Tình hình nhiễm porcine circovirrus type 2(PCV2) ở đàn lợn nuôi tại một số tỉnh mièn bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

ðINH ðỨC CẢNH

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
-------

-------

ðINH ðỨC CẢNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

TÌNH HÌNH NHIỄM PORCINE CIRCOVIRUS
TYPE 2 (PCV2) Ở ðÀN LỢN NUÔI TẠI MỘT SỐ
TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành : Thú y
Mã Số

: 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: TS. HUỲNH THỊ MỸ LỆ

HÀ NỘI - 2012

HÀ NỘI - 2012


LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi, kết quả nghiên
cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học
vị nào.
Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñã
ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñẫ ñược chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 15 tháng 8 năm 2012
Tác giả luận văn
Học viên

ðinh ðức Cảnh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện ñề tài, ngoài sự nỗ lực của
bản thân tôi còn nhận ñược rất nhiều sự quan tâm, giúp ñỡ của các tập thể và
cá nhân.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường ðại học Nông
Nghiệp Hà Nội, Viện ðào tạo sau ñại học, Ban chủ nhiệm khoa Thú y ñã tạo
ñiều kiện cho tôi trong thời gian học tập và làm luận văn tốt nghiệp.
ðặc biệt, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Huỳnh
Thị Mỹ Lệ - giảng viên Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y,
trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã dành nhiều thời gian chỉ dẫn và giúp
ñỡ tận tình ñể tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ tận tình của các thầy cô trong Bộ
môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn
thành công việc trong quá trình thực tập của mình.

Tôi luôn biết ơn tới gia ñình, bạn bè, những người luôn ñộng viên,
giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình
thực hiện ñề tài này.
Hà Nội, ngày 15 tháng 8 năm 2012
Tác giả luận văn
Học viên

ðinh ðức Cảnh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ii


CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
ADN

: Axit Deoxyribose Nucleotide

ELISA

: Enzym Linked Immunosorbent Assay

nPCR

: Nested Polymerase Chain Reaction

ORF

: Open Reading Frame

PBS

: Phosphate – Buffered - Saline

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PCV

: Porcine CircoVirus

PCV1

: Porcine CircoVirus type 1

PCV2

: Porcine CircoVirus type 2

PCVAD

: Porcine CircoVirus Associated Disease

PDNS

: Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome

PK15

: Pig Kidney 15

PMWS

: Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome

PNP

: Proliferating Necrotizing Pneumonia

PRDC

: Porcine Respiratory Disease Complex

PRRS

: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

TAE buffer

: Tris-Acetate Etilendiamin Tetraaxetic Axit buffer

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii


MỤC LỤC
LỜI CAM ðOAN ...................................................................................0

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................... ii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN.............................................iii
MỤC LỤC .............................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG…………………………...…………….……………vii
DANH MỤC HÌNH………………………………………….......……..….viii
PHẦN 1 : MỞ ðẦU................................................................................1
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................4
I. GIỚI THIỆU VỀ PCV2 VÀ BỆNH DO PCV2 GÂY RA .......................4
1.1. Một vài nét về PCV2 .........................................................................4
1.1.1. Phân loại ........................................................................................4
1.1.2. Hình thái, cấu trúc ..........................................................................5
1.1.3. Tính chất nuôi cấy ..........................................................................7
1.1.4. Sức ñề kháng..................................................................................7
1.2. Bệnh do PCV2 gây ra ........................................................................8
1.2.1. Loài vật mắc bệnh ..........................................................................8
1.2.2. Phương thức truyền lây...................................................................8
1.2.3. Cơ chế sinh bệnh ............................................................................9
1.3. Triệu chứng và bệnh tích ................................................................. 10
1.3.1. Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (PMWS).............................. 11
1.3.2. Hội chứng viêm da và viêm thận (PDNS) ...................................... 13
1.3.3. Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn (PCV2 – Associated Reproductive Failure)... 15
1.3.4. Hội chứng rối loạn hô hấp ở lợn (PCV2 – Associated Respiratory Disease)..15
1.3.5. Hội chứng viêm ruột ở lợn (PCV2 – Associated Enteritis) ............. 16

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iv


1.3.6. Hiện tượng nhiễm PCV2 thể cận lân sàng (PCV2 subclinical infection) .. 17

1.4. Chẩn ñoán ....................................................................................... 17
1.4.1. Chẩn ñoán lâm sàng...................................................................... 17
1.4.2. Chẩn ñoán khẳng ñịnh .................................................................. 18
1.5. Phòng bệnh ..................................................................................... 20
1.5.1. Vệ sinh phòng bệnh ...................................................................... 20
1.5.2. Phòng bệnh bằng vacxin ............................................................... 21
1.6. ðiều trị ........................................................................................... 23
II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ PCV2
VÀ BỆNH DO PCV2 GÂY RA.............................................................. 23
2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................... 23
2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................... 25
PHẦN 3: NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
.............................................................................................................. 30
3.1. Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 30
3.2. ðịa ñiểm nghiên cứu ....................................................................... 30
3.3. Nguyên liệu..................................................................................... 30
3.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 31
3.4.1. Phương pháp tính toán dung lượng mẫu ........................................ 31
3.4.2. Phương pháp thu thập mẫu huyết thanh, mẫu bệnh phẩm ............... 31
3.4.3. Phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể kháng PCV2 .... 31
3.4.4. Phương pháp nested PCR chẩn ñoán PCV2 trong bệnh phẩm............. 35
3.4.5. Phương pháp phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15 ............ 37
3.4.6. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang xác ñịnh PCV2 trong môi
trường tế bào ......................................................................................... 39
3.4.7. Phương pháp xử lý số liệu............................................................. 40

