Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu

Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu Trần Thị Thu Hiền- Thực vật K17
Phần 1. MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa, nền kinh tế chủ yếu
vẫn là sản xuất nông nghiệp. Khí hậu nóng ẩm rất phù hợp cho sự sinh trưởng và
phát triển của cây trồng, đồng thời cũng là điều kiện tốt cho sâu bệnh phát triển.
Theo thống kê của tổ chức Lương- Nông thế giới, hiện nay các loại cây trồng
trên đồng ruộng phải chống đỡ với 100000 loài sâu hại khác nhau, 10000 loài
nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Hàng
năm, khoảng 20 % sản lượng lương thực, thực phẩm trên thế giới bị mất trắng [1].
Do đó việc sử dụng thuốc trừ sâu là vô cùng cần thiết để đảm bảo an ninh lương
thực cho loài người. Theo TS. Marcus Theurig (2002), nếu không sử dụng thuốc
BVTV thì loài người phải cần đến 3 lần diện tích trồng cấy như hiện nay [3].
Bên cạnh những lợi ích lớn lao của thuốc trừ sâu hóa học thì nó cũng gây
ra các hậu quả không nhỏ. Thuốc trừ sâu hóa học tồn tại lâu trên nông sản ảnh
hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng, đồng thời một lượng lớn thuốc trừ sâu
khi phun cho cây đã phát tán vào môi trường đất, nước gây ô nhiễm nghiêm
trọng. Ô nhiễm do thuốc trừ sâu kết hợp với các loại ô nhiễm khác đã làm cho
môi trường của chúng ta đang ở trong tình trạng đáng báo động.
Trước tình hình này, việc sử dụng phương pháp đấu tranh sinh học trong
trồng trọt để bảo vệ mùa màng đang được áp dụng mạnh mẽ. Trong số những
bệnh côn trùng, bệnh gây ra do vi sinh vật chiếm 80- 90%, nên vi sinh vật là đối
tượng lý tưởng để lợi dụng đấu tranh sinh học trong bảo vệ cây trồng.
Xuất phát từ những lý do trên, tôi quyết định tìm hiểu đề tài:
“Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu”
1
Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu Trần Thị Thu Hiền- Thực vật K17
Phần 2. NỘI DUNG
I. Thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi khuẩn
1.1. Một số vi khuẩn có khả năng diệt sâu hại [2]
1.1.1. Vi khuẩn sinh bào tử điển hình
Clotridium brevifaciens

Clotridium malacosomae
Baciluss cereus
Baciluss thuringiensis
Baciluss var. entomocidus
Baciluss var. galleriae
Baciluss var. isralensis (Bti)
Baciluss sphaericus (Bs)
Baciluss popilliae
1.1.2. Vi khuẩn không sinh bào tử điển hình
Serratia marcescens
Pseudomonas aeruginosa
P. putida
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Nhiều loài của chi Aerobacter
Nhiều loài của chi Cloaca
Trong số những vi khuẩn có khả năng diệt sâu hại, Baciluss thuringiensis
(Bt) là tác nhân sinh học đầu tiên được nghiên cứu sản xuất thành thuốc trừ sâu
vi sinh trên thế giới.
* Một số loài sâu bị Bac. Thuringiensis gây chết [1]
Có khoảng hơn 200 loài côn trùng có thể bị vi khuẩn Bt gây chết trong đó
đa số là sâu hại cây trồng và cây rừng. Con số này không ngừng gia tăng do các
nhà khoa học không ngừng tìm kiếm các chủng vi sinh vật có khả năng diệt côn
trùng và thử nghiệm trên các loài sâu khác nhau.
Sâu xanh hại bông (Heliothis armigera)
Sâu xám hại rau (Agrotis upsilon)
Ngài đêm hại su hào, bắp cải (Barathra brassicae)
2
Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu Trần Thị Thu Hiền- Thực vật K17
Sâu xanh hại ớt (Heliothis assulta)

