phương pháp định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
--------

Bộ Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm
BÀI BÁO CÁO
Đề tài:

MỤC LỤC

1. Tổng quan về vi sinh vật hiếu khí
1.1. Định nghĩa


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
Vi sinh vật hiếu khí là những vi khuẩn tang trưởng và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có sự hiện diện của oxy (O2) phân tử.
Là vi sinh vật chỉ thị. Do đó, chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được sử dụng để
đánh giá chất lượng vệ sinh hơn là độ an toàn thực phẩm
Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực
phẩm, đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản
của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm
Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường
thạch dinh dưỡng, từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc phát triển từ
một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn
lạc (CFU) trong một đơn vị khối lượng hay thể tích thực phẩm và có một số tên gọi khác
nhau như:

-

Số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count_APC)

-

Tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count_TPC)

-

Tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count_TVC)

-

Số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count_SPC)

2.

3.
4. Một số phương pháp xác định tổng vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm
4.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
TCVN 4884- 2005


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
Nguyên tắc: ủ vi sinh vật trong mẫu thực phẩm cần phân tích trong điều kiện hiếu
khí ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ. Sau đó tính số lượng vi sinh vật trên 1g hoặc 1ml mẫu
từ số lượng khuẩn lạc thu được trên đĩa đã chọn.

4.2. Phương pháo màng lọc
Phương pháp sử dụng bộ lọc màng ô vuông kị nước (TCVN 7923:2008)
Nguyên tắc: Bộ lọc màng kẻ ô vuông kỵ nước có các màng lọc khuôn mẫu kẻ ô

vuông được đóng vật liệu kỵ nước. Các đường kẻ ngăn chặn không cho các khuẩn lạc
mọc lan, do đó phân chia bề mặt bộ lọc màng thành các ngăn tách biệt có kích thước xác
định bằng nhau.
Đếm số lượng các ô vuông có chứa khuẩn lạc và quy đổi sang số có xác suất lớn
nhất (MPN) các vi sinh vật, sử dụng công thức đã cho

4.3. Kỹ thuật màng petrifilm
TCVN 9977:2013
Nguyên tắc: môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định vào các màng
mỏng gọi là Petrifilm. Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ 1 ml
dịch mẫu rồi đậy lại. Một đĩa pertri nhựa được đặt trên màng bảo vệ để tạo một khuôn
tròn. Môi trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ vi sinh vật phát triển trong thời gian ủ. Sau khi
đem đi ủ thì đếm khuẩn lạc

5. Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
5.1. Nguyên tắc
Cấy lên môi trường cấy quy định, sử dụng hai đĩa, dung một lượng mẫu thử qui
định nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc với một lượng huyền phù ban đầu quy định nếu sản
phẩm ở dạng khác.


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử
hoặc của huyền phù ban đầu vào hai đĩa cho mỗi dung dịch pha loãng.
Các đĩa này được ủ trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 300C trong 72 ± 6 giờ.
Tính số lượng vi sinh vật trên 1g hoặc 1ml mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu được
trên đĩa đã chọn.

5.2. Dụng cụ, thiết bị và hoá chất
5.2.1.

Thiết bị

• Cân phân tích: cân lượng mẫu phân tích trong trường hợp phân tích mẫu rắn hay huyền
phù

Hình 1: Cân phân tích

• Máy dập mẫu (Stomacher): dùng để dập mẫu và đồng nhất mẫu trong trường hớp mẫu
rắn


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

Hình 2: Máy dập mẫu

• Máy rung: dùng để trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất

Hình 3: Máy rung

• Nồi hấp, tủ sấy: dùng để khử trùng khô như bình tam giác, ống nghiệm…. ( tủ sấy) hoặc
khử trùng ướt (nồi hấp)


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

Hình 4: Nồi hấp

Hình 5: Tủ sấy

• Tủ ấm: để ủ vi sinh vật. Có khả năng hoạt động ở 30oC

Hình 6: Tủ sấy

• pH kế:


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
Hình 7: pH kế

5.2.2.

Dụng cụ

Hình 8: Bình tam giác và pipetman

Hình 9: Ống nghiệm và đĩa petri

5.2.3.

Hoá chất và môi trường
Môi trường - hóa chất

Mục đích

Saline Pepton Water (SPW)

Pha loãng mẫu

Plate count agar (PCA)

Nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí

HCl 10%

Chỉnh pH


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
NaOH 10%
Thành phần môi trường PCA
Pepton từ casein

5g

Cao nấm men

2.5 g

Glucoza, dạng khan

1g

Thạch Agar

9 – 18 g

Nước

1000 ml

Thành phần dịch pha loãng SPW
NaCl

8.5 g

Pepton

1g

Nước

1000 ml

5.3. Quy trình phân tích


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone Water
Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60 giây

Dịch mẫu 10-1

Pha loãng

Dịch mẫu 10-2

15 ml

15 ml

PCA

02 đĩa

02 đĩa

(PCA đã đung chảy và làm nguội đến 470C)

Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 300C trong 72 ± 6 giờ

Đọc kết qủa chọn các đĩa mọc lớn hơn hoặc bằng 15 và nhỏ hơn hoặc bằng 300 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả
Hình 10: Quy trình phân tích tổng vi sinh vật hiếu khí

5.4. Các bước tiến hành
5.4.1. Chuẩn bị môi trường
• Chuẩn bị môi trường PCA: có 2 phương pháp
o Chuẩn bị từ môi trường hoàn chỉnh dạng thương phẩm khô


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
o Chuẩn bị từ các thành phần cơ bản khô
• Khử trùng môi trường: Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121oC. Làm nguội trong
nồi cách thuỷ đến nhiệt độ 47oC. Chỉnh pH sau khi khử trùng là 7

5.4.2. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu
lỏng của phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác).

Cho dung dịch pha loãng SPW 90 ml vô trùng vào bao PE (hoặc bình tam giác)
chứa mẫu.
Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có
mẫu dịch pha loãng SPW trong 2-3 phút.
Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của
dịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng.

5.4.3. Pha loãng mẫu
Dịch mẫu tiếp tục được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman có
đầu típ vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng.
Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung vortex hoặc dùng pipet
hút đảo dịch mẫu lên xuống 5-10 lần. Dung dịch này có độ pha loãng là 10 -2. Sau đó sử
dụng pipetman cùng đầu tip hay thay đầu tip mới tiếp tục chuyển 1ml dịch trong ống
nghiệm vừa mới pha loãng sang ống nghiệm khác chưa 9ml dịch pha loãng và thao tác
tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10 -3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có các độ
pha loãng thập phân tiếp theo cho đến độ pha loãng cần thiết.
Lưu ý:

• Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi chất cấy tiếp xúc với
môi trường không được vượt quá 45 phút và thời gian chuẩn bị huyền phù ban đầu đến


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
khi bắt đầu chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo không được vượt quá
30 phút.

• Nếu đầu tip của pipetman có nguy cơ bị nhiễm trong quá trình thao tác như chạm tay,
chạm mặt ngoài ống nghiệm, mặt ngoài bình chứa… thì cần phải thay đầu tip vô trùng
khác

5.4.4. Cấy và ủ mẫu
• Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chưa 15-300 tế bào vi sinh vật trong 1 ml để
cấy lên đĩa Petri

o Nếu mẫu ở dạng lỏng: dung pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml.
o Nếu mẫu ở dạng rắn: dung pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml dịch huyền phù ban đầu.
• Tương ứng với mỗi độ pha loãng thì cấy ít nhất 2-3 đĩa (thực hiện 2-3 lần lặp lại)
• Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng 12-15ml môi trường PCA ở 440C đến 470C.
• Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay đều đĩa Petri xuôi và ngược chiều kim
đồng hồ, mỗi chiều 3- 5 lần ngay sau khi đổ môi trường và đặt các đĩa trên mặt phẳng
nằm ngang để cho hỗn hợp đông đặc.

• Lật ngược các đĩa đã cấy và đặt vào tủ ấm ở 300C trong 72 giờ.

5.4.5. Đếm khuẩn lạc
• Sau giai đoạn ủ qui định, đếm các khuẩn lạc trên các đĩa. Sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc
(nếu cần). Kiểm tra các đĩa dưới ánh sang dịu, điều quan trọng là các khuẩn lạc chính
phải được đếm và tránh đếm nhầm với các hạt không hòa tan hoặc các chất kết tủa trên


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
đĩa. Kiểm tra cẩn thận các khuẩn lạc nghi ngờ, khi cần nên dung kính lúp có độ khuyếch
đại lớn hơn để phân biệt khuẩn lạc với các tạp chất lạ.

• Các khuẩn lạc mọc lan rộng được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu ít hơn đĩa mọc dày lan
rộng, thì đếm các khuẩn lạc trên đĩa phần còn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa. nếu quá
¼ đĩa bị mọc dày lan rộng thì loại bỏ đĩa đó và không đếm.

Hình 11: Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA từ 15-300 khuẩn lạc

PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

Hình 12: Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA lớn hơn 300 khuẩn
lạc

Hình 13: Khuẩn lạc mọc loang trên môi trường PCA


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

Hình 14: Mẫu bị nhiễm và không đạt yêu cầu

5.4.6. Tính kết quả thu được
• Chọn các đĩa có 15-300 khuẩn lạc đếm
• Tính số lượng VSV hiếu khí trong 1g hoặc 1 ml thực phẩm bằng công thức:
A(CFU/g hay CFU/ml) =
Trong đó: A: số đơn vị hình thành khuẩn lạc vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy được giữ lại ở độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng

• Nguyên tắc làm tròn kết quả: kết quả được làm tròn đến hai chữ số có nghĩa. Sau khi tính
kết quả, nếu chữ số thứ 3 bé hơn 5 thì không thay đổi chữ số đứng trước nó, nếu lớn hơn
hoặc bằng 5 thì tăng chữ số đứng trước nó lên 1 đơn vị
Ví dụ:


PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

11,300 CFU/g báo cáo là 1,1 x 104 CFU/g
235,000 CFU/g báo cáo là 2,4 x 105 CFU/g

• Ví dụ cách tính kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí:

Độ pha loãng
Số khuẩn lạc

10-3

10-4

168

19

173

15

Số khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí đếm được trên hai độ pha loãng liên tiếp là:
Ở độ pha loãng d=10-3: đếm được 168 khuẩn lạc và 173 khuẩn lạc.
Ở độ pha loãng d=10-4: đếm được 19 khuẩn lạc và 15 khuẩn lạc, ta có
A(CFU/g hay CFU/ml) =

Làm tròn kết quả là 1,7 x 105 CFU/g (hoặc CFU/ml).

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Thúy Hương, bài giảng Phân tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại Học
Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM, 2012.

PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
[2]. Đinh Thị Hải Thuận (chủ biên), Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Kim Liên,
Nguyễn Thị Kim Oanh, Liêu Mỹ Đông, giáo trình Thực hành phân tích vi sinh thực
phẩm, Trường Đại Học Công Nghiêp Thực Phẩm TP.HCM, 2013
[3]. Trần Linh Thước, phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và
mỹ phẩm, nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, 2013