Tách tế bào từ mô lách chuột

Hoàng Nguyễn Công Trình
Đặt vấn đề
Để nuôi cấy sơ cấp hay thứ cấp tế bào động vật thì việc đầu tiên phải
làm là tách rời các tế bào ra khỏi mô và giữa các tế bào với nhau. Nuôi cấy
sơ cấp là phương pháp sử dụng các tế bào được tách từ các mảnh mô và
trước lần cấy truyền đầu tiên. Quy trình được tiến hành bắt đầu từ việc thu
nhận các mảnh mô. Sau đó các mảnh mô được xử lý để loại bỏ vi khuẩn,
nấm và các thành phần không mong muốn khác. Tiếp theo chúng được
huyền phù tế bào đơn trước khi nuôi cấy. Nuôi cấy thứ cấp được tiến hành
sau khi tế bào được tạo dòng từ nuôi cấy sơ cấp. Các tế bào động vật trong
khối mô liên kết chặt chẽ với nhau và với ECM nhờ các cầu nối protein hình
thành giữa các tế bào với nhau. Để tách rời các tế bào trong khối mô, người
ta thường dùng các enzyme protease như trypsin. Mô là tập hợp tế bào được
tổ chức tinh vi và đặc trưng, chúng liên kết thành một khối thống nhất, thông
qua các cầu nối gian bào. Tách các tế bào ra khỏi mô cần phải phá bỏ những
cầu nối này, nhưng không gây tổn thương cho tế bào. Người ta có thể dùng
cơ học hay enzyme cắt. Trong bài báo cáo này, tôi kết hợp cả hai để tăng
hiệu quả tách. Vì theo tôi nếu dùng cơ học thì hiệu quả thấp hơn enzyme,
nhưng nếu dùng enzyme thì tác dụng của enzyme lên tế bào là rất lớn. Vì
vậy, việc kết hợp này để giảm thời gian xử lý bằng enzyme kết hợp với cơ
học tăng khả năng tách tế bào.
Hoàng Nguyễn Công Trình
Tổng quan
Trong bài báo cáo này, tôi dùng trypsin để tách tế bào từ mô lách chuột. Mô
được cắt nhỏ và khuấy từ ở 37
o
C trong 30 phút với trypsin. Pha loãng và
đem nhuộm với trypan blue, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Dựa
trên kết quả trong buồng đếm hồng cầu thì tỉ lệ tế bào sống không cao.
Nhưng đây cũng là kết quả bước đầu đạt được, tế bào đơn được tách còn
sống và có khả năng nuôi cấy sơ cấp và thao tác được cách nhuộm tế bào

sống. Phân biệt được tế bào sống và tế bào chết.

Hoàng Nguyễn Công Trình
Vật liệu và phương pháp
1. Vật liệu
- Chuột nhắt trắng
- Cồn 70
o
- Dung dịch PBS
- Trypsin-EDTA 0,25%
- Erlen 250ml, erlen 50ml
- Becher 50ml
- Kẹp cong, kẹp thẳng
- Kéo thẳng, kéo cong.
- Đĩa Petri đường kính 9-10cm
- Cá khuấy từ
- Ống ly tâm loại 10ml
- Buồng đếm hồng cầu, Lamelle
- Đầu tip 1ml, đầu tip 0,1ml.
- Pipetteman.
- Bình Flask 25 cm
2
.
- Khay rác.
- Kim tiêm 1ml.
2. Phương pháp:
Giết chuột và mổ chuột:
- Đặt chuột lên giá, giết chuột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ ( tay phải
cầm đuôi chuột, ngón cái và ngón trỏ bàn tay trái kẹp chặt gáy chuột,
tay phải kéo 1 lực mạnh về phía sau tới khi nghe tiếng rắc ).

- Đặt chuột nằm ngửa trên khay sạch ( lưng tiếp xúc với khay).
- Sát trùng vùng da bụng chuột bằng cồn 70
o
.
- Cắt ngang bụng chuột một đường ngắn chừng 1-2 cm, tiến hành kéo
hai vùng da hai bên vết cắt về phía hai đầu và đuôi chuột, tiếp tục kéo
mạnh để tuột hết lớp da bao phủ hai chân chuột đến gót chân.
Thu nhận mô lách:
- Vị trí lách trong cơ thể: là một cơ quan nằm ở phần trên bên trái trong
ổ bụng, tiếp giáp với cơ hoành, tụy, dạ dày và thận trái, được hệ thống
dây chằng gắn vào màng bụng.
Hoàng Nguyễn Công Trình
- Thu nhận mô lách: mổ mở ổ bụng chuột ra, khi các cơ quan của phần
bụng lộ ra, tiến hành cắt bỏ gan, bao tử ta sẽ thu được lách, tiếp đó là
loại mỡ và rửa bằng PBS. Cắt thành những khối nhỏ trong PBS.
2.3 Quy trình thu nhận tế bào lách từ mô lách.
- Chuyển mô vào đĩa Petri có chứa PBS vô trùng và rửa.
- Chuyển sang đĩa Petri thứ 2, cắt bỏ những phần mô không cần như mô
mỡ.
- Sau khi rửa sạch mẫu, dùng kẹp chuyển mô vào erlen 50ml đã chứa
sẵn Trypsin 0,25%, dùng kéo cắt vụn mẫu mô thành những khối 3
mm
3
.
- Dùng kẹp bỏ cá từ vào khuấy từ : 200 vòng /phút trong 30 phút, ở
37
o
C.
- Thu phần dịch nổi và đem ly tâm với tốc tộ khoảng 1000v/ph trong 10
phút. Sau đó bỏ phần dịch trong bên trên hòa cặn với 1ml PBS.

- Chuẩn bị giếng để nhuộm trypan blue: hút 50μl Trypan blue vào
giếng, sau đó hút 10μl từ giếng 50μl cho vào giếng khác.
- Hút 40μl dịch tế bào huyền phù cho vào giếng nhuộm 10μl trypan
blue. Huyền phù sau đó hút 5μl dịch nhuộm cho vào buồng đếm hồng
cầu. Đếm số lượng tế bào sống và số lượng tế bào chết trong 25 ô. Tế
bào sống là tế bào sau khi nhuộm nhìn dưới kính hiển vi chiết quang
không màu, còn tế bào chết là những tế bào ăn màu xanh đen đậm.
- Thao tác cho mẫu vào buồng đếm hồng cầu:
Buồng đếm được làm sạch và sấy khô. Đậy lamelle lên 2 khu vực có kẻ ô
đếm.
Đưa buồng đếm lên kính hiển vi, dùng thị kính 10 và vật kính 10 điều
chỉnh để tìm ô đếm.
Đặt buồng đếm lên mặt phẳng, dùng pipet man hút 5μl cho vào buồng
đếm, dung dịch sẽ theo mao dẫn lan khắp ô đếm.
Để yên buồng đếm 1 phút để tế bào lắng xuống nhưng không nên để mẫu
bị khô, sau đó đưa lên khí hiển vi đếm với vật kính 40.
Trên buồng đếm Neubauer: Đúng ra phải đếm 5 ô trung bình( 4 ô ở 4 góc
và 1 ô ở giữa). Trong mỗi ô trung bình đếm cả 16 ô nhỏ.Trong mỗi ô
nhỏ , đếm tất cả những tế bào nằm gọn trong ô, cạnh trên và cạnh trái.
Như vậy, biết được số tế bào trong 80 ô nhỏ(mỗi ô là 1/400mm
2
)
Công thức tính là: