phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây sài đất (wedelia chinensis merr.) trồng ở thành phố cần thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH
TRONG CÂY SÀI ĐẤT (Wedelia chinensis Merr.)
TRỒNG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN PHÚC HUY
MSSV: 3113716
Lớp: Vi Sinh Vật Học K37

Cần Thơ, Tháng 11/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH
TRONG CÂY SÀI ĐẤT (Wedelia chinensis Merr.)
TRỒNG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN PHÚC HUY
MSSV: 3113716
Lớp: Vi Sinh Vật Học K37

Cần Thơ, Tháng 11/2014


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

(Ký tên)

(Ký tên)

PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp

Nguyễn Phúc Huy

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Ký tên)


LỜI CẢM TẠ
Sau hơn 3 năm học tập và nghiên cứu, đến nay tôi đã hoàn thành Luận văn tốt
nghiệp Đại học, chuyên ngành Vi SinhVật Học. Trong thời gian này, bên cạnh sự cố
gắng và tìm tòi của bản thân, tôi luôn luôn nhận được sự hỗ trợ, động viên từ phía gia
đình, quý Thầy Cô và bạn bè đã giúp tôi vượt qua những khó khăn, thử thách để hoàn
thành Luận văn tốt nghiệp.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - trường Đại
học Cần Thơ, tất cả quý Thầy Cô của Viện NC&PT Công nghệ Sinh học - trường Đại
học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức chuyên môn cho tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.

PGs.TS Nguyễn Hữu Hiệp – phó trưởng bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh
vật đã tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Vi sinh vật –Viện NC & PT Công nghệ Sinh
học Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn ủng hộ tôi về
mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống.
Tôi xin kính chúc quý Thầy Cô cùng các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khoẻ và
công tác tốt.
Chân thành cảm ơn!
Cần thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2014

Nguyễn Phúc Huy


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

TÓM TẮT

Sài đất (Wedelia chinensis), thuộc họ Cúc (Asteraceae) được biết đến như
một loại dược liệu quý có tính kháng khuẩn mạnh, nhưng các nghiên cứu trước đây
chỉ sử dụng dịch trích mà chưa quan tâm nhiều đến vi khuẩn nội sinh trong cây Sài
đất . Vì vậy, việc phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sài đất được thực
hiện. Từ ba mẫu cây Sài đất được trồng tại hai quận Cái Răng và Ninh Kiều ở thành
phố Cần Thơ đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA đặc. Phần
lớn các dòng vi khuẩn đều có dạng hình que và có khả năng di động, một số có dạng
hình cầu hoặc cầu đôi. Trong đó có 18 dòng vi khuẩn Gram âm và 3 dòng vi khuẩn
Gram dương.Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+ và IAA khi

chủng vào trường NFb lỏng, không đạm, không Yeast extract. Chín dòng có khả
năng hòa tan lân khó tan trên môi trường NBRIP đặc. Khảo sát khả năng kháng
khuẩn với 2 dòng vi khuẩn gây bệnh là Escherichia coli và Aeromonas hydrophila,
kết quả là có 8 dòng có khả năng kháng E. coli và 4 dòng có khả năng kháng A.
hydrophila. Điều đáng ngạc nhiên là, có hai dòng kháng được cả E. coli và A.
hydrophila. Tuyển chọn 3 dòng CT1, CL2 và CL5 có hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất,
kết hợp với các tiêu chí như khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân để
tiến hành định danh.
Kết quả giải trình tự gene 16S-rRNA của ba dòng CT1, CL2 và CL5 được nhận
diện lần lượt là Pseudomonas viridiflava dòng ATCC 13223, Rhodobacter
capsulatus dòng KC2137 và Bacillus cereus ATCC 14579 với độ tương đồng 95%,
94% và 93%.

Từ khóa: cây Sài đất, hòa tan lân, kháng khuẩn, tổng hợp AmmoniumIAA, vi khuẩn nội sinh.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

i

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
Trang
KÝ TÊN HỘI ĐỒNG...................................................................................................
LỜI CẢM TẠ ...............................................................................................................

