khảo sát histamine trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT HISTAMINE TRONG SẢN PHẨM
THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
ThS. ĐỖ TẤN KHANG

Cần Thơ, Tháng 01/2013

SINH VIÊN THỰC HIỆN
LÊ ANH VŨ
MSSV: 3082568
LỚP: CNSH TT34


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên)

(ký tên)

Đỗ Tấn Khang

Lê Anh Vũ

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành luận văn này ngoài những cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi xin gửi
lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy cô, bạn bè và gia đình đã tận tình hướng dẫn,
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Đặc biệt tôi xin hết lòng cảm
ơn:
Th.S Đỗ Tấn Khang đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ, cung cấp những tài
liệu cần thiết và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài luận văn của
mình trong thời gian quy định.
Cám ơn các anh chị phụ trách phòng thí nghiệm Enzyme tại Viện Nghiên Cứu và
Phát Triển Công nghệ Sinh học: Anh Nguyễn Ngọc Phú và bạn Nguyễn Văn Tính đã
truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời
gian thực hiện luận văn.
Tôi cũng vô cùng biết ơn công lao to lớn của cha mẹ đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi về vật chất lẫn tinh thần cho tôi hoàn thành khóa học, và thực hiện tốt luận văn này.
Cuối lời, tôi xin chúc Quý thầy, cô, cha mẹ và các anh chị nhiều sức khỏe và
thành đạt trên lĩnh vực mà mình yêu thích.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Lê Anh Vũ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá hiệu quả của các dung môi khác nhau
trong phân tích hàm lượng histamine trong hải sản. Kết quả cho thấy histamine trong
các mẫu hải sản được ly trích hiệu quả nhất với perchloric acid 0.6M và
trichloroacetic acid 6%. Ngoài ra, nghiên cứu còn so sánh hiệu quả giữa quy trình
dansyl và quy trình bezoyl trong phân tích hàm lượng amine trong hải sản bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả thu được cho thấy có sự
khác biệt rõ rệt về hiệu quả phân tích giữa hai quy trình này trong định lượng
histamine trên mẫu cá ngừ. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản (0 oC, 4oC)
đến sự gia tăng hàm lượng histamine và mật số vi khuẩn trong cá ngừ cũng được
nghiên cứu. Cá ngừ bảo quản ở 4oC cho thấy hàm lượng histamine sinh ra cao hơn so
với khi được quản ở 0oC. Các mẫu bảo quản ở 0oC có hàm lượng histamine khá thấp
(49.1 mg/kg sau 11 ngày bảo quản), trong khi đó khi được bảo quản ở 4oC, các mẫu
có chứa hàm lượng cao histamine (161.29 mg/kg sau 7 ngày bảo quản). Sự tăng mật
số vi khuẩn theo thời gian bảo quản cũng đã được ghi nhận ở các mẫu thí nghiệm. Mật
số vi khuẩn tăng từ 4.54 log10 cfu/g đến 5.88 log10 cfu/g trong các mẫu bảo quản ở
0oC, trong khi đối với các mẫu bảo quản ở 4oC, mức tăng này khá đáng kể với mật số
vi khuẩn tăng từ 4.54 log10 cfu/g đến 8.88 log10 cfu/g. Bên cạnh đó, hàm lượng
histamine trong một số sản phẩm hải sản cũng được báo cáo trong nghiên cứu này.
Từ khóa : HPLC, histamine, hải sản, trichloroacetic acid, perchloric acid, nhiệt
độ bảo quản.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
MỤC LỤC .......................................................................................................................i
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................iv
DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................vi
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề.................................................................................................1

1.2.

Mục tiêu đề tài .........................................................................................2

CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1.

Sơ lƣợc về biogenic amine và histamine ................................................3

2.1.1.

Biogenic amine ................................................................................................. 3

2.1.2.

Histamine và ngộ độc histamine .................................................................... 4

2.1.3.

Sự hình thành biogenic amine ........................................................................ 5

2.1.4.

Sự tích lũy histamine trong quá trình chế biến và bảo quản ....................... 5

2.1.5.

Các vi khuẩn sinh histamine ........................................................................... 6

2.1.6.

Ảnh hưởng đến sức khỏe của histamine và vai trò của các biogenic
amine khác ........................................................................................................ 7

2.1.7.

Vai trò của các biogenic amine trong đánh giá chất lượng thủy sản ....... 10

2.1.8.

Giới hạn cho phép của histamine trong thủy sản ....................................... 11

2.1.9.

Phương pháp xác định histamine trong thủy sản bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) ................................................................................... 12

2.2.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ..............................14

2.2.1.

Giới thiệu........................................................................................................ 14

2.2.2

Các bộ phận của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................... 15

CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 16
3.1.

Phƣơng tiện nghiên cứu ........................................................................16

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

3.1.1.

Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 16

3.1.2.

Hóa chất ........................................................................................................... 16

3.1.3.

Thiết bị, dụng cụ ............................................................................................. 16

3.1.4.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 16

3.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................16

3.2.1.

Tối ưu hóa dung môi ly trích histamine trong hải sản ............................... 16

3.2.2.

So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích

histamine trong hải sản ............................................................................ 19

3.2.3.

Sự phát triển của hàm lượng histamine và vi khuẩn tổng số trong cá
ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản ................................................. 20

3.2.4.

Xác định hàm lượng histamine có trong một số sản phẩm thủy sản ....... 21

3.2.5.

