Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng Artessunat trong nguyên liệu

Bộ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIM OANH

GÓP PHẦN NGHIÊN

cứu PHƯƠNG PHÁP

ĐỊNH
LƯỢNG
ARTESƯNAT TRONG NGUYÊN LIỆU
•
•
•
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ (1997 - 2002)

Người hướng dân:

TS. TRAN

Nơi thực hiện

Bộ MÔN HOÁ Dược.

:

đức h ậ u

Thòi gian thực hiện: 03 / 2002 -» 05 / 2002

HÀ NỘI, THÁNG 05 - 2002


Lèữ eẩm ơR
Trước tiên, cho phép tôi bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc
đến TS. Trần Đức Hậu - người thầy đă trực tiếp hướng dẫn
và tận tình giúp đõ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện
khoá luận tốt nghiệp n ày.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS.ĐỖ Hữu
Nghị, các thầy cô giáo , cán bộ kỹ thuật viên ỏ bộ môn Hoá
Dược và phòng giáo tài đã quan tâm giúp đở và tạo mọi
điều kiên đ ể tôi có th ể hoàn thành tốt khoá luận này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn
bè đã quan tâm giúp đỗ, động viên tôi trong suốt 5 năm
học vừa qua.

Hà Nội, rtgàỵ 2 7 tháng 5 năm 2002

Sinh viên
Nguyễn Thị Kim Oanh.


MỤC LỤC

ĐẬT VÂN ĐỂ

1

PHẦN 1: TỔNG QUAN

3

1.1.

Vài nét về bệnh sốt rét, công tác phòng và điều trị sốt rét

3

trong những năm qua.
1.2.

Cây thanh hao hoa vàng và hoạt chất của nó.

5

1.2.1.

Đặc điểm thực vật.

5

1.2.2.

Phân bố.

5

1.2.3.

Tác dụng và công dụng.

6

1.2.4.

Thành^hoá học.

6

1.3.

Tổng quan về artesunat.

8

1.3.1.

Bán tổng hợp artesunat.

8

1.3.2.

Đại cương về artesunat.

11

1.3.3.

Điểm qua một số phương pháp định lượng hiện nay

15

1.3.4.

Nhận xét và lựa chọn.

19

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1.

Nguyên vật liệu và trang thiết bị

20
20

2.1.1. Dụng cụ và thiết bị.

20

2.1.2.

20

Hoáchất.

2.2.

Phương pháp nghiên cứu.

20

2.3.

Kết quả nghiên cứu.

21


2.3.1.

Khảo sát quá trình tạo sản phẩm trung gianQ289.

21

2.3.2.

Khảo sát quá trình tạo sản phẩm cuối cùng Q345.

23

2.3.3.

Xây dựng phương pháp định lượng.

26

2.4.

Đánh giá phương pháp.

28

2.4.1.

Xác định tính chính xác của phương pháp.

28

2.4.2

Xác định tính đúng của phương pháp.

29

2.4.3.

Xác định tính tuyến tính của phương pháp.

30

2.4.4.

Xác định tính đặc hiệu của phương pháp.

32

PHẦN 3: KẾT LUẬN.
TÀI LIỆU THAM KHẢO.

36


ĐẶT VẤN ĐỂ
•

Sốt rét là một bệnh xã hội gây ra bởi ký sinh trùng sốt rét thuộc chi
Plasmodium. Những loài gây bệnh cho người chủ yếu gồm:
-

Plasmodium falciparum ( tỷ lệ mắc bệnh là 70% ).
Plasmodium malariae
Plasmodium vivax

( tỷ lệ mắc bệnh là 20 - 30% ).
( tỷ lệ mắc bệnh là 1 - 2%).

Bệnh sốt rét là một bệnh truyền nhiễm, gây nguy hại rất lớn đến sức
khoẻ con người, gây suy giảm sức khỏe, nếu thể ác tính có thể dẫn tới tử vong.
Ở nước ta, những nơi có bệnh sốt rét lưu hành chiếm 3/4 diện tích, nhất là các
vùng núi và ven biển, trên 10% dân số sống trong vùng bị sốt rét đe dọa[22].
Với tính chất nguy hiểm của bệnh, thuốc men giữ vai trò rất quan trọng
trong việc điều trị và dự phòng bệnh sốt rét. Nhưng hiện tượng ký sinh trùng
sốt rét kháng thuốc nhóm 4 - aminoquinolein, đặc biệt là kháng Chloroquin đã
lan rộng trên 60 nước, trong đó có Việt Nam. Vì vậy, việc tìm kiếm thuốc mới
chưa kháng ký sinh trùng sốt rét là hết sức cấp bách[22].
Artesunat là một dẫn chất của Artemisinin thuộc nhóm thuốc điều trị
sốt rét mới chiết xuất từ cây Thanh hao hoa vàng. Nhiều nghiên cứu ở Việt
Nam và trên thế giới đã công nhận những ưu điểm của nhóm thuốc này: cắt

sốt nhanh, diệt ký sinh trùng nhanh, ít gây độc cho cơ thể, có tác dụng tốt với
cả chủng Plasmodium đã kháng thuốc sốt rét khác, có thể thấm qua hàng rào
máu não để điều trị sốt rét thể não. Điều trị sốt rét ác tính bằng Artesunat dễ
sử dụng, an toàn và tỷ lệ tử vong thấp hom Quinin truyền tĩnh mạch. Hiện nay,
có nhiều thuốc thuộc nhóm này đã và đang được nghiên cứu để đưa vào sử
dụng thay thế dần các thuốc sốt rét khác đang bị giảm hiệu lực do ký sinh
trùng kháng thuốc ( VD: Artesunat, Artemether, Arteether, A. artelinic...)[20].