TÓM TẮT ................................................................................................................... i
MỤC LỤC.................................................................................................................. ii
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... ix
DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................................x
CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................ xi
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .......................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài .....................................................................................................2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................3
2.1. Điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ .....................................................3
2.1.1. Vị trí địa lý ................................................................................................3
2.1.2. Địa hình .....................................................................................................3
2.1.3. Khí hậu ......................................................................................................4
2.1.4. Thủy văn....................................................................................................4
2.2. Sơ lược về cây Sài đất .........................................................................................5
2.2.1. Tên gọi và phân loại ..................................................................................5
2.2.2. Đặc điểm ...................................................................................................5
2.2.3. Phân bố ......................................................................................................6
2.2.4. Thành phần hóa học ..................................................................................6
2.2.5. Công dụng của Sài đất trong Đông y ........................................................7
2.2.6. Tác dụng của cây Sài đất trong y học hiện đại..........................................7
a. Tác dụng kháng khuẩn ................................................................................7
b. Tác dụng bảo vệ gan ...................................................................................7

Chuyên ngành Vi sinh vật học

ii

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

c. Tác dụng giảm căng thẳng ..........................................................................8
d. Tác dụng chữa lành vết thương ..................................................................8
e. Tác dụng chống loãng xương......................................................................8
f. Tác dụng chống ung thư ..............................................................................8
2.3. Vi khuẩn nội sinh ................................................................................................9
2.3.1. Định nghĩa vi khuẩn nội sinh ....................................................................9
2.3.2. Sơ lược về vi khuẩn nội sinh .....................................................................9
2.3.3. Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp ...........................................11
a. Vi khuẩn Bacillus ......................................................................................11
b. Vi khuẩn Pseudomonas.............................................................................12
c. Vi khuẩn Rhodobacter ..............................................................................14
d. Vi khuẩn Azotobacter ...............................................................................15
e. Vi khuẩn Azospirillum ..............................................................................15
2.3.4. Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh ........16
a. Nguồn gốc .................................................................................................16
b. Di chuyển ..................................................................................................16
c. Tiếp cận .....................................................................................................16
d. Sinh sản .....................................................................................................17
e. Xâm nhập hay xuyên thấu.........................................................................17
f. Định cư ......................................................................................................17
2.3.5. Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ....................................................18
a. Khả năng cố định đạm ..............................................................................18
b. Khả năng hòa tan lân khó tan ...................................................................20
c. Khả năng tổng hợp IAA ............................................................................21
d. Khả năng đối kháng sinh học....................................................................22

2.4. Tình hình nghiên cứu cây Sài đất trong và ngoài nước ................................25
2.4.1. Trong nước ..............................................................................................25
2.4.2. Ngoài nước ..............................................................................................25
2.5. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .................................................26
Chuyên ngành Vi sinh vật học

iii

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

2.5.1. Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR ........................................................26
2.5.2. Mồi (primer) sử dụng trong kỹ thuật PCR ..............................................27
2.6. Điện di gel agarose ............................................................................................28
2.6.1. Nguyên tắc của kỹ thuật điện di ..............................................................28
2.6.2. Kỹ thuật điện di gel agarose ....................................................................28
2.7. Phương pháp giải trình tự DNA ......................................................................29
2.7.1. Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy ..........................................29
2.7.2. Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động..............................29
2.7.3. Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã ...................................29
2.8. Xử lý số liệu .......................................................................................................30
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............31
3.1. Phương tiện nghiên cứu....................................................................................31
3.1.1. Thời gian – Địa điểm thực hiện ..............................................................31
3.1.2. Vật liệu ....................................................................................................31
3.1.3. Dụng cụ - Thiết bị ...................................................................................31

3.1.4. Hóa chất ..................................................................................................32
a. Hóa chất dùng để xử lý mẫu .....................................................................32
b. Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn ...............................................................32
c. Hóa chất trích DNA ..................................................................................32
d. Hóa chất thực hiện phản ứng PCR............................................................32
e. Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh .....................................................33
f. Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ ..........................................33
g. Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân................................................34
h. Môi trường khảo sát khả năng kháng khuẩn.............................................34
3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................35
3.2.1. Thu thập và xử lý mẫu ............................................................................35
3.2.2. Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây Sài đất ...................36
3.2.3. Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và kích thước vi khuẩn ......36
3.2.4. Nhuộm Gram vi khuẩn ............................................................................38
Chuyên ngành Vi sinh vật học