Phương pháp xử lý thống kê ................................................................... 21

CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 22
4.1

Tối ƣu hóa dung môi ly trích histamine trong hải sản ....................... 22

4.2

So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích
histamine trong hải sản ......................................................................... 23

4.3

Sự phát triển của hàm lƣợng histamine và vi khuẩn tổng số
trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản .............................. 26

4.4

Xác định hàm lƣợng histamine trong một số sản phẩm thủy sản ..... 31

CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 33
5.1

Kết luận ................................................................................................... 33

5.2

Kiến nghị................................................................................................. 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 34

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Tên bảng

Bảng

Trang

Bảng 1

Danh mục biogenic amine trong đánh giá chất lượng thủy sản

11

Bảng 2

Thời gian lấy mẫu của các mẫu cá ngừ theo nhiệt độ bảo quản

20

Bảng 3

Chú thích về các mẫu hải sản

21

Bảng 4

Giá trị trung bình hàm lượng histamine trong các mẫu hải sản

31

Bảng 5

Giá trị diện tích peak của dung dịch histamine chuẩn (đo bằng quy Phụ lục

trình dansyl)

Bảng 6

Giá trị diện tích peak của dung dịch histamine chuẩn (đo bằng quy Phụ lục
trình benzoyl)

Bảng 7

Hiệu quả của dung môi tách chiết đến hàm lượng histamine định Phụ lục
lượng bởi quy trình dansyl

Bảng 8

Hiệu quả của dung môi tách chiết đến hàm lượng histamine định Phụ lục
lượng bởi quy trình benzoyl

Bảng 9

So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục
phân tích hàm lượng histamine (mẫu 1)

Bảng 10

So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục
phân tích hàm lượng histamine (mẫu 2)

Bảng 11

So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục

phân tích hàm lượng histamine (mẫu 3)

Bảng 12

So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục
phân tích hàm lượng histamine (mẫu 4)

Bảng 13

So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục
phân tích hàm lượng histamine (mẫu 5)

Bảng 14

So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục
phân tích hàm lượng histamine (mẫu 6)

Bảng 15

Sự gia tăng hàm lượng histamine trong cá ngừ trữ ở 4oC theo thời Phụ lục

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

gian bảo quản
Bảng 16

Sự gia tăng hàm lượng histamine trong cá ngừ trữ ở 0oC theo thời Phụ lục
gian bảo quản

Bảng 17

Sự gia tăng mật số vi khuẩn trong cá ngừ trữ ở 4oC theo thời gian Phụ lục
bảo quản

Bảng 18

Sự gia tăng mật số vi khuẩn trong cá ngừ trữ ở 0oC theo thời gian Phụ lục
bảo quản

Bảng 19

Hàm lượng histamine theo dung môi ly trích (định lượng bởi quy Phụ lục
trình dansyl)

Bảng 20

Hàm lượng histamine theo dung môi ly trích (định lượng bởi quy Phụ lục
trình benzoyl)

Bảng 21

Hàm lượng histamine các mẫu cá ngừ trữ ở 4oC theo thời gian lưu Phụ lục
trữ

Bảng 22

Hàm lượng histamine các mẫu cá ngừ trữ ở 0oC theo thời gian lưu Phụ lục
trữ

Bảng 23

Mật số vi khuẩn có trong các mẫu cá ngừ trữ ở 4oC theo thời gian Phụ lục
lưu trữ

Bảng 24

Mật số vi khuẩn có trong các mẫu cá ngừ trữ ở 0oC theo thời gian Phụ lục
lưu trữ

Bảng 25

Hàm lượng histamine có trong một số mẫu thủy sản mua tại các Phụ lục
siêu thị tại thành phố Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1

Các amino acid tiền chất và các enzyme amino acid decarboxylase

3

trong sự hình thành biogenic amine trong thủy sản
Hình 2

Cấu trúc hóa học của histamine

4

Hình 3

Các con đường chuyển hóa của sự hình thành các biogenic amine

9

Hình 4

Giá trị trung bình hàm lượng histamine thu được khi ly trích bằng

22

các dung môi khác nhau.
Hình 5

Sắc ký đồ của dung dịch histamine chuẩn và dung dịch mẫu ly trích

24

Hình 6

Giá trị trung bình hàm lượng histamine định lượng bằng quy trình

25

dansyl và quy trình benzoyl
Hình 7

Giá trị trung bình hàm lượng histamine trong các mẫu cá ngừ trữ ở

27

4oC theo thời gian bảo quản
Hình 8

Giá trị trung bình hàm lượng histamine trong các mẫu cá ngừ trữ ở

27

0oC theo thời gian bảo quản
Hình 9

Giá trị trung bình mật số vi khuẩn trong các mẫu cá ngừ trữ ở 4 oC

29

theo thời gian bảo quản
Hình 10 Giá trị trung bình mật số vi khuẩn trong các mẫu cá ngừ trữ ở 0 oC

29

theo thời gian bảo quản
Hình 11 Biểu đồ đường chuẩn histamine (đo bằng quy trình dansyl)

Phụ lục

Hình 12 Biểu đồ đường chuẩn histamine (đo bằng quy trình benzoyl)

Phụ lục

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AOAC

Association of Official Analytical Chemists

BA

Biogenic Amine

DAO

Diamine Oxidase

FAA

Free Amino Acid

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

FDA

Food and Drug Administration

HACCP

Hazard Analysis and Critical Control Points

HMT

Histamine-N-methyltransferase

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

MAO

Monoamine Oxidase

OPA

o-Phthalaldehyde

ppb

parts per billion

ppm

parts per million

PCA

Perchloric Acid

TCA

Trichloroacetic Acid

WHO

World Health Organization

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1.