Bọ lá khoai tây (Leptinotarsa decemlineata) (H.1-Phụ lục)
Bọ xít rùa (Eurygaster integriceps)
Sâu cắn lá ngô (Leucania separate Walker)
Mọt lúa mì (Sitophilus granaries Linne)
Sâu non đục củ khoai tây (Gnorimoschema opereulella Zeller)
Sâu đục thân bắp (Pyrausta nubilalis Hiibner) (H.3-Phụ lục)
1.2. Chế phẩm thuốc trừ sâu Bt
1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Bt [2]
- Bt là trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, nhuộm gram
dương, kích thước 3-6 µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ và
xếp thành từng chuỗi.
- Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Bt không cao, chất dinh dưỡng chủ
yếu là protein động thực vật. Bt có thể phát triển bình thường trong nhiều nguồn
nitơ, cacbon và muối vô cơ.
+ Nguồn cacbon: tinh bột, maltose, glucose
+ Nguồn nitơ: nitơ hữu cơ: cao thịt bò, peptone, bột men, bột bánh lạc, bột
cá v.v...
+ Muối vô cơ: K
2
HPO, MgSO
4
, CaCO
3
.
- Biên độ nhiệt sinh trưởng của Bt là 12
0
C – 40
0
C, nhiệt độ thích hợp là
27

0
C- 32
0
C, ở 35
0
C- 40
0
C sinh trưởng nhanh nhưng chóng lão hóa, nhiệt độ thấp
sinh trưởng rất chậm.
- Bt thích hợp với điều kiện kiềm, pH thích hợp là 7,5; ở pH 8,5 vẫn có
thể hình thành bào tử; pH= 5 không hình thành bào tử.
- Phản ứng sinh lý, sinh hóa của Bt:
+ làm ngưng kết sữa;
+ trong đường glucose, fructose, glycerol, tinh bột, maltose sẽ hình thành
acid
+ có phản ứng dương với methyl đỏ, phản ứng VP dương (ethiryl methyl
methanol)
3
Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu Trần Thị Thu Hiền- Thực vật K17
+ có tác dụng hòa tan trong môi trường huyết ngựa agar
+ có thể mọc trên môi trường muối xianat, khử muối nitrat thành nitrit,
không khử muối sulphat, sản sinh ra enzyme phospholypase.
Quá trình sống có thể chia làm 3 giai đoạn: Thể sinh dưỡng, nang bào tử,
bào tử và tinh thể.
1.2.1.1. Thể sinh dưỡng
Dạng que, hai đầu tù, kích thước 1,2- 1,8 μm x 3- 5 μm, bắt màu gram
dương. Lông mọc xung quanh, hơi động hoặc không động. Thường tồn tại 1
hoặc 2 cá thể liền nhau. Thể sinh dưỡng sinh sản theo kiểu phân chia ngang.
Trong thời kì sinh sản, thường có 2,4,8,v.v.. thể sinh dưỡng liền nhau thành một
chuỗi. Lúc này vi khuẩn sinh trưởng nhanh, trao đổi chất mạnh, dễ nuôi cấy trên

