Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm a/h5n1 clade 2.3.2.1b phân lập ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
***



ðÀO THANH VÂN



NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA
VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE 2.3.2.1B
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM





LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP









HÀ NỘI , 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
***



ðÀO THANH VÂN



NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA
VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE 2.3.2.1B
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM





CHUYÊN NGÀNH :

THÚ Y
MÃ SỐ :

60.64.01.01




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1

PGS.TS. NGUYỄN VIẾT KHÔNG
2

PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN



HÀ NỘI , 2013


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


ii
LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan: Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này
trung thực, do tôi tiến hành nghiên cứu và thu thập, có sự hợp tác, giúp ñỡ của
các ñồng nghiệp và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.

Tôi xin cam ñoan: Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện ñề tài nghiên cứu và
hoàn thành luận án ñều ñược cảm ơn. Các thông tin trích dẫn trong luận án ñều
chính xác và ñược nêu rõ nguồn gốc.
Hà nội, tháng 11 năm 2013

Học viên

ðào Thanh Vân







Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iii
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:
PGS. TS. Nguyễn Viết Không, Phó viện trưởng Viện Thú y, trưởng bộ
môn Siêu Vi trùng - Viện Thú y và PGS. TS. Nguyễn Bá Hiên - trưởng bộ môn
Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y – Trường ðại học Nông nghiệp Hà nội,
là những người thầy ñã tận tình hướng dẫn và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.
Lãnh ñạo và các cán bộ của Viện Thú y, các bạn ñồng nghiệp của bộ môn
Siêu Vi trùng Viện Thú y ñã tạo ñiều kiện thuận lợi về thời gian và cơ sở vật chất
cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành ñề tài nghiên cứu của
mình; các nghiên cứu sinh tại Viện Thú Y ñã chia sẻ thông tin và hợp tác nghiên
cứu.
Tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y –
Trường ðại học Nông nghiệp Hà nội, ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Ban Giám hiệu, Viện ðào tạo Sau ðại học, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y-

Trường ðại học Nông nghiệp Hà nội ñã tạo ñiều kiện cho tôi ñược theo học
chương trình ñào tạo thạc sĩ tại trường.
Gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã nhiệt tình giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong
quá trình thực hiện, hoàn thành nội dung nghiên cứu và bản luận văn này.
Hà Nội, tháng 11 năm 2013
Học viên


ðào Thanh Vân


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iv
MỤC LỤC

Lời cam ñoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình viii

Danh mục các từ viết tắt ix

MỞ ðẦU 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm 3
1.1.1. Khái niệm bệnh cúm gia cầm 3
1.1.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm 3
1.1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới 4
1.2. ðặc ñiểm sinh học của vi rút cúm type A 5
1.2.1. ðặc ñiểm phân loại hình thái và cấu trúc 5
1.2.2. ðặc tính kháng nguyên của vi rút cúm type A 7
1.2.3. Các phương thức biến ñổi kháng nguyên 9
1.2.4. ðộc lực của vi rút 10
1.2.5. Nuôi cấy và lưu giữ vi rút cúm gà 12
1.3. Tiến hóa và hình thành genotype của vi rút cúm gia cầm 12
1.3.1. Sự tiến hóa của vi rút cúm A/H5N1 12
1.3.2. Tiến hóa của kiểu hình H5 15
1.3.3. Khả năng thích ứng ña vật chủ của vi rút cúm A/H5N1 17
1.4. Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 17
1.5. Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm 19
1.5.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm 19
1.5.2. Bệnh tích 20
1.6. Tình hình dịch và nghiên cứu về cúm gia cầm ở Việt Nam 20
1.6.1. Bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam 20


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


v
1.6.2. Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm trong nước 24
Chương 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28
2.1. ðối tượng và nội dung 28

2.1.1. ðối tượng 28
2.1.2. Nội dung 28
2.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 28
2.3. Nguyên liệu 28
2.3.1. Tế bào, vi rút và sinh phẩm 29
2.3.2. Môi trường, sinh phẩm 29
2.3.3. Máy, thiết bị, vật liệu và dụng cụ 29
2.4. Phương pháp nghiên cứu 30
2.4.1. Phương pháp phân lập vi rút trên phôi trứng gà 30
2.4.2. Phương pháp tiếp ñời (hồi phục) vi rút chủng ñã phân lập 31
2.4.3. Xác ñịnh chỉ số EID
50
31
2.4.4. Xác ñịnh chỉ số TCID
50
31
2.4.5. Phương pháp Reed-Muench 34
2.4.6. Phương pháp gây bệnh cho ñộng vật thí nghiệm 34
2.4.7. Phương pháp HA, HI 35
2.4.8. Phương pháp xác ñịnh MDT 36
2.4.9. Phương pháp tính chỉ số IVPI 36
2.4.10. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide và cây phả hệ 37
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39
3.1. Giám ñịnh ñặc tính vi rút cúm gia cầm A/H5N1 phân lập ñược 39
3.1.1. Nguồn gốc của các chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 phân l
ập
ñược
39
3.1.2. ðặc tính di truyền (gene H5) của các chủng vi rút phân lập 40
3.1.3. ðặc tính nuôi cấy trên phôi trứng gà 42

3.2. ðộc lực của vi rút cúm gia cầm A/H5N1 44
3.2.1. Chỉ số EID
50
của các chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 44


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vi
3.2.2. ðặc tính nhân lên trên tế bào MDCK c
ủa các chủng vi rút phân
lập
47
3.2.3. Kết quả xác ñịnh chỉ số IVPI của các chủng vi rút phân lập 48
3.2.4. Trình tự axit amin tại cleavage site của chủng phân lập 50
3.3. ðặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút clade 2.3.2.1B 51
3.4. ðộc lực của vi rút A/Duck/VNBN/06/12 trên gà 54
3.4.1. Kết quả xác ñịnh LD
50
của chủng A/Duck/VNBN/06/12 54
3.4.2. Tính ổn ñịnh ELD
50
và LD
50
của vi rút A/Duck/VNBN/06/12 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 61
Tiếng Việt 61
Tiếng Anh 67

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vii
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 : Sơ ñồ pha loãng vi rút 32

Bảng 2.2 : Sơ ñồ thực hiện chuẩn ñộ vi rút 33

Bảng 2.3 : Bảng tính EID
50
, ELD
50
/TCID
50
theo Reed-Meunch 34

Bảng 2.4 : Bảng tính chỉ số IVPI 37

Bảng 3.1 : Nguồn gốc của các chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 39

Bảng 3.2 : Hiệu giá HA của nước trứng gây nhiễm vi rút cúm 43

Bảng 3.3 : Chỉ số EID
50
và MDT của vi rút cúm trên phôi trứng 44

Bảng 3.4 : Chỉ số TCID
50
của các chủng vi rút cúm trên tế bào MDCK

47

Bảng 3.5 : Chỉ số IVPI của 2 chủng vi rút phân lập 49

Bảng 3.6 : Trình tự Amino acid tại Cleavage site 50

Bảng 3.7 : Chỉ số HI miễn dịch chéo giữa các chủng vi rút phân lập 51

Bảng 3.8 : LD
50
của chủng vi rút A/Duck/VNBN/06/12 trên gà 54

Bảng 3.9 : ELD
50
của vi rút A/Duck/VNBN/06/12 sau tiếp ñời 55

Bảng 3.10: LD
50
của chủng vi rút A/Duck/VNBN/06/12 sau tiếp ñời 57

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


viii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Mô phỏng cấu trúc của vi rút cúm 6
Hình 1.2. Mô phỏng cấu trúc kháng nguyên bề mặt vi rút (Stubb 1965) 8
Hình 1.3. Cây phả hệ dựa trên gene HA vi rút cúm A/H5N1 ñộc lực cao 14

Hình 1.4. Tiến hóa của các clade vi rút cúm A/H5N1 theo thời gian 16

Hình 1.5. Sự xuất hiện các clade H5N1 ở Việt Nam (Hui et al., 2008) 26

Hình 3.1. Phả hệ vi rút cúm gia cầm clade 2.3.2.1 41

Hình 3.2. Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của các vi rút phân lập 43

Hình 3.3.Tương quan (C) của chỉ số EID
50
(A) và MDT (B) của các chủng
vi rút phân lập
45

Hình 3.4. Tương quan giữa chỉ số EID
50
và TCID
50
của vi rút cúm A 48

Hình 3.5. ELD
50
và MDT của vi rút sau tiếp ñời trên phôi trứng 56

Hình 3.6. LD
50
và MDT trên gà của vi rút sau tiếp ñời trên phôi trứng 57

Hình 3.7. Biến ñộng ELD
50
, LD
50
và MDT của vi rút sau tiếp ñời trên phôi
trứng gà
58










Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


ix
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt Tên ñầy ñủ
AI Avian Influenza
CEF Chicken Embryo Fibroblast
CK Chicken
DEF Duck Embryo Fibroblast
Dk Duck
EID
50
Embryo Infectious Dose 50%
FAO Food and Agriculture Organisation
HA Haemaglutinine
HI Haemaglutination Inhibition
HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza
IVPI Intravenous Pathogenicity Index
LD
50
Leathal Dose 50%
LPAI Low Pathogenic Avian Influenza
M Matrix protein
MDCK Mardine Darby Canine Kidney
MDEF Muscovy Duck Embryo Fibroblast
MDT Mean Dead Time
MEGA Molecular Evolution Genetic Analysis
NA Neuraminidase
NP Nucleoprotein
NS Non-strutural protein
OIE Office International des Epizooties
PA Polymerase acid protein 1
PB1 Polymerase basic protein 1

PB2 Polymerase basic protein 2
RNA Ribonucleic acid
RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction
TCID
50
Tissue Culture Infectious Dose 50%
WHO World Health Organisation






Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


1
MỞ ðẦU
Bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao do vi rút cúm A/H5N1 xảy ra ở Việt
Nam cuối năm 2003 ñã gây ra những hậu quả nghiêm trọng ñến ñời sống xã hội,
làm giảm tăng trưởng kinh tế quốc dân và ảnh hưởng ñến sức khỏe con người.
Hàng triệu gia cầm ñã bị thiêu hủy, các vụ dịch cúm gia cầm ñã gây ra những
ñình trệ và thiệt hại lớn về kinh tế. ðầu năm 2004, những ca cúm gia cầm ở
người ñã ñược phát hiện tại Việt Nam và Thái Lan, sau ñó ñến năm 2005, lần
lượt ñược phát hiện tại Campuchia, Trung Quốc, Indonesia và Thổ Nhĩ Kỳ. Vi
rút cúm gia cầm hiện nay ñã lan truyền rộng khắp các quốc gia và có nguy cơ tồn
tại dai dẳng với các biến chủng mới xuất hiện. Nguy cơ dịch cúm gia cầm tái
bùng phát và người nhiễm vi rút cúm gia cầm vẫn luôn tồn tại.
Vi rút cúm A/H5N1 ñộc lực cao không những nguy hiểm cho gia cầm mà
còn rất nguy hiểm ñối với con người. Từ năm 2003 cho ñến nay, thế giới ñã ghi

nhận vi rút cúm gia cầm ñã gây nhiễm lên người ở 15 nước, với 607 ca bệnh và
358 người ñã chết (WHO, 7/2012).
Vi rút cúm A/H5N1 có ñặc tính biến chủng rất nhanh. ðến nay ñã có
nhiều biến chủng vi rút A/H5N1 ñã ñược phát hiện và phân lập ở nhiều nước
khác nhau từ châu Á sang châu Âu. ðặc biệt ở Việt Nam, chúng ta cũng ñã phát
hiện ñược nhiều chủng vi rút A/H5N1 khác nhau ñược phân loại vào các nhánh
(clade) khác nhau như: clade 1, clade 3, clade 2.3.4, clade 2.3.2.1A, clade
2.3.2.1B, clade 7…(Cục Thú y, 2013). Qua theo dõi phân bố về thời gian của các
clade vi rút cúm A/H5N1 cho thấy: Clade 1 xuất hiện ở Việt Nam từ năm 2003
ñến nay; clade 2.3.4 xuất hiện từ năm 2007 ñến năm 2010; clade 2.3.2 xuất hiện
trong năm 2006 sau ñó không xuất hiện và tái xuất hiện trong năm 2010 cho ñến
nay. Số liệu phân tích các mẫu vi rút từ các ổ dịch cúm gia cầm và số liệu giám
sát vi rút cúm cho thấy nhánh vi rút mới (clade 2.3.2) của vi rút cúm A/H5N1 ñã
biến ñổi và phát triển thành 3 nhánh phụ có sự khác biệt lớn về kháng nguyên.
Nhánh phụ 1 (gọi là 2.3.2.1A) lưu hành rộng rãi ở hầu khắp các tỉnh miền Bắc,
Duyên Hải, miền Trung và Tây Nguyên; nhánh phụ 2 (2.3.2.1B) xuất hiện tại


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


2
Nam ðịnh, Thái Bình, sau ñó lần lượt có mặt ở Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Kạn,
Thái Nguyên và Nghệ An Sau khi chúng tôi khởi ñộng nghiên cứu này, nhánh
phụ thứ 3 (2.3.2.1C) xuất hiện tại các tỉnh ở phía Bắc và dần dần thay thế các
nhánh phụ 2.3.2.1 trước ñây.
ðược sự ñồng ý của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và Viện Thú Y,
tại thời ñiểm tháng 6/2012, chúng tôi tiến hành ñề tài:
“Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học của vi rút cúm A/H5N1 clade
2.3.2.1B phân lập ở Việt Nam”.

• Mục tiêu của ñề tài
Hiểu biết rõ hơn về các ñặc ñiểm sinh học của vi rút cúm gia cầm clade
phổ biến nhất (clade 2.3.2.1B) ñang lưu hành ñể có thể ñề xuất một chủng vi rút
chuẩn sử dụng trong nghiên cứu kiểm ñịnh hiệu quả phòng bệnh của văc xin, góp
phần vào công tác phòng chống dịch cúm gia cầm ở nước ta.
• Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những thông tin ñể hiểu biết rõ hơn về
một số ñặc tính sinh học của vi rút cúm gia cầm clade 2.3.2.1B (bao gồm các ñặc
tính về di truyền, phát sinh loài, ñặc tính kháng nguyên và ñặc biệt là về ñộc lực
của vi rút).
Sản phẩm chủng chuẩn của nghiên cứu có thể ñược ñề xuất ñể sử dụng
trong công tác kiểm nghiệm và khảo nghiệm các văc xin phòng cúm gia cầm do
chủng thuộc clade 2.3.2.1 gây ra.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


3
CHƯƠNG I
1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm
1.1.1. Khái niệm bệnh cúm gia cầm
Bệnh cúm gia cầm (avian influenza), là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi
vi rút cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae với nhiều subtype khác nhau.
Bệnh lúc ñầu có tên dịch tả gà (Fowl plague) (Stubb, 1965), từ Hội nghị
Quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ, năm 1981 tên bệnh
ñược gọi là bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm (Highly Pathogenic Avian

Influenza viết tắt là HPAI: vi rút cúm type A có ñộc lực cao) (Beard C.W., 1998).
Bệnh cúm gia cầm HPAI là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có tốc ñộ lây
lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao. Các chủng vi rút gây dịch cúm gia cầm lớn chủ
yếu có genotype loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, ñà ñiểu,
các loại chim. Người tuy nhiễm vi rút cúm gia cầm mang tính cá thể cảm thụ
nhưng sự biến ñổi ñặc tính loài cảm thụ luôn có nguy cơ hình thành ñại dịch cúm
ở người làm cho bệnh cúm gia cầm ñang ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao
giờ hết.
1.1.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm
Năm 412 trước công nguyên, Hippocrate ñã mô tả về bệnh cúm. Năm
1680 một vụ ñại dịch cúm ñược mô tả chi tiết và từ ñó ñến nay ñã xảy ra 31 vụ
ñại dịch ở diện rộng trên thế giới. Ở người, trong hơn 100 năm qua có 4 vụ ñại
dịch cúm xảy ra vào các năm 1889, 1918, 1957, 1968 (Trần Hữu Cổn và Bùi
Quang Anh, 2004).
Năm 1878 ở Italy ñã xảy ra một bệnh gây tử vong rất cao ở ñàn gia cầm và
ñược gọi là bệnh dịch tả gia cầm (Fowl plague), bệnh lần ñầu tiên ñược
Porroncito mô tả (Perroncito E., 1878). Năm 1901, Centanni và Savunozzi phát
hiện căn bệnh là siêu vi trùng qua lọc (Filterable agent) (Centanni E and
Savonuzzi E, 1901), (Stubs E.L, 1943).


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


4
Năm 1955 Achafer ñã xác ñịnh ñược vi rút thuộc nhóm cúm type A
(Schäfer W., 1878) dựa vào kháng nguyên bề mặt, các vi rút A/H7N1 và
A/H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và chim hoang ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Châu Phi,
Trung Cận ðông (Beard C.W, 1998), (Lupiani and Reddy, 2009).
1.1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới

Năm 1963, vi rút cúm type A ñược phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do thủy
cầm di trú lây cho gà (sau ñó ngày càng có nhiều bằng chứng chứng tỏ chim
hoang dã là vật mang và truyền bệnh cho gia cầm nuôi ñặc biệt là các subtype H5
và H7 (Lupiani and Reddy, 2009). Cuối thập kỷ 60, phân type A/H1N1 thấy ở
lợn (Iftimovici, Iacobescu et al., 1979), (Nerome, Ishida et al., 1982a), (Nerome,
Ishida et al., 1982b) và gà tây (Hinshaw, Alexander et al., 1984), (Aymard,
Douglas et al., 1985), tạo nên khả năng vi rút cúm ở ñộng vật có vú có thể lây
nhiễm và gây bệnh cho gia cầm. Vi rút cúm type A/ H1N1 ở lợn truyền cho gà
tây và vi rút phân type A/H1N1 ở vịt truyền cho lợn (Wright, Kawaoka et al.,
1992), (Webster, Wright et al., 1993), (Shu, Lin et al., 1994), (Munster and
Fouchier 2009).
Năm 1971, Beard ñã mô tả chi tiết vi rút gây bệnh và ñặc ñiểm bệnh lý
lâm sàng của gà và gà tây nhiễm A/H7N1 (Beard and Easterday, 1973). Từ năm
1960-1979 bệnh lần lượt ñược báo cáo ở Canada, Mehico, Achentina, Braxin,
Nam Phi, Ý, Pháp, Anh, Hà Lan, Australia, Hồng Kông, Nhật Bản, các nước khu
vực Trung Cận ðông, liên hiệp Anh và Liên Xô (Capua, Mutinelli et al., 2002;
Capua, 2013).
Năm 1977 ở Minesota cúm gia cầm A/H7N7 gây dịch cho gà tây (Mo,
Brugh et al., 1997).
Năm 1983-1984 dịch cúm gà xảy ra do chủng vi rút A/H5N2 ở 3 bang
Pensylvania, Virginia, Newtersey (Mỹ) thiệt hại hơn 19 triệu gà (Suarez and
Senne, 2000), (Yee, Novick et al., 2011). Tại Ireland 270 nghìn vịt tuy không có
triệu chứng lâm sàng nhưng ñã bị tiêu hủy do phân lập ñược vi rút cúm (HPAI)
(Alexander, 2003).


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


5

Năm 1986 dịch cúm gà do chủng H5N2 xảy ra tại bang Victoria, Australia
(Senne, 2003).
Năm 1997 ở Hồng Kông dịch cúm gà do vi rút cúm A/H5N1, ñồng thời
gây tử vong cho con người, toàn bộ ñàn gia cầm của lãnh thổ này ñã bị tiêu hủy.
Dịch cúm gia cầm Hồng Kông năm 1997 ñánh dấu lần ñầu tiên vi rút cúm gia
cầm ñã vượt “hàng rào loài”, 18 người nhiễm bệnh, trong ñó có 6 người chết
(Wu, Chen et al., 2008).
Năm 2003, ở Hà Lan dịch cúm gia cầm xảy ra với quy mô lớn do chủng vi
rút A/H7N7, 30 triệu gia cầm bị tiêu hủy, 83 người lây nhiễm và 1 người chết,
gây thiệt hại về kinh tế hết sức nghiêm trọng (Koopmans, Wilbrink et al., 2004).
Dịch xảy ra gần như ñồng thời ở 11 quốc gia ở châu Á: Nhật Bản, Hàn Quốc,
Thái Lan, Lào, Campuchia, Indonesia, Trung Quốc, Hồng Kông, ðài Loan,
Pakistan và Việt Nam. Sau ñó, dịch tái bùng phát trở lại ở nhiều nước châu Á, lây
lan nhanh chóng sang nhiều nước châu Âu và châu Phi ( Phạm Sỹ Lăng, 2004).
Tính ñến tháng 4-2012 ñã có tổng số 55 nước, vùng lãnh thổ bùng phát
dịch cúm, thiệt hại trên 250 triệu gia cầm. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO,
7/2012), từ năm 2003 ñến nay có 607 người nhiễm bệnh tại 15 quốc gia, trong ñó
có 358 trường hợp tử vong.
1.2. ðặc ñiểm sinh học của vi rút cúm type A
1.2.1. ðặc ñiểm phân loại hình thái và cấu trúc
Họ Orthomyxoviridae gồm có 4 nhóm vi rút là:
- Vi rút cúm A: Gây bệnh cho mọi loài chim, một số ñộng vật có vú và
người,
- Vi rút cúm B: Chỉ gây bệnh ở người,
- Vi rút cúm C: Gây bệnh cho người và lợn,
- Nhóm Thogotovirus.
Vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae có ñặc tính cấu trúc chung là hệ gene
chứa axit Ribonucleic (ARN) một sợi, có cấu trúc là sợi âm [ss (-)ARN], phân

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


6
ñoạn (6-8) mỗi phân ñoạn là một gene chịu trách nhiệm mã hóa cho một ñến một
vài protein của vi rút, với tổng ñộ dài từ 10.000-15.000 nucleotit (tùy loại vi rút).
Hình thái cấu trúc của vi rút cúm A ñược mô phỏng như ở hình 1.1.


Hình 1.1. Mô phỏng cấu trúc của vi rút cúm
Hạt vi rút (virion) có cấu trúc hình khối, ñôi khi có dạng hình khối kéo
dài, ñường kính khoảng 80-120 nm, có khối lượng khoảng 250 triệu dalton.
Vỏ vi rút có bản chất protein có nguồn gốc từ tế bào chủ, chủ yếu bao gồm
các glycoprotein, tạo thành những gai, mấu có ñộ dài 10-14 nm, ñường kính 4-6
nm.
Phân bố trên bề mặt của vi rút là Haemagglutinin (HA) gây ngưng kết
hồng cầu và một loại protein - enzym phá hủy thụ thể của vi rút có tên gọi
Neuraminidae (NA).
Nucleocapsid protein bao bọc lõi vi rút là tập hợp của nhiều protein phân
ñoạn, cấu trúc ñối xứng xoắn, kích thước 130-150 nm. Lõi vi rút có cấu trúc là
axit Ribonucleic sợi âm ở dạng ñơn, tổng ñộ dài 13.500 nucleotit chứa 8 phân
ñoạn mã hóa cho 10 loại protein khác nhau: HA, NA, NP, M1, M2, PB1, PB2,
PA, NS1, NS2.
- Phân ñoạn 1-3: mã hóa cho protein PB1, PB2 và PA là các protein có
chức năng là enzym polymerase ñể tổng hợp axit Ribonucleic của vi rút.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

7
- Phân ñoạn 4: mã hóa cho protein Haemagglutinin (HA) có khả năng gây
ngưng kết hồng cầu, có chức năng bám dính vào thụ thể của tế bào làm hợp nhất
vỏ vi rút với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hòa vi rút. HA
là polypeptit gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng ñoạn oligopeptit ngắn
HA0. Trình tự axit amin mang tính ñặc thù cho
ñặc tính kháng nguyên và tạo
khung cho các motyf
. ðến nay, có 16 motif ñặc trưng cho subtype H (H1-H16).
Thành phần và trình tự axit amin tại HA0 có tính chất quyết ñịnh ñộc lực của vi
rút (Bosch, Garten et al. 1981), (Keawcharoen, Amonsin et al., 2005),
(Gambotto, Barratt-Boyes et al., 2008), (Zhang, Sun et al., 2012).
- Phân ñoạn 5: mã hóa cho Nucleoprotein (NP) một loại phosphoryl
protein mang tính kháng nguyên ñặc hiệu theo nhóm (Group-Specific), có chức
năng bám ARN tạo cấu trúc lõi vi rút (Ribonucleo protein) (Nguyễn Tiến Dũng
và cs, 2004).
- Phân ñoạn 6: mã hóa cho protein enzym Neuraminidae (NA), có chức
năng phân cắt tiền HA sau khi vi rút vào bên trong tế bào nhiễm.
- Phân ñoạn 7: mã hóa cho 2 tiểu phần protein M1 và M2 (Matrix protein)
tham gia vào cấu trúc vỏ (non-glycosyl) và cấu trúc lõi nucleoprotein. M2 là một
tetramer có chức năng giúp cởi bỏ vi rút sau khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm.
M1 có chức năng tham gia vào quá trình tạo chồi vi rút (Castrucci M.R, 1993).
- Phân ñoạn 8 : Có ñộ dài ổn ñịnh (890 nucleotit) mã hóa cho 2 tiểu phần
protein phi cấu trúc NS1 và NS2 có chức năng chuyển ARN từ nhân ra kết hợp
với M1, kích thích phiên mã, và kháng interferon (Sekellick, Carra et al., 2000),
(Zhou, Fu et al., 2007), (Zhu, Yang et al., 2008).
1.2.2. ðặc tính kháng nguyên của vi rút cúm type A
Vi rút cúm type A ñược xác ñịnh subtype dựa trên cơ sở kháng nguyên bề
mặt Haemagglutinin (HA viết tắt là H) và Neuraminidase (NA, viết tắt là N). Cả
hai protein này ñóng vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ, trong ñó

Haemagglutinin có vai trò quyết ñịnh về kháng nguyên tính và ñộc lực của vi rút
cúm A.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


8
Protein HA (Haemagglutinin)
Haemagglutinin là một glycoprotein màng type I (cấu trúc thuộc nhóm
lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro).
Kháng thể ñặc hiệu kháng HA có thể phong tỏa quá trình ngưng kết hồng cầu,
còn gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI- Haemagglutinin
Inhibitory antibody).

Hình 1.2. Mô phỏng cấu trúc kháng nguyên bề mặt vi rút (Stubb 1965)
Trên mỗi hạt vi rút, có khoảng 400 phân tử HA. Phân tử HA có dạng hình
trụ, dài khoảng 130 Angstron (Å), cấu tạo từ ba tiểu phần có cấu trúc giống nhau
(trimer), mỗi tiểu phần (monomer) ñược tạo thành từ hai tiểu ñơn vị HA1 (36
kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (S-S).
Glycosyl hóa chủ yếu xảy ra ở tiểu ñơn vị HA2, nằm ở mặt vỏ ngoài của capsid,
phần móc nối bên trong do HA1 ñảm nhiệm và không ñược glycosyl hóa. Cấu
trúc này tạo nên ñiểm gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào
ñích.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


9

Quá trinh xâm nhiễm tế bào ñược khởi ñộng bằng sự nhận biết của HA với
thụ thể ñặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt tế bào cảm thụ. ðiểm
bám dính ñược quyết ñịnh ở vị trí tương ứng với các axit amin 226 (aa226) của
HA
1
. Thành phần của các axit amin tại vị trí này là yếu tố quyết ñịnh tính ñặc
hiệu loài. ðối với ñường hô hấp của gia cầm, Glycine226 là axit amin ñược nhận
biết bởi thụ thể Gal α-2,3 sialic acid. Thành phần axit amin ở một số vị trí gần
ñiểm bám như Glutamine 222, Glycine 224, cũng có ảnh hưởng ñến quá trình
xâm nhập tế bảo chủ của vi rút. Có thể coi thành phần axit amin tại những vị trí
này là chỉ thị phân tử của các subtype H của vi rút.
Protein NA (Neuraminidase)
Protein neuraminidase còn gọi là sialidase là một protein enzyme có bản
chất là glycoprotein gắn trên bề mặt capsid của vi rút cúm A, mang tính kháng
nguyên ñặc trưng theo từng subtype NA trong số 9 subtype hiện lưu hành.
Subtype N1 - N9 có ở vi rút cúm gia cầm, hai subtype N1 và N2 chủ yếu tìm thấy
ở vi rút cúm A gây bệnh cho người. Mỗi capsid có khoảng 100 phân tử NA nằm
xen giữa các phân tử HA, phần có hoạt tính ñược tạo thảnh bởi cấu trúc 4 tiểu
ñơn vị, vùng kỵ nước giúp NA bám vào vỏ capsid.
Hoạt tính cắt sialic acid ñóng vai trò quan trọng trong giai ñoạn “hòa
màng”, ñẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gene của vi rút vào
trong bào tương tế bào nhiễm. Hoạt tính của NA bị ức chế bởi các cấu trúc phân
tử như Oseltamivir; biệt dược Tamiflu tác ñộng ức chế hoạt tính của enzyme theo
cơ chế này.
1.2.3. Các phương thức biến ñổi kháng nguyên
Có hai phương thức chủ yếu làm biến ñổi ñặc tính kháng nguyên ở vi rút
cúm A : Trôi trượt và ñảo dạng.
Trôi trượt kháng nguyên (antigenic drift)
Trôi trượt kháng nguyên là một quá trình diễn ra thường xuyên, từ từ xảy
ra do ñột biến ñiểm. Trong tự nhiên, ñột biến ñiểm thường xảy ra ở tần suất trung

bình 1/10.000 nucleotide, nghĩa là gần như mỗi hạt vi rút mới ñược sinh ra ñều


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


10
chứa ñựng một ñột biến ñiểm trong hệ gene. Tùy thuộc vào vị trí ñột biến mà ñặc
tính protein mã hóa có sự thay ñổi. Sự thay ñổi kháng nguyên tính chủ yếu phụ
thuộc vào hai loại protein Haemagglutinin và Neuramidase, thành phần chính của
vỏ vi rút bề mặt. Tuy nhiên, sự tích lũy của quá trình ñột biến ñiểm là cho vi rút
sau một số lần nhân lên nhất ñịnh có ñược tính trạng mới (kháng nguyên trôi
trượt dần khỏi ñặc tính kháng nguyên chung của quần thể) (Abbas, Spackman et
al., 2011). Thay ñổi thường xuyên có thể ñược xem là một phương thức vi rút
trốn thoát khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ : một vật chủ nhiễm một vi rút
nhất ñịnh, sản sinh kháng thể ñặc hiệu kháng vi rút. Một thời ñiểm nào ñó một vi
rút « mới » xuất hiện trong quần thể vi rút mà kháng thể không thể nhận biết. Kết
quả là ñặc tính di truyền học (trình tự nucleotid của hệ gene) không thay ñổi
nhiều nhưng vi rút ñã có ñược tính trạng mới (ñặc tính kháng nguyên thay ñổi so
với vi rút thủy tổ (Medeiros, Naffakh et al., 2004), (Velkov, Thompson et al.,
2011), (Rockman, Camuglia et al., 2013).
ðảo dạng kháng nguyên (antigenic shift)
Thường do quá trình tái tổ hợp của 2 hay nhiều vi rút cúm A ñồng nhiễm
tạo ra vi rút mới có kiểu hình khác biệt mang tính tổ hợp của 2 hay nhiều vi rút.
Hệ gene của vi rút cúm A gồm 8 phân ñoạn riêng biệt. Khi ñồng nhiễm sản phẩm
có thể bao gồm thành phần phân ñoạn có nguồn gốc từ cả hai vi rút tái tổ hợp
(reassort) hoặc trao ñổi (swap). Vi rút mới hình thành có ñặc tính của hai vi rút
bố mẹ. ðặc tính này dẫn ñến vi rút hoàn toàn có tính kháng nguyên mới và ñôi
khi vượt cả hàng rào loài cảm thụ (Manuguerra and Hannoun, 1997), (Shoham,
2006).

1.2.4. ðộc lực của vi rút
ðộc lực của vi rút cúm gia cầm có sự dao ñộng lớn, phụ thuộc vào nhiều
yếu tố, trong ñó protein HA có vai trò quan trọng nhất. Ở mức ñộ phân tử, khả
năng lây nhiễm của vi rút phụ thuộc vào tác ñộng của enzym proteaza vật chủ
giúp phá vỡ liên kết hóa học của haemaglutinin, thực chất là tách rời protein HA
thành 2 tiểu phần HA1 và HA2. Khả năng cắt tách tiểu phần phụ thuộc vào thành


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


11
phần và số lượng các axit amin kiềm tại peptid HA0. Các enzym nhóm trypsin có
khả năng phá vỡ liên kết khi HA0 có một phân tử Arginin, trong khi ñó các
protease khác chỉ có thể phân hủy cầu nối này khi có nhiều axit amin kiềm tại
HA0.
Tổ chức Y tế Thế giới, kết hợp với các bằng chứng thực nghiệm, ñã công
bố thành phần và trình tự axit amin tại HA0 ñược xem là dấu hiệu nhận biết ñộc
lực của vi rút cúm.
Tổng kết các ổ dịch và type H gây bệnh gia cầm, người ta cho rằng 2 type
H5 và H7 thường có ñộc lực cao ở gia cầm. Tại Hội thảo thế giới lần ñầu tiên về
bệnh cúm gà 1981, Bankowski et al., công bố vi rút cúm gà mang kháng nguyên
bề mặt type H7 thuộc loại có ñộc lực cao. Tuy nhiên sau ñó dịch xảy ra tại
Pensyvania (Mỹ) gây chết 75% số gà lại do vi rút cúm A/H5.
ðể ñánh giá ñộc lực của vi rút cúm có cơ sở thực nghiệm, các nhà khoa
học sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3-6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh
mạch nước trứng ñã ñược gây nhiễm vi rút. Sau ñó ñánh giá mức ñộ bệnh của gà
bằng phương pháp cho ñiểm (chỉ số IVPI). Chỉ số IVPI tối ña là 3 ñiểm ñược xác
nhận cho những vi rút có ñộc lực cao nhất, gây chết toàn bộ gia cầm thí nghiệm
trong 1-2 ngày. Theo quy ñịnh của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), vi rút cúm A

có chỉ số IVPI trên 1,2 thuộc nhóm vi rút có ñộc lực cao (Nguyễn Tiến Dũng và
cs, 2004).
Áp dụng cùng quy trình gây bệnh thực nghiệm : Tiêm tĩnh mạch 0,2 ml
nước trứng gà ñã gây nhiễm vi rút ñược pha loãng ở nồng ñộ 1/10 cho gà mẫn
cảm từ 3-6 tuần tuổi, căn cứ vào kết quả chỉ số IVPI, các nhà khoa học ñã thống
nhất chia ñộc lực của vi rút ra 3 nhóm:
- Vi rút có ñộc lực cao: Sau khi tiêm tĩnh mạch 10 ngày có 75%-100% số
gà thực nghiệm chết. Trường hợp chỉ số này thấp hơn, nếu vi rút cúm gà phải làm
chết tối thiểu 20% số gà mẫn cảm tại thực ñịa và phát triển tốt trên tế bào xơ phôi
trong môi trường nuôi cấy không có Trypsin.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


12
- Vi rút có ñộc lực trung bình: là những chủng vi rút gây dịch cúm gà
với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng không gây chết quá 15% số gà bị nhiễm
bệnh tự nhiên hoặc không gây quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm.
- Vi rút có ñộc lực thấp: là những vi rút phát triển tốt trong cơ thể gà, có
thể gây ra dịch nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt, không có bệnh tích
ñại thể và không làm chết gà.
Trong thực tế người ta thường chia vi rút cúm gà ra làm 2 loại: Loại vi rút
có ñộc lực thấp- LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza). Loại vi rút có ñộc lực
cao- HPAI (Highly Pathogennic Avian Influenza).
Cho ñến nay người ta thừa nhận chỉ có 2 biến chủng vi rút có cấu trúc
kháng nguyên H5, H7 ñược coi là loại có ñộc lực cao gây bệnh ở gia cầm, nhưng
không phải tất cả các chủng mang gene H5, H7 ñều gây bệnh.
Tuy nhiên, ñối với các chủng có ñộc lực thấp, trong quá trình lưu hành tại
các nguồn dịch thiên nhiên, ở các ñàn thủy cầm, chúng có thể mang ñột biến nội

gene hoặc tái tổ hợp ñể trở thành các chủng có ñộc.
1.2.5. Nuôi cấy và lưu giữ vi rút cúm gà
Vi rút cúm gà phát triển tốt trên phôi gà 9-11 ngày tuổi, trong dịch niệu
mô gà tập trung khá nhiều vi rút và có thể lưu giữ vi rút ñược vài tuần ở ñiều kiện
4
0
C. Khả năng tồn tại và gây bệnh của vi rút rất cao nếu ta bảo quản dịch niệu mô
ñó ở - 70
0
C hoặc cho ñông khô.
Vi rút cúm gà cũng phát triển tốt trên nuôi cấy tế bào tế bào xơ phôi gà
(CEF: Chicken Embryo Fibroblast) và tế bào thận chó MDCK (Madin-Darby
Canine Kidney) trong ñiều kiện môi trường nuôi cấy tế bào không chứa Trypsin.
1.3. Tiến hóa và hình thành genotype của vi rút cúm gia cầm
1.3.1. Sự tiến hóa của vi rút cúm A/H5N1
Năm 1996, vi rút cúm A/H5N1 ñược phân lập lần ñầu tiên từ ngỗng ở
Quảng ðông (Trung Quốc) và chủng này ñược coi là chủng nguyên thủy tạo nên
các dòng vi rút gây bệnh cúm gia cầm trong 12 năm qua. Chủng vi rút nguyên


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


13
thủy tổ hợp với các chủng vi rút khác từ người và chim cút tạo nên biến chủng
gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997. ðối với gene HA
(H5) ñột biến làm tăng số lượng axit amin kiềm tại HA0 (chuỗi nối giữa HA
1
và
HA

2
) (Arginin và Lysin) có liên quan ñến tiến trình tăng ñộc lực của vi rút, và ở
các chủng thuộc dòng Quảng ðông (Guangdong-like sublineage), các amino acid
thông thường là –RRRKK.
Trong các năm 1997 - 2002, các biến chủng vi rút cúm A/H5N1 mang
những ñặc tính kháng nguyên khác nhau của subtype H5 ñược hình thành tạo nên
nhóm kháng nguyên (clade) 1 có ñộc lực cao với gà nhưng thấp ñối với vịt.
Nhóm này ñã biến mất vào những năm 2001 - 2002. Trong năm 2002 - 2003,
gene HA (H5) có những ñột biến mới do hậu quả của hiện tượng trôi trượt kháng
nguyên (antigenic drift), tạo nên biến chủng có tính gây bệnh cao, ñặc biệt ñối
với vịt (lần ñầu tiên ghi nhận vi rút cúm gây bệnh lâm sàng ở vịt), và lây sang
người (Doherty, Turner et al., 2006). ðặc tính thích ứng gây bệnh trên người
càng tăng dần, ñồng thời ñộc lực ñối với ña vật chủ bao gồm vịt, gà, ngan, ngỗng,
chim cút, chim hoang dã, mèo, hổ, cày vằn và người cũng ñược gia tăng. Biến
chủng mới ñã gây thành dịch và xâm nhập vào nhiều quốc gia châu Á trong ñó
có Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Lào, Campuchia…
Tóm tắt diễn biến các biến cố hình thành chủng và tính cảm thụ ña loài, có
thể nói, kết thúc giai ñoạn 1997 - 2003, vi rút cúm A/H5N1 ñã có ñược mức ñộ
ổn ñịnh cao về ñặc tính gây bệnh và thích ứng ña vật chủ, trở thành nguy cơ cao
gây bệnh cho gia cầm, ñộng vật có vú và người trong các năm kế tiếp.
Tuy nhiên, xét về kiểu gene và kiểu hình (tính kháng nguyên), các chủng
vi rút cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện trong giai ñoạn 1997 - 2002 vẫn mang tính
tương ñồng kháng nguyên HA với chủng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của Quảng
ðông. Sự thay ñổi mạnh về tính kháng nguyên thực sự diễn ra ở giai ñoạn ñại
dịch cúm gia cầm xảy ra năm 2003 - 2005. Sự xuất hiện của kiểu hình Z trong
thời gian này ở các nước ðông Nam Á là bằng chứng của sự ñột biến “ñảo dạng
kháng nguyên” của vi rút cúm A/H5N1.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

14

Hình 1.3. Cây phả hệ dựa trên gene HA vi rút cúm A/H5N1 ñộc lực cao


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


15
Cuối năm 2005, có nhiều dòng phụ (sublineage) của vi rút cúm A/H5N1
cùng lúc ñược hình thành, ñó là sự xuất hiện dòng phụ Thanh Hải (Qinghai và
các Qinghai-like sublineage) và dòng phụ Phúc Kiến (Fujian và Fujian-like
sublineage). Các dòng này lan tràn sang các nước châu Á bao gồm Trung Quốc,
Hồng Kông, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, sau ñó lan rộng sang khu vực Trung
Á, châu Âu và châu Phi, tại ñó ñã có trường hợp người nhiễm cúm gia cầm. Các
chủng thuộc dòng phụ Phúc Kiến có trình tự gene NA (N1) ít thay ñổi so với
chủng nguyên thủy, nhưng motif axit amin ở vùng HA0 của ñiểm cắt protease là
ñã biến ñổi -RRRK- (giảm mất một axit amin Lysine) so với các chủng phát sinh
hậu Quảng ðông. Theo dòng lịch sử, từ sau năm 2006, nhiều chủng/dòng/clade
vi rút cúm A/H5N1 mới xuất hiện và ñồng tồn tại, tạo thành một quần thể vi rút
gây bệnh có ñặc tính kháng nguyên và ñộc lực khác nhau, làm cho diễn biến dịch
tễ học của dịch cúm A/H5N1 trở nên ngày càng phức tạp.
1.3.2. Tiến hóa của kiểu hình H5
Protein HA quyết ñịnh tính kháng nguyên của vi rút cúm, có tính ngưng
kết hồng cầu, do vậy còn có tên gọi là ngưng kết tố - Haemagglutinin. Tính
kháng nguyên này có thể xác ñịnh ñược bằng phản ứng “ức chế ngưng kết” hồng
cầu. Bản chất của phản ứng là kháng thể ñặc hiệu kháng HA sẽ ngăn không cho
vi rút cúm bám dính vào hồng cầu và tạo ra phản ứng ngưng kết. Sự thay ñổi tính

kháng nguyên do hiện tượng drift không làm thay ñổi có tính toàn bộ mà có tính
mức ñộ. Một khi có sự sai khác về hiệu giá ức chế ngưng kết giữa hai vi rút cúm
với một loại kháng thể ñặc hiệu cho một trong hai vi rút ñến 2 log
2
trở lên thì có
thể coi chúng thuộc hai clade khác nhau. Mặt khác, theo dõi cây phả hệ bằng
phân tích gene thì cho biết chúng liên quan với nhau về phả hệ như thế nào. Trên
cơ sở ñó nhóm theo dõi tiến hóa của vi rút cúm gia cầm ñã tổng hợp quá trình
này như cây phả hệ ở hình 1.4.