Đặt vấn đề
Hiện nay ngộ độc histamine đang là một trong những mối nguy phổ biến nhất đối

với sức khỏe của người tiêu dùng. Ngộ độc histamine xảy ra sau khi ăn phải một số hải
sản có chứa hàm lượng cao histamine và có thể là một số biogenic amine khác. Các
loài cá có liên quan bao gồm cá thu, cá ngừ, cá nục và một số loài cá khác thuộc họ
Scombroidiae. Các loài cá này có chứa hàm lượng cao histidine tự do trong mô của
chúng. Và khi điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn (ví dụ khi cá được
bảo quản trong nhiệt độ không thích hợp), enzyme decarboxylase do vi khuẩn sinh ra
sẽ chuyển hóa histidine thành histamine. Một vài biogenic amine khác sinh ra trong
quá trình phát triển của vi khuẩn có thể làm tăng độc tính của histamine. Các triệu
chứng ngộ độc có thể khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng histamine và sự nhạy cảm
của mỗi người đối với histamine. Tại một số nơi trên thế giới, ngộ độc histamine
chiếm tỷ lệ lớn nhất trong các trường hợp ngộ độc liên quan đến cá (FAO/WHO,
2012). Tại Việt Nam, ngộ độc histamine thường xảy ra và các loài cá thường liên quan
đến các trường hợp này là cá ngừ, cá thu (Bộ Thủy Sản, 2003).
Sau khi đánh bắt, cá tươi có hàm lượng histamine rất thấp nhưng hàm lượng này
tăng lên cùng với sự phân hủy của cá. Do đó, histamine cũng đã được sử dụng làm
chất chỉ thị hóa học để đánh giá chất lượng của cá. Cơ quan FDA đã thiết lập tiêu
chuẩn cho hàm lượng histamine trong cá ăn được là 50 mg/kg (FDA, 2005) và các loại
cá có hàm lượng histamine cao hơn quy định này sẽ bị cấm bán cho người tiêu dùng.
Để cung cấp cơ sở cho thực hành phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn
(HACCP) trong cá và các sản phẩm từ cá một phương pháp nhanh chóng, chính xác,
độ tin cậy cao để xác định hàm lượng histamine là cần thiết.
Nhiều phương pháp định lượng histamine đã được phát triển. Phương pháp chính
thức của AOAC (AOAC, 1995) sử dụng quang phổ để định lượng histamine có ưu
điểm là nhạy, tính lặp lại cao nhưng phức tạp và tốn thời gian. Bên cạnh đó, nhiều
phương pháp sắc ký cũng đã được áp dụng để phân tách và định lượng histamine trong
thực phẩm, bao gồm: sắc ký khí, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng, và sắc ký lỏng hiệu
năng cao.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Histamine có tầm quan trọng cao trong công nghiệp thực phẩm. Những năm gần
đây xuất hiện nhiều nghiên cứu tập trung vào histamine do tiềm năng ứng dụng to lớn
của amine này trong đánh giá chất lượng hải sản và các sản phẩm làm từ hải sản.
Ngoài ra, hàm lượng cao histamine trong hải sản cũng là một mối nguy đối với sức
khỏe người tiêu dùng.
Vì tầm quan trọng của histamine, nhằm mục đích nghiên cứu quy trình định
lượng histamine nhanh chóng, chính xác trong thực phẩm nên đề tài “Khảo sát
histamine trong sản phẩm thủy sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Tối ưu hóa quy trình ly trích và định lượng histamine bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao.
Khảo sát sự gia tăng hàm lượng histamine trong sản phẩm thủy sản theo thời gian
và nhiệt độ bảo quản.
Định lượng histamine trong một số sản phẩm thủy sản phổ biến trên thị trường,
từ đó so sánh với tiêu chuẩn cho phép.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
Sơ lƣợc về biogenic amine và histamine

2.1.

2.1.1. Biogenic amine
Biogenic amine là những hợp chất hữu cơ có một hoặc nhiều nhóm amine trong
phân tử và có trọng lượng phân tử nhỏ (Hình 1). Các hợp chất này hiện diện trong
nhiều loại thực phẩm, bao gồm cá và các sản phẩm làm từ cá. Dựa vào cấu trúc hóa
học, các biogenic amine có thể được chia thành 3 nhóm: aromatic amine (histamine,
tyramine, serotonin, β-phenylalanyl, và tryptamine), aliphatic amine (putrescine và
cadaverin), hoặc aliphatic polyamine (agmatine, spermidine, và spermine) (Smith,
1980).

Hình 1. Các amino acid tiền chất và các enzyme amino acid decarboxylase
trong sự hình thành biogenic amine trong thủy sản.
(Nguồn: Nollet và Toldra, 2011)
Quá trình trao đổi chất ở động vật, thực vật và vi sinh vật tạo thành một trong các
chất trên (putrescine, spermidine, cadaverine và agmatine và spermine) một cách tự
nhiên. Một vài trong số các amine này đóng vai trò quan trọng đối với sinh lý người và
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

động vật. Chúng cần thiết cho sự phát triển tế bào và có vai trò quan trọng trong điều
hòa tổng hợp nucleic acid và protein (Barzdoc và cs, 1995). Ngoài ra, biogenic amine
cũng được sinh ra từ sự khử nhóm carboxyl của các amino acid tự do (Smith, 1980;
Halasz et al., 1994; Bazdoc, 1995; Shalaby, 1996). Các biogenic amine quan trọng vì
hai lý do. Thứ nhất, việc tiêu thụ thực phẩm chứa nhiều biogenic amine có thể nguy
hiểm cho sức khỏe (Bazdoc, 1995; Shalaby, 1996; Lehane và Olley, 2000). Thứ hai,
chúng có thể dùng làm chất chỉ thị để đánh giá chất lượng thủy sản (Mietz và Karmas,
1977; Ruiz-Capillas và Moral, 2001; Yamanaka et al., 1989).
2.1.2. Histamine và ngộ độc histamine
Histamine là ―một amine được tạo thành trong quá trình chuyển hóa amino acid
histidine dưới sự xúc tác của các enzyme thuộc nhóm decarboxylation enzyme; một
chất kích thích mạnh mẽ cho sự tiết dịch vị, chất gây giãn mạch máu và đồng thời
cũng là chất dẫn truyền của các dây thần kinh trung tâm‖ (Pubchem, 2012). Histamine
có công thức hóa học là C5H11Cl2N3 (Hình 1). Phân tử này có danh pháp theo IUPAC
là 2-(3H-imidazol-4-yl)ethanamine dihydrochloride và có trọng lượng phân tử là
111.14506 g/mol (Pubchem, 2012).

