu hết các hợp chất hoạt tính sinh học
từ hải miên có thể được phân loại như kháng viêm, chống khối u, ức chế miễn dịch,
kháng virus, chống sốt rét, thuốc kháng sinh.
Sử dụng hoạt tính sinh học từ hải miên, với sự hiện diện của các chất chuyển

hóa thứ cấp được sản xuất bởi các vi sinh vật cộng sinh trong các loài hải miên. Các
chất chuyển hóa thứ cấp đã được phân lập thành công từ hải miên, với nhiều chất
chuyển hóa có tính chất dược liệu tiềm năng, chẳng hạn như gây độc tế bào, chống
viêm và hoạt tính kháng virus. Do đó, chúng có tiềm năng đáng kể trong ngành
công nghiệp dược phẩm để tạo ra các loại thuốc mới. Tuy nhiên việc tách chiết các
chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển rất khó khăn. Theo nghiên cứ cho thấy
rằng lượng sản phẩm của quá trình trao đổi chất rất nhỏ, 10,7mg spongistatin 4 chiết
từ 2,5 tấn bọt biển Spirastrella spinispirulifera từ vùng biển Nam Phi, tinh chế bằng
HPLC kích thước cột 3 m x 15 cm

Hình 1.7.Hoạt dộng chuyển hóa của các chất có trong hải miên [1]


14

Một số các hoạt chất từ hải miên như sau:
Các hoạt chất kháng viêm
Trong số các hợp chất phân lập được từ hải miên phải kể đến Manoalide A,
một sestertecpen phân lập được từ loài Luffatiella variabilis, hợp chất này thể hiện
hoạt tính kháng viêm rất mạnh trên cơ chế kìm hãm PLA2 (enzim xúc tác quá trình
tạo arachidonic). Cho đến nay, manoalide A vẫn được coi là chất chuẩn trong các
thí nghiệm phát triển thuốc kháng viêm theo co chế kìm hãm PLA2 .
Hải miên chính là loài sinh vật biển chứa rất nhiều các sterol dị thường. Một
trong số đó là Contignasterol phân lập từ Petrosia contignata, hợp chất này thể hiện
hoạt tính kháng viêm rất cao. Do đó, chúng được xếp vào nhóm các thuốc chống
viêm kìm hãm đặc hiệu bạch cầu. Dựa trên những đặc tính đó mà contignasterol đã
được thử nghiệm trong điều trị chống hen suyễn, thí nghiệm được thực hiện bởi
hãng InflaZyme và Aventis Pharma. Cũng bởi cấu trúc đặc biệt phức tạp và tính bền
động học, hoạt chất này đã được lựa chọn nghiên cứu thay đổi và tối ưu hóa cấu
trúc để tạo nên một loạt các dẫn xuất quan trọng như IPL576, 902, IPL512, 602.

Các chất này sau đó đã được tiếp tục nghiên cứu điều trị bệnh hen đến giai đoạn lâm
sàng pha II .

Cogtinasterol

IPL 512,602

Cũng phải kể đến một số hoạt chất có hoạt tính kháng viêm mạnh khác như
sestertecpen Variabilin từ Icrinia variabilis, Cacospongionolide B từ Fasciospongia
cavernosa và Petrosaspongiolide M từ Petrospongia nigra, chúng đều là những hoạt
chất thể hiên hoạt tính kháng viêm mạnh. Theo một vài thí nghiệm khác, hai hợp


15

chất halipeptins A và halipeptins B đã được phân lập từ loài hải miên Haliclona sp.
Chúng thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh trên các thí nghiệm in vivo. Đáng chú ý
là hoạt tính của halipeptins A mạnh gấp 40 đến 130 lần các thuốc kháng viêm đang
sử dụng trong điều trị hiện nay.
Các hoạt chất chống ung thư
Agosterol A, một hợp chất tách được từ loài hải miên Spongia sp. Người ta
đã chứng minh được rằng việc liên kết của azido agosterol-A trên MRP1 (một
protein có hoạt tính kháng nhiều thuốc) và làm bất hoạt protein này đã tăng hiệu quả
điều trị khối u của nó.
Halichondrin B, Loganzo và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sâu trên
các dẫn xuất tổng hợp từ hemiasterin, một tripeptide dị thường phân lập từ Auletta
sp. Những nghiên cứu này đã dẫn đến sự phát triển dẫn xuất có tên HTI-286.
Một hợp chất mới hiên đang được nghiên cứu tiền lâm sàng trong chống lây
nhiễm và chống tạo mạch đó là một alcaloit có tên motuporamine, phân lập từ loài
hải miên Xetospongia exigua. Từ những nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính của nó,

nguời ta đã tiến hành tổng hợp nên một dẫn xuất mới, Dihydromotuporamine C, có
tác dụng rất cao trong ngăn chặn quá trình lây lan của các tế bào ung thư. Các tác
giả đã cho rằng đây là một hợp chất rất đáng quan tâm để có thể được phát triển
thành các thành tố chống ung thư trong tương lai.
Salicylihamide A, một alcaloit phân lập từ Haliclona sp. được cho là một
chất kìm hãm đặc hiêu enzim ATPase đồng thời cũng thể hiên hoạt tính độc tế bào
đối với các dòng tế bào ung thư cao gấp 60 lần các tế bào bình thường khác. Gần
đây, cũng có nhiều các alcaloit mới được phân lập và thử nghiệm hoạt tính chống
khối u cho kết quả rất cao như Naamine D một imidazole alcaloit từ Leucetta cf.
chagosensis, Jaspamide từ Hemiastrella sp., hay với n-methyl-epi- manzamine D,
hoạt chất cho khả năng diêt tế bào ung thư rất mạnh (IC50 đối với dòng B16F10 là
0.1 pg/ml), Đáng chú ý hơn nữa đó là hợp chất Halitulin 14, một cấu trúc thuộc
khung bisquinolinylpyrrole mới từ loài hải miên Haliclona tulearensis. Chất này
cho thấy hiệu quả diệt tế bào ung thư rất mạnh với các dòng tế bào ung thư bạch cầu