nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm a h5n1 clade 7 phân lập ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN TÙNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT
CÚM A/H5N1 CLADE 7 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ
CHUYÊN NGÀNH: KÝ SINH TRÙNG VÀ VI SINH VẬT HỌC THÚ Y

HÀ NỘI, NĂM 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN TÙNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT
CÚM A/H5N1 CLADE 7 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: KÝ SINH TRÙNG VÀ VI SINH VẬT HỌC THÚ Y
MÃ SỐ: 62.64.01.04

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS NGUYỄN BÁ HIÊN
TS NGUYỄN VĂN CẢM

HÀ NỘI, NĂM 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan: công trình khoa học này là của tôi, các số liệu và kết
quả nghiên cứu trong luận án này trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin cam ñoan: mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện ñề tài nghiên cứu và
hoàn thành luận án ñều ñược cảm ơn. Các thông tin trích dẫn trong luận án ñều
chính xác và ñược nêu rõ nguồn gốc.
Hà nội, tháng 12 năm 2013
Tác giả

Nguyễn Tùng

i
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn
nhận ñược sự giúp ñỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin cảm ơn
Ban Giám hiệu, Ban Quản lý ðào tạo, Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp
Hà Nội ñã tạo ñiều kiện cho tôi ñược theo học chương trình ñào tạo nghiên cứu
sinh tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh ñạo và các cán bộ của Trung tâm Chẩn
ñoán Thú y ñã tạo ñiều kiện thuận lợi và giúp ñỡ cho tôi hoàn thành ñề tài nghiên
cứu của mình.
Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm,
khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình
học tập và nghiên cứu.

Tôi xin bày tỏ long biết ơn sâu sắc ñến Thầy giáo, PGS. TS Nguyễn Bá
Hiên, Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và TS Nguyễn Văn
Cảm – Hội Thú y , là những người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp ñỡ tôi
trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến những ñồng nghiệp công tác tại các tổ chức và
cơ quan quốc tế như FAO, CDC, USDA ñã hỗ trợ và cung cấp tài liệu cũng như
các nguyên liệu cần thiết ñể tôi thực hiện nghiên cứu.
Tôi luôn biết ơn gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã luôn bên cạnh, ñộng
viên và giúp ñỡ tôi hoàn thành nghiên cứu và luận án.
Hà Nội, tháng 12 năm 2013
Tác giả

Nguyễn Tùng

ii
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Lời cam ñoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ðẦU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm
1.1.1. Lịch sử bệnh trên thế giới
1.1.2. Bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam

1.2. Nguyên nhân của bệnh cúm gia cầm
1.2.1. ðặc ñiểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm
1.2.2. Kháng nguyên của virus cúm gia cầm
1.2.3. ðặc ñiểm tiến hóa và hình thành genotype của virus cúm gia cầm
giai ñoạn 1996-2008
1.2.4. Tính thích ứng ña vật chủ của virus cúm A/H5N1
1.2.5. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ
1.2.6. ðộc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm
1.2.7. Triệu chứng lâm sàng của gia cầm mắc bệnh cúm
1.2.8. Bệnh tích của gia cầm mắc cúm gia cầm
1.3. Chẩn ñoán bệnh
1.3.1. Chẩn ñoán dựa vào dịch tễ học
1.3.2. Chẩn ñoán dựa vào triệu chứng và bệnh tích
1.3.3. Chẩn ñoán phòng thí nghiệm
1.4. Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm
1.4.1. Tình hình sử dụng vắc-xin cúm gia cầm trên thế giới
1.4.2. Tình hình sử sụng vắc-xin cúm gia cầm tại Việt Nam
1.5. Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm ở Việt Nam
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung
2.1.1. Phân lập và giám ñịnh virus cúm gia cầm A/H5N1 từ các mẫu dịch
ngoáy ổ nhớp
2.1.2. Xác ñịnh ñặc tính di truyền học của virus cúm A/H5N1 clade 7
2.1.3. Xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của virus A/H5N1 clade 7
2.1.4. Xác ñịnh ñặc tính kháng nguyên (tính tương ñồng kháng nguyên)
2.1.5. Xác ñịnh hiệu lực của vacxin H5N1 Re-1
2.2. ðịa ñiểm nghiên cứu
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu

Trang
i
ii
iii
v
vi
viii
1
4
4
4
7
9
10
14
20
29
30
32
34
36
36
36
36
37
37
39
41

42
44
46
46
46
46
46
46
46
47
47
47
iii

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và giám ñịnh virus cúm gia cầm H5N1 clade 7
3.2. Xác ñịnh ñặc tính di truyền của virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7
phân lập ở Việt Nam
3.2.1. Giải trình tự gen HA (H5) và phân tích cây phả hệ sử dụng chuỗi
gen H5
3.2.2. Giải trình tự gen NA(N1) và phân tích cây phả hệ dựa trên chuỗi
nucleotide của gen N1
3.2.3. Giải trình tự gen M và phân tích cây phả hệ dựa trên chuỗi
nucleotide của gen M
3.3. Xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của chủng virus A/H5N1 clade
7 A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
3.3.1. Tính thích ứng trên phôi gà (xác ñịnh chỉ số EID50)

3.3.2. Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà (xác ñịnh chỉ số TCID50)
3.3.3. Kết quả xác ñịnh ñộc lực của virus cúm A/H5N1clade 7
3.3.4. Kết quả ñánh giá ñộ bài thải virus trên ñộng vật thí nghiệm
3.3.5. ðánh giá khả năng nhiễm ña phủ tạng của virus cúm
A/H5N1clade 7
3.3.6. Xác ñịnh ñặc tính kháng nguyên của các chủng virus cúm A/H5N1
clade 7 phân lập ở Việt Nam.
3.3.7. ðánh giá khả năng bảo hộ của vacxin Re-1 ñối với virus cúm
A/H5N1HA clade 7 trên gà.
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
Tài liệu tham khảo
Công trình công bố liên quan ñến luận án
Phụ lục