1


Ở Việt Nam, Artesunat đã có dạng viên nén và dạng tiêm. Các thuốc
này đã được Bộ y tế công nhận là thuốc điều trị sốt rét chủ yếu trong chương
trình phòng chống sốt rét quốc gia. Do vậy, việc kiểm tra chất lượng nguyên
liệu thuốc và thành phẩm thuốc là rất quan trọng.
Trong giới hạn một khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, chúng tôi
nghiên cứu bằng thực nghiệm để đưa ra một cách tiến hành định lượng nguyên
liệu Artesunat, góp phần làm phong phú các phương pháp định lượng cho
thuốc này.

2


PHẦN 1

TỔNG QUAN
1.1.

VÀI NÉT VỂ BỆNH SỐT RÉT, CÔNG TÁC PHÒNG VÀ ĐIỂU
TRỊ SÓT RÉT TRONG NHỮNG NÃM QUA.

Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm, có tính chất dịch tễ quan trọng vì có

thể lan thành dịch nếu không phát hiện và ngăn chặn kịp thời. Bệnh phát triển
ờ nhiều nước trên Thế giới, đặc biệt là những nước thuộc vùng khí hậu nhiệt
đới như Châu Á, châu Phi, châu Mỹ La tinh. Theo thống kê của Tổ chức y tế
Thế giới ( WHO ), hàng năm trên Thế giới có khoảng 100 - 200 triệu người bị
sốt rét thuộc 95 quốc gia gồm tất cả các châu lục. Bệnh sốt rét đã gây hậu quả
hết sức nghiêm trọng đối với sức khoẻ của nhân dân ở những vùng sốt rét lưu
hành[5,6]. Việt Nam là một nước nằm trong vùng sốt rét lưu hành mạnh của
Thế giới. Theo báo cáo của Viện sốt rét ký sinh trùng và côn trùng trung ương,
hàng năm nước ta có khoảng 500.000 người mắc bệnh sốt rét và 200 - 5000
người chết do sốt rét, hơn 30,1 triệu người đang sống trong vùng sốt rét lưu
hành [20].
Từ những năm cuối thập kỷ 90, công tác phòng chống bệnh sốt rét đã được Bộ
y tế quan tâm hơn và cũng đã thu được nhiều thành tích đáng kể. Tổng kết kết
quả phòng chống sốt rét ở Việt Nam từ năm 1992 đến 1997 cho thấy: bệnh
nhân sốt rét năm 1997 đã giảm 59% so với năm 1991, chết do sốt rét đã giảm
97%, đồng thời số vụ dịch sốt rét cũng đã giảm 92%. Đầu tư hàng năm mua
thuốc và hoá chất phòng chống sốt rét của chương trình phòng chống sốt rét
quốc gia khoảng 35 - 40 tỷ đồng[19].
Với tính chất nguy hiểm của bệnh, việc ngăn chặn và loại trừ sốt rét là
nhiệm vụ hàng đầu của ngành y tế. Việc kiểm soát bệnh sốt rét là rất khó
3


khăn, có tới 1,7 tỷ người hiện đang sinh sống trong những vùng mà trước đó
sốt rét đã bị đẩy lùi, nhưng giờ đây đang phát triển mạnh trở lại. Hiện nay, ký
sinh trùng sốt rét đã kháng hầu hết các loại thuốc quen thuộc vẫn dùng để
phòng và điều trị trong thời gian qua. Chloroquin đã bị Plasmodium
falciparum kháng khoảng 60%, các thuốc khác như Fansida cũng đã bị kháng