môi trường.
1.2.1.2. Nang bào tử
Khi các thể vi khuẩn già, một đầu sẽ hình thành bào tử hình bầu dục, đầu
kia hình thành tinh thể hình thoi. Đây là giai đoạn nang bào tử, nang bào tử hình
trứng dài, to hơn thể sinh dưỡng.
1.2.1.3. Bào tử và tinh thể (H.1)
Nang bào tử phát triển nứt ra giải phóng bào tử và tinh thể. Bào tử ở dạng
ngủ có thể chống chịu với môi trường bất lợi, do đó chế phẩm bào tử thường
được bảo quản ở dạng bào tử.
Tinh thể thường có dạng hình thoi, tùy theo loài và môi trường tinh thể có
thể có dạng tròn hoặc bầu dục. Tinh thể có bản chất protein, là chất diệt sâu có
hiệu quả.
Hình 1: Nang bào tử của Bacillus thuringiensis [8]
1.2.2. Độc tính và cơ chế gây độc của vi khuẩn Bt
1.2.2.1. Các nhóm độc tố của Bt
Các chủng khác nhau của loài Bacillus thuringiensis sinh ra 2 loại chất
độc chính
4
Bào tử
Tinh thể độc
Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu Trần Thị Thu Hiền- Thực vật K17
+ Các chất độc tinh thể (Cry) được mã hóa bởi các gene cry khác nhau.
+ Các chất độc phân giải tế bào (Cyt), loại chất độc này tác động riêng rẽ
hoặc cùng với Cry làm tăng tác dụng của tinh thể độc.
* Nhóm chất độc phân giải tế bào (Cyt)
Gồm các ngoại độc tố do vi khuẩn tiết ra
- Ngoại độc tố α (alpha- exotoxin): là enzim phospholipase được tiết ra
trước khi bào tử và tinh thể độc được hình thành gây phân hủy mô trong cơ thể
côn trùng bị tác động.
- Ngoại độc tố β (beta- exotoxin): là loại ngoại độc tố của Bt được nghiên

cứu kỹ nhất. Độc tố này có tính bền nhiệt, được tạo ra trước khi tinh thể độc
hình thành. Vi khuẩn Bt có một số type huyết thanh là H
1
, H
4a
, H
4c
, H
5
, H
8
, H
9
và
H
10
có khả năng sinh ngoại độc tố β [1].
Ngoại độc tố này có cấu trúc tương tự ATP, có tác dụng cạnh tranh với
ATP  ức chế hoạt động của ARNpolymerase.
Cùng với tinh thể độc ngoại độc tố β xâm nhập vào huyết tương của côn
trùng, đến các cơ quan làm tăng tính độc của vi khuẩn. Hiệu quả của ngoại độc
tố β thể hiện rõ nhất trên tế bào sâu non của côn trùng chịu tác động  ngăn cản
quá trình lột xác, hoặc gây dị thường trong phát triển.
- Ngoại độc tố γ: là một loại phospholipase tác động lên phospholipid, phá
hủy mô tế bào.
* Tinh thể độc: Nội độc tố δ (delta- endotoxin) (H.3)
Tinh thể độc Cry được tạo ra với một lượng lớn hơn nhiều so với chất độc
Cyt và là tác nhân có hiệu quả chính trong việc gây độc cho côn trùng.
Tinh thể độc không hòa tan trong nước hoặc các chất hữu cơ nhưng có thể
hòa tan trong dung dịch kiềm.

Có hơn 50 gene mã hóa các protein tinh thể độc, có thể chia protein tinh
thể độc thành 15 nhóm dựa trên sự giống nhau trong trình tự gene
5
Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu Trần Thị Thu Hiền- Thực vật K17
1.2.2.2. Cơ chế gây độc của tinh thể độc (H.2)
Hình 2: Cơ chế hoạt động của tinh thể độc tố diệt côn trùng [6]
A: Sâu ăn lá có vi khuẩn  tinh thể độc và bào tử xâm nhập vào cơ thể
sâu. Trong điều kiện bình thường, tinh thể độc không hòa tan.
B. Quá trình hòa tan tinh thể và hoạt hóa chất độc: xảy ra ở ruột giữa nơi
có pH kiềm cao (> 9,5), ở pH này tinh thể độc tan ra  tiền độc tố có kích thước
135- 140 kDa  protease trong ruột giữa của sâu hoạt hóa thành dạng hoạt động
là độc tố δ (kích thước 60- 66 kDa).
C. Độc tố liên kết với thụ thể (receptor) trên biểu bì ruột  đâm qua
màng tạo thành lỗ xuyên màng  mất cân bằng ion nội bào của tế bào biểu mô
 tế bào nội mô bị phân giải  sâu ngừng ăn  chết đói
D. Lỗ xuyên màng xuất hiện trên thành ruột  pH trong ruột giảm xuống
bằng pH nội môi trong huyết tương  cho phép bào tử nảy mầm, xâm chiếm vật
chủ  gây chết.
Nội độc tố δ có 3 vùng chức năng:
+ Vùng I: là một bó gồm 7 chuỗi xoắn α, một vài chuỗi hoặc tất cả các
chuỗi có thể cài vào màng tế bào ruột, tạo ra các lỗ  các ion qua lại tự do
6
Tinh thể
Bào tử
Quá trình hòa tan
tinh thể và hoạt hóa
chất độc
Nội độc tố δ
tiền độc tố
độc tố hoạt động

