BÁO CÁO Xác định loài nấm phytophthora tác nhân chính gây bệnh thối đen quả ca cao bằng chỉ thị phân tử

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
BỘ NÔNG NGIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN BẢO VỆ THỰC VẬT
-------------------***------------------

CHUYÊN ĐỀ 4
Xác định loài nấm Phytophthora tác nhân
chính gây bệnh thối đen quả ca cao bằng chỉ
thị phân tử
Thuộc: Đề tài độc lập cấp Nhà nước
Mã số: ĐTĐL.2011- G/63

Chủ trì đề tài: ThS. Nguyễn Hồng Tuyên

Hà nội, 2015
1


1. Đặt vấn đề
Theo Duncan và Cooke, 2002, trước giai đoạn phát triển của sinh học phân
tử, tất cả các loài nấm thật (fungi) và nấm noãn (oomyces, kể cả các loài thuộc chi
Phytophthora) đều được xác định dựa trên các đặc điểm hình thái và sinh học.
Cách xác định truyền thống này nhìn chung khá khó và dễ tạo ra kết quả không
chính xác đối với các loài nấm Phytophthora. Các đặc điểm hình thái của nấm
Phytophthora có giá trị chẩn đoán thường không thống nhất, phụ thuộc nhiều vào
isolate và điều kiện nuôi cấy.
Hiện nay, việc xác định và phân loại cũng như phân tích quan hệ của các loài
Phytophthora có thể được thực hiện khá dễ dàng dựa trên các kỹ thuật phân tích
phân tử, nhiều vùng gen của Phytophthora đã được lựa chọn làm đối tượng nghiên
cứu như các vùng mã hóa và không mã hóa của DNA ribosome (rDNA), các gen

mã hóa cytochrome oxidase I và II của ty thể.
Để xác định chính xác tên loài nấm gây hại, chúng tôi xin thực hiện chuyên
đề: “Xác định loài nấm Phytophthora tác nhân chính gây bệnh thối đen quả ca
cao bằng chỉ thị phân tử”.
2. Tài liệu tham khảo
Một số phương pháp hiện đã được ứng dụng trong nghiên cứu về nấm
Phytophthora. Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn giới hạn (Restriction fragment
length polymorphism = RFLP) là kỹ thuật được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1975
để xác định đa hình DNA nhằm lập bản đồ di truyền một đột biến mẫn cảm nhiệt
độ của các serotype của adenovirus. Kỹ thuật dựa trên việc cắt bằng Enzyme cắt
giới hạn (RE= Restriction enzyme) toàn bộ bộ gen của vi sinh vật. Mặc dù 2 cá thể
cùng loài có bộ gen đồng nhất thì chúng vẫn khác nhau một số nucleotide do các
nguyên nhân sau: đột biến điểm, thêm/mất, chuyển vị trí, đảo vị trí và lặp
(duplication) nucleotide. Kết quả là sản phẩm cắt DNA sẽ có số lượng và kích
thước thay đổi. Phân tích rDNA-RFLP đã được sử dụng trong xác định nấm P.
palmivora MF4 từ các isolate phân lập trên cây ớt.
Kong và cộng sự, 2004 đã sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình chuỗi đơn
PCR - SSCP (Single stranded conformational polymorphism) cho rDNA - ITS để
chẩn đoán nhanh Phytophthora ramorumich. Sự khuếch đại DNA và phân tích
SSCP của các sản phẩm PCR được tiến hành ở Mỹ. Sử dụng một cặp mồi thích
hợp với nấm thuộc Oomycete (Cooke và cộng sự, 2000), mồi xuôi (forward
primer) ITS6: 5’-GAA GGT GAA GTC GTA ACA AGG-3’, tại vị trí trong 18S
rDNA và mồi ngược (reverse primer) ITS7: 5’- AGC GTT CTT CAT CGA TGT
GC-3’, được định vị trên 5-8 S rDNA để khuếch đại.
Theo tác giả Ivors và cộng sự, 2004, kỹ thuật dựa trên phân tích đa hình
đoạn dài khuyếch đại (amplified fragment length polymorphism = AFLP) cũng
được áp dụng để nghiên cứu nấm Phytophthora. Vos et al., 1995 là người đầu tiên
2