iv

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

3.2.5. Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ ..........................................................39
a. Nguyên tắc ................................................................................................39
b. Hóa chất ....................................................................................................39
c. Tiến hành thí nghiệm ................................................................................39
d. Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4 và 6 (sau khi

chủng) ...........................................................................................................40
3.2.6. Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan....................................................41
3.2.7. Khảo sát khả năng tổng hợp IAA ............................................................41
a. Chuẩn bị ....................................................................................................41
b. Hóa chất ....................................................................................................42
c. Phương pháp .............................................................................................42
3.2.8. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn ........................................................43
3.2.9. Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh ...............................................43
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................46
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh ................................................................46
4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được ....................47
4.1.3. Đặc điểm tế bào của vi khuẩn nội sinh phân lập được ................................50
4.2. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập dựa
trên lượng ammonium (NH4+) tổng hợp được ................................................................. 51

4.2.1. So sánh khả năng tổng hợp ammonium của các dòng vi khuẩn nội sinh phân
lập ở rễ cây Sài đất ..............................................................................................53
4.2.2. So sánh khả năng tổng hợp ammonium của các dòng vi khuẩn nội sinh phân
lập ở thân của cây Sài đất ....................................................................................54
4.2.3. So sánh khả năng tổng hợp ammonium của các dòng vi khuẩn nội sinh phân
lập ở lá của cây Sài đất ........................................................................................56
4.2.4. So sánh khả năng tổng hợp ammonium của các dòng vi khuẩn nội sinh triển
vọng ...................................................................................................................58

4.3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn phân
lập được ở cây Sài đất ..............................................................................................60

Chuyên ngành Vi sinh vật học

v

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

4.4. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập
được ở cây Sài đất ....................................................................................................63
4.4.1. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập ở rễ của
cây Sài đất .........................................................................................................64
4.4.2. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập ở thân
của cây Sài đất ..................................................................................................66
4.4.3. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập ở lá của
cây Sài đất .........................................................................................................68
4.4.4. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh triển
vọng trong cây Sài đất ......................................................................................70
4.5. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh
phân lập được ở cây Sài đất ....................................................................................71
4.5.1. Khả năng kháng vi khuẩn E. coli gây bệnh ở đường ruột ......................72
4.5.2. Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá ......74
4.6. Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR .....................78
4.6.1. Kết quả mã hóa gen 16S-rRNA của dòng CT1....................................79
4.6.2. Kết quả mã hóa gen 16S-rRNA của dòng CL2....................................80
4.6.3. Kết quả mã hóa gen 16S-rRNA của dòng CL5...................................80
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..............................................................82
5.1. Kết luận ....................................................................................................82
5.2. Đề nghị .....................................................................................................82
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................83

PHỤ LỤC ......................................................................................................................
Phụ lục 1: Kết quả thí nghiệm.
1. Kết quả khảo sát hàm lượng ammonium (NH4+) được tạo ra do các
dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được.
2. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn
nội sinh phân lập được.
3. Kết quả khảo sát hàm lượng IAA được tạo ra do các dòng vi khuẩn nội
sinh phân lập được.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

vi

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

4. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được.
4.1.

Khả năng kháng E. coli của các dòng vi khuẩn phân lập được.

4.2.

Khả năng kháng A. hydrophila của các dòng vi khuẩn phân lập được.

Phụ lục 2: Hình biểu đồ đường chuẩn NH4+ và IAA
1. Hình biểu đồ đường chuẩn NH4+

2. Hình biểu đồ đường chuẩn IAA
Phụ lục 3: Bảng số liệu biểu đồ
1. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm
1.1. Lượng ammonium (µg/mL) do các dòng vi khuẩn phân lập ở thân của

cây Sài đất tổng hợp theo thời gian
1.2. Lượng ammonium (µg/mL) do các dòng vi khuẩn triển vọng tổng hợp

theo thời gian
2. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA
2.1. Lượng IAA (µg/ml) do các dòng vi khuẩn phân lập ở thân của cây Sài

đất tổng hợp theo thời gian
2.2. Lượng IAA (µg/ml) do các dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng tổng hợp

theo thời gian
3. Khả năng kháng A. hydrophila của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập

được
Phụ lục 4: Kết quả giải trình tự
1. Trình tự mã hóa gen 16S-rRNA của dòng CT1
2. Trình tự mã hóa gen 16S-rRNA của dòng CL2
3. Trình tự mã hóa gen 16S-rRNA của dòng CL5
Phụ lục 5 : Kết quả thống kê.
1. Kết quả thống kê lượng ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập
được
1.1. Lượng ammonium của 21 dòng vi khuẩn tạo ra theo thời gian.
1.2. Lượng ammonium của các dòng vi khuẩn nội sinh ở rễ tổng hợp theo
thời gian

Chuyên ngành Vi sinh vật học

vii

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

1.3. Lượng ammonium của các dòng vi khuẩn nội sinh ở thân tổng hợp theo
thời gian
1.4. Lượng ammonium của các dòng vi khuẩn nội sinh ở lá tổng hợp theo
thời gian
1.5. Lượng ammonium của các dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng tổng hợp
tổng hợp theo thời gian
2. Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được
3. Kết quả thống kê lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được
3.1. Lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được tổng hợp theo thời
gian
3.2. Lượng IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh ở rễ tổng hợp tổng hợp
theo thời gian
3.3. Lượng IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh ở thân tổng hợp theo thời
gian
3.4. Lượng IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh ở lá tổng hợp theo thời gian
3.5. Lượng IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng tổng hợp tổng
hợp theo thời gian
4. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được
4.1. Khả năng kháng E. coli của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được

4.2. Khả năng kháng Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn nội sinh
phân lập được

Chuyên ngành Vi sinh vật học

viii

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Thành phần các chất trong phản ứng PCR ...................................................33
Bảng 2: Môi trường PDA...........................................................................................33
Bảng 3: Môi trường NFb (g/l) (Kirchhof et al., 1997) ..............................................33
Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lượng ...................................................................34
Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamin ....................................................................34
Bảng 6: Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999) .....................................................34
Bảng 7: Giá trị pH tại nơi thu mẫu ............................................................................35
Bảng 8: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen .......................................45
Bảng 9 : Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sài đất.................47
Bảng 10: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được..........48
Bảng 11: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được .............................50
Bảng 12: Lượng ammonium (µg/mL) do các dòng vi khuẩn phân lập ở cây Sài đất
tổng hợp theo thời gian ..............................................................................................52
Bảng 13: Lượng ammonium (µg/mL) do các dòng vi khuẩn phân lập ở rễ tổng

hợp theo thời gian ......................................................................................................53
Bảng 14: Lượng ammonium (µg/mL) do các dòng vi khuẩn phân lập ở lá tổng hợp
theo thời gian .............................................................................................................57
Bảng 15: Hiệu quả hòa tan lân theo thời gian của các dòng vi khuẩn nội sinh trên môi
trường NBRIP đặc……………………………………………………….…………61
Bảng 16: Lượng IAA (µg/mL) do các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây
Sài đất tổng hợp theo thời gian ..................................................................................64
Bảng 17: Lượng IAA (µg/mL) của các dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập ở rễ
cây Sài đất tổng hợp theo thời gian............................................................................65
Bảng 18: Lượng IAA (µg/mL) của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập ở lá của cây
Sài đất tổng hợp theo thời gian ..................................................................................68
Bảng 19: Khả năng kháng E. coli của các dòng vi khuẩn phân lập được..................72
Bảng 20: Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA ...........................................................79

Chuyên ngành Vi sinh vật học

ix

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Bản đồ hành chính thành phố Cần Thơ ..........................................................3
Hình 2: Cây Sài đất (Wedelia chinensis) ....................................................................5
Hình 3: Sự thay đổi màu của dãy dung dịch NH4+ theo phương pháp Indolphenol