khoảng 30 - 35%. Mefloquin tác dụng khá tốt nhưng giá thành cao và hiện
cũng đã bắt đầu bị kháng. Quinin ít bị ký sinh trùng kháng hơn nhưng lại có
một số tác dụng phụ gây khó khăn cho bệnh nhân. Chính vì vậy, nhóm thuốc
Artemisinin và dẫn chất khi mới được đưa ra áp dụng điều trị sốt rét đã gây
được tiếng vang lớn và thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học[20,21].
Vào đầu thập niên 70, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất được
từ lá cây thanh hao hoa vàng một loại hoạt chất có tác dụng điều trị sốt rét gọi
là Quinghaosu ( QHS ) hay là Artemisinin. Chất này đã được chứng tỏ hiệu
lực chống sốt rét tốt kể cả với những bệnh nhân mắc chứng kháng thuốc. Hơn
thế nữa, Artemisinin và các dẫn chất của nó có khả năng vượt qua hàng rào
máu não nên rất có hiệu lực trong điều tri sốt rét thể não[14]. Tuy nhiên, do độ
tan của Artemisinin trong nước kém và tỷ lệ tái phát sau khi dùng còn cao nên
tác dụng điều trị của Artemisinin phần nào còn bị hạn chế. Để hoàn thiện khả
năng của Artemisinin, những năm đầu thập kỷ 80, các nhà khoa học đã tiếp
tục nghiên cứu và bán tổng hợp ra một số dẫn chất mới từ Artemisinin như:
Artesunat, Artemether, Arteether, acid artelinic.v.v... có tác dụng điều trị cao
hơn chất gốc, đồng thời có thể sử dụng được cho cả đường tiêm. Trong số đó
thì Artesunat là chất được dùng phổ biến nhất. Hiện nay, ờ Việt Nam đã có
nhiều cơ sở sản xuất Artemisinin dạng viên để uống và Artesunat dạng uống
và dạng tiêm để đáp ứng nhu cầu sử dụng của nhân dân. Vì vậy, vấn đề cần
quan tâm của các nhà sản xuất và quản lý là đảm bảo công tác kiểm tra chất
lượng thuốc. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu trong nước về các mặt
khác nhau của nhóm thuốc này như tác dụng, độc tính, dạng bào chế.v.v... về
4


kiểm nghiệm, cũng đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về định tính, thử
tinh khiết, định lượng Artemisinin và Artesunat; hiện nay Dược điển Việt
Nam III cũng đã có chuyên luận về hai thuốc này.
1.2.

CÂY THANH HAO HOA VÀNG VÀ HOẠT CHẤT CỦA NÓ

1.2.1. Đặc điểm thực vật
- Tên khoa học: Artemisia annua L.asteraceae.
- Tên dân gian: ngải si, ngải dại, ngải đắng, ngải hôi, ngải hoa vàng...
Cây thảo, mọc hàng năm, thơm, cao tới lm, thân có rãnh, gần như
không lông. Lá có phiến xoan, 2 - 3 lần kép thành đoạn hẹp nhọn, không lông.
Chuỳ cao ở ngọn mang chùm dài, hẹp, hoa đầu cao 1,8 - 2mm, lá bắc ngoài
hẹp, có lông xanh, lá bắc giữa và lá bắc trong xoan rộng, hoa hoàn toàn hình
ống, cỡ 15 cái, hoa ngoài cái, hoa trong lưỡng tính. Quả bế nhẩn, cao 0,5mm,
không có mào lông. Hoa tháng 6 - 11, có quả tháng 1 0 -3 . Thường lụi vào
tháng 5 [17,21].
Theo thông báo của Tổ chức y tế Thế giới ( WHO ), của Trung Quốc,
của Mỹ, trong khoảng 40 loài thực vật thuộc chi Artemisia, qua chọn lọc chỉ
có loài Artemisia annua L. là có chứa hoạt chất chữa sốt rét. Theo
T.D.HOOKER, M.H.LECOMB 1922 và một số tài liệu khác thì trong chi
Artemisia có 250 loài trên thế giới, ở Việt Nam đã biết là có 15 loài, trong đó
có 4 loài dễ nhầm lẫn với nhau, đó là: Artemisia apiceaehance, Artemisia
capilaris, Artemisia campestric là ba loài không có hoạt chất chữa sốt rét như
loài Artemisia annua [17,22].
1.2.2. Phân bô
Thanh hao hoa vàng phân bố ở nhiều nơi trên Thế giới chủ yếu tập
trung ở những nơi có khí hậu nhiệt đới và ôn đới như Bắc Mỹ, Đông Âu, Nga,
Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ.v.v... Tại Việt Nam, cây mọc hoang
dại thành từng cụm dọc ven sông, ven suối, chân đồi, nơi ẩm thấp ánh sáng
nhiều. Ta có thể bắt gặp ở các tỉnh phía Bắc như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Cao
5

Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Hà Bắc, Vĩnh Phú, Tuyên Quang, Hoà Bình...
và dọc theo các tỉnh Thanh Hoá, Nghệ An... Do vừa là dược liệu quý và có giá
trị kinh tế, dễ trồng, dễ thích nghi với điều kiện khí hậu nên thanh hao hoa
vàng đã được trồng với diện tích rộng, cho năng suất và hàm lượng hoạt chất
cao hơn cây mọc hoang dại. Thời gian thu hái tốt nhất vào tháng 8 lúc cây
chuẩn bị ra hoa [4].
1.2.3. Tác dụng và công dụng
Theo y học cổ truyền Việt Nam, thanh hao có vị đắng (khổ), tính lạnh
(hàn), quy vào hai kinh can và đởm. Có tác dụng thanh thư tịnh uế, trừ phục
nhiệt ở âm phận. Dùng chữa những trường hợp cốt chưng lao nhiệt (đau
xương, nóng), đạo hãn (ra mồ hôi trộm), ngược tật (sốt rét), lở ngứa. Còn dùng
chữa cảm mạo, thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi gan mật. Có thể dùng riêng hoặc
phối hợp với một số vị thuốc khác [17].
Theo khoa học hiện đại, dùng làm nguyên liệu chiết Artemisinin để
chữa sốt rét.
1.2.4. Thành phần hoá học
Tất cả các bộ phận của cây thanh hao hoa vàng đều có chứa tinh dầu và
hàm lượng tinh dầu trong cây rất khác nhau, nó phụ thuộc vào giống và nơi
trồng, dao động từ khoảng 0,5 - 0,6%. Tinh dầu có màu vàng nhạt và có mùi
long não với thành phần chủ yếu là camphor, artemisia ceton, p myrcen...[4,17,18].
Ngoài thành phần tinh dầu thì hoạt chất chính có tác dụng điều trị sốt
rét là Artemisinin đã được các nhà khoa học Trung Quốc chiết tách và xác
định cấu trúc từ năm 1972, Artemisinin là một secquiterpen lacton có cầu nối
peroxyd nội phân tử, chính nhóm này đã quyết định tác dụng diệt ký sinh
trùng sốt rét.Bên cạnh Artemisinin, người ta còn xác định được một loạt hợp
chất secquiterpen khác nhau [5,18]:

6

Yo \ tH j
Artemisinin

Deoxyartemisinin

Arteannuin c

Arteannuin B

Artemisitin

Epideoxyarteannuin B

( Quinghaosu II )

H ,c
H2C

COOH

Acid artemisinic

o
Qinghaosu I

V

^

ch3

o
Quinghaosu IV

( Arteannuin A )

Arteannuin F

Arteannuin E ( Q5)
7


1.3.

TỔNG QUAN VỂ ARTESUNAT

1.3.1. Bán tổng hợp Artesunat:
Artesunat được bán tổng hợp từ nguyên liệu ban đầu là Artemisinin qua
giai đoạn trung gian là Dihydroartemisinin (DHA) với hiệu suất cao ( > 90% )
[18,27,29].
• Giai đoan 1:
Artesunat

được

khử hoá

nhóm

lacton

thành

hemiacetal

là

Dihydroartemisinin bởi tác nhân khử Natri borohydrid (NaBH4) trong môi
trường methanol và ở nhiệt độ 0 - 5°c.
Sơ đồ phản ứng như sau:

Artemisinin

DHA

DHA có tác dụng trị sốt rét mạnh gấp 2 lần Artemisinin nhưng do ít tan
trong nước nên bất tiện cho việc sử dụng. Vì vậy, người ta tiếp tục bán tổng
hợp ra Artesunat.
• Giai đoan 2:
DHA được ester hoá thành Artesunat khi tác dụng với anhydyd
succinic, xúc tác là một amin bậc ba Dimethylamino pyridin ( DMAP ) hay
hỗn hợp của DMAP và Dicyclohexyl carbodiimid ( DCC):
Sơ đồ phản ứng như sau:

8


DHA
Ngoài Artesunat, từ DHA người ta còn bán tổng hợp ra nhiều chất khác
có hoạt lực tác dụng tương tự, như Arteether ( AE ) và Artemether ( AM )

bằng cách cho DHA tác dụng với Ethanol hoặc Methanol xúc tác là acid
Lewis. AM và AE bền vững hơn Artesunat do chất này có chức ester dễ bị
thuỷ phân, hơn nữa AM và AE lại tan tốt trong dầu và cũng có hoạt tính chống
rốt rét ngang với Artesunat [10,22].

OC^5
Arteether

Artemether

Hiện nay người ta còn tạo ra một dẫn chất mới có hoạt lực cao trên ký
sinh trùng sốt rét, đó là acid artelinic. Chất này vừa có hiệu lực cao hơn
Artesunat lẫn AM, mặt khác muối natri của nó lại tan được trong nước nên có
thể chế được cả thuốc uống lẫn thuốc tiêm [7].

9


DHA
thuỷ phân

10


I

1.3.2. Đại cương về Artesunat:
- Công thức cấu tạo:

OCOC^CH2COOH

- Công thức phân tử: C19H28Og
- Trọng lượng phân tử: 384,42.
- Tên khoa học: a - dihydroartemisinin hydrosuccinat
- Tên khác: acid artesunic.
• Tính chất của Artesunat T241:
- Tinh thể không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi và thực tế
không vị. Tan ít trong nước, nhưng tan trong dung dịch
natrihydrocarbonat, dễ tan trong ethanol, aceton hay cloroform. Bền
vững trong môi trường trung tính. Trong dung dịch nước dễ bị thuỷ
phân, nhất là trong môi trường kiềm. Dạng muối natri dễ tan trong
nước, do vậy có thể dùng để pha thuốc tiêm.
- Năng suất quay cực của dung dịch Artesunat 4% trong Cloroíorm là:
( +10° ) đến ( +14°)
• Tác dung, cơ chế và dươc đổng hoc của Artesunat:
- Tác dụng [241: có tác dụng diệt thể phân liệt của ký sinh trùng sốt rét
trong máu, kể cả các trường hợp kháng cloroquine. Không có tác dụng
đối với ký sinh trùng ở gian đoạn ngoại hồng cầu và thể giao tử. Tác
dụng nhanh, hiệu lực cao, độc tính thấp. Hiệu lực cao với sốt rét ác
tính thể não, sốt rét kháng Chloroquin và kháng cả các thuốc sốt rét
khác.
11