sử dụng kỹ thuật đa hình đoạn dài khuyếch đại và hiện nay kỹ thuật này được sử
dụng nhiều nhất trong nghiên cứu đa dạng thực vật, nấm và vi khuẩn. AFLP là một
trong các kỹ thuật hiệu quả nhất khi nghiên cứu DNA fingerprinting và kỹ thuật
này kết hợp ưu điểm của RFLP (RE trên toàn bộ bộ gen) và PCR. Đặc điểm quan
trọng nhất của AFLP là khả năng đánh giá mức độ đa hình trên toàn bộ bộ gen hay
nói cách khác là kiểm tra đồng thời một cách ngẫu nhiên các sản phẩm từ nhiều
locus trên.
Theo tác giả Blair, 2008, các phân tích phân tử nhằm xác định cũng như
đánh giá mối quan hệ của các loài nấm Phytophthora chủ yếu dựa vào các vùng
liên gen ITS (internally transcribed spacers) của cụm gen rDNA. Các rDNA của
nấm Phytophthora cũng như của các sinh vật nhân thật (Eukaryote) được tổ chức
thành các đơn vị phiên mã. Mỗi đơn vị phiên mã có thể được lặp lại nhiều lần trên
bộ genome. Về cấu trúc, ở sinh vật nhân thật, các đơn vị phiên mã thường lặp lại
nhiều lần và kề nhau thành các cụm đơn vị phiên mã. Một đơn vị phiên mã gồm
các gen xếp theo thứ tự là 18S-5.8S-28S. Xung quanh vùng gen 5.8S là 2 vùng ITS
ký hiệu là ITS1 (ở đầu 5’) và ITS2 (ở đầu 3’) (Hình 1).

Hình 1. Sơ đồ minh họa các cụm gen rDNA của sinh vật nhân thật. Vùng ITS1
và ITS2 được chỉ bằng mũi tên.
Theo Duncan & Cooke, 2002, các vùng ITS do có tốc độ đột biến tương ứng
với tốc độ biến hóa loài (tiến hóa trung tính) nên có thể phân biệt mối quan hệ tới
mức loài, như đã được chứng minh đối với các loài nấm Phytophthora.
Nguyễn Văn Viết, 2002, sử dụng kỹ thuật dựa trên PCR dùng mồi tùy ý
(Random amplified polymorphic DNA= RAPD), xác định sự khác nhau giữa các
kiểu gen của nấm Phytophthora colocasiae từ 5 mẫu phân lập trên cây khoai sọ ở
Việt Nam.

3

Theo Phạm Ngọc Dung và Hà Viết Cường, 2010, tác nhân gây bệnh chết
nhanh hồ tiêu ở Đăk Nông do nấm Phytophthora tropicalis gây nên dựa vào
phương pháp ITS , sử dụng mồi ITS5 và ITS4.
3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.1. Nội dung
- Chạy PCR để nhân dòng
- Dòng hoá sản phẩm PCR
- Giải trình tự sản phẩm PCR
- Phân tích cây phân loại
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Chuẩn bị nguồn nấm
Các mẫu Phytophthora được phân lập từ quả ca cao bị thối đen thu thập tại
tỉnh Đăk Lăk, Bình Phước và Đăk Nông. Tác nhân gây bệnh được phân lập trên
môi trường chọn lọc Phytopthora PSM (Phytophthora selective medium) là V8
agar chứa rifarmpicin, hymexazol và pimaricin và sau đó được cấy truyền sang
môi trường PDA (potato dextrose agar) hoặc V8 agar.
3.2.2. Tách chiết ADN
ADN được chiết theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium
bromide) của Doyle & Doyle (1987). Nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA ở
nhiệt độ 250C 3 - 7 ngày. Khoảng 100 mg sợi nấm được chuyển sang ống
effpendorf 1,5 mL và được rửa với 1 ml nước cất. Sợi nấm được nghiền trong ống
effpendorf với 500 µl đệm chiết (2 M NaCl, 25 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, 2
% polyvinyl pyrrolidone và 2 % CTAB) dùng chày nhựa nhỏ. Dịch nghiền được
chiết 2 lần với chlorophorm:isoamyl alcohol (24:1). Cặn ADN được rửa 2 lần bằng
ethanol 70 %, làm khô trong không khí 30 phút và được hòa trong 50 µl đệm TE.
Dịch ADN được giữ ở -20 OC.
3.2.3. Chạy phản ứng PCR
Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) đã được sử dụng để nhân toàn bộ
vùng ITS của nấm Phytophthora. Các phản ứng PCR được thực hiện trong tube 0,5
ml với tổng thể tích phản ứng 25 µl chứa 2,5 µl đệm DreamTaq PCR X10