Hình 2. Cấu trúc hóa học của histamine.
(Nguồn: Pubchem, 2012)
Ngộ độc histamine (histamine poisoning) thường được biết đến như ngộ độc
scrombroid (scrombroid poisoning) do các triệu chứng ngộ độc xảy ra là kết quả của

việc ăn phải các loài cá bị ôi, ươn thuộc họ Scombridae và Scombresocidae như cá thu,
cá dũa (mahi mahi), cá bluefish, cá ngừ, cá skipjack, cá thu đao (saury), cá nục và một
số loài cá khác. Ngộ độc histamine thường được phát hiện trong các trường hợp ngộ
độc thực phẩm liên quan đến các biogenic amine (Halasz et al., 1994). Tuy nhiên, các
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

biogenic amine khác như putrescine và cadaverine cũng có thể gây ngộ độc, thậm chí
ngay cả khi không có sự hiện diện của histamine (FDA, 2001). Các enzyme histidine
decarboxylase và histaminase là những enzyme được biết đến nhiều nhất trong vai trò
chuyển hóa histidine thành histamine (Taylor, 1986; Middlebrooks et al. 1988; Flick et
al., 2001).
2.1.3. Sự hình thành biogenic amine
Sự hình thành các biogenic amine có thể xảy ra theo hai cách: bằng quá trình
decarboxylation nội sinh hoặc quá trình decarboxylation ngoại sinh. Quá trình
decarboxylation nội sinh bao gồm sự hình thành các biogenic amine bởi các enzyme
decarboxylase có trong tế bào của các loài cá và các loài sinh vật biển khác, trong khi
quá trình decarboxylation ngoại sinh diễn ra dưới sự hoạt động của các vi sinh vật có
khả năng tạo ra các enzyme decarboxylase ngoại bào. Tuy nhiên, quá trình sinh tổng
hợp histamine và các biogenic amine cũng có thể được thực hiện bởi động vật. Ở trạng
thái bình thường, tế bào động vật có chứa sẵn histamine, nhưng không có hoạt tính vì
ở dạng phức hợp protein. Khi cơ thể động vật bị mẫn cảm hay bị kích thích, kháng

nguyên ức chế yếu tố kháng protease; protease không bị kiềm chế nữa, tác động lên
phức hợp protein và giải phóng histamine. (Medina et al., 2003; Rodrigues-Caso et al.,
2003).
2.1.4. Sự tích lũy histamine trong quá trình chế biến và bảo quản
Sự tích lũy histamine là kết quả của sự lạm dụng thời gian/ nhiệt độ trong quá
trình chế biến và bảo quản dẫn đến hư hỏng thực phẩm. Để giảm thiểu nguy cơ này, tổ
chức FDA (2001) đề xuất các loại cá sau khi đánh bắt cần được bảo quản dưới 4oC.
Thời gian từ lúc cá chết đến lúc cá được bảo quản không được quá 6 giờ. Mức nhiệt độ
4oC hoặc thấp hơn được xem như đủ để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật mang
mầm bệnh.
Các vi khuẩn sinh histamine có mặt khá phổ biến trong môi trường nước biển.
Chúng thường có mặt trong mang và ruột của các loài cá biển. Theo Letker et al.
(1978), hàm lượng histamine trong cá ngừ bị ôi, ươn có thể cao đến 9190 ppm. Hàm
lượng histamine ở phần thân trên của cá thường cao hơn hàm lượng ở phần thân dưới.
Do đó, phần thân trên của cá thường được lựa chọn để thực hiện phân tích hàm lượng
histamine (FDA, 2004).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Sau khi chết, cơ chế bảo vệ các cơ quan của cá trước sự nhiểm khuẩn không còn
hoạt động (Connell, 1990). Từ đó, vi khuẩn có thể xâm nhập qua da, qua các lỗ trên cơ
thể, qua đường ruột hoặc thâm nhập qua các mạch máu ở mang và thận (Gram và