Tác dụng diệt ký sinh trùng của Artesunat mạnh gấp 5 lần so với
Artemisinin. Nó là một trong những thuốc điều trị sốt rét hiệu quả nhất
hiện nay.
- Cơ chế[ 14,22]: theo Gu và cộng sự, tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét
của Artesunat là do cầu peroxyd nội phân tử tạo ra các gốc tự do. Các
gốc này tấn công vào những thành phần cơ bản trong tế bào ký sinh
trùng và tiêu diệt chúng. Chính vì vậy, khi bị mất cầu nối peroxyd thì

thuốc không còn tác dụng. Ở pH cao, Artesunat tạo ra tức thì các dạng
hoạt động. Cơ chế này khác hẳn với các thuốc tổng hợp trước đây.
Bằng phương pháp đánh dấu dùng Triti, các nhà khoa học nhận thấy
rằng nồng độ thuốc ở hồng cầu nhiễm Plasmodium cao hơn hẳn so với
hồng cầu bình thường. Cơ chế cụ thể là Artesunat tấn công vào màng
Plasmodium. Ngoài ra, Artesunat natri còn ức chế hoạt tính của
Cytocrom oxydase và hệ vận chuyển Glutamin trong hồng cầu.
- Dược động học: theo đường uống, Artesunat hấp thu từ 24 - 64%. Thời
gian bán thải Tl/2 = 41 phút. Thuốc bị giảm hoạt tính do bị chuyển
hoá tại gan. Thuốc qua được hàng rào máu thai nhi nên tránh dùng cho
phụ nữ có thai. Artesunat thải trừ qua nước tiểu và các chất thải trừ tìm
thấy

trong

nước

tiểu

gồm

9

-

10

dihydroartemisinin,

Deoxyartemisinin, Dihydrodeoxyartemisinin.

- Tương tác thuốc: tác dụng của Artesunat là do cầu nối peroxyd đem
lại. Vì một lý do nào đó mà phân tử Artesunat bị mất cầu nối này thì
nó không còn tác dụng nữa. Do đó tác dụng của Artesunat bị giảm đi
khi có mặt chất xúc tác phân huỷ như Catalase hay các chất khử như
acid ascorbic, Vitamin E, Glutathion dạng khử và tác dụng tăng lên
khi có mặt chất gây stress oxy hoá như Misconasol, Doxarubicin...
Các thuốc chống sốt rét khác như Mefloquin, Primaquin,
Chloroquin khi phối hợp với Artesunat cho tác dụng hiệp đồng tăng
12


cường hay hiệp đồng cộng. Ngược lại, các chất kháng Folat như
Pyrimithamin, Sulfamid lại có tác dụng đối kháng [14].
• Chế phẩm và cách sử dung Artesunat trong điều tri [5,211:
- Chế phẩm:
* Biệt dược: hiện nay trên thị trường Việt Nam có khoảng trên 10
biệt dược chế phẩm Artesunat ở 2 dạng bào chế
* Dạng bào chế: Viên nén 50mg
Dạng bột pha tiêm: lọ chứa 60mg acid artesunic ở
dạng bột khô vô trùng kèm ống tiêm có chứa lml
dung dịch natri hydrocarbonat 5% trong nước cất.
- Chỉ định: điều trị sốt rét do Plasmodium falciparum, Plasmodium
vivax, Plasmodium malarie, kể cả sốt rét do nhiễm Plasmodium
falciparum đã kháng các loại thuốc khác.
- Liều dùng'.
4» Dạng uống: viên nén 50mg.
Điều trị: mỗi đợt dùng 12 viên, uống trong 6 ngày.
Phòng bệnh: uống 2 viên/lần/tuần X 5 tuần.
* Dạng tiêm: hoà tan thuốc vào dung dịch natrihydrocarbonat cho
thêm dung dịch glucose đẳng trương để có nồng độ 10mg/ml.

Người lớn: 1,2 - 6mg/kg/lần
Trẻ em < 6 tuổi: lmg/kg/lần.
Tuỳ theo từng bệnh nhân, cứ sau 4 -2 4 -4 8 giờ nhắc lại 1 lần.
• Đốc tính:
Được thử tại bộ môn Dược lý - trường Đại học Y Hà Nội [5,10,22].
- Độc tính cấp: LD50 trên chuột nhắt trắng = 1200mg/kg (1081 - 1331 )
bằng đường uống.