(Fermantas), 0,5 µl dNTPS (10 mM môi loại A, T, G, C, Roche), 0,5 µl mỗi loại
mồi (đều đươc chuẩn bị ở nồng độ 20 μM), 0,25 μL DreamTaq polymerase (5U/µl,
Fermentas) và 0,5 µl DNA. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100
(MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94 OC trong 5 phút; tiếp
theo là 35 chu trình PCR (biến tính ở 94 OC trong 40 giây, gắn mồi ở 50OC trong

4


45 giây và tổng hợp sợi ở 72OC trong 1 phút). Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở
72OC.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % được chuẩn bị bằng đệm
TAE và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide. Gel được chạy trên thiết bị điện di là
Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE ở điện thế 100 V trong 30 phút. Bản gel
được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp bằng máy ảnh số.
3.2.4. Dòng hóa và giải trình tự
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLink TM
Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm
lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di agarose. Sản phẩm PCR tinh
chiết được nối vào vector pTZ57R/T của kít dòng hóa InsTA Clone (Fermentas)
theo hướng dẫn của nhà sản xuất và được biến nạp vào tế bào vi khuẩn
Escherichia coli dòng XL1-Blue. Plasmid được tinh chiết dùng kít tinh chiết
plasmid (Bionier). Các dòng vi khuẩn tái tổng hợp được kiểm tra sự có mặt của
vector tái tổ hợp đúng bằng PCR dùng mồi ITS. Plasmid tái tổ hợp được giải trình
tự cả 2 chiều dùng kít BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems) trên máy PCR. Sản phẩm giải trình tự được tinh chiết, làm khô và gửi
đọc tại Viện Công nghệ sinh học tại Hà Nội. Trình tự nucleotide được biên tập và
lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene).
3.2.5. Phân tích trình tự chuỗi ADN
Đầu tiên, các chuỗi mẫu được xác đinh danh tính khi so sánh với các chuỗi

đã công bố từ trước nhờ phần mềm tìm kiếm BLAST tại NCBI (the National
Center for Biotechnology Information ( />Phân tích chuỗi và xây dựng cây phả hệ được thực hiện với các phần mềm BioEdit
7.0, ClustalX1.83 và MEGA 4.0
4. Kết quả nghiên cứu
4.1. Đặc điểm hình thái
Đặc điểm hình thái là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong việc phân loại
và giám định. Tất cả 20 mẫu nấm đã được kích thích sinh bào tử nhằm quan sát
đặc điểm hình thái của bào tử nang (sporangium), cành bào tử nang
(sporangiophore), bào tử hậu (chlamydospore) (Bảng 1). Các quan sát hinhfthias
cho thấy:
• Bào tử nang (sporangium) của tất cả các mẫu nấm đều có núm, một số mẫu
nấm có bào tử nang 2 núm. Hình dạng bào tử nang rất biến động: hình cầu,
hình trứng tới hình ellip (hình 1).

5


• Bào tử nang hình thành trên cành bào tử nang (sporangiophore) dạng sym
(Hình 2).
• Hầu hết các mẫu đều hình thành bào tử hậu (chlamydospore) ở mức độ khác
nhau. Bào tử hậu có thể hình thành ở đỉnh hoặc giữa sợi nấm (Hình 3).