59
59
62
62
71
78
84
84
89
92
103
106
113
116
121
124

135
136

iv
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tên ñầy ñủ

AI
CDC
CEF
CK
cs
Ct
DEF
Dk
EID50
ELD50
FAO
HA
HI
HPAI
IHC
LPAI
M
MDCK

MDEF
MDT
MEGA
NA
NCBI
NCVD
NP
NS
OIE
PA
PB1
PB2
RNA
RRT-PCR
TCID50
WHO

Avian Influenza
Center of Disease Control and Prevention
Chicken Embryo Fibroblast
Chicken
cộng sự
Cycle Threshold
Duck Embryo Fibroblast
Duck
Embryo Infection Dose 50%
Embryo Lethal Dose 50%
Food and Agriculture Organisation
Hemaglutinin
Hemagglutination Inhibition

Highly Pathogenic Avian Influenza
Immuno Histochemistry
Low Pathogenic Avian Influenza
Matrix protein
Mardine Darby Canine Kidney
Muscovy Duck Embryo Fibroblast
Mean Death Time
Molecular Evolution Genetic Analysis
Neuraminidase
National Center for Biotechonology Information
National Centre for Veterinary Diagnostics
Nucleoprotein
Non-strutural protein
Office International des Epizooties
Polymerase acidic
Polymerase basic protein 1
Polymerase basic protein 2
Ribonucleic acid
Realtime Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction
Tissue Culture Infection Dose 50%
World Health Organisation

v
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp


DANH MỤC CÁC BẢNG
TT
1.1.
1.2.

1.3
1.4
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
3.6.
3.7.
3.8.
3.9.
3.10.
3.11.
3.12.
3.13.
3.14.
3.15.
3.16.
3.17.

Tên bảng
Trang
Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo
6
cho WHO ñến 4/2012

Một số ñặc ñiểm triệu chứng của gia cầm mắc cúm A/H5N1
34
Một số loại vacxin phòng cúm gia cầm H5N1 ñang ñược sử dụng
40
trên thế giới
Kết quả tiêm phòng vacxin cúm gia cầm chương trình quốc gia
41
Bảng tổng hợp số liệu tính toán theo phương pháp Reed-Muench
49
Primer và probe ñể phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1
52
Chuẩn bị mix (hỗn hợp phản ứng cho Realtime RT-PCR
52
Chuẩn bị mix (hỗn hợp phản ứng) RT-PCR giải trình tự gen
55
Trình tự primer ñể giải trình tự gen(theo quy trình CDC)
56
Kết quả xét nghiệm virus từ chương trình giám sát biên giới
60
Kết quả giải trình tự gen và phân tích cây phát sinh loài các mẫu
62
virus cúm A/ H5N1 phát hiện ở Lạng Sơn
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 dùng ñể so sánh và lập cây
66
phát sinh loài dựa trên gen H5
69
So sánh mức ñộ khác biệt về di truyền trên gen HA của 5 chủng
virus A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu
Danh sách các chủng virus A/H5N1 sử dụng ñể so sánh và lập cây
74

phát sinh loài dựa trên N1
So sánh mức ñộ khác biệt về di truyền trên gen N1 của 5 chủng
77
virus cúm A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 sử dụng ñể so sánh và lập
80
cây phát sinh loài dựa trên gen M
So sánh mức ñộ khác biệt về di truyền trên gen M của 5 chủng virus
83
cúm A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu
Theo dõi thời gian gây chết phôi
85
Kết quả theo dõi tỷ lệ sống/chết của phôi trứng khi gây nhiễm virus
86
A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
Theo dõi thời gian virus gây nhiễm lên tế bào CEF
89
Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào trên CEF khi gây nhiễm virus
90
A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
93
Các axit amin vùng “cleavage site” của virus cúm H5N1 ñộc lực cao
clade 7 và một số chủng virus tham chiếu
Kết quả ñánh giá ñộc lực của virus cúm A/H5N1clade 7 trên gia
95
cầm
Kết quả theo dõi lâm sàng của gà thí nghiệm
96
ðánh giá ñộ bài thải virus khi gây nhiễm bằng virus A/chicken/
103

Vietnam/NCVD-016/2008
Kết quả xét nghiệm RRT-PCR ñối với một số loại phủ tạng gà gây
107
bệnh bằng virus A/H5N1 clade 7 và chuyển ñổi sang nồng ñộ virus
vi

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp


3.18.
3.19.
3.20.

Phân bố bệnh tích vi thể và nhuộm IHC phát hiện kháng nguyên
virus cúm H5N1A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
Kết quả xác ñịnh ñặc tính kháng nguyên của virus cúm A/H5N1
clade 7 phân lập ñược bằng phản ứng HI
Kết quả theo dõi thí nghiệm công cường ñộc gà tiêm vacxin cúm gia
cầm H5N1 Re-1

109
115
118

vii
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp


DANH MỤC CÁC HÌNH
TT

1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.
1.7.
1.8.
1.9.
1.10.
1.11.
1.12.
1.13.
1.14.
1.15.
1.16.
2.1.
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
3.6.
3.7.
3.8.
3.9.
3.10.

Tên hình
Trang

Bản ñồ phân bố các ca cúm A/H5N1trên thế giới (tính ñến 2009)
5
Biểu ñồ biểu diễn dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 theo thời
8
gian
(A)Mô phỏng hình thái của virus cúm, (B) Hình thái kính hiển vi
10
ñiện tử
Mô hình hệ gen virus cúm A
14
Mô phỏng cấu trúc kháng nguyên Haemalutinin và Neurminidase
15
Sơ ñồ minh họa ñột biến ñiểm của các phân ñoạn genvirus cúm A
20
Sơ ñồ minh họa hiện tượng trộn kháng nguyên của virus cúm
20
A/H5N1và H3N2
Cây phả hệ dựa trên gen HA các virus cúm A/H5N1 ñộc lực cao
22
Sự tiến hóa của các clade virus A/H5N1 theo thời gian
23
Sự phân bố của các clades virus cúm gia cầm trên thế giới từ 200324
2009
Thời gian xuất hiện của các clade H5N1 ở Việt Nam từ 2001-2007
25
Hình 1.12. Sự phân bố các clade virus A/H5N1 khác nhau theo
27
không gian
Các genotype của virus cúm gia cầm A/H5N1 ñộc lực cao
28

Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A
30
Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ
31
Minh hoạ vùng “Cleavage site” của virus cúm ñộc lực thấp(LPAI)
33
Sơ ñồ bố trí primer giải trình tự gen H5, N1 và M virus cúm A/H5N1
52
Hình 3.1. Bản ñồ nơi phát hiện ñược virus A/H5N1 clade 7
61
Cây phả hệ dựa trên gen H5 của các virus A/H5N1 clade 7
62
Hiện tượng chèn và xóa các axit amin tại vị trí cleavage site của các
71
chủng virus A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam
Cây phả hệ dựa trên gen N1 các virus A/H5N1 clade 7
73
Cây phả hệ dựa trên gen M các virus A/H5N1 clade 7
79
Kiểm tra ñặc tính gây ngưng kết hồng cầu(phản ứng HA)
87
Kết quả kiểm tra bệnh tích phôi bsau khi gây nhiễm bằng chủng virus
88
cúm A/H5N1 clade 7 phân lập tại Việt Nam
Hình ảnh tế bào CEF và DEF khi phân lập và chuẩn ñộ virus
92
Một số hình ảnh bệnh tích ñại thể gà gây bệnh bằng virus A/H5N1
98
Clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD 016)
Môt số hình ảnh thể hiện bệnh tích ñại thể ở gà gây bệnh bằng

99
virus A/H5N1 clade 2.3.4 và 2.3.2
viii

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp


3.11.
3.12.
3.13.
3.14.

Diễn biến sống/chết của gà sau khi gây nhiễm bằng chủng virus
A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
Phân bố virus ở các cơ quan phủ tạng qua xét nghiệm RRT-PCR
(chuyển ñổi sang log10)
Một số hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch phủ tạng gà gây bệnh
Một số hình ảnh bệnh tích vi thể trên phủ tạng gà ñược gây bệnh

100
107
110
111

ix
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp


MỞ ðẦU
Việt Nam là một ñất nước nông nghiệp với khoảng 70% dân số sống ở

nông thôn và gắn liền với lĩnh vực sản xuất nông nghiệp như trồng trọt và chăn
nuôi. Trong những năm gần ñây, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gia
cầm nói riêng ñang ngày càng phát triển và dần chiếm vị trí quan trọng trong nền
nông nghiệp nước ta. Trong những năm qua do các tiến bộ kỹ thuật về giống,
thức ăn, quản lý, thú y cùng với các biện pháp khuyến khích chăn nuôi của nhà
nước làm cho ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta phát triển với tốc ñộ tương ñối
cao. Sự phát triển ñó ñã mang lại hiệu quả kinh tế cho người dân, tạo nhiều cơ
hội việc làm và nâng cao ñời sống vật chất tinh thần cho người dân, góp phần xóa
ñói giảm nghèo và tạo cơ hội vươn lên làm giàu cho nhiều hộ gia ñình ñồng thời
góp phần vào nền kinh tế quốc gia.
Tuy nhiên, bên cạnh với sự phát triển ñó cũng có rất nhiều thách thức cho
ngành chăn nuôi ñó là sự gia tăng và diễn biến ngày càng phức tạp của dịch bệnh,
trong ñó phải kể ñến bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 ñộc lực cao thuộc
họ Orthomyxoviridae gây ra. ðây là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc ñộ
lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh.
Bệnh cúm gia cầm xảy ra lần ñầu tiên ở Việt Nam vào cuối năm 2003 ñầu
năm 2004 ñược ghi nhận là do virus cúm A/H5N1 ñộc lực cao (HPAI). Kể từ ñó
cho ñến nay dịch cúm gia cầm H5N1 vẫn liên tục xảy ra ở Việt Nam tuy nhiên
quy mô dịch ñã thay ñổi trở nên nhỏ và lẻ tẻ.
Cũng trong những năm qua, ở các nước trong khu vực châu Á như Nhật
Bản, Hàn quốc, Trung quốc, Lào Thái lan, Indonesia… dịch cúm gia cầm cũng
xảy ra. Việc khống chế dịch cúm gia cầm ñã ñược tiến hành một cách mạnh mẽ,
ñã giảm thiểu ñi nhiều những thiệt hại mà virus này gây ra nhưng những nguy cơ
bệnh tái phát vẫn luôn tồn tại.
Virus cúm A/H5N1 ñộc lực cao không những nguy hiểm cho gia cầm mà
còn rất nguy hiểm ñối với con người. Từ năm 2003 cho ñến nay, thế giới ñã ghi
nhận virus cúm gia cầm ñã gây nhiễm lên người ở 15 nước, với 602 ca bệnh và
355 người ñã chết. (WHO,2012).

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

1


Virus cúm A/H5N1 có ñặc tính là biến chủng rất nhanh và ñến nay ñã có
nhiều biến chủng H5N1 ñã ñược phát hiện và phân lập ở nhiều nước khác nhau
từ châu Á sang châu Âu. ðặc biệt ở Việt Nam chúng ta ñã cũng ñã phát hiện
ñược nhiều chủng virus A/H5N1 khác nhau ñược phân loại vào các nhánh
(clade) khác nhau như: clade 1, clade 3, clade 2.3.4, clade 2.3.2.1…(Cục Thú y,
2012)
ðầu năm 2008 Trung tâm Chẩn ñoán Thú y Trung ương ñã phát hiện và
phân lập ñược một số chủng virus A/H5N1 mới thuộc clade 7 từ gà nhập lậu ở
biên giới. Virus cúm A/H5N1 mới này trước ñó mới chỉ ñược phát hiện ở gà
Trung quốc và từng ñược phát hiện trên người năm 2003. Trung Quốc ñã sản
xuất vacxin (Re-4) từ chủng virus A/H5N1 thuộc clade 7 và ñã sử dụng phòng
bệnh ở một số ñịa phương từ năm 2006 (Chen và cs, 2008). Với thực tế có rất
nhiều gà nhập lậu vào Việt Nam qua biên giới cho thấy nguy cơ virus này sẽ xâm
nhập và nhiễm cho các ñàn gia cầm của Việt Nam và có nguy cơ ñối với cả con
người.
Vì vậy việc tiến hành nghiên cứu về ñặc tính sinh học của virus này như
khả năng sinh bệnh ñối với các ñối tượng gia cầm khác nhau, khả năng bảo hộ
của vacxin hiện hành ñối với ñối với gia cầm chống lại virus trên là cần thiết. Từ
ñó có những phương án chủ ñộng tích cực ñể ñối phó nếu virus này xâm nhập
vào ñàn gà nội ñịa nước ta.
ðứng trước thực tế trên chúng tôi tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu một số
ñặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam”.
Nhằm góp phần cung cấp thông tin làm cơ sở cho việc xây dựng biện pháp phòng
chống bệnh cúm gia cầm.
Mục tiêu của ñề tài
- Xác ñịnh ñặc tính di truyền học, tính kháng nguyên và ñộc lực của cúm
A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam năm 2008;

- Xác ñịnh ñược hiệu lực của vacxin H5N1 Re-1, góp phần xây dựng biện
pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm.
Ý nghĩa khoa học của ñề tài
ðây là một trong những nghiên cứu ñầu tiên ở Việt Nam có hệ thống về
ñặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1 clade 7.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
2


- Làm cơ sở tham khảo cho việc nghiên cứu sự biến ñổi của virus cúm
gia cầm tiếp theo, ñặc biệt là ñối với ngành thú y.
- Kết quả nghiên cứu của ñề tài có thể ñược sử dụng phục vụ cho công
tác giảng dạy
Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài
- Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc hiểu biết rõ hơn về một số ñặc
tính sinh học của virus cúm gia cầm.
- Kết quả nghiên cứu có thể ñược sử dụng làm tiền ñề ñể tiếp tục nghiên
cứu các virus cúm gia cầm thể ñộc lực cao H5N1, cũng như cúm gia cầm ñộc lực
thấp, và các loại virus cúm khác trên ñộng vật.
- Khuyến cáo cho việc sử dụng vacxin cúm phù hợp với nhánh virus mới
lưu hành trong thực tế.
- Chủ ñộng trong công tác phòng ngừa sự xâm nhập của chủng virus cúm
mới vào nội ñịa.
Những ñóng góp mới của ñề tài
- ðã xác ñịnh ñược các ñặc tính sinh học của virus cúm gia cầm ñộc lực
cao H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam, như ñặc tính kháng nguyên, ñộc lực, khả
năng nhân lên trên ñộng vật cảm nhiễm, môi trường nuôi cấy.
- ðã xác ñịnh ñược ñặc tính di truyền, cụ thể là giải trình tự các gen HAH5, NA-N1 và gen Matrix (M) của virus cúm A/H5N1 clade 7.
- ðánh giá ñược khả năng bảo hộ của vacxin H5N1 Re-1 với virus cúm
A/H5N1 clade 7 tại Việt Nam.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
3


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Lịch sử bệnh cúm gia cầm

1.1.1. Lịch sử bệnh trên thế giới
Cúm gia cầm lần ñầu tiên ñược phát hiện ở Italia vào năm 1878 với tên
gọi là dịch hạch gà (Fowl plague) (Stubb và cs, 1965). Nhưng mãi tới năm 1901
mới xác ñịnh ñược yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua
màng lọc và tới năm 1955 mới xác ñịnh ñược nguyên nhân chính xác nguyên
nhân gây bệnh cúm gia cầm là virus cúm type A thông qua kháng thể bề mặt
A/H7N1 và A/H7N7 gây chết nhiều ở gà và gà tây và các loài ñộng vật khác
(Beard và cs, 1998).
ðã xuất hiện 8 ñại dịch cúm trong thế kỉ XVII, 5 ñại dịch trong thế kỉ
XX. ðại dịch cúm lần ñầu tiên ñược xác nhận ñã xảy ra vào những năm 1510 và
1580. Kể từ ñó ñến năm 2003, trên toàn thế giới ñã có những ñợt dịch lớn như:
- Năm 1918 – 1919, một ñại dịch cúm ñã nổ ra với mức ñộ trầm trọng ñã
gây tử vong khoảng 20 – 40 triệu người trên toàn thế giới. Vào thời kì ñó, chưa
có các phương pháp phòng thí nghiệm ñể giám ñịnh tác nhân gây bệnh. Các số
liệu có sức thuyết phục sau này cho thấy ñại dịch này do virus cúm type
A/H1N1.
- Cúm Châu Á – Asian Flu do virus cúm type A/H2N2 gây nên, bắt ñầu
từ Hong Kong năm 1957;
- Cúm Hong Kong – Hong Kong Flu do virus cúm type A/H3N2, xảy ra

năm 1968;
- Cúm Nga – Russia flu” do virus cúm type A(H1N1) xảy ra năm 1977.
Trong ñó, ñại dịch cúm “Châu Á” và “Hong Kong” , người ở mọi lứa tuổi
ñều mắc và tỉ lệ tử vong cao ñặc biệt ñối với người trên 65 tuổi và người có tiền
sử về bệnh tim phổi (Kilbourne, 2006).
Chủng virus cúm A/H5N1ñược phát hiện lần ñầu tiên gây bệnh dịch trên
gà tại Scotland vào năm 1959 và có thể là biến thể H5N1 ñầu tiên trên thế giới.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
4


Năm 1997 ở Hong Kong, lần ñầu tiên virus cúm gia cầm H5N1 ñãã gây ra ổ dịch
trên gia cầm
m và lây sang người
ngư làm 18 ngưòi nhiễm bệnh, 6 ngườii ch
chết và hàng
triệu gia cầm ñã bị tiêu huỷ
hu nhằm ngăn chặn dịch
ch lây lan. ðây là llần ñầ
/H5N1gây bệệnh ñược trên người (Wu và cs, 2008).
Từ
ừ cuối năm 2003 ñến 2012, dịch cúm gia cầm H5N1 bùng
bùng phát ở nhiều
nước
ớc châu Á, trong ñó có Việt Nam, lây lan nhanh chóng và
và liên ttục tái bùng
phát hàng năm ở nhiều nước
n
trên thế giới. ðến nay ñã có nhiều nư

ước và vùng
lãnh thổ xuất hiện dịch
h cúm gia cầm
c H5N1 gồm Hàn Quốc,
ốc, Nhật Bản, Thái Lan,
Campuchia, Lào, Indonesia, Trung Quốc,
Quốc, Malaysia, Hong Kong, Việt Nam.
Ngoài ra, có 7 nước vàà vùng lãnh thổ
th có dịch cúm gia cầm nhưng
ưng khác ch
chủng
gồm: Pakistan, Hoa Kì,
ì, Canada, Nam Phi, Ai Cập,
C
Cộng hoà dânn ch
chủ nhân dân
triều tiên
ên và ðài Loan. Tính ñến
ñ tháng 4-2012 ñã có tổng số 55 nước,
ớc, vvùng lãnh
thổ bùng phát dịch
ịch cúm làm
l
250 triệu gia cầm chết hoặc bị tiêu
êu hu
huỷ bắt buộc
(WHO, 2008).

/H5N1trên gia cầm hoặc chim hoang dãã
Các nước có

/H5N1trên người
Hình 1.1. Bản ñồ phân bố
b
/H5N1trên thế giớii (tính ñ
ñến
2009)(WHO-2010)

Trường ðại Học Nông Nghiệpp Hà Nội
N – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp


Bảng 1.1. Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo cho WHO ñến 4/2012 (WHO
2012)
2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

Total

Quốc gia
Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death
Ajerbaijan

8

5

Bangladesh

1

Cambodia
China

1

1

4

4

2

2

1

1

1

8

5

13

8

5

3

4

2
1
4

7

4

3

8

5

6

0

1

1

8

8

2

2

20

18

2

1

1

1

1

1

42

28

1

0

Djibouti

1

Egypt

18

10

25

9

8

4

39

4

29

13

39

15

9

5

167

60

55

45

42

37

24

20

21

19

9

7

12

10

5

5

188

156

3

2

3

2

2

2

1

0

Indonesia

20

13

Ỉraq
Lao PDR

2

Myanmar

1

Nigeria

1

1

1

1

Pakistan

3

1

3

1

Thailand

17

12

5

2

Turkey
Vietnam

3

3

29

20

61

19

Total

4

4

46

32

98

43

2

3

3

25

17

12

4

12

4

115

79

8

5

6

5

5

5

7

2

88

59

44

33

73

32

48

24

62

34

4

2

123

61

24

15

602

355

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
6


ðặc biệt, ñã có nhiều người nhiễm và bị tử vong do virus cúm H5N1, theo
thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 của các nước báo cáo với Tổ
chức Y tế thế giới (WHO) từ tháng 12/2003 ñến 12/4/2012, ñã có tới 602 trường
hợp mắc cúm H5N1, trong số ñó 355 trường hợp ñã tử vong chiếm tới 58.9%.
Indonesia, Việt Nam và Ai Cập là 3 nước có số người tử vong và nhiễm cao nhất
do virus cúm A/H5N1trên thế giơi, và ñang ñược Tổ chức Y tế Thế giới-WHO
xác ñịnh là quốc gia “ñiểm nóng” có thể xảy ra dịch cúm mới ở người trong
tương lai cần ñược quan tâm ngăn chặn, do virus cúm A/H5N1có ñược các ñiều
kiện thuận lợi ñể tiến hoá thích nghi và lây nhiễm trên người (WHO, 2008).
1.1.2. Bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam
Bệnh cúm gia cầm xuất hiện lần ñầu tiên ở Việt Nam vào cuối tháng
12/2003 (Bùi Quang Anh, 2005; BCðQG, 2005) do virus cúm gia cầm H5N1
ñộc lực cao (HPAI) gây ra. Sau ñó liên tục tái phát và thường vào lúc chuyển
mùa, nhất là vụ ðông – Xuân. Theo Cục Thú y, tính tới năm 2010 thì có 6 ñợt
dịch (epidemic) cúm gia cầm H5N1 xảy ra:
- ðợt 1: từ tháng 12/2003 ñến tháng 3/2004: dịch bệnh ñã xảy ra ở 2.574

xã, phường, 381 huyện, thị thuộc 57 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh,
chết và tiêu huỷ là 43,9 triệu con (gà: 30,4 triệu; thuỷ cầm: 13,5 triệu). Trong
năm 2003 có 3 ca tử vong ở người do virus cúm H5N1.
- ðợt 2: từ tháng 4 ñến tháng 11/2004: dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ
ở các hộ gia ñình chăn nuôi gia cầm, bệnh xuất hiện ở 46 xã, phường tại 32
huyện, quận, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành. Thời gian cao ñiểm nhất là tháng 7, sau
ñó giảm dần, ñến tháng 11 cả nước chỉ có 1 ñiểm phát dịch. Tổng số gia cầm mắc
bệnh, chết và tiêu huỷ là 84.078 con (gà: 55.999, vịt: 8.132). Trong năm 2004, có
29 ca H5N1 ở người, có 20 ca tử vong.
- ðợt 3: từ tháng 12/2004 ñến tháng 5/2005: dịch ñã xuất hiện ở 670 xã tại
182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố. Số gia cầm tiêu huỷ là 470.495 gà, 825.689
vịt, ngan. Trong năm 2005, có 61 ca bị nhiễm virus cúm A/H5N1 ở người, trong
ñó có 19 ca tử vong.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
7


- ðợt 4: từ tháng 10/2005 ñến 01/2006: dịch xảy ở cả 3 miền với 24 tỉnh,
thành tái phát. Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 3.972.763 con, trong ñó, gà:
1.338.523; thuỷ cầm và loài khác: 2.135.081.

Hình 1.2. Biểu ñồ biểu diễn dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 theo
thời gian (Cục Thú y, 2012)
- ðợt 5: bắt ñầu và kéo dài trong suốt năm 2007. Dịch không tập trung mà
rải rác, lẻ tẻ ở khắp nơi và có thể chia nhiều ñợt:
Từ 12/2006 ñến 3/2007 dịch xảy ra trên 83 xã, phường của 33 quận,
huyện thuộc 11 tỉnh, thành. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là
103.092 con, trong ñó có 13.622 gà ; 89.472 ngan, vịt.
Từ 5/2007 ñến 8/2007, dịch xảy ra ở 167 xã, phường của 10 huyện, thị

thuộc 23 tỉnh, thành. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 294.894 con
(21.525 gà, ; 264.549 vịt và 8.775 ngan). Sau khi bị khống chế trong vòng 1
tháng, ñến tháng 10/2007, dịch lại tái ở 15 xã, phường của 9 huyện, quận, thị trấn
thuộc 6 tỉnh, thành phố.
Năm 2007 có 8 ca bị nhiễm virus cúm A/H5N1 ở người, trong ñó có 5
người chết.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
8


- ðợt 6: từ ñầu năm 2008: xảy ra rải rác với 74 ñàn gia cầm tại 57 xã,
phường của 40 huyện thị thuộc 21 tỉnh phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu huỷ là
60.090 con, trong ñó có 23.498 gà, 36.592 thuỷ cầm. Năm 2008 có 6 ca mắc
H5N1 ở người và 5 trong số 6 ca ñã tử vong.
Năm 2009, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 68 xã, phường, thị trấn của 34
huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy
trên 127.000 con. Năm 2009 có 5 ca mắc H5N1 ở người và tỷ lệ tử vong là 100%
(5/5).
Năm 2010, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở ít nhất 63 xã, phường của 37
huyện, quận thuộc 24 tỉnh, thành phố, làm hơn 76.000 con gia cầm mắc bệnh,
chết và buộc phải tiêu hủy, trong ñó chủ yếu là vịt (chiếm hơn 70%). Trong năm
2010,

có

7

ca

mắc

H5N1

ở

người

và

có

2

ca

tử

vong

().
1.2. Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm ở Việt Nam
Bệnh cúm gia cầm xuất hiện ở Việt nam từ cuối năm 2003 (Trương Văn
Dung và Nguyễn Viết Không, 2004). Từ ñó ñến nay ñã có nhiều nghiên cứu về
virus và bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam, chủ yếu tập trung nghiên cứu dịch tễ
bệnh, khảo sát sự lưu hành của virus, các phương pháp chẩn ñoán, nghiên cứu
ứng dụng vacxin, xác ñịnh hàm lượng kháng thể sau tiêm phòng, ñiều tra mức ñộ
nhiễm bệnh và giám ñịnh phân tử và phân nhóm hệ phả virus gây bệnh, nghiên
cứu sản xuất và thử nghiệm vacxin.
Nghiên cứu ñịnh type, biến ñổi di truyền và gen học tiến hóa của virus cúm
A/H5N1 ñược các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những

tháng ñầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Những chuỗi gen giúp
xác ñịnh subtype H5, subtype N1 và các gen cấu trúc ñã ñược Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện
Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen (Lê Thanh Hòa, 2006, Dung
Nguyen T và cs, 2008). Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và
N1, các tác giả khẳng ñịnh nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và
người tại Việt Nam cùng nhóm với virus A/H5N1 phân lập tại Trung Quốc
(Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lê Thanh Hòa, 2006; Muramoto và cs, 2005).

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
9


Các biến chủng H5N1 của Hong Kong, Trung Quốc phân lập những năm 1997 2001 và Hàn Quốc, ðài Loan (phân lập năm 2003) ñều có nguồn gốc từ chim cút
và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng ðông (Trung Quốc), ñó là các
biến chủng thuộc dòng Quảng ðông (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lê Thanh
Hòa, 2006; Lê Trần Bình và cs, 2006). Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở
gia cầm và người tại Việt Nam là cúm A/H5N1type A thuộc thế hệ mới ñã có
biến ñổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1
từ vùng ñịa lý Nam Trung Quốc và Hong Kong (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004;
Lee và cs, 2007; Simmons và cs, 2007). Các chủng phân lập những năm 20042006 ñã ñược nghiên cứu khá chi tiết về góc ñộ gen học và quan hệ phân tử với
các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng ñịnh virus A/H5N1 vùng Nam
và ðông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-ThailandMalaysia), có những ñặc tính sinh học nhất ñịnh khác với các nhóm vùng Trung
Quốc và Hong Kong (Lee và cs, 2007, Chen và cs, 2006). Năm 2007, xuất hiện
thêm biến chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, ñã và ñang làm phức
tạp thêm vấn ñề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ
tương ñồng kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các chủng phân dòng
Quảng ðông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo hộ miễn dịch (Nguyễn Mạnh
Kiên và cs, 2008, Lê Thanh Hòa và cs, 2008; Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004;
Dung Nguyen T và cs, 2008).

Nghiên cứu vấn ñề gen học kháng nguyên liên quan ñến vacxin và miễn
dịch, ñã ñược Viện Công nghệ sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện
Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Thú y trung ương tiến hành ñó là việc thu thập
gen kháng nguyên H5 và N1 từ các chủng phân lập trên gà, vịt, ngan của Việt
Nam các năm 2004 - 2008, và so sánh với trình tự chuỗi gen cúm A/H5N1 của
các chủng cường ñộc ñương nhiễm và vacxin của Việt Nam và thế giới (Lê
Thanh Hòa, 2004; Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lê Trần Bình và cs, 2006; Lê
Thanh Hòa, 2006; Dung Nguyen T và cs, 2008). Năm 2007, xuất hiện thêm
chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4) tại Việt Nam, qua phân tích gen
giữa

các

chủng

phân

lập

tại

Nghệ

An

(Việt

Nam),

A/Dk/Vietnam/NA114/2007(H5N1) và A/Dk/ Vietnam/NA72/2007(H5N1),

thuộc dòng Phúc Kiến) với các chủng H5N1 thuộc phân dòng Quảng ðông, bao

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
10


gồm một số chủng làm vacxin ñang sử dụng, chỉ ñạt 94% (Lê Thanh Hòa và cs,
2008, Nguyễn Mạnh Kiên và cs, 2008). Nhận ñịnh hỗn hợp virus gây bệnh và
phân hóa kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam cũng ñã ñược xác
nhận qua phân tích hàng chục chủng thu nhận từ nhiều vùng khác nhau trong cả
nước (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Dung Nguyên T và cs, 2008). ðiều này
ảnh hưởng ñến dịch tễ, chẩn ñoán, phòng trừ và quan hệ lây nhiễm trong tự nhiên
(Simmons và cs, 2007; Alexander, 2007), cũng như vai trò miễn dịch của các
chủng cổ ñiển ñang làm vacxin tại Việt Nam và thế giới (vacxin H5N1, chủng
gốc: A-Gs-CN-Gd1(96)(H5N1); vacxin H5N2, chủng gốc: A-Turkey-ENGN28(73)(H5N2);
1378(83)(H5N8));

vacxin
vacxin

TrovacAIV-H5,

chủng

H5N2,

gốc:

chủng

gốc:

A-Tk-IRE-

A-Ck-MEX-Hidalgo-

232(94)(H5N2)) và vacxin H5N1 thế hệ mới chủng NIBRG-14, sử dụng chủng
gốc: A/Vietnam/1194/2004(H5N1) hiện nay ñang ñược Việt Nam nghiên cứu sản
xuất (Lê Trần Bình và cs, 2006; Nguyễn Thị Lan Phương và Lê Văn Hiệp, 2006;
Lê Trần Bình và cs, 2007).
Vấn ñề chẩn ñoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt
cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các
subtype HA và NA ñã ñược các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp
nghiên cứu với các tổ chức thế giới. Phát hiện nhanh H5N1 và các subtype khác
bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử ñã
ñược xây dựng thành phương pháp (Chan và cs, 2007; WHO, 2008). Nghiên cứu
vacxin và miễn dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng ñã có những ñóng góp
nhất ñịnh về tạo chế phẩm kháng nguyên, tạo vacxin di truyền ngược hoặc vector
tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam (Gao và cs, 2006; Bạch Thị
Như Quỳnh, 2006; Lu và cs, 2006; Ge và cs, 2007).
Về nghiên cứu sản xuất vacxin, Viện Công nghệ sinh học tiến thực hiện ñề
tài “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vacxin cúm A/H5N1 cho gia cầm”
và “ðánh giá chất lượng vacxin phòng bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm tại Việt
Nam bằng chủng NIBRG-14” trong giai ñoạn 2006 - 2008, kết hợp với Viện Thú
y, Xí nghiệp thuốc Thú y trung ương (VETVACO), Công ty Thuốc thú y trung
ương II (NAVETCO), Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương, thực
hiện nghiên cứu có ñược vacxin sản xuất từ chủng NIBRG-14 (Lê Trần Bình,

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
11

2007). ðây là chủng vacxin ñược tạo ra bằng công nghệ di truyền ngược tại Viện
Tiêu chuẩn và Kiểm ñịnh sinh học Quốc gia (Vương quốc Anh). Kết quả là ñã
xây dựng ñược các quy trình sản xuất giống, sản xuất vacxin, kiểm nghiệm và
bảo quản vacxin cúm A/H5N1 và kiểm nghiệm miễn dịch ñạt chất lượng bằng
phương pháp huyết thanh học và thử thách cường ñộc (Nguyễn Thị Lan Phương
và Lê Văn Hiệp, 2006; Lê Trần Bình, 2007). Hiện nay, vacxin này ñã ñược
chuyển giao sản xuất tại NAVETCO với tên thương phẩm là NAVETCOVIFLUVAC. Song song với những nội dung nghiên cứu về cúm gia cầm ở gia
cầm, các cơ sở y tế gồm bệnh viện, viện nghiên cứu (Bệnh viện Nhi trung ương,
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vacxin
Nha Trang) ñều có những triển khai các lĩnh vực nghiên cứu liên quan ñến cúm
A/H5N1 trên người (Nguyễn Thị Kim Tiến, 2005; Dinh và cs, 2006; Chan và cs,
2007; Hatta và cs, 2007).
1.3.

Cúm gia cầm và các ñặc ñiểm của virus cúm gia cầm
Cúm gia cầm (Avian Influenza-AI) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của

gia cầm, do nhóm virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. ðây là
nhóm virus có biên ñộ vật chủ rộng, ñược phân chia thành nhiều subtype khác
nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt capsid của hạt virus là HA và NA (De
Wit, 2008). Nhóm virus cúm A có 16 subtype HA (từ H1 ñến H16) và 9 subtype
NA (từ N1 ñến N9). Sự tổ hợp (reassortment) giữa các subtype HA và NA, về
mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau. Mặt khác, virus cúm A có ñặc
tính quan trọng là dễ dàng ñột biến trong gen/hệ gen (ñặc biệt ở gen NA và HA),
hoặc trao ñổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn
tại lây truyền giữa các loài vật chủ dẫn ñến việc tạo nên nhiều subtype có ñộc
tính và khả năng gây bệnh khác nhau.
Họ Orthomyxoviridae ñã ñược phát hiện bao gồm 4 nhóm virus, ñó là:

nhóm virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus
cúm C (Influenza C); và nhóm Thogotovirus. Các nhóm virus khác nhau bởi các
kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở virus

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
12


cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là
Glycoprotein (GP)(Ito và cs, 1998; Murphy và Webster, 1996).
1.3.1. ðặc ñiểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm
Hình thái và cấu trúc của virus cúm gia cầm type A ñuợc Kawaoka và
Murphy (1988) mô tả khá chi tiết. Qua kính hiển vi ñiện tử, virion có dạng hình
khối tròn, hình trứng, hoặc dạng khối dài, ñường kính khoảng 80 – 120 nm.
Nhiều khi virus có dạng hình sợi dài ñến vài µm. Phân tử lượng của hạt virus
khoảng 250 triệu Dalton.

A

B

Hình 1.3. Hình ảnh virus cúm A
(A)Hình ảnh mô phỏng; (B) Hình thái dưới kính hiển vi ñiện tử
( />Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus,
bản chất cấu tạo là màng lipit kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm ñược ñặc
hiệu hóa gắn vào các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai
mấu” nhô ra và phân bố dày ñặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có ñường
kính 4 - 6 nm, ñó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là
glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus (Bender
và cs, 1999; Zhao và cs, 2008). Có sự phân bố không ñồng ñều giữa các phân tử

NA và HA (tỉ lệ khoảng 1 NA/4 HA), ñây là hai loại protein kháng nguyên có vai
trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy
và Webster, 1996; Uiprasertkul và cs, 2007).

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
13


Hệ gen của virus cúm A là RNA sợi ñơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8
phân ñoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành
một sợi duy nhất bên trong vỏ capsid, mã hóa cho 11 protein tương ứng của
virus, trong ñó phân ñoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân ñoạn NS
mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân ñoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1
và PB1-F2 (Ito và cs, 1998; Conenello và cs, 2007) (Hình 1.3.).
- Phân ñoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein
enzyme PB2, là tiểu ñơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của
virus, chịu trách nhiệm khởi ñầu phiên mã RNA virus. Protein PB2 có khối lượng
phân tử theo tính toán khoảng 84.103 Da (trên thực tế là 87.103 Da) (Murphy và
Webster, 1996). Tính thích nghi nhiệt ñộ cơ thể loài vật chủ ñược cho là có liên
quan ñến vị trí axit amin 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu
- thích ứng nhiệt ñộ cơ thể gia cầm khoảng 40oC, còn ở virus thích nghi trên
người là Lys - thích ứng nhiệt ñộ cơ thể người khoảng 37oC) (Subbarao và cs,
1998; Wang và cs, 2009).
- Phân ñoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp
enzyme PB1 - tiểu ñơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá
trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy và Webster,
1996). Gần ñây, ñã có phát hiện thêm một protein (PB1-F2) ñược mã hóa bởi
một khung ñọc mở khác của PB1, có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis (hiện
tượng tế bào chết theo chương trình) (Tumpey và cs, 2002).
- Phân ñoạn 3 (gen PA) có kích thước 2233 bp, là phân ñoạn gen bảo tồn

cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toán
khoảng 83.103 Da (trên thực tế là 96.103 Da). PA là một tiểu ñơn vị của
polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp
RNA của virus (Luong và Palese, 1992).
- Phân ñoạn 4 (gen HA) có ñộ dài thay ñổi tuỳ theo từng chủng virus cúm
A (ở A/H1N1 là 1778 bp; ở H9N1 là 1714 bp; ở H5N1 là khoảng 1704 - 1710
bp). ðây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề
mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA1 và HA2
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
14