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 41
4.1. Kết quả xác ñịnh tỷ lệ lưu hành huyết thanh kháng PCV2 ở ñàn lợn
nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam ................................................. 41
4.1.1. Kết quả xác ñịnh tỷ lệ lưu hành kháng thể kháng PCV2 ở ñàn lợn
nuôi tại các ñịa phương .......................................................................... 43
4.1.2. Kết quả xác ñịnh tỷ lệ lưu hành kháng thể kháng PCV2 ở ñàn lợn có
quy mô khác nhau .................................................................................. 46
4.1.3. Kết quả xác ñịnh tỷ lệ lưu hành kháng thể kháng PCV2 ở ñàn lợn
thuộc các lứa tuổi................................................................................... 48
4.1.4. Kết quả xác ñịnh tỷ lệ lưu hành kháng thể kháng PCV2 ở ñàn lợn có
hoặc không có triệu chứng của bệnh liên quan ñến PCV2........................ 51
4.2. Kết quả phân lập PCV2 ở ñàn lợn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam... 54
4.3. Kết quả chẩn ñoán, xác ñịnh sự có mặt của PCV2 ở ñàn lợn nuôi tại
một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.............................................................. 56
4.3.1. Kết quả xác ñịnh sự có mặt của PCV2 trong mẫu bệnh phẩm......... 56
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ................................................... 61
4.1. Kết luận .......................................................................................... 61
4.2. ðề nghị ........................................................................................... 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................... 63

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cấu trúc PCV2..........................................................................5
Hình 2.2. Lợn mắc chứng gày còm ......................................................... 12
Hình 2.3. Hạch bẹn nông sưng, xuất huyết .............................................. 12

Hình 2.4. Viêm dính màng phổi với thành lồng ngực .............................. 12
Hình 2.5. Hạch màng treo ruột bị sưng, xuất huyết.................................. 12
Hình 2.6. Thận bị sưng, xuất huyết và có ñiểm hoại tử ............................ 13
Hình 2.7. Phổi bị viêm ở các mức ñộ khác nhau...................................... 13
Hình 2.8. Lợn bị viêm da........................................................................ 14
Hình 2.9. Lợn mắc chứng gày còm và bị viêm da.................................... 15
Hình 2.10. Lợn có triệu chứng rối loạn hô hấp ........................................ 16
Hình 2.11. Lợn bị gày còm, tiêu chảy ..................................................... 17
Hình 4.4. Máy ñọc ELISA xác ñịnh kháng thể kháng PCV2 .................... 53
Hình 4.5. Phản ứng ELISA xác ñịnh kháng thể kháng PCV2 ................... 54
Hình 4.6. Kết quả nested PCR trên mẫu ADN dương chuẩn và mẫu bệnh phẩm.. 56

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Bảng so sánh các khung ñọc mở của PCV1 và PCV2.................7
Bảng 2.2. Những nghiên cứu về PCV2 trên thế giới ................................ 28
Bảng 3.1. Sơ ñồ bố trí thí nghiệm ........................................................... 32
Bảng 3.2. Trình tự cặp mồi dùng trong chẩn ñoán và xác ñịnh genotype PCV2 . 35
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR chẩn ñoán và ñịnh type PCV2 .... 37
Bảng 4.1. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu huyết thanh xác ñịnh kháng thể
kháng PCV2 .......................................................................................... 41
Bảng 4.2. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu huyết thanh xác ñịnh ............ 42
Bảng 4.3. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu huyết thanh xác ñịnh ............ 42
Bảng 4.4. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu huyết thanh xác ñịnh ............ 42
Bảng 4.5. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu huyết thanh xác ñịnh ............ 43
Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra kháng thể kháng PCV2 ở ñàn lợn nuôi tại các ñịa. 44

Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra kháng thể kháng PCV2 ở ñàn lợn có quy mô
khác nhau .............................................................................................. 46
Bảng 4.8. Kết quả kiểm tra kháng thể kháng PCV2 ở các lứa tuổi lợn...... 48
Bảng 4.9. Kết quả kiểm tra kháng thể kháng PCV2 ở ñàn có và không .... 51
Bảng 4.10. Kết quả phân lập PCV2......................................................... 55
Bảng 4.11. Kết quả nested PCR xác ñịnh sự có mặt của PCV2 trong mẫu 57
Bảng 4.12. So sánh tỷ lệ dương tính PCR ở nhóm lợn khỏe mạnh và nhóm
lợn có triệu chứng bệnh.......................................................................... 59