Hình 1. Đặc điểm của bào tử nang: hình cầu, trứng, ellip, bất qui tắc, bào tử nang
có hai núm (minh họa từ trái sang phải, CCĐL 3.6, CCĐL 15.1, CCĐL 13,
CCĐL 5.1, CCĐL11.4)

6


Hình 2: Bào tử nang hình thành trên cành bào tử mọc dạng sym (minh họa mẫu

CĐL1.3)

Hình 3: Bào tử hậu hình thành ở đỉnh sợi (mẫuCBP 10.1)
và ở giữa sợi (mẫu CCBP 5)

Các đặc điểm hình thái của các mẫu nấm Phytophthora trên caccao nhìn chung
giống với các nấm đã công bố trên cacao như P. capsici (nhóm 2), P. palmivora,
P. megakarya (nhóm 4).
Thiếu các đặc điểm liên quan tới sinh sản hữu tính như hình thái bao đực
(antheridium), bao trứng (oogonium), bào tử trứng (oospore) và cách giao phối dẫn
tới không thể định danh loài các mẫu Phytophthora trên cacao.

7


Bảng 1. Đặc điểm hình thái các mẫu Phytophthora phân lập từ cacao
Stt

Mẫu

Bào tử hậu (Đường kính (µm)/
vị trí hình thành

Cành bào
tử nang

Bào tử nang (sporangium)
Hình dạng

Dài (µm)

Rộng (µm)

Núm

Lỗ thoát động
bào tử (µm)

23-65

16-27

1 núm

5

20-37

17-32

1 núm

5

1

CCĐL 1.3

19 ( mọc ở đầu sợi)

Dạng sym

2

CCĐL 2.3

Hiếm, 27( mọc ở giữa sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng, ellip, bất qui
tắc
Cầu, trứng

3

CCĐL 2.4

25 - 40 (mọc ở đầu, giữa sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng, ellip

22-50

20-32

1 - 3 núm

5

4

CCĐL 3.6

25 - 32 (mọc ở đầu, giữa sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng

22-55

20-42

1 núm

5

5

CCĐL 4.2

20 - 30 (mọc ở đầu, giữa sợi)

Dạng sym

22-45

17-35

1 núm

5

6

CCĐL 5.1

17 - 25 (mọc ở đầu sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng, ellip
Cầu, trứng, ellip,
bất quy tắc

25-47

20-40

1 núm

5

7

CCĐL 11.4

Dạng sym

Cầu, trứng

22-57

17-52

1 - 2 núm

5

8

CCĐL 13.2

25 -27 (mọc ở đầu, mọc nhiều ở giữa
sợi)
25 - 30 (mọc ở giữa sợi)

Dạng sym

Trứng, cầu

25-59

21-51

1 núm

5

9

CCĐL 15.1

22 - 25 (mọc ở đầu, giữa sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng, ellip

25-52

20-37

1 - 2 núm

2.5 – 5

10

CCĐL 16.1

20 - 25(mọc ở đầu sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng

20-42

15-30

1 núm

5

11

CCĐN 3

19 - 23 (mọc ở đầu sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng, ellip

27-57

17-30

1 núm

5

12

CCĐN 4

15 - 17 (mọc ở đầu sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng, ellip

22-45

15-30

1 núm

5

13

CCĐN 7

25 - 32 (mọc ở đầu sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng

27-60

22-40

1- 2 núm

5

14

CCĐN 8

27 - 35 (mọc ở đầu sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng

27-50

12--37

1- 2 núm

5

15

CCBP 2

20 - 32 (mọc ở đầu sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng

27-55

20-40

1- 2 núm

5

16

CCBP 3

14 - 21(mọc ở đầu sợi)

Dạng sym

18-48

15-31

1- 2 núm

4—5

17

CCBP 5

21 - 32 (mọc ở đầu, giữa sợi)

Dạng sym

27-50

22-40

1 núm

5

18

CCBP 10.1

30 - 40(mọc ở đầu sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng
Hình thành ít bào tử
Cầu, trứng
Cầu, trứng, ellip

23-60

17-40

1 núm

5

19

CCBP 10.2

17 - 32 (mọc ở đầu, giữa sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng, ellip