13


- Độc tính bán cấp: cho thỏ uống qua xông vào dạ dày dung dịch
natriartesunat 2ml/kg/24 giờ với liều 20mg/kg/24h vào giờ nhất định trong
ngày, cho uống liên tục trong 30 ngày chưa thấy có độc tính bán cấp.
- Những thay đổi cấu trúc vi thể ở gan và thận chuột nhắt trắng khi
uôhg Artesunat liều điều trị', cho chuột nhắt trắng uống artesunat liều
4mg/kg thể trọng trong 5 ngày liền:
* Không thấy hình ảnh tổn thương cấu trúc tế bào ở mô gan và thận.
Cấu trúc chung của gan và thận không thay đổi.
* Có hiện tượng xung huyết các mạch trong thận.
- Về khả năng gây đột biến: Artesunat không làm tăng tần số rối loạn
nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ xương hoặc tế bào tinh hoàn, không làm
xuất hiện các rối loạn nhiễm sắc thể, không gây nên các rối loạn về
sinh sản. Các chuột con được đẻ ra không có dị tật bẩm sinh: quan sát
được cả F1 và F2, số lượng cũng như trọng lượng của chuột con được
đẻ ra bình thường. Khi chuột chửa uống Artesunat không gây nên
những bất thường ở thế hệ con.
Năm 1994, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã tiến hành
thử nghiệm Artesunat trên người khoẻ mạnh và bệnh nhân nhiễm
Plasmodium falciparum không biến chứng. Kết quả:

* Khi thử trên người khoẻ mạnh không có sự thay đổi về huyết học,
sinh hoá, điện tim trước và sau khi thử. Tại chỗ tiêm không có phản
ứng, không đỏ, không mẩn ngứa. Thuốc khuyếch tán nhanh. Dấu
hiệu chủ quan: người tình nguyên không thấy có cảm cảm gì đặc
biệt sau khi tiêm.
* Với bệnh nhân nhiễm Plasmodium falciparum không biến chứng:
thấy rằng thuốc có hiệu quả điều trị trên mọi đối tượng bệnh ( cả
người lớn lẫn trẻ em ) có tác dụng mạnh với ký sinh trùng sốt rét,
làm giảm nhanh mật độ của ký sinh trùng ( đa số trong vòng 24 giờ
14


đầu ), cắt cơn sốt nhanh, ngăn chặn được sốt rét nặng. Thuốc không
ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, huyết học, không ảnh hưởng gì
đến hệ tim mạch.
1.3.3. Điểm qua một số phương pháp định lượng hiện nay
• Phương pháp đo quang phổ hấp thu vùng tử ngoai T5.91:
Sau khi đun nóng trong môi trường kiềm, Artesunat chuyển thành Q289
là sản phẩm có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 289nm, do đó có thể định
lượng Artesunat trong chế phẩm và trong nguyên liệu bằng phương pháp đo
độ hấp thụ cuả Artesunat ( sau khi thuỷ phân trong môi trường kiềm ) trên
máy quang phổ tử ngoại ở bước sóng 289nm.
Artesunat sau khi thuỷ phân trong môi trường kiềm tạo thành sản phẩm sau:
COOH
I
CH2
I
ch2
I
COOH

Nhận xét:
- Phương pháp định lượng dễ thực hiện, trang thiết bị để định lượng các
cơ sở đều có thể có được.
- Sản phẩm đo quang không phải trực tiếp là Artesunat mà là sản phẩm
biến đổi của nó trong môi trường kiềm - Q289. Theo [5], điều kiện áp
dụng là phải khống chế được lượng Dihydroartemisinin ( DHA ) trong
chế phẩm, khi đó phép định lượng mới có kết quả đúng. Tuy nhiên
trong chế phẩm viên nén, khó có thể khống chế được lượng DHA.
• Phương pháp HPLC với detector UY f20.21.231:
Định lượng Artesunat không qua đun nóng trong môi trường kiềm,
dùng pha động là acetonitril : đệm phosphat pH = 5,1 ( 38 : 62 ), bước sóng
15


phát hiện là 235nm. Hoặc để định lượng Artesunat trong dược liệu, trong các
dịch sinh vật hay để định lượng Artesunat trong viên nén, người ta đã sử dụng
phương pháp HPLC với chương trình sắc ký cột Lichrosorb RP60

(

125

X

4mm; 5|0.m ), pha động : 48% CH3CN + 32% dung dịch KH2PO4 0,05M trong
nước + 20% nước, tốc độ dòng lml/phút, detector uv 210nm và thể tích tiêm
20 fxl, với chương trình sắc ký trên, Artesunat có tR= 2,1 phút.
Nhận xét: Artesunat chỉ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng bước sóng
ngắn. Trong phương pháp định lượng trên, bước sóng phát hiện là 235nm, sản
phẩm định lượng có thể không phải là Artesunat, nên DHA có thể ( nếu có )

sẽ ảnh hưởng tới kết quả định lượng.
• Phương pháp HPLC với detector điên hoár5,211:
Nguyên tắc: trong phân tử Artemisinin và các dẫn chất của nó có chứa
cầu nối peroxyd nội phân tử, cầu nối này quyết định tác dụng điều tri sốt rét
của riêng chúng. Đồng thời chính sự có mặt của cầu nối peroxyd mà người ta
đã sử dụng phương pháp HPLC với detector điện hoá để định lượng Artesunat.
Quá trình xảy ra trên bề mặt điện cực được mô tả như sau:

or

OCOC^CH2COOH

or

Nhận xét: phương pháp này có độ nhạy, tính đặc hiệu cao nên thích hợp
trong việc định lượng với hàm lượng nhỏ như trong dịch sinh vật. Tuy nhiên,
phương pháp này không phải cơ sở nào cũng có đủ trang thiết bị và có điều
kiện áp dụng được.