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

viii


PHẦN 1

MỞ ðẦU
ðối với ngành công nghiệp chăn nuôi lợn, Porcine circovirus type 2
(PCV2) là nguyên nhân khởi phát gây các hội chứng liên quan tới PCV2
(Porcine circovirus type 2-associated disease, PCVAD) làm thiệt hại lớn về kinh
tế, ñặc biệt là chăn nuôi theo quy mô công nghiệp với mật ñộ chăn nuôi dày, môi
trường không ñược kiểm soát tốt cũng như các biện pháp quản lý phòng bệnh
chưa hợp lý.
Nghiên cứu trên các mẫu bệnh phẩm ñược thu thập từ những 1970 ñã chỉ
ra sự có mặt của PCV2 lưu hành trên ñàn lợn ở một số nước. Tuy nhiên, hội
chứng bệnh do PCV2 gây ra chỉ ñược xác ñịnh vào những năm 90 của thế kỷ
XX. PCV2 có liên quan ñến Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (postweaning
multisystemic wasting syndrome – PMWS); Hội chứng viêm da và viêm thận
(porcine dermatitis and nephropathy syndrome – PDNS); Hội chứng viêm
ñường hô hấp (porcine respiratory diseases complex) và Hội chứng rối loạn sinh

sản ở lợn (porcine reproductive disorders); gây tác ñộng lớn tới sức sản xuất của
ñàn lợn. Trong số các bệnh do circovirus gây ra, PMWS ñược coi là nguyên
nhân gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn; danh từ Hội
chứng 30kg (The 30kg syndrome) cũng ñôi khi ñược dùng ñể chỉ bệnh này do
lợn bệnh chỉ ñạt khối lượng khoảng 30kg trong khi lợn bình thường cùng lứa
tuổi có thể ñạt 100kg. Thiệt hại kinh tế do PCV2 gây ra ước tính khoảng 600
triệu Euro/năm ñối với khối EU (Segalés và cộng sự, 2005). Tại Mỹ, người ta tính
toán và cho biết PCVAD gây thiệt hại kinh tế trung bình 3 - 4 ñô la/lợn, thậm chí
có ñàn lên ñến 20 ñô la/lợn (Gillespie và cộng sự, 2009) và PCV2 ñược coi là virus
gây bệnh quan trọng nhất trong ngành chăn nuôi (Opriessnig và cộng sự, 2007).

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1


Hiện tại, PCV2 và các hội chứng bệnh liên quan ñược phát hiện ở ñàn lợn
tại nhiều nước trên thế giới. Một số quốc gia trong khu vực ðông Nam Á như
Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan … ñều công bố về sự xuất hiện của
PCVAD. Cho ñến nay, việc nghiên cứu porcine circovirus trên thế giới ñã có
nhiều thành tựu về hệ gen, các ñiểm quyết ñịnh kháng nguyên, phương pháp
chẩn ñoán và thậm chí ñã có vacxin thương mại ñể phòng chống bệnh.
Tại Việt Nam, bằng kỹ thuật miễn dịch Peroxidase trên tế bào một lớp
(Immuno Peroxidae Monolayer Assay - IPMA) ñối với các mẫu máu của một số
tỉnh thành phía Nam bảo quản từ năm 2000, Nguyễn Thị Thu Hồng cho biết
PCV2 xuất hiện ở Việt Nam ít nhất từ năm 2000 với tỷ lệ nhiễm 38,97% và tăng
dần ñến 90,26% (năm 2005). Lâm Thị Thu Hương và ðường Mai Chi (2006)
khảo sát tại một số trại lợn công nghiệp ở thành phố Hồ Chí Minh và vùng phụ
cận cho biết tỷ lệ nhiễm PCV2 trên lợn khá cao, 7/9 trại nhiễm trên (77,77%) và
tỷ lệ nhiễm ở các trại biến ñộng cao 12,5- 83,33%.

Tại các tỉnh miễn Bắc Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về tình hình
nhiễm cũng như vacxin phòng PCV2 trên lợn. Tuy nhiên theo thông tin mà
chúng tôi thu thập ñược, có một tỉ lệ không nhỏ ñàn lợn ở các tỉnh phía Bắc có
sự lưu hành PCV2. Thực trạng chăn nuôi lợn ở nước ta hiện nay ñã tạo môi
trường hết sức thuận lợi cho việc thường xuyên tồn tại nhiều mầm bệnh PCV2
trong ñàn. Cộng thêm sự xuất hiện của virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và
sinh sản (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus - PRRSV) từ
năm 2007 ñã làm cho tình hình dịch bệnh càng trở nên phức tạp. Do vậy nghiên
cứu chỉ ra sự có mặt của PCV2 và PCVAD ở ñàn lợn là hết sức cấp thiết ñể từ
ñó có ñược những chiến lược phòng bệnh, vacxin phòng bệnh kịp thời.
Trong khi các nước trên thế giới, thậm chí các nước trong khu vực ñã và
ñang ñi sâu nghiên cứu về PCV2 và bệnh PCVAD thì tại Việt Nam chưa có báo
cáo chính thức nào về tình hình nhiễm, phân lập PCV2 và so sánh hệ gen của
PCV2 phân lập tại Việt Nam với các chủng trên thế giới; vì vậy, ñặt vấn ñề
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

2


nghiên cứu về PCV2 là hoàn toàn cần thiết và cấp thiết trong thời ñiểm hiện nay.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài “Tình hình nhiễm Porcine circovirus
type 2 (PCV2) ở ñàn lợn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam” nhằm xác
ñịnh lưu hành huyết thanh chống PCV2, lưu hành virus của PCV2. ðây là
những nghiên cứu bước ñầu, là nền tảng quan trọng, không thể thiếu cho những
nghiên cứu kế tiếp về vacxin phòng bệnh trong tương lai.
* Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài:
- Mục tiêu tổng quát: xác ñịnh sự lưu hành của PCV2 ở ñàn lợn nuôi tại một
số tỉnh miền Bắc Việt Nam, phục vụ cho công tác chẩn ñoán và nghiên cứu sản
xuất vacxin phòng bệnh do PCV2 gây ra.
- Mục tiêu cụ thể:

+ Xác ñịnh sự có mặt của kháng thể kháng PCV2 ở ñàn lợn nuôi tại một
số tỉnh miền Bắc Việt Nam,
+ Phân lập virus nhằm xây dựng ngân hàng giống virus phục vụ cho các
nghiên cứu khác như chẩn ñoán và sản xuất vacxin phòng bệnh do PCV2 gây ra
ở ñàn lợn.
* Ý nghĩa khoa học:
- ðây là nghiên cứu ñầu tiên về sự lưu hành kháng thể kháng PCV2 ở ñàn
lợn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.
- Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp
theo về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra.
* Ý nghĩa thực tiễn:
- Nghiên cứu cung cấp quy trình chẩn ñoán xác ñịnh PCV2 trong bệnh
phẩm của lợn mắc bệnh.
- Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ sự tồn tại của PCVAD ở ñàn lợn
tại ñịa bàn nghiên cứu giúp xây dựng ñược biện pháp phòng chống bệnh phù hợp.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

3


PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. GIỚI THIỆU VỀ PCV2 VÀ BỆNH DO PCV2 GÂY RA
Porcine circovirus (PCV) thuộc họ Circoviridae, bao gồm Porcine
circovirus type 1 (PCV1) và Porcine circovirus type 2 (PCV2).
Trong những năm cuối thập niên 1990, một loại circovirus mới (Porcine
Circovirus) gây bệnh ñã ñược phát hiện ở lợn. Virus này khác với PCV thích
ứng trên môi trường tế bào thận lợn PK15 ñã biết trước ñó. Người ta ñã ñề nghị

gọi PCV ñã biết là PCV type 1 (PCV1) và virus mới phân lập ñược là PCV type
2 (PCV2). PCV1 ñược phân lập lần ñầu tiên tại ðức vào năm 1974, virus này
ñược xem như không phải tác nhân gây bệnh (nonpathogenic) ở lợn. Năm 1991
tại Canada, PCV2 ñược nhận diện là nguyên nhân gây hội chứng gầy còm ở lợn
sau cai sữa và sau ñó ñược ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, các
kết quả nghiên cứu hồi cứu mẫu bệnh phẩm cho biết ñã phát hiện ñược kháng
thể kháng PCV2 trong huyết thanh của lợn từ năm 1969 tại Bỉ, năm 1970 tại
Anh, năm 1973 tại Ireland và năm 1983 tại Canada (trích theo Gillespie và cộng
sự, 2009) và Tây Ban Nha (Rodríguez-Arrioja và cộng sự, 2003).
Theo Hamel và cộng sự (1998), mức ñộ tương ñồng trình tự nucleotide
giữa PCV1 và PCV2 là 68 – 76%.
1.1. Một vài nét về PCV2
1.1.1. Phân loại
PCV2 thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae. Họ circoviridae gồm 3
giống, ñược xác ñịnh là nguyên nhân gây một số bệnh ở gia súc và gia cầm:
- Giống Anellovirus: gồm một số circovirus của người như Transfusion
Transmitted Virus hay Torque teno virus (TTV). Virus này ñược phát hiện lần
ñầu tiên vào năm 1997 tại Nhật Bản và thường phân lập ñược từ bệnh nhân mắc
bệnh gan; tuy nhiên chúng không ñược coi là nguyên nhân gây bệnh. Một số

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4


nghiên cứu gần ñây cho thấy TTV cũng có thể gây bệnh cho một số loài vật nuôi
khác như lợn, và có thể phân lập ñược từ huyết thanh của lợn mắc PMWS tại
Tây Ban Nha (Francisco de Grau).
- Giống Gyrovirus: thành viên duy nhất của giống này là chicken anemia virus
(CAV) gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà (Chicken Infectiuos Anemia – CIA).

- Giống Circovirus: gồm các virus ñã phát hiện ñược từ ñộng vật như
porcine circovirus type 1 và 2 (circovirus ở lợn), canary circovirus (circovirus ở
chim hoàng yến), bovine circovirus (circovirus ở bò), goose circovirus (circovirus
ở ngỗng), ostrich circovirus (circovirus ở ñà ñiểu), raven circovirus (circovirus ở
quạ) và human circovirus (circovirus gây hội chứng mệt mỏi mạn tính ở người).
Các chủng PCV2 phân lập ñược trên thế giới có cùng nguồn gốc với mức
ñộ tương ñồng về kiểu gen khoảng 93% (Larochelle và cộng sự, 2002).
Hiện nay, dựa vào kết quả giải trình tự gen, PCV2 ñược chia thành 5
genotype, ký hiệu từ PCV2a-2e. Genotype PCV2a và PCV2b lại có thể ñược
chia thành các cluster khác nhau (ví dụ PCV2a có 5 cluster 2A-2C; PCV2b có 3
cluster 1A-1C).
1.1.2. Hình thái, cấu trúc
PCV mang bộ gen là ADN virus sợi ñơn vòng chứa khoảng 1759
nucleotide (PCV2) và khoảng 1767 - 1768 nucleotide (PCV2) (Guo và cộng sự,
2010; Olvera và cộng sự, 2007). ðây là một virus trần không có vỏ bọc bên ngoài.