20-40

12--40

1 núm

5

20

CCBP 10.3

17 - 30 (mọc ở đầu, giữa sợi)

Dạng sym

Cầu, trứng, ellip

27-47

17-38

1 núm

5

8


PCR và giải trình tự vùng ITS
Tất cả 20 mẫu nấm được chiết DNA, thực hiện PCR (Hình 4) và giải trình
tự. Sau khi lắp ráp, tất cả 20 mẫu đều có kích thước đoạn đọc được từ 729 – 782,
tương ứng với sản phẩm PCR (Bảng 2, Phụ lục 1). Đoạn đọc được của tất cả 20
mẫu đều chứa vùng ITS 4 và ITS 5 cần cho phân tích.

Hình 4. PCR nhân vùng ITS bằng cặp mồi ITS4 và ITS5 của các mẫu Phytophthora
phân lập từ ca cao. M là thang DNA 1 kb (GeneRuler 1 kb, Fermentas) với băng tham
khảo 750 bp được chỉ bằng mũi tên. Các giếng: 1 (CCBP3), 2 (DL3.6), 3 (DL11.4), 4
(DL4.2), 5 (CCDN4), 6 (CCBP2), 7 (DL15.1), 8 (CCBP10.1), 9 (CCBP5), 10
(CCDN7), 11 (CCDN3), 12 (CCDN8), 13 (DL5.1), 14 (DL16.1), 15 (DL2.4), 16
(DL2.3), 17 (CCBP10.3).

9


Bảng 2. Kết quả giải trình tự các mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao
STT
1
2

3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32

33
34
35
36
37
38
39
40

Mẫu
CCBP10.1
CCBP10.1
CCBP10.2
CCBP10.2
CCBP10.3
CCBP10.3
CCBP2
CCBP2
CCBP3
CCBP3
CCBP5
CCBP5
CCDN3
CCDN3
CCDN4
CCDN4
CCDN7
CCDN7
CCDN8
CCDN8

DL1.3
DL1.3
DL11.4
DL11.4
DL13.2
DL13.2
DL15.1
DL15.1
DL16.1
DL16.1
DL2.3
DL2.3
DL2.4
DL2.4
DL3.6
DL3.6
DL4.2
DL4.2
DL5.1
DL5.1

Mã Sequencing

Mồi giải
trình tự

CCBP10-1_ITS4
13COZAA003
13D1ZAB010
13D1ZAB011

CCBP10-3_ITS4
13COZAA004
CCBP2_ITS4
13COZAA000
CCBP3_ITS4
13COZAA001
CCBP5_ITS4
13COZAA002
CCDN3_ITS4
13COZAA005
13D1ZAB008
13D1ZAB009
CCDN7_ITS4
13COZAA006
CCDN8_ITS4
13COZAA007
13D1ZAB004
13D1ZAB005
DL11-4_ITS4
13COZAA013
13D1ZAB006
13D1ZAB007
DL15-1_ITS4
13COZAA014
DL16-1_ITS4
13COZAA015
DL2-3_ITS4
13COZAA008
DL2-4_ITS4
13COZAA009

DL3-6_ITS4
13COZAA010
DL4-2_ITS4
13COZAA011
DL5-1_ITS4
13COZAA012

ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4

ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5
ITS4
ITS5

Chất lượng
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải

Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái
Tốt 1/4 bên phải
Tốt 3/4 bên trái

Sản phẩm
cuối (bp)
781
782
750
729
781
756
757
776
792
748
783
710
775
736
764
782
779
761
773
751

Chúng tôi cũng nhận thấy đối với tất cả 20 mẫu được giải trình tự đều có
đặc điểm giống nhau như sau:
10