16


• Phương pháp HPLC với dectector khúc xa kế T311:
Định lượng artesunat với pha tĩnh là cột RP18 (12,5 cm x3,5 mm) cỡ
hạt 5 |im,pha động là acetonitril - đệm pH3 ( dung dịch đệm pH3: l,36g
KH2P 04 trong 1000 ml H20 , điều chỉnh pH tới 3 bằng H3P04) với tỷ lệ 1:1.
Tốc độ dòng 0,6 ml/phút, nồng độ dung dịch mẫu 4 mg/ml, thể tích tiêm mẫu
20 |J,1, detector khúc xạ kế.
• Phương pháp đo kiềm trong mối trường khan f311:
Cũng dựa vào nhóm chức acid tự do còn lại trong phân tử artesunat để

tiến hành định lượng. Chế phẩm (« 0,2g) được hoà tan trong ethanol tuyệt đối
(50 ml). Chuẩn độ bằng dung dịch tetrabutylaminonium hydroxyd trong 2propanol (0,1 mol/1). Điểm kết thúc của phép định lượng xác định bằng chỉ thị
tím tinh thể trong acid acetic khan hoặc bằng kỹ thuật chuẩn độ đến điểm
dừng.
• Phương pháp chuán đỏ acid - base T51:
Vì Artesunat là ester của acid succinic và DHA nên trong phân tử còn
một nhóm chức acid tự do, do đó người ta có thể định lượng trực tiếp nhóm
chức này bằng dung dịch NaOH với chỉ thị là phenolphtalein, từ đó suy ra
hàm lượng Artesunat. Hoặc có thể định lượng Artesunat bằng phương pháp
chuẩn độ gián tiếp. Cho Artesunat tác dụng với một lượng dư KOH rồi chuẩn
độ KOH dư bằng dung dịch chuẩn acid.
Nhận xét.
- Phương pháp chuẩn độ trực tiếp chỉ áp dụng khi không có acid
succinic tự do trong chế phẩm, do đó khó có thể áp dụng cho định
lượng viên nén.
- Phương pháp chuẩn độ gián tiếp là phương pháp dễ thực hiện song
phương pháp này mới chỉ được nghiên cứu áp dụng cho định lượng
nguyên liệu Artesunat, muốn áp dụng trong định lương các'd ^ ^ b ào
chế Artesunat thì cần được nghiên cứu thêm.

/

K

'Ỹ \

í .rìiiĩVVTÍAM*


• Phương pháp đo quang phổ hấp thu vùng khả kiến T211:

Nguyên tắc: dựa vào nhóm chức ester của Artesunat để làm phản ứng
tạo hydroxamat sắt (III) có màu và đo quang dung dịch thu được ở bước sóng
508nm.
Nhận xét: phương pháp này không phụ thuộc sự có mặt của acid
succinic song DHA lại ảnh hưởng đến kết quả định lượng.
• Các phương pháp khác Í211:
- Cầu nối peroxyd nội phân tử của Artesunat và Artemisinin còn thể
hiện sự đáp ứng trên điện cực giọt thuỷ ngân, nên người ta còn dùng
phương pháp cực phổ để định lượng.
- Phương pháp phân tích phóng xạ miễn dịch đã được áp dụng để định
lượng Artemisinin và các dẫn chất của nó.
- Các nhà khoa học Trung Quốc còn miêu tả hai phương pháp khác để
định lượng Artemisinin và các dẫn chất cuả nó trong mẫu thử sinh học:
* Phương pháp đo độ phóng xạ: sau khi uống thuốc đã được đánh dấu
bằng Tritium [29].
4» Phương pháp đo mật độ quang trên sắc ký lớp mỏng.
- Định lượng Artesunat dạng nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ
vùng khả kiến dựa vào phương pháp tách chiết (phân lập artesunat
khỏi DHA) và phản ứng tạo hydroxamat sắt có màu, khắc phục được
ảnh hưởng của DHA đến kết quả định lượng[21].
- Định lượng Artesunat dạng nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ
vùng tử ngoại ở bước sóng 289 nm dựa vào phương pháp tách chiết
(phân lập Artesunat khỏi DHA ), khắc phục được ảnh hưởng của DHA
đến kết quả định lượng[21].
- Định lượng Artesunat trong viên nén bằng cách đo quang phổ hấp thụ
tử ngoại ở bước sóng 289nm, song khắc phục được ảnh hưởng của

