Nhân giống vô tính invitro

1
I. Phần Mở Đầu
•
Khái niệm về nhân giống invitro
•
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái
niệm chung cho tất cả các loại nguyên liệu
nuôi cấy thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật
trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô
trùng.
•
Nhân giống vô tính invitro là quá trình sản xuất
một lượng lớn cây hoàn chỉnh từ các bộ phận
cơ quan như: Chồi, mắt ngủ, vảycủ, thân lá …
của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nc in
vitro.
Nhóm 1:Nhân giống vô tính
invitro
2
2. Tính cấp thiết của phương pháp nhân
giống vô tính in vitro:
•
Từ xa xưa ông cha ta đã biết nhân giống
cây trồng bằng phương pháp vô tính
truyền thống giâm, chiết, ghép, …
•
Nhưng các biện pháp đó ngày càng bộc lộ
nhiều hạn chế : giống được nhân nhiều
lần bị thoái hóa giống, mắc nhiều bệnh
hơn, năng suất giảm, phân ly …
3

•
Bằng biện pháp nhân giống invitro, với
công nghệ vô trùng cao đã khắc phục
được những hạn chế trên, nâng cao năng
suất chất lượng của giống cây trồng cả về
giá trị nông học và giá trị thương phẩm.
•
Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển nhân
giống invitro ngày nay là rất quan trọng
cần được chú trọng đầu tư.
4
3. Ưu điểm của phương pháp nhân giống
invitro
•
Có hệ số nhân rất cao
•
Có thể nhân giống ở quy mô công
nghiệp, đặc biệt đối với các đối tượng
khó nhân bằng các phương pháp thông
thường.
•
Chủ động giống trong sản xuất
•
Tạo ra các giống cây trồng sạch bệnh
•
VD: khoai tây, dứa…
5
4. Nhược điểm của phương pháp invitro
•
Chi phí cao hơn so với các phương pháp

nhân giống vô tính khác nên khó cạnh
tranh.
•
Một số cây rất dễ bị biến dị khi nhân
giống invitro.
•
Nhân giống invitro không thể áp dụng
trên tất cả các đối tượng.
6
II. Cơ sở khoa học
•
Dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật.
•
Theo quan điểm của sinh học hiện đại: tính
toàn năng của tế bào thực vật tế bào là tế bào
chứa đầy đủ lượng thông tin di truyền cần thiết
của cơ thể thực vật.
•
Sự hình thành và phát triển của phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của
những phát hiện sau đây trong lĩnh vực sinh lý
thực vật và di truyền học phân tử:
7
•
1. Tính toàn thể (potipotency) của mô và tế
bào thực vật cho phép tái sinh được cây hoàn
chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi tách
rời;
•
2. Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy

túi phấn, từ đó tạo các dòng đồng hợp tử
tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình
lai tạo;
•
3. Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế
bào thực vật và khả năng chuyển gen để gây
biến đổi (transformation) ở thực vật do ADN
ngoại lai nhờ công nghệ gen (genetic
engineering).
8
•
4. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật như
nuôi cấy vi sinh vật dẫn đến khả năng ứng
dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao
để phục vụ cho công tác tạo giống;
•
5. Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng
dung hợp protoplast, tái sinh cây hoàn chỉnh từ
protoplast lai (cybrid);
•
6. Khả năng loại trừ virus bằng phương pháp
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô
tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính.
9
•
7. Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi
protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ
cực nhanh một số cây trồng;
•
8. Khả năng sử dụng phương pháp nuôi cấy

phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai
xa;
•
9. Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng
nuôi cấy trong ống nghiệm;
•
10. Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống
trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp mà
không mất tính toàn thể của tế bào.
10
•
III. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN
Bước 1: Nuôi cấy
khởi động
Bước 2: Nhân nhanh
Bước 3: Tạo cây
invitro
Bước 4: chuyển ra môi
trường tự nhiên
Bước 0: Chọn lọc cây
mẹ  Lấy mẫu
Cây huấn luyện giai
đoạn đầu(vườn ươm)
Trồng cây ra đất
Khử trùng vào
mẫu
Mt ra rễ
Chọn cây đạt
y/c
Ngoại cảnh

thích hợp
Gía thể
trồng
Chăm
sóc
Mt phát sinh
h/t
11
Bước o: chọn lọc và chuẩn bị cây
mẹ
•
Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là
bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng
mạnh.
•
Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi
trường thích hợp với chế độ chăm sóc và
phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy
mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm,
tăng khả năng sống, sinh trưởng của mẫu
nuôi cấy
12
Bước 1: nuôi cấy khởi động
•
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi
cấy in vitro.
•
Yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống
ccao, mô tồn tại, sinh trưởng phát triển tốt.
•

Cần chý ý chọn đúng loại mô, đúng giai
đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên
hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ…)
•
Cần xác định chế độ khử trùng mẫu thích
hợp. Thường dùng các chất: Hgcl2 0.1%
xử lý trong 5 – 10 phút.
13
Bước 2: nhân nhanh
•
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát
sinh hình thái và tăng nhanh số lượng
thông qua: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi
bất định, và tạo phôi vô tính.
•
Chú ý xác định điều kiện môi trường và
điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hiệu
quả là cao nhất: Theo nguyên tắc chung
môi trường có nhiều xytokinin sẽ kích
thích tạo chồi, nhiều auxin sẽ kích thích ra
rễ.
14
Bước 3: tạo cây in vitro hoàn chỉnh
•
Để tạo rễ cho chồi phải cấy chuyển từ môi
trường nhân nhanh sang môi trường ra rễ.
•
Môi trường ra rễ thường bổ sung 1 lượng
nhỏ auxin. Tuy nhiên có một số chồi có
thể phát sinh rễ ngay chuyển từ môi

