công nghệ vi sinh - sản xuất protein tái tổ họep trên e.coli

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
INSULIN
INSULIN
Công NGhệ vi sinh
Sản xuất protein tái tổ hợp trên E.coli
Nhóm:
1.Trần Thị Huyền Trân 61003158
2.Huỳnh Thị Trúc 61003267
3.Lê Thị Thúy Quyên 61003118
4.Nguyễn Thị Kim Thao 61003132
5.Huỳnh Thị Thanh Trúc 61003268
6.Phan Mỹ Hoàng Mai 61003080
7.Trần Nguyễn Hương Trang 61003262
I/ Bệnh tiểu đường:
II/ Một số loại insulin trên thị trường:
Loại insulin Màu sắc Nguồn gốc
Thời gian bắt đầu tác dụng
Thời gian hết tác dụng
Tác dụng nhanh
- Insulin Actrapid HM
- Insulinum maxirapid


Trong Người
Lợn

30 phút (tiêm dưới da) 8h
Tác dụng bán chậm
- Insulatard HM

- Insulin Lente


Đục Người
Lợn


1h


20h
18h
Loại pha trộn
-Mixtar HM 30/70 Đục Người 30 phút 20h
Tác dụng rất chậm
-Utra – Lente Đục Bò 4h 30h
III/ Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất insulin
1. Cấu trúc phân tử insulin:
Insulin người là 1 polipeptide
Bao gồm:
-
Chuỗi A 21 aa
-
Chuỗi B 30aa.
Có 1 cầu nối disulfur giữa 2
chuỗi A và 2 cầu nối giữa 2
chuỗi A và B.
CTHH: C
257
H

383
N
65
O
77
S
6.
Trọng lượng phân tử: 5808
2. Vai trò của insulin:
2. Vai trò của insulin:

Insulin làm tăng tính hấp thụ của các acid amin.

Thúc đẩy sự sinh tổng hợp các acid béo trong gan

Insulin làm tăng tính thấm của các ion kali, magie và phosphate vô cơ tạo
điều kiện cho quá trình phosphoryl hóa và sử dụng glucose.
IV/ Công nghệ sản xuất insulin:
Năm 1922, Fred Banting và
Charles Best thuộc Đại học
tổng hợp Toronto (Canada)
thông báo họ đã tìm ra insulin
và ứng dụng chất này trong
điều trị bệnh tiểu đường ở
người.
Nhược điểm:
+Insulin từ động vật có cấu trúc không hoàn toàn giống insulin người.
+ Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn insulin người.
+ Khả năng hấp thụ kém.
+ Có thể gây ra các phản ứng miễn dịch trong cơ thể.

+ Trong quá trinh tách chiết không thể loại bỏ hết các tác nhân gây bệnh ở động vật.
+ Qui trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao.
+ Chi phí đắt (cần lượng lớn tụy để sản xuất) => giá thành cao.
+ Khó sản xuất lượng lớn với qui mô công nghiệp.
V/ Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp trên E.coli:
1. Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp mini proinsulin
(MPI):
Bước 1:
bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được gen mã
hóa proinsulin người trên NST số 11
Bước 2: Tách và thiết kế plasmid tái tổ hợp
- Cắt gen mã hóa proinsulin và plasmid bằng một loại giới hạn. Nối bằng ADN ligase của
phageT4.
- Thiết kế các trình tự mã hóa cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào
chất.
- Nếu sử dụng mRNA tách được từ trên tiến hành như sau:
+ Sao mRNA tinh khiết thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược và nhờ các dNTP (trong phản
ứng RT – PCR).
+ Cài đoạn cDNA mã hóa insulin hoàn chỉnh vào plasmid đứng sau một promoter mạnh. Biến
nạp vector tái tổ hợp vào E.coli.
DNA mã hóa 8 – 12 aa TNF-α và His
10

được tổng hợp hóa học.
Cắt bằng NdeI và BamHI
Chèn vào downstream T7 promoter
Biểu hiện trong pET-3a
Cắt bởi endonuclease
Thu pT2
Chủng E.coli: BL21 (DE3)

Gen: T7 RNAP
Promoter lacUV5
Plasmid T2
Gen mã hóa cho proinsulin người PCR
(5 DNA overlapping, mỗi đoạn 65 – 68 base như mẫu)
Cắt bằng BamHI và HindIII
Chèn vào pT2
pT2-hPI
Plasmid pT2-
hPI
Plasmid pT2M2PI:
Gen mã hóa M2PI đem PCR
(gen proinsulin người làm mẫu DNA)
Cắt bằng BamHI và HindIII
Chèn vào pT2
pT2M2PI
Plasmid pT2M2PI:
Bước 3: Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau
quá trình biến nạp cần chọn lọc những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.
Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó
được đưa vào lên men.
Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng
phương pháp nuôi cấy liên tục, các chất
dinh dưỡng được bổ sung thường xuyên
để đảm bảo sự tăng trưởng của vi khuẩn
theo hàm số mũ. Sau 20 phút có hàng
triệu vi khuẩn được nhân lên qua nguyên
phân. Chỉ sau 1 thời gian ngắn, sinh khối
tăng lên rất nhanh và gen insulin được

tổng hợp
Môi trường: Luria – Bertani

-
1% (w/v) peptone
-
0,5% (w/v) cao nấm men
-
1% (w/v) NaCl
-
0,1% (w/v) NaOH (v/v)
-
duy trì 200 mg/l ampicilline
Sơ đồ biểu hiện mini proinsulin trong plasmid pT2M2PI
Bước 5: Tiền tinh sạch
Sau khi lên men cần tách tế bào và khử trùng nhiệt.
+ Dùng enzyme lizozyme phá vỡ màng tế bào sau đó dùng hỗn
hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit
+ Bằng phương pháp ly tâm lọc và tách được proinsulin.
Bước 6: Hoạt hóa
Hoạt hóa proinsulin vitro (sau tinh sạch ở dạng mạch thẳng)
bằng cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4
(tạo phản ứng xoắn cuộn), sau đó dùng enzyme đặc hiệu
trypsin để phân cắt proinsulin.
Khi đó sản phẩm thu được mới có hoạt tính cần thiết.

+ 50mM glycine buffer  mini proinsulin tinh sạch
(50 µM, 0.375 mg/l)
+ 2-mercaptoethanol  phản ứng cuộn xoắn

(bằng 2 lượng mini proinsulin) (18h, 4
o
C)
↓
+ H
3
PO
4
đến pH 2.5  Dừng phản ứng
↓
Tinh sạch
(Reverse-phase HPLC)
` ↓
So sánh peak với mini proinsulin xoắn cuộn với
insulin

Phản ứng xoắn cuộn