Huss, 1996). Những vi khuẩn này có thể sinh histamine trong quá trình phát triển của
chúng. Do đó, việc moi ruột và loại bỏ mang cá trong quá trình sơ chế có thể làm giảm
số lượng vi khuẩn sinh histamine, và kết quả là tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao
hơn (Craven et al., 2001). Tuy nhiên, những biện pháp này không thể loại bỏ hoàn
toàn sự phát triển của vi khuẩn.
2.1.5. Các vi khuẩn sinh histamine
Enterobacter, Clostridium, Hafnia, Klebsiella, Lactobacillus, Photobacterium,
Proteus, Pseudomonas và Vibrio spp. là những loài vi khuẩn có khả năng sinh các
enzyme decarboxylase, nhất là enzyme histidine decarboxylase (Taylor et al., 1979;
Eitenmiller et al., 1982; Yoshinaga và Frank, 1982; Ababouch, 1991; Ben-Gigirey et
al., 2000; Flick et al., 2001; Kim et al., 2001; Takahashi et al., 2003).
Vi khuẩn sinh histamine có thể phát triển trong một khoảng nhiệt độ rộng. Nhiều
nghiên cứu về khả năng sinh sinh histamine đã được thực hiện trên những điều kiện
khác nhau và trên những loài cá khác nhau (Lerke, 1978; Eitenmiller et al., 1982; Kim
et al., 2002; Ozogul, 2004) . Sự phát triển của vi khuẩn hay khả năng sinh ra histamine
thường không xuất hiện ở nhiệt độ 5oC hoặc thấp hơn. Nghiên cứu của Cravel et al.
(2001) cho rằng cá ngừ albacore được làm lạnh ngay lập tức ở nhiệt độ 10 oC hoặc thấp
hơn có hàm lượng histamine thấp. Kết quả phân tích ngay sau khi cá được đưa lên bờ
cho thấy hàm lượng histamine cao nhất ghi nhận được chỉ có 1.5 ppm, mặc dù các mẫu
cá này đã được làm lạnh từ 6 đến 8 ngày trong quá trình đánh bắt.
Nghiên cứu về vi khuẩn sinh histamine trên các mẫu cá ngừ albacore tươi bởi
Kim et al. (2002) đã phân lập được các chủng vi khuẩn Hafnia alvi, Photobacterium
damselae, Acinetobacter lwoffi, Enterobacter cloacae từ mang; H. alvei, E. cloacae, E.
aerogenes và A. lwoffi từ da; A. lwoffi và 3 chủng chưa được định danh từ ruột. Mật số
vi khuẩn cao nhất được tìm thấy trên mang dao động từ 6.9x104 đến 7.7x104 cfu/g.
Trong số các vi khuẩn tìm thấy, P. damselae được cho là vi khuẩn sinh histamine
nhiều nhất.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Klausen và Huss (1987) cho rằng enzyme histidine decarboxylase được tạo ở
nhiệt độ cao vẫn có thể hoạt động ở nhiệt độ thấp hơn nhiều. Tuy nhiên, sự hình thành
histamine có vẻ thường là kết quả của sự ôi thiu thực phẩm ở nhiệt độ cao trong thời
gian ngắn hơn là sự ôi thiu ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài (FDA, 2001). Nhận định
này được ủng hộ bởi nghiên cứu của Eitenmiller et al. (1982) về hoạt động của enzyme
decarboxylase và sự gia tăng hàm lượng histamine trong cá ngừ vây vàng bị nhiễm vi
khuẩn Proteus morganii.
2.1.6.

Ảnh hƣởng đến sức khỏe của histamine và vai trò của các biogenic

amine khác
Các biogenic amine được xem như là các yếu tố kháng dinh dưỡng tự nhiên và là
tác nhân gây ngộ độc thực phẩm. Khả năng của chúng trong việc kích thích các phản
ứng dược lý trong cơ thể con người là mối quan tâm hàng đầu đối với sức khỏe cộng
đồng.
2.1.6.1. Ảnh hưởng dược lý của các biogenic amine
Histamine có thể gây ra nhiều hiệu ứng dược lý như giải phóng adrenaline và
noradrenaline; kích thích cử động cơ trơn của dạ con, ruột non và đường hô hấp; kích
thích các neuron thần kinh vận động và cảm giác; điều khiển sự tiết dịch vị. Putrescine
và cardaverine có thể gây hạ huyết áp, cứng hàm, giảm nhịp tim, gây liệt các chi và

tăng tiềm lực độc tố của các amine khác. Tryptamine có thể làm tăng huyết áp, trong
khi tyramine có thể tác dụng như chất làm giảm sự co mạch, tăng lượng máu ra khỏi
tim, gây chảy nước mắt, tăng hô hấp, tăng lượng đường huyết, giải phóng
noradrenaline từ hệ thống thần kinh giao cảm, và có thể gây ra hội chứng đau nửa đầu
(Shalaby, 1996).
Triệu chứng ngộ độc histamine có thể chia ra làm bốn nhóm chính: đường tiêu
hóa, da, thần kinh và máu. Các triệu chứng xuất hiện trên da bao gồm nổi mẩn ngứa,
rát, nổi mề đay, phù da và viêm da tại chỗ (Purohit et al., 2002). Các triệu chứng
đường tiêu hóa có thể gồm buồn nôn, ói mửa và tiêu chảy (Scoging, 1998). Đau đầu,
cảm giác nóng ran, phồng rộp và nóng trong miệng là những triệu chứng ảnh hưởng
của amine đến hệ thần kinh. Các triệu chứng về máu bao gồm sự tăng huyết áp. Sabroe
và Black (1998) cho rằng phát ban đỏ, tức ngực, cảm giác hồi hộp, lo lắng, hoa mắt,
chóng mặt, khó thở cũng là những triệu chứng của ngộ độc histamine.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