trường nhân nhanh sang môi trường
không chứa chất điều tiết sinh trưởng.
•
Đối với cac phôi vô tính thường chỉ gieo
trên môi trường không chứa chất điều tiết
sinh trưởng hoặc có nồng độ xytokinin
thấp để phôi phát triển thành cây.
15
Bước 4: thích ứng cây in vitro ngoài
điều kiện tự nhiên
•
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm
có tỷ lệ sống cao cần phải chú ý một số
điểm:
•
Cây đạt tiêu chuẩn hình thái nhất định: số
lá, chiều cao cây, bộ rễ…)
•
Có giá thể sạch, tơi xốp, thích hợp để tiếp
nhận cây con in vitro.
•
Chủ động điều chỉnh hàm lượng dinh
dưỡng, ẩm độ, ánh sáng trong vườn ươm.
16
IV. CÁC PHƯƠNG THỨC NHÂN
GIỐNG VÔ TÍNH
1. Hoạt hoá chồi nách
1. Hoạt hoá chồi nách
Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách,
Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách,

hay xảy ra khi nuôi cấy cây 2 lá mầm: khoai tây,
hay xảy ra khi nuôi cấy cây 2 lá mầm: khoai tây,
hoa cúc,…
hoa cúc,…
Tạo cụm chồi từ chồi
Tạo cụm chồi từ chồi
đỉnh hoặc chồi nách, hay
đỉnh hoặc chồi nách, hay
gặp với cây 1 lá mầm: mía, lúa,…
gặp với cây 1 lá mầm: mía, lúa,…
2. Tạo chồi bất định-
Thực hiện quá trình phản phân hoá và tái phân hoá
tế bào để bắt các tế bào soma hình thành chồi trực
tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển
mô sẹo.
Ở cây 1 lá mầm: lan, dứa, hoa loa kèn,…
17
3. Tạo phôi vô tính
•
Tương tự như tạo chồi bất định, nhưng
phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực bao
gồm cả chồi mầm và rễ mầm.
•
Phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn
chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản
xuất hạt giống nhân tạo.
18

Sự hình thành phôi vô tính có 2 bước:
Bước 1: phân hóa tế bào có khả năng phát

sinh phôi ( thường là các tế bào nhỏ, nhân
lớn nhiều hạch nhân,không có không bào,
tế bào chất đậm đặc, giàu protein và
mRNA. Cần môi trường giàu auxin.
Bước 2: sự phát triển của những tế bào
phôi mới hình thành. Môi trường nghèo
hoặc không có auxin ( nồng độ auxin cao
kích thích hình thành phôi vô tính nhưng
ức chế quá trình phân hóa và phát triển
tiếp theo của phôi.
19
Từ việc tạo phôi vô tính người ta đã sản
xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính
•
Nguyên liệu:

Các Polyme sinh học

Phôi vô tính

Môi trường dinh dưỡng tạo hạt nhân tạo
Thường sử dụng polyme tự nhiên Alginate
để tạo hạt nhân tạo.
•
Cách thực hiện:
•
+ Dùng polyme bao gói 1 phôi vô tính với
1 thể tích nhất định chất dinh dưỡng để
tạo hạt.
20

•
Quy trình cụ thể như sau:
•
Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi
trường dinh dưỡng với mật độ phù hợp và
bổ sung Na – alginate dược làm tan trong
nước với nồng độ 2-4%.
•
Dùng pipet nhỏ 100 – 150 µl huyền phù
nêu trên có chứa 1 phôi soma và dung
dịch Cacl2 (2-5%). Khi đó sẽ sinh ra phản
ứng trao đổi ion Na – Ca và hạt nhân tạo
được hình thành, có đủ độ cứng thích
hợp. ngâm trong nước làm cứng hạt.
21
•
Dùng Ca – alginate thường hạt luôn luôn
ẩm ướt bề mặt, hiện nay người ta dùng 1
loại polymer Elvax (4260) để bao lớp
alginate.
•
Giai đoạn kế tiếp là làm khô hạt để giúp
hạt nhân tạo dễ dàng bảo quản và nảy
mầm khi cần thiết. Kitto và Janick, đặt hạt
cây cà rốt trên khay có chứa 25%
polyoxyethylene để làm mất nước và khi
làm ướt lại thì hạt được tái sinh thành cây
hoàn chỉnh.
22
Chú ý

•
Hệ thống sản xuất hạt nhân tạo phải được
cơ giới hóa và không phụ thuộc vào
những thiết bị đắt tiền và nhất là thỏa mãn
yêu cầu vô trùng.
4. Ngoài ra còn có phương pháp nhân
giống qua tạo củ in vitro
23
Những công nghệ nới trong vi nhân
giống cây trồng
1. Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng.
Nghiên cứu tập trung vào vấn đề nuôi cấy mô trên
môi trường không có đường nhưng được điều khiển
chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2
VD: Phòng công nghệ tế bào viện sinh học nhiệt đới
đã tiến hành nuôi cấy mô quang tự dưỡng thành
công theo 2 phương pháp:
1. Trao đổi khí tự nhiên (khí trao đổi bằng cách
khuếch tán qua màng millipore hoặc nút giấy).
2. Bơm khí trực tiếp (khí được bơm trực tiếp vào
hộp nuôi cấy)
24
•
Ưu điểm:
- Tốc độ sinh trưởng, chất lượnh và tỉ lệ
sống của mô thực vật được nâng cao ở
tất cả các bước trong điều kiên tự dưỡng.
- Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế.
- Tỉ lệ đột biến có thể được giảm.
- Tự động hóa =>giảm chi phí lao động.

25
•
Nhược điểm:
- Chi phí cao cho việc điều khiển môi
trường.
- Chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên
dụng và chuẩn bị giá thể.