Blue ............................................................................................................................41
Hình 4: Sự thay đổi màu của dãy dung dịch IAA theo phương pháp Salkowski.....43
Hình 5: Vòng pellicle của vi khuẩn nội sinh trong môi trường NFb bán đặc ...........46
Hình 6: Một số dạng khuẩn lạc vi khuẩn nội sinh phân lập được .............................49
Hình 7: Kết quả nhuộm Gram chụp ở vật kính X100 ................................................51
Hình 8: Lượng ammonium (µg/mL) do các dòng vi khuẩn phân lập ở thân tổng hợp
theo thời gian .............................................................................................................55
Hình 9: Lượng ammonium (µg/mL) do các dòng vi khuẩn triển vọng tổng hợp theo
thời gian .....................................................................................................................59
Hình 10: Khả năng hòa tan lân của dòng CT1 và CR4 ở ngày 2...............................62
Hình 11: Lượng IAA (µg/mL) do các dòng vi khuẩn phân lập ở thân tổng hợp theo
thời gian .....................................................................................................................67
Hình 12: Lượng IAA (µg/mL) do các dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng tổng hợp
theo thời gian .............................................................................................................70
Hình 13: Khả năng kháng E. coli của dòng CL5 và CT1 ở ngày 2 ...........................73
Hình 14: Khả năng kháng A. hydrophila của bốn dòng vi khuẩn nội sinh trong 3
ngày………………………………….........................................................................75
Hình 15: Khả năng kháng A. hydrophila của dòng CL5 và dòng CL2 ở ngày 3 ......77
Hình 16: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rRNA .............................78

Chuyên ngành Vi sinh vật học

x

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

CÁC TỪ VIẾT TẮT
BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CFU

colony-forming unit

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

dNTP

deoxyribonucleotide triphosphates

EAC

Ehrlich Ascites Carcinoma

EAEC

Enteroaggregative E. coli

EHEC

Enterohemorrhagic E. coli

EIEC

Enteroinvasive E. coli

EPEC

Enteropacthogenic E. coli

ETEC

Enterotoxigenic E. coli

IAA

Indole – 3 – Acetic Acid

MEWC

Methanolic Wedelia chinensis

NBRIP

National Botanical Research Institute's phosphate

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PDA

Potato dextrose agar

rRNA

ribosomal ribonucleic acid

Chuyên ngành Vi sinh vật học

xi

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1.

Đặt vấn đề

Trong thiên nhiên, có rất nhiều cây cỏ có chất kháng sinh và là nguồn dược liệu

vô cùng quý giá, phong phú và đa dạng. Trong đó có nhiều loại cây có tính kháng
khuẩn đã được Y học dân tộc dùng làm thuốc từ rất lâu. Chúng thường là những cây
cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn nhà. Nhiều cây
thuốc đã được các nhà khoa học nghiên cứu và tìm thấy những chất kháng khuẩn có
tác dụng tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn. Nhiều loại dược phẩm có nguồn gốc từ thiên
nhiên còn có nhiều ưu điểm vượt trội như: ít tác dụng phụ, thường không có độc tính
và đem lại hiệu quả điều trị lâu dài.
Bên cạnh đó, với điều kiện thiên nhiên nhiều ưu đãi. Việt Nam là nước có một
hệ sinh thái tự nhiên phong phú và đa dạng. Theo Phạm Hoàng Hộ (1999) thì Việt
Nam có hệ thực vật phong phú hàng đầu thế giới với khoảng 12.000 loài khác nhau, có
nhiều tiềm năng thuận lợi để phát triển nguồn cây dược liệu. Trong đó, có nhiều cây
dược liệu quý có tính kháng khuẩn đã được Y học dân tộc dùng làm thuốc. Trong số
đó có thể kể đến cây Sài đất (Wedelia chiensis). Sài đất là loại cây mọc hoang ở nhiều
tỉnh miền Bắc nước ta. Thường ưa nơi ẩm mát. Gần đây do nhu cầu, nhiều nơi đã trồng
Sài đất để dùng làm thuốc. Theo Đỗ Tất Lợi (2004) cây Sài đất được sử dụng làm
thuốc trị một số bệnh như rôm sảy ở trẻ em, sốt xuất huyết, viêm cơ, viêm tuyến vú,
viêm bàng quang, hỗ trợ chữa ung thư môn vị...
Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất
(Wedelia chinensis M.), cây Diếp Cá (Houttuynia cordata T.), cây Diệp Hạ Châu
(Phyllanthus urinaria L.)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng
khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như
methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α
pinen, camphen,…Có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia,
Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh ở cây dược liệu chưa
được quan tâm nhiều. Do đó, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát

Chuyên ngành Vi sinh vật học

1

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

triển nguồn cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang lại nhiều ý