2.1.6.2. Sự chuyển hóa histamine
Histamine có thể được tìm thấy ở nhiều bộ phận ở nhiều sinh vật, trong đó có cả
con người. Nhìn chung, hàm lượng histamine thường tập trung nhiều nhất ở tế bào nội
tiết (ở biểu mô) và trong các dưỡng bào (Befus et al., 1999). Theo Klawasser et al.
(1994), tế bào bạch cầu và tế bào lympho ở người chứa khoảng 0.05 pg histamine trên
mỗi tế bào. Cũng có nhiều báo cáo cho rằng rất nhiều loại tế bào khác, bao gồm đại

thực bào có chứa histamine. Ngộ độc histamine và triệu chứng ngộ độc chỉ xuất hiện
khi amine này xâm nhập vào đường máu. Cơ thể người có hệ thống khử độc khá hiệu
quả trong ruột non giúp chuyển hóa histamine bởi các vi khuẩn đường ruột (Shalaby,
1996).
Các enzyme monoamine oxidase (MAO), diamine oxidase (DAO) và histamineN-methyltransferase (HMT) là một trong số những enzyme trong ruột non đã được xác
định có thể chuyển hóa histamine thành các chất không độc (Taylor, 1986; Bodmer et
al., 1999).
Hệ thống khử độc này hoạt động khá hiệu quả để xử lý một lượng histamine mà
con người hấp thụ trong bữa ăn hằng ngày. Tuy nhiên, hệ thống này là không đủ để xử
lý một lượng lớn histamine có trong các sản phẩm cá bị ôi, ươn.
2.1.6.3. Sự tăng tiềm lực ngộ độc histamine
Các chất có khả năng ức chế/ngăn chặn sự chuyển hóa histamine được gọi là các
chất tăng tiềm lực histamine. Các chất này làm tăng ảnh hưởng ngộ độc histamine và
có thể đi vào cơ thể qua thức ăn. Cơ chế tăng tiềm lực có thể giải thích qua một trong
những cơ chế sau:
- Gây ức chế các enzyme chuyển hóa histamine (Sattler et al., 1988),
- Cạnh tranh vị trí bám với histamine trong cơ chế bám vào phức hợp mucinehistamine (Lehane và Olley, 2000),
- Kích thích sự giải phóng histamine nội bào từ các dưỡng bào (Veien et al.,
2000).
Ảnh hưởng đến sức khỏe gây ra bởi ngộ độc histamine do ăn phải cá bị ôi, ươn
nhìn chung nguy hiểm hơn những trường hợp bị ngộ độc do tiêm một lượng tương
đương histamine vào cơ thể (FAO, 2003). Có những đề xuất cho rằng các amine khác
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

có thể đóng vai trò như chất làm tăng độc tính của histamine. Theo Durand et al.
(1973) thì lượng độc tố gây ra bởi 150 ppb putrescine dihydrochloride hấp thụ cùng
lúc với 300 ppb histamine dihydrochloride bằng với lượng độc tố gây ra bởi 1200 ppb
putrescine dihydrochloride hay 300 ppb histamine dihydrochloride.
Rượu và một số loại thuốc như d-Tubocurarine, pancuronium, alcuronium và
aminoguanidine được biết đến như những chất làm tăng hoạt lực (Sattler et al., 1985;
Sattler và Lorenz, 1990; Stratton et al., 1991). Các chất này ức chế enzyme diamine
oxidase trong quá trình chuyển hóa histamine. Các amine khác, ví dụ như spermine,
spermidine, putrescine, cadarverine, tryptamine, tyramine và b-phenylethylamine cũng
có thể hoạt động như chất tăng tiềm lực bằng cách làm tăng sự vận chuyển histamine
qua màng dạ dày (Chu và Bjeldanes, 1981).

Hình 3. Các con đƣờng chuyển hóa của sự hình thành các biogenic amine.
(Nguồn: Halasz et al., 1994)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

2.1.7.

Trường Đại học Cần Thơ

Vai trò của các biogenic amine trong đánh giá chất lƣợng thủy sản

Mặc dù sự kiểm soát các biogenic amine trong thủy sản thường được cam kết vì
sự liên quan của các amine này trong các trường hợp ngộ độc thực phẩm, sự định
lượng các biogenic amine này cũng được đề xuất như là chỉ tiêu chất lượng để phát
hiện cá ôi, ươn hay sai sót trong quá trình bảo quản, chế biến thủy sản (Mietz và
Karzas, 1977; Ruiz-Capillas và Moral, 2001; Yamanaka et al., 1987; Yamanaka et al.,
1989). Các biogenic amine thường được sử dụng như chất chỉ thị chất lượng vì chúng
biến đổi hàm lượng trong quá trình chế biến và bảo quản. Các biogenic amine này
được tìm thấy ở nồng độ thấp ở cá tươi và có xu hướng tăng lên trong quá trình bảo
quản và thường gắn với sự ôi thiu thực phẩm do vi khuẩn (Halasz et al., 1994; Emborg
et al., 2002).
Hàm lượng histamine thường được sử dụng như chỉ thị xác định độ tươi/ôi thiu
của cá ngừ, do ở cá tươi hàm lượng histamine rất thấp (Mietz và Karmas, 1977; Farn
và Sims, 1987; Wei et al., 1990). Hàm lượng cao histamine thường liên quan đến các
sản phẩm thối rữa, nhưng không áp dụng cho mọi trường hợp. Do đó, cả hàm lượng
histamine và sự đánh giá cảm quan được dùng để đánh giá sự chấp nhận sản phẩm cá
ngừ (FDA, 2004).
Danh mục biogenic amine của Mietz và Karmas (1977) được dùng phổ biến như
tiêu chuẩn để đánh giá sự ôi, ươn của cá dựa trên hàm lượng một số biogenic amine
phổ biến (histamine, cadaverine, putrescine, spermidine, and spermine) (Bảng 1). Giới
hạn chấp nhận được cho danh mục chất lượng này được thiết lập là 10. Sau đó, một số
tác giả khác đề xuất chỉ số được tính toán từ việc cộng hàm lượng histamine, tyramine,
cadaverine, và putrescine cho thấy mối tương quan tốt với thời gian lưu trữ và đánh
giá cảm quan trong đánh giá chất lượng cá ngừ (Veciana-Nogues, 1997). Một số
biogenic amine cũng đã được sử dụng riêng lẻ để đánh giá chất lượng thủy sản. Tổ
chức Food and Drug Administration (Commission Regulation, 2005) khuyến cáo
không chỉ histamine có thể chỉ ra mức độ khiếm khuyết trong bảo quản thực phẩm, mà
các số liệu khoa học khác cũng có thể sử dụng để đánh giá độ tươi của cá, ví dụ như sự

hiện diện của các biogenic amine khác liên quan đến sự thối rữa của cá.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 1. Danh mục biogenic amine trong đánh giá chất lƣợng thủy sản
Loại thủy hải sản