Hình 2.1: Cấu trúc PCV2 (Gillespie và cộng sự, 2009)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5


Bộ gen của PCV2 gồm 11 khung ñọc mở ORFs (open reading frame) mã
hóa cho các phân tử protein của virus, trong ñó hai khung ñọc mở chính (ORF1
và ORF2) theo hướng ngược nhau. Hiện nay trên thế giới các nghiên cứu về
PCV thường tập trung vào ba ORF là ORF1, ORF2 và ORF3.
ORF1 mã hóa cho các protein liên quan ñến sự nhân lên của virus (viral
replication protein – Rep), có khối lượng phân tử 35,8 kDa. Sự tương ñồng amino
acid của phân tử protein quy ñịnh bởi ORF1 giữa PCV1 và PCV2 khoảng là 85%.
ORF2 mã hóa cho các protein liên quan ñến sự hình thành vỏ capsid của

virus (capsid protein – Cap), có khối lượng phân tử 27,8 kDa. Sự tương ñồng
amino acid của phân tử protein do ORF2 mã hóa giữa PCV1 và PCV2 là 66%.
Sản phẩm ORF2 chứa các ñiểm quyết ñịnh kháng nguyên, kích thích sinh kháng
thể chống lại virus, vì vậy người ta sử dụng kháng thể nguồn gốc ORF2 như một
công cụ ñể chẩn ñoán phân biệt PCV.
ORF3 mã hóa protein có khối lượng phân tử 11,9 kDa, ñược cho là có liên
quan ñến hiện tượng apoptosis ở tế bào nhiễm virus; sự tương ñồng amino acid
của protein này giữa PCV1 và PCV2 là 62%.
Theo Hamel và cộng sự (1998), trình tự 11 ORF của PCV2 gây hội chứng
còi cọc (PCV2) và chủng không gây bệnh (PCV1) như sau (bảng 2.1).

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

6


Bảng 2.1. Bảng so sánh các khung ñọc mở của PCV1 và PCV2
PCV gây chứng còi cọc (PCV2)
ORF

Vị trí
nucleotide

1
2
3
4
5
6
7

8
9
10
11

51–995
1735–1034
671–357
565–386
1016–1177
1611–1530
1682–1741
753–688
92–1732
1524–1631
1033–989

Số aa
314
233
104
59
53
27
19
21
42
35
14

PCV không gây bệnh (PCV1)

Tương

Khối lượng

Vị trí

Số

Khối lượng

ñồng

protein (kDa)

nucleotide

aa

protein (kDa)

(%)

35,8
27,8
11,9
6,5
6,2
2,8

1,9
2,3
4,6
4,1
1,8

47–985
1723–1022
658–38
552–205
1163–1450
1518–1330
1670–81
740–627
968–873
1642–1755
648–719

312
233
206
115
95
62
56
37
31
3.7
23

35,7
27,8
23,2
13,3
9,8
6,7
6,0
4,3
3,4
3,7
2,8

85
66
62
83
không
không
79
67
không
không
không

1.1.3. Tính chất nuôi cấy
Hiện nay, những hiểu biết về ñặc tính sinh học của PCV2 như khả năng
nhận biết, gắn và xâm nhập vào tế bào chưa nhiều. Vì PCV2 chỉ mã hóa cho hai
loại protein nên chúng ñược cho rằng phải dựa vào protein của tế bào vật chủ ñế
nhân lên, nghĩa là chúng nhân lên tốt trong tế bào ñang phân chia.
Môi trường tế bào thận lợn PK15 rất thích hợp ñể nuôi cấy PCV2, virus

nhân lên trong nhân tế bào, nhưng không gây bệnh tích tế bào. Tischer và cộng
sự (1987) cho biết tế bào PK15 ñược xử lý với glucosamine sẽ giúp cho sự nhân
lên của PCV2 tốt hơn. Do PCV2 không gây bệnh tích tế bào nên ñể khẳng ñịnh
sự nhân lên của virus cần phải làm phản ứng miễn dịch huỳnh quang hoặc PCR.
ðể phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15 thường mất rất nhiều
công sức và thời gian do phải cấy chuyển nhiều lần, thường chỉ áp dụng trong
nghiên cứu ñể sản xuất vacxin phòng bệnh.
Virus không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu.
1.1.4. Sức ñề kháng
PCV2 rất bền ở nhiệt ñộ cao và chịu ñược trong ñiều kiện pH dao ñộng
lớn, có khả năng sống ñược 72 giờ ở 800C, 30 phút ở nhiệt ñộ 70 - 750C và 1 giờ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7


ở 560C; bị bất hoạt ở pH 3 và bởi chloroform. Ở nhiệt ñộ phòng, khi bị tác ñộng
trong 10 phút bởi một số chất sát trùng như chlorhexidine, formol, iodine và cồn
thì hiệu giá của virus sẽ giảm.
Có thể phân lập ñược PCV2 trong bệnh phẩm của lợn bảo quản ở -700C.
1.2. Bệnh do PCV2 gây ra
1.2.1. Loài vật mắc bệnh
Tất cả các giống lợn ñều mẫn cảm với bệnh, kể cả lợn nuôi và lợn hoang
dã, nhưng các loài vật khác không mẫn cảm với PCV2. Khả năng mẫn cảm với
bệnh thay ñổi tùy theo tính biệt, giống lợn, có liên quan ñến sự nhân lên của
PCV2 trong ñại thực bào phế nang. Ví dụ, thường lợn ñực mẫn cảm với bệnh
hơn so với lợn cái; lợn giống Landrace mẫn cảm hơn giống Duroc và ðại Bạch.
Gần ñây, nghiên cứu Potter và cộng sự (2012) ñã khẳng ñịnh bản chất di truyền
của từng giống lợn có ảnh hưởng ñến mức ñộ mẫn cảm với PCVAD.
Chen và cộng sự (2007) cho biết chỉ xác ñịnh ñược kháng thể kháng