• Tất cả 20 mẫu được giải trình tự với mồi ITS5 đều có khoảng 650
nucleotide phía bên trái có chất lượng rất tốt, phần còn lại có chất lượng rất

xấu (nhiễu).
• Tất cả 20 mẫu được giải trình tự với mồi ITS4, trái lại, đều có khoảng 100
nucleotide phía bên phải có chất lượng rất tốt, phần còn lại có chất lượng
rất xấu (nhiễu).
• Đối với tất cả 20 sản phẩm PCR, vị trí phân chia 2 vùng có trình tự chất
lượng tốt – xấu của mỗi cặp giải trình đều giống nhau như minh họa đối
với mẫu Cacao-BB5 ở Hình 4.
Hiện tượng này xuất hiện khi giải trình tự trực tiếp một sản phẩm PCR mà
trên sản phẩm này chứa vị trí có trình tự không đồng nhất. Hậu quả, DNA
polymerase sẽ không thể đọc đúng trình tự tính từ phái hạ lưu của vị trí không
đồng nhất.
Không giống như nấm túi, nấm noãn oomyces như Phytophthora có bộ gen
lưỡng bội. Vị trí không đồng nhất có thể được xem là một locus dị hợp tử, hậu
quả của sinh sản hữu tính của một loài Phytophthora nhóm dị tản (Heterothalic).

> Cacao-PB5
ATTACCACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAAAACTTAGTTGGGGGTCTCT
11


TTCGGCGGCGGCTGCTGGCTTCATTGCTGGCGGCTGCTGTTGGGAGAGCTCTATCATG
GCGAGCGTTTGGGCTTCGGTCTGAACTAGTAGCTTTTTTAAACCCATTCTTTATAACT
GATTATACTGTAGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGTG
GATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAAT
TGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCC
TGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGTTTTCTTCCTTCCGTGTA
GTCGGTGGTGGATGTGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGCTGGTCTTCGGATCGGCTGT
GAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCCAAAAGCGTGGCGTTGCT
GATTGTGGAGGCTGCTTGCGTAGCCAGTCTGGCGACCAGTTTGTCTGCTGTGGCGTTA
ATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGAA

TATTTCTTCAGCTGTGGTGGTATGARTTGGTGAACCGTAGCTATGTGAGCTTGGCTTT
TGAATTGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGTCGATCC
AT

Hình 4. Minh họa vị trí xuất hiện locus dị hợp tử của sản phẩm giải trình tự mẫu
Cacao-BP5. Hướng giải trình tự của mỗi mồi được chỉ bằng mũi tên. Hình ngôi
sao đánh dấu vị trí locus dị hợp tử. Vị trí tương ứng trên trình tự cuối cùng của
sản phẩm PCR được đóng khung.

2. Tìm kiếm trình tự tương đồng trên Gen Bank và Phytophthora.ID
Dựa trên trình tự mẫu thu được, chúng tôi tìm kiếm trên cả 2 cơ sở dữ liệu
GenBank và Phytophthora.ID. Kết quả tìm kiếm cho thấy tất cả 10 mẫu
Phtophthora Việt Nam gần gũi nhất với một loài duy nhất là Phytophthora
palmivora với mức đồng nhất trình tự 99 % trên toàn bộ đoạn so sánh (Bảng 3).

12


Bảng 3. Xác đinh danh tính loài của các mẫu Phytophthora ca cao dựa trên
tìm kiếm cơ sở dữ liệu
STT

Mẫu

1
2
3
4
5
6

7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

CCBP10.1
CCBP10.2
CCBP10.3
CCBP2
CCBP3
CCBP5
CCDN3
CCDN4
CCDN7
CCDN8
DL1.3
DL11.4
DL13.2
DL15.1
DL16.1

DL2.3
DL2.4
DL3.6
DL4.2
DL5.1

GenBank & Phytophthora-ID
% đoạn so
Mức đồng nhất
Loài gần gũi nhất
sánh
trình tự (%)
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99

Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99

Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99
Phytophthora palmivora
100
99

3. Phân tích phả hệ
Phân tích phả hệ dùng các trình tự mẫu thu được và các trình tự của loài
Phytophthora gần gũi nhất được xác định thông qua tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu
và một số loài Phytophthora đại diện khác cũng cho kết quả tương tự (Hình 5).
Tất cả 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao Việt Nam phân nhóm chặt
chẽ cùng với các mẫu P. palmivora trên GenBank và hình thành một cụm loài
riêng biệt. Thậm chí loài P. megakarya, đã được công bố gây hại trên ca cao và
thuộc cùng nhóm phân loại (nhóm 4) với P. palmivora cũng hình thành một
nhóm độc lập với cụm loài này.
13