18

DHA đến kết quả định lượng bằng cách tách chiết, phân lập Artesunat
khỏi DHA[23].
1.3.4. Nhận xét và lựa chọn:
• Phương pháp HPLC với detector điện hoá có khả năng phân tích tốt, tính
đúng và tính đặc hiệu cao, song hiện nay ở Việt Nam vẫn còn chưa áp
dụng thực hiện được.
• Các phương pháp HPLC với detector 235nm có thể không phải trực tiếp
định lượng Artesunat nên DHA có thể ảnh hưởng đến kết quả.
• Phương pháp chuẩn độ acid - base lại chỉ cho kết quả đúng khi Artesunat
không chứa acid succinic - sản phẩm thuỷ phân của Artesunat và cũng là
nguyên liệu bán tổng hợp ra chất này.
• Phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại ở bước sóng 289 ± lnm
và phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng khả kiến: đơn giản, dễ thực
hiện và hiện nay đã khắc phục được ảnh hưởng của DHA bằng cách phân
lập Artesunat ra khỏi DHA trước khi tiến hành định lượng.
Trong khoá luận tốt nghiệp này, chúng tôi nghiên cứu áp dụng một
phương pháp mới định lượng Artesunat dựa theo phương pháp đã được công
bố trong một tài liệu của nước ngoài (bản tóm tắt)[26]. Theo tài liệu này,
nguyên tắc của phương pháp là: Q289 là sản phẩm phân huỷ của Artesunat
trong môi trường kiềm có cực đại hấp thụ ở bước sóng 289±lnm; sản phẩm
này phản ứng với Fast TR Red salt ( một muối diazoni) để tạo ra 1 sản phẩm
có màu vàng, có cực đại hấp thụ ở 420nm ( Q420 ). Cụ thể như sau:
“Lấy một lượng chế phẩm tương đương 0,5 mg artesunat, thêm 0,5 ml
dung dịch NaOH IN, trộn đều. Sau 5 phút, thêm lml acid acetic 1,1M và 0,5
ml muối Fast TR red salt (5mg/ml). Sau 5 phút, xuất hiện sản phẩm màu vàng,
đó chính là artesunat thực”.sản phẩm này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng
420nm.
19

PHẦN 2

THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIÊT BỊ

2.1.1. Dụng cụ và thiết bị:
- Cân phân tích hiện số Mettler AB 204 ( Toledo - Thuỵ sĩ ) độ chính
xác 0,1 mg.
- Máy đo quang phổ 6405 UV/VIS Spectrophotometer Jenway.
- Nồi đun cách thuỷ.
- Bình định mức, pipet chính xác các loại.
2.1.2. Hoá chất:
- Artesunat nguyên liệu do trường Đại học Dược sản xuất.
- Artesunat đối chiếu hoá học hàm lượng 98,6% của Viện Kiểm nghiệm.
- Dung dịch Natri hydroxyd 0,2N
- Dung dịch acid acetic 1,1M.
- Dung dịch Natri nitrit 2%.
- Acid sulíanilic.
- Dung dịch acid hydrocloric 250g/ì.
- Dung dịch kẽm clorid 0,5%.
- Ethanol tuyệt đối.

2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
Dựa vào bản tóm tắt của phương pháp [26], song trong điều kiện
không có thuốc thử Fast TR red salt, chúng tôi nghiên cứu xây dựng

cách tiến hành định lượng artesunat phù hợp với điều kiện sẩn có.Cụ thể:
- Xây dựng phương pháp định lượng và áp dụng phương pháp đó để định
lượng nguyên liệu Artesunat do trường đại học Dược sản xuất.
20


-Đánh giá phương pháp định lượng này theo các chỉ tiêu: tính chính xác,
tính đúng, tính tuyến tính và tính đặc hiệu.

2.3.

KẾT QUẢ NGHIÊN cứ u .
Do thuốc thử Fast TR red salt không sẵn có ở Việt Nam, chúng tôi thay

thế nó bằng một muối Diazoni khác có trong Dược điển Quốc tế, đó là muối
Diazoni của acid sulíanilic. Sau đó chúng tôi đã tiến hành định lượng theo
[26], và đo phổ hấp thụ của sản phẩm cuối cùng. Kết quả là sản phẩm này hấp
thụ cực đại ở bước sóng 345nm (không phải là 420 nm như trong [26]).
2.3.1. Khảo sát quá trình tạo sản phẩm trung gian Q289:
Theo nguyên tắc của phương pháp: do Artesunat không trực tiếp phản
ứng với thuốc thử diazoni mà nó phản ứng trước với kiềm tạo thành sản phẩm
trung gian Q289, sau đó Q289 mới phản ứng với thuốc thử diazoni tạo sản
phẩm cuối cùng Q345. Vì thế, trước tiên chúng tôi khảo sát việc chuyển
Artesunat thành sản phẩm trung gian Q289.
♦

Để xác định xem artesunat đã chuyển hết sang Q289 chưa, chúng tôi

tiến hành thực nghiệm sau:
-

Thực nghiệm 1 (dùng dung dịch NaOH IN như [26]):
Cân 0,lg artesunat vào cốc có mỏ, hoà tan bằngethanoltuyệt đối,rồi

chuyển vào bình định mức dung tích 50ml,thêm dung môi đến vạch, lắc đều
(dung dịch A). Lấy chính xác 5,0ml dung dịch A cho vào bình định mức dung
tích 50ml khác, thêm dung dịch NaOH IN đến vạch, đậy nút bình, lắc đều.
Sau đó để yên ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Đem đo phổ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng 289 ± Inm,
cuvet dày lcm. Mẫu trắng là dung dịch NaOH IN.
Kết quả thu được: phổ hấp thụ của sản phẩm không rõ, tại bước sóng
289 nm độ hấp thụ của sản phẩm rất thấp ( D = 0,143 ).

21