PCV2 trong huyết thanh của lợn trong các loài ñược kiểm tra là lợn, gà, vịt, dê
và trâu, bò. Bệnh không có khả năng lây sang người.
1.2.2. Phương thức truyền lây
Mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua ñường miệng - mũi. Bệnh có
thể lây qua tiếp xúc, qua phân, qua ñường hô hấp và tinh dịch của lợn ñực giống.
Bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) có thể xác ñịnh ñược mầm bệnh
có trong dịch bài xuất và bài tiết của lợn mắc hoặc không mắc PMWS, trong
huyết thanh lợn có triệu chứng lâm sàng cũng như lợn khỏe mạnh, không có
triệu chứng (Segalés và cộng sự, 2005).
PCV2 cũng có thể truyền trực tiếp từ mẹ sang con qua nhau thai, là
nguyên nhân khiến cho mầm bệnh tồn tại lâu trong ñàn, lợn con bị nhiễm virus
ngay từ khi mới sinh. Tuy nhiên, ñường truyền lây này ít gặp. Ngoài ra, PCV2
còn ñược tìm thấy trong sữa ñầu, nhưng ñể khẳng ñịnh ñược ñây có phải là

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

8


ñường truyền lây bệnh hay không thì cần phải tiếp tục nghiên cứu (trích theo
Gillespie và cộng sự, 2009).
1.2.3. Cơ chế sinh bệnh
ðiểm ñặc trưng quan trọng nhất quan sát ñược khi lợn bị hội chứng
PCVAD là số lượng bạch cầu giảm rất nhanh (leucopenia). PCV2 tác ñộng ñến
tế bào lympho và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch như tế bào ñơn nhân, ñại
thực bào và tế bào tua (dendritic cell) gây suy giảm miễn dịch, tạo ñiều kiện
thuận lợi cho nhiều loại mầm bệnh khác xâm nhập và gây bệnh.
Bằng thực nghiệm người ta thấy rằng lợn bị nhiễm PCV2 không có khả
năng sản sinh interferon ở giai ñoạn ñầu của quá trình nhiễm trùng có thể là
nguyên nhân làm giảm ñáp ứng miễn dịch với PCV2 và bị bệnh. Ngoài ra, hiện

tượng giảm sản sinh interferon nhưng tăng lượng IL-10 ở những lợn thực
nghiệm bị nhiễm PCV2 cũng ñã ñược chứng minh. Cho ñến nay, ảnh hưởng của
PCV2 ñến hệ miễn dịch của lợn vẫn còn nhiều tranh cãi và cần phải có các
nghiên cứu ñể làm sáng tỏ. Nghiên cứu cần tập trung làm rõ tác ñộng qua lại
giữa giai ñoạn sau nhiễm trùng và trước khi biểu hiện triệu chứng lâm sàng ñể
giải thích hiện tượng nhiễm trùng cấp tính hoặc/và mạn tính.
Opriessnig và cộng sự (2006) cho biết mặc dù hầu hết lợn trong ñàn có
thể bị nhiễm PCV2 nhưng chỉ có khoảng 5 – 30% lợn mẫn cảm biểu hiện triệu
chứng. Có bốn yếu tố ảnh hưởng ñến sự phát sinh PCVAD do nhiễm PCV2 là
cấu trúc và ñộc lực virus, giống lợn, sự ñồng nhiễm, trạng thái miễn dịch của cơ
thể. Việc sử dụng một số loại vacxin, trong ñó chất bổ trợ sẽ khiến cho tỷ lệ lợn
có triệu chứng PCVAD tăng lên. Ở lợn cùng tiêm một loại vacxin nhưng có chất
bổ trợ khác nhau (ñặc biệt bổ trợ dầu) sẽ làm cho thời gian nhiễm virus cũng
như số lượng PCV2 trong huyết thanh và mô bào tăng lên, tế bào lympho bị tổn
thương nặng hơn so với những lợn ñược tiêm vacxin bổ trợ là keo phèn. Một thí
nghiệm khác cũng cho thấy khi lợn ñược tiêm vacxin phòng bệnh do M.
hyopneumoniae hoặc A. pleuropneumoniae, sau ñó gây nhiễm PCV2 thì thời
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

9


gian PCV2 có trong máu sẽ lâu hơn và các bệnh tích vi thể sẽ trầm trọng hơn so
với những lợn không tiêm phòng vacxin.
ðiểm ñặc biệt trong cơ chế sinh bệnh của PCV2 là hiện tượng ña nhiễm
hoặc bội nhiễm với nhiều loại mầm bệnh khác. Pallares và cộng sự (2002) khi
nghiên cứu trên 484 mẫu bệnh phẩm từ các ca bệnh PMWS chỉ xác ñịnh 1,9%
số mẫu ñơn nhiễm PCV2; 51,9% số mẫu nhiễm kép PRRSV; 35,5% nhiễm kép
với M. hyopneumoniae; 5,4% nhiễm kép với virus cúm lợn và 15% nhiễm kép
với PPV (porcine parvovirus). Bên cạnh ñó, trong trường hợp bại huyết, thường