76
53

87

P. palmivora-HQ237477
P. palmivora-AM422704
Cacao-PB2
Cacao-PB10.1
Cacao-PB10.2
Cacao-PB3
P. palmivora-GQ924478
61 P. palmivora -HQ237480
P. palmivora -GU111660
Cacao-DL11.4
Cacao-DL13.2
Cacao-PB10.3
P. palmivora -GU111663
P. palmivora -GU111661
60 P. palmivora -GQ131800
Phytophthora
CaCao-DN3
palmivora
Cacao-DN8
Cacao-DL2.3
Cacao-DL2.4
Cacao-DL1.3
Cacao-DL5.1
Cacao-DL4.2
CaCao-DN4
Cacao-DL3.6
Cacao-DL16.1
Cacao-DN7
Cacao-DL15.1
P. palmivora -AF266780

98 P. palmivora -HQ643146
P. palmivora -GQ398157
Cacao-PB5
P. megakarya-HQ261611
P. nicotiana-AF266776
P. megasperma-HQ643281
P. citricola-GU259136
P. tropicalis-DQ464057-T
87
P. capsici-DQ464056-T
50
75 P. colocasiae-HQ261539
54
P. meadii-AY251649
100 P. botryosa-AF266784
57 P. citrophthora-AF266785
P. katsurae-FJ172258
P. hevea-AF266770
100

0.02

Hình 5. Cây phả hệ không rễ dựa trên chuỗi ITS cho thấy mối quan hệ của 20 mẫu Phytophthora
phân lập từ ca cao ở Việt Nam với các loài Phytophthora. Mã truy cập (Accesion number) của các
mẫu GenBank được chỉ rõ. Thanh bar trình bày khoảng cách di truyền. Các số trên nốt là giá trị
boostrap tính theo % (500 lần lặp) theo phương pháp NJ (Neighbour Joining) . Mẫu Việt Nam
được chỉ rõ bằng chấm đen.

14

5. Kết luận và đề nghị
5.1. Kết luận
•

Đã giải trình tự toàn bộ vùng ITS của 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca
cao.

• Phân tích trình tự và phả hệ đã xác định được tất cả 20 mẫu này đều thuộc
loài P. palmivora.
• Phân tích trình tự cũng cho thấy có sinh sản hữu tính trong quần thể P.
palmivora hại cac cao ở Việt Nam.
5.2. Đề nghị
Các loài này cần lây nhiễm nhân tạo để xác định tác nhân gây bệnh thối
đen quả ca cao.
Người viết báo cáo

Chủ nhiệm đề tài

TS. Hà Viết Cường

ThS. Nguyễn Hồng Tuyên

15


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Drenth, A. and Guest, D.I. (2004), Diversity and Management of Phytophthora
in Southeast Asia, Australian Centre for International Agricultural Research
Canberra, 235 pp.

2. Drenth, A. and Sendall, B. (2004), “Isolation of Phytophthora from infected
Plant Tisue and soil, and Principles of Species Identification”. In “Diversity and
Management of Phytophthora in Southeast Asia”, Australian Centre for
International Agricultural Research Canberra, pp. 94 – 102.
3. Duncan, J., and Cooke, D. (2002). Identifying, diagnosing and detecting
Phytophthora by molecular methods. Mycologist, Vol.16, Part 2: 59-66.
Erwin, D.C. and Riberrio O.K (1996), “Phytophthora diseases worldwide”, St
Paul, Minnessota, USA, American Phytopathological Society Press, 562 pp.
4. Guest, D.I.,Pegg, K.G.and Whiley, A.W.(1995), “Control of Phytophthora
diseases of tree crops using trunk-injected phosphonates”, Horticultural Reviews,
17, p. 299 - 330.
5. Keane, P.J (1992), Disease of pest and cocoa: an overview. In: Keane, P.J. and
Putter, C.A., ed., Cocoa pest and disease management in Southeast Asia and
Australasia. Rome, Italya, Food and Agriculture Organization of the United
Nations, FAO Plant Production and Protection Paper No.112.

16