Biogenic Amine

Rockfish, cá hồi, tôm

Quality index = (histamine + putrescine +
cadaverine)/(1 + spermidine + spermine)

Cá tuyết

Cadaverine, agmatine

Mực ống

Agmatine

Họ cá hồi

Cadaverine

Cá hương

Putrescine,cadaverine, histamine

Cá ngừ vằn

Putrescine and cadaverine

Cá ngừ đóng hộp

Histamine

Cá ngừ

Quality index = (histamine + tyramine +
putrescine + cadaverine)

Cá hồi hun khói

Cadaverine, histamine, putrescine, tyramine

Cá ngừ mắt to

Cadaverine, histamine

Cá thu

Histamine

(Nguồn: Mietz và Karmas, 1977)
2.1.8.

Giới hạn cho phép của histamine trong thủy sản

Sự ăn phải các biogenic amine có thể gây nguy hiểm cho người tiêu dùng, và do
đó đã có nhiều cố gắng để thiết lập giới hạn an toàn cho người tiêu dùng, đặc biệt là
đối với trường hợp của histamine. Liên minh Châu Âu (Commission Regulation,
2005) đã thiết lập cho phép đối với histamine ở một số loài cá dựa vào công nghệ sử
dụng trên các loài cá này. Hàm lượng histamine tối đa cho phép trong các sản phẩm cá
tươi thuộc họ Combridae và Clupeidae là 100 mg/kg và lên đến 400 mg/kg cho các sản
phẩm đã qua sơ chế thuộc cùng một họ (Commission Regulation, 2005). Tổ chức FDA
đã thiết lập hàm lượng histamine ở mức 50 mg/kg, trên mức này thì sản phẩm được
xem như có nguy cơ gây hại cho sức khỏe (FDA, 2005). Tại Australia thì giới hạn cho
phép của nồng độ histamine được coi là an toàn cho sức khỏe là 200 mg/kg và tại Nam
Phi giới hạn này là 100 mg/kg (Auerswald et al., 2006). Tuy nhiên, mối liên quan giữa

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

hàm lượng histamine và độc tính của một mẫu cá chưa rõ ràng và sự hiện diện của các
chất làm tăng cường hoạt tính của histamine cũng cần được xem xét.
2.1.9.

Phƣơng pháp xác định histamine trong thủy sản bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao (HPLC)
Vì tầm quan trọng của histamine trong đánh giá chất lượng thủy sản do đó cần
thiết phải có những phương pháp phân tích phù hợp. Histamine trong những thực
phẩm khác nhau, bao gồm cá và sản phẩm từ cá, được xác định theo nhiều cách như
bằng kỹ thuật sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, điện di mao dẫn và sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) (Onal, 2007). Trong những phương pháp có sẵn để xác định
histamine trong hải sản, phương pháp được dùng nhiều nhất là sắc ký, đặc biệt là
HPLC với cột trao đổi ion hoặc cột pha đảo bằng cách dùng các cặp ion để tách
histamine (Batange et al., 2005). Quy trình này có ưu điểm là độ nhạy, độ linh hoạt
cao. Ngoài ra, việc chuẩn bị mẫu cũng tương đối đơn giản.
2.1.9.1. Quy trình ly trích
Việc xác định histamine từ cá thường gặp nhiều vấn đề do nhiều nguyên do. Các
biogenic amine chính yếu trong cá thường hiện diện ở những nồng độ khác nhau. Hơn
nữa, loại mẫu này rất phức tạp, chứa nhiều nồng độ protein và nhiều thành phần chất
béo (0.5% - 30%). Vì thế, hầu hết phương pháp xác định biogenic amine (BA) bao
gồm nhiều bước sơ bộ để ly trích những hợp chất này từ phần thịt cá và sau đó tiến
hành lý trích và tinh sạch.
Chuẩn bị mẫu và ly trích histamine từ cá là một bước quyết định trong phân tích
histamine. Nhiều dung môi đã được sử dụng để ly trích BA từ sản phẩm cá, bao gồm
hydrochloric acid, trichloroacetic acid (TCA), perchloric acid (PCA), và một số dung
môi khác như methanol, dichloromethane, acetone, và acetonitrile (Moret và Conte,
1996). Được dùng nhiều hơn cả là PCA và TCA bởi tác dụng của nó trong sự tủa

protein, làm cho chúng thành những chất ly trích BA hữu hiệu nhất cho cá. Sự ly trích
thường bao gồm bước đầu tiên 5-15 gram cơ cá được đồng nhất với 10-50 ml acid
nhiều nồng độ (5%, 6%, và 7,5%); hỗn hợp này sau đó được ly tâm và lọc (RuizCapillas và Moral, 2001; Veciana-Nogues et al., 1997). Phần tủa được rửa nhiều với
acid, ly tâm, và lọc thêm lần nữa. Dịch trích thu được có thể sử dụng cho việc xác định