có sự hiện diện của Streptoccocus suis (14%) và Pasteurella multocida (7,6%).
Nghiên cứu gần ñây nhất của Lâm Thị Thu Hương tại hai tỉnh miền ðông Nam
Bộ cũng cho thấy lợn mắc PMWS thường cộng nhiễm một số vi khuẩn như E.
coli (55%), Streptococcus (42,5%), Salmonella (32,5%), P. multocida (22,5%)
và Haemophilus parasuis (17,5%).
Sau năm 1988, nhiều nghiên cứu trên thế giới tập trung vào vai trò của
PCV2 gây hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa PMWS. ðiều dễ dàng nhận thấy
là nếu chỉ gây nhiễm PCV2 rất ít khi lợn biểu hiện triệu chứng lâm sàng (Okuda
và cộng sự, 2003). Trong hầu hết các trường hợp lợn có triệu chứng lâm sàng rõ
khi ñược gây nhiễm ñồng thời với một số mầm bệnh truyền nhiễm hoặc không
truyền nhiễm (Rovira và cộng sự, 2002). Do ñó PCV2 ñược coi là ñiều kiện cần
nhưng chưa ñủ ñể gây thành bệnh (Tomás và cộng sự, 2008).
Với trường hợp PDNS, cần phải làm thí nghiệm chứng minh giả thuyết
cho rằng hàm lượng kháng thể PCV2 tăng cao sẽ là nguyên nhân gây bệnh.
1.3. Triệu chứng và bệnh tích
Thời gian nung bệnh khi gây bệnh thực nghiệm PCV2 cho lợn thường dao
ñộng từ 2 – 4 tuần, virus có trong máu từ 7 – 14 ngày sau khi nhiễm. Ngay sau
khi xâm nhập vào cơ thể, PCV2 sẽ nhân lên ở hạch amidan và các hạch lympho
ở vùng ñầu, tấn công tế bào lympho B; rồi từ ñó ñi ñến các cơ quan khác trong
cơ thể như lách, mảng Paye’r...
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10


Theo Segalés (2011), một số hội chứng ở lợn ñã ñược mô tả có liên quan
ñến sự nhiễm PCV2; trong ñó PMWS ñược mô tả nhiều nhất với tên gọi lúc ñầu
là circovi-rosis, một số trường hợp khác là PDNS, hội chứng rối loạn hô hấp, hội
chứng rối loạn sinh sản ở lợn, hội chứng viêm ruột ở lợn... Hiện nay tên gọi phổ
biến ñể mô tả các bệnh liên quan ñến PCV2 là “hội chứng liên quan ñến PCV2

(PCVAD)”.
1.3.1. Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (PMWS)
PMWS thường xảy ra ở lợn từ 7 – 16 tuần tuổi. Tỷ lệ ốm thường dao
ñộng từ 4 - 30% (ñôi khi lên ñến 50 - 60%), tỷ lệ chết khoảng từ 4 - 20% nhưng
cũng có thể 50%. Do khi lợn mắc bệnh thường còi cọc và giảm hiệu quả kinh tế
nên khoảng 70 – 80% lợn có triệu chứng PCVAD bị giết thịt.
PMWS ñặc trưng bởi hiện tượng còi cọc, da nhợt nhạt, thở khó, ñôi khi bị
ỉa chảy (phân sẫm màu) và có chứng hoàng ñản. Giai ñoạn ñầu bị bệnh các hạch
lympho dưới da ñều bị sưng to.
Bệnh tích ñặc trưng thường quan sát ñược là các hạch lympho bị sưng to
trong giai ñoạn ñầu của bệnh. Bệnh tiến triển, hạch lympho trở lại kích thước
bình thường và thậm chí bị teo nhỏ, tuyến ức bị teo. Phổi có thể sưng to, dai
chắc như cao su, tương ứng với bệnh tích vi thể viêm kẽ phổi. Nhiều trường hợp
phế quản bị viêm tơ huyết.
Gan bị sưng to hoặc teo nhỏ, nhạt màu, cứng, bề mặt có các hạt nhỏ. Một
số lợn bị hoàng ñản trong giai ñoạn cuối của bệnh.
Thận có nốt hoại tử màu trắng (viêm kẽ thận không có mủ).
Bệnh tích vi thể cho thấy lợn mắc PMWS bị giảm tế bào lympho và thâm
nhiễm tế bào khổng lồ ña nhân và tế bào mô (histiocyte). Phần vỏ tuyến ức bị
teo nhỏ. Ngoài ra còn quan sát ñược các tiểu thể virus trong tế bào tua (dendritic
cell) và tế bào mô.
Một số triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc chứng PMWS ñược minh họa
trong hình 2.2 – 2.7.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