Độc tố liên kết với
receptor trên biểu bì
ruột
receptor
độc tố
Xuyên
thủng màng
ruột
D. Bào tử nảy
mầm và vi
khuẩn sinh sôi
Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu Trần Thị Thu Hiền- Thực vật K17
+ Vùng II: chứa 3 dải β không song song tương tự như vùng gắn kháng
nguyên của globulin miễn dịch, vùng này có chức năng gắn với thụ thể trên bề
mặt tế bào biểu mô ruột.
+ Vùng III: bảo vệ độc tố đã được hoạt hóa khỏi bị phân hủy bởi protease
ruột.
Với cấu trúc và hoạt tính như vậy, tinh thể độc liên kết một cách đặc hiệu
với màng tế bào biểu mô ruột của sâu, do đó phổ tác động của Bt khá hẹp, tùy
từng loại tinh thể độc mà các chủng Bt tác động với các sâu của nhóm côn trùng
chủ yếu thuộc bộ Lepidoptera.
Hình 3: Tinh thể độc của Bacillus thuringiensis [8]
1.2.3. Phương pháp sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu Bt: [2]
Bt được sản xuất chủ yếu theo hai cách : lên men thường (lên men bề mặt)
và lên men chìm có sục khí. Hiện nay người ta sử dụng phương pháp lên men
chìm vì mang lại hiệu quả cao.
Bước chọn chủng lên men: tùy theo việc phòng trừ loài sâu hại nào mà
nhà sản xuất chọn chủng vi khuẩn phù hợp để lên men.
Bước chọn môi trường lên men: trên cơ sở môi trường cơ bản, tùy thuộc
chủng vi khuẩn cần lên men mà thêm các chất phù hợp.

7
Vùng I
Vùng II
Vùng III
Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu Trần Thị Thu Hiền- Thực vật K17
Quy trình tổng quát sản xuất chế phẩm Bt
Lên men chìm tiến hành trong các nồi lên men 500l, 1000l, 2000l, ngoài
môi trường dinh dưỡng cần chú ý tới một số thông số khác như: chế độ thổi khí,
chế độ nhiệt độ, chế độ luân chuyển giống v.v.. để hạn chế các thực khuẩn thể
phá hủy các bào tử và tinh thể độc.
+ Chế độ thổi khí: là chỉ tiêu quan trọng trong quá trình hình thành bào tử
và tinh thể độc. Ngưỡng thổi khí tốt nhất trong quá trình lên men là 0,5- 0,6 m
3
môi trường / m
3
không khí. Chế độ thổi khí thấp  bào tử phát triển yếu, mật độ
thưa. Chế độ thổi khí cao  bào tử phát triển nhanh, thời gian lên men ngắn,
tinh thể độc nhỏ  hiệu quả diệt sâu không cao.
+ Nhiệt độ: ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử, nhiệt độ quá cao
hoặc quá thấp sẽ rút ngắn hoặc kéo dài quá trình lên men, nhiệt độ phù hợp là
30
0
C.
8
Chủng Bt thuần khiết
Nhân giống cấp 2
Nhân giống cấp 1
Thời gian lên men: 48- 72 h,
pH = 7, nhiệt độ: 30
0

C
Lên men
Lọc và ly tâm
Thu sinh khối
Hoàn thiện sản phẩm