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

những hợp chất khác như trimethylamine, volatile base nitrogen, amonia, urea, và một
ít amino acid tự do (FAA) (Capillas và Moral, 2001).
Trong một số trường hợp, bước đầu tiên trong quá trình định lượng histamine ở
cá và các sản phẩm làm từ cá có thể bao gồm việc tinh sạch và rửa các dịch chiết sau
cùng dựa trên cột nhựa trao đổi ion và pha rắn. Trong phương pháp HPLC, cột tách
chính dùng để định lượng histamine thường được thiết lập bên cạnh một cột trao đổi
ion nhỏ (cột bảo vệ) (Capillas và Moral, 2001).
2.1.9.2. Quy trình xác định
Các biogenic amine phản ứng chậm với hệ thống dò tìm bởi dễ bay hơi và thiếu
sắc thể. Nhiều biogenic amine trong thực phẩm không có tính hấp thụ lẫn huỳnh quang
chuyên biệt, trong đó có histamine. Do đó, một chất dẫn xuất thường được dùng để
làm tăng độ nhạy. Có nhiều chất dẫn xuất đã được biết như dansyl và dabsyl chloride,
benzoyl chloride, fuoresceine, 9-fuorenylmethyl chloroformate, o-phthalaldehyde
(OPA), và naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (Onal, 2007). Trong số này, OPA và

dansyl chloride được dùng nhiều nhất. Dansyl chloride tạo thành chất bền vững sau
khi phản ứng với nhóm amino thứ nhất và thứ hai và sản phẩm thường bền hơn các sản
phẩm được tạo dẫn xuất với OPA. Tuy nhiên, OPA lại phản ứng nhanh với nhóm
amine đầu tiên dưới sự có mặt của những chất khử như của N-acetylcysteine, 2mercaptoethanol hoặc thiofluor. Dưới điều kiện cơ bản (pH>9) và nhiệt độ phòng,
phản ứng hoàn thành trong vòng 1-30 giây. Sản phẩm của phản ứng này, 1-alkyl-2alkylthio-substituted isoindoles, cho thấy sự kích thích tối ưu ở 330 nm và bức xạ tối
đa ở 465 nm (Capillas và Moral, 2001). Ngoài ra, phương pháp tạo dẫn xuất bằng
OPA đơn giản hơn, có thể dùng tự động với máy tự load mẫu. Tuy nhiên, dẫn xuất
OPA thì kém bền và cường độ huỳnh quang giảm nhanh chóng. Do đó, cần kiểm soát
nghiêm ngặt thời gian phản ứng. Hiện nay, vấn đề này có thể được giải quyết bằng
cách tạo dẫn xuất sau khi tách (postcolumn derivatization) hoặc dùng máy tạo dẫn xuất
tự động trước khi tách.
Việc tạo dẫn xuất histamine có thể được thực hiện trước (precolumn), trong (oncolumn) hoặc sau quá trình phân tách sắc ký (postcolumn) (Onal, 2007; Gosetti, 2007).
Quy trình được thực hiện phổ biến nhất là tạo dẫn xuất tự động trực tiếp sau khi phân
tách vì phương pháp này có nhiều ưu điểm: thứ nhất, phương pháp này không cần
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

nhiều bước xử lý sơ bộ như các phương pháp khác, do đó giảm thiểu khả năng làm
nhiễm mẫu trong quá trình xử lý; thứ hai, thời gian phân tách ngắn và sự tạo dẫn xuất
diễn ra cùng lúc, do đó làm tăng tính lặp lại và độ nhạy phân tích (Tracy et al., 1995).
Ngược lại, phương pháp tạo dẫn xuất trước phân tách đòi hỏi nhiều bước xử lý mẫu và
có thể dẫn đến nhiều vấn đề trong quá trình phân tích sau này. Dansyl chloride thường

được sử dụng để tạo dẫn xuất trước phân tách trong sắc ký pha đảo đi kèm với việc dò
tìm bằng UV còn OPA thường được dùng để tạo dẫn xuất trước hoặc sau phân tách
trong sắc ký pha đảo cặp ion kết hợp với việc phát hiện bằng huỳnh quang (Capillas và
Moral, 2001, Veciana-Nogues, 1997).
2.2.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.2.1. Giới Thiệu
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách và phân tích các hợp
chất được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do: có độ nhạy tương
đối cao, có khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi
hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ
nghiên cứu khoa học trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh vực
khác.
Hợp chất có thể phân tích bằng sắc ký lỏng như acid amin, protein, acid nucleic,
hydrocacbon, carbohydrate, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu, các hợp chất vô cơ… Dựa
vào sự khác nhau về cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà
người ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký
ion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến.
Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng
pha thường và sắc ký lỏng pha đảo.
-

Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung

môi pha động, dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử
lượng không lớn lắm.
-

Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký pha thường, pha tĩnh có độ phân cực

thấp, pha động có độ phân cực cao hơn. Phương pháp này dùng để phân tích các hợp
chất từ không phân cực đến phân cực vừa. Dung môi sử dụng là dung môi phân cực,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường Đại học Cần Thơ

trong đó nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền, do đó sắc ký lỏng pha đảo được
sử dụng nhiều nhất.
2.2.2 Các bộ phận của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính: bơm, bộ phận
tiêm mẫu, cột sắc ký phân tích, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu.
Mẫu sau khi được tiêm vào cột sẽ được pha động lôi kéo qua cột. Dựa vào khả
năng tương tác khác nhau giữa các chất có trong nền mẫu với pha tĩnh và pha động mà
chúng được tách ra khỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi bộ dò cụ thể.
Sắc ký lỏng có thể ghép với nhiều loại đầu dò khác nhau như đầu dò phổ tử ngoại
khả kiến UV-Vis, đầu dò huỳnh quang FLD, đầu dò chỉ số khúc xạ RID, đầu dò điện
hóa ECD, đầu dò khối phổ MS… Hiện nay đầu dò khối phổ được ứng dụng rộng rãi
trong phân tích vết và các hợp chất nhận danh chính xác.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học