11


Hình 2.2. Lợn mắc chứng gày còm

Hình 2.3. Hạch bẹn nông sưng, xuất

Hình 2.4. Viêm dính màng phổi với

huyết

thành lồng ngực

Hình 2.5. Hạch màng treo ruột bị sưng, xuất huyết

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12


Hình 2.6. Thận bị sưng, xuất huyết vàcó ñiểm hoại tử

Hình 2.7. Phổi bị viêm ở các mức ñộ khác nhau

1.3.2. Hội chứng viêm da và viêm thận (PDNS)
Hội chứng này ñược mô tả lần ñầu tiên vào năm 1993 tại Anh. PDNS xảy
ra ở lợn con, lợn thịt và lợn trưởng thành (11 - 14 tuần tuổi). Tỷ lệ nhiễm
khoảng dưới 1% nhưng ñôi khi có thể cao hơn. Tỷ lệ chết có thể lên ñến 100% ở
ñàn lợn trên 3 tháng tuổi nhưng chỉ khoảng 50% với lợn nhỏ hơn. Lợn chết chỉ
sau một vài ngày có biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Những con sống sót có thể
tăng trọng trở lại sau 7 - 10 ngày.
Bệnh xảy ra thường ghép với một số mầm bệnh khác như PRRSV,
Pasteurella multocida, Streptococcus suis type 1 và 2...
Lợn mắc PDNS có biểu hiện mệt mỏi, ủ rũ, bỏ ăn, sốt (410C) hoặc không
sốt, nằm một chỗ, lười vận ñộng và/hoặc ñi lại khó khăn, cứng nhắc. Triệu

chứng rõ nhất là trên da xuất hiện những ñám phát ban có màu ñỏ tía, không có
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

13


hình dạng nhất ñịnh, bắt ñầu ở vùng chân sau và mông, có trường hợp nốt ban
lại phân tán khắp cơ thể. Bệnh tiến triển, hình thành ñám vẩy sẫm ở những nơi
có bệnh tích, sau ñó nhạt màu dần, ñôi khi ñể lại sẹo.
Bệnh tích ñại thể là hiện tượng hoại tử và xuất huyết mô bào, tương ứng
với bệnh tích vi thể là viêm hoại tử mạch máu. Hạch lympho, ñặc biệt là hạch
sau bụng có màu ñỏ, sưng to và có thể có chất lỏng chứa trong bụng.
Khi lợn chết thể cấp tính, hai bên thận sưng to, trên bề mặt có nốt màu
trắng, phù thũng bể thận, tương ứng với bệnh tích vi thể là viêm hoại tử có mủ
tiểu cầu thận và viêm kẽ thận.
Thường thì bệnh tích ở da và thận ñều xuất hiện khi lợn mắc PDNS, tuy
nhiên có những trường hợp chỉ biểu hiện một trong hai bệnh tích trên.
Hạch lympho thường bị sưng to, có màu ñỏ. Lách bị nhồi huyết.

Hình 2.8. Lợn bị viêm da

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14


Hình 2.9. Lợn mắc chứng gày còm và bị viêm da
1.3.3. Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn (PCV2 – Associated Reproductive
Failure)
Hội chứng này ñược mô tả lần ñầu tiên tại Canada năm 1999, chủ yếu ảnh

hưởng ñến lợn nái. PVC2 có liên quan ñến hiện tượng sảy thai và thai chết non,
tuy nhiên trong thực tế hiếm gặp. ðiều này có thể giải thích do tỷ lệ huyết thanh
dương tính với PCV2 ở lợn trưởng thành cao và do ñó lợn sinh sản thường
không mẫn cảm với bệnh. Trong những trường hợp rối loạn sinh sản do PCV2,
triệu chứng ñặc trưng là lợn xảy thai, chết yểu. Mổ khám thai chết có hiện tượng
gan xung huyết, tim sưng to, trên bề mặt có nhiều ñiểm hoại tử. Bệnh tích vi thể
rõ nhất là hiện tượng cơ tim bị viêm tơ huyết và/hoặc hoại tử.
1.3.4. Hội chứng rối loạn hô hấp ở lợn (PCV2 – Associated Respiratory Disease)
Hội chứng này cũng ñóng vai trò gây bệnh ñường hô hấp phức hợp ở lợn.
Bệnh xảy ra ở lợn từ 8 – 26 tuần và thường cộng phát với một số nguyên nhân
khác. Triệu chứng bao gồm giảm khả năng tăng trọng, giảm chuyển hóa thức ăn,
lợn mệt mỏi, sốt, ho và khó thở.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

15


Bệnh tích ñặc trưng gồm viêm kẽ phổi, phế quản viêm loét hoặc hoại tử
nặng, phế nang viêm tơ huyết.

Hình 2.10. Lợn có triệu chứng rối loạn hô hấp
1.3.5. Hội chứng viêm ruột ở lợn (PCV2 – Associated Enteritis)
Thường xảy ra ở lợn từ 8 – 16 tuần tuổi, gây chứng viêm hồi tràng mạn
tính có liên quan ñến Lawsonia intracellularis. Lợn bị bệnh có triệu chứng tiêu
chảy, còi cọc, giảm tăng trọng và tăng tỷ lệ chết.
Bệnh tích bao gồm viêm ruột dạng hạt, rõ nhất là ở các mảng Paye’r. Hạch
màng treo ruột bị sưng to, niêm mạc ruột tăng sinh dày lên.
Ngoài ra, vai trò của PCV2 gây hội chứng thần kinh ở lợn (PCV2 –
Associated Neuropathy) cần phải tiếp tục nghiên cứu làm rõ. Năm 2001, PCV2
ñược phát hiện có liên quan ñến hiện tượng lợn con sinh ra có triệu chứng run

bẩm sinh và viêm màng não không có mủ. Một số nghiên cứu gần ñây cho biết
lợn bị nhiễm PCV2 có thể gây viêm mạch quản tiểu não và viêm xuất huyết
màng não. PCV2 còn liên quan ñến triệu chứng opisthotonus, chứng giật cầu
mắt và co giật ở lợn từ 6 – 8 tuần tuổi (trích theo Gillespie và cộng sự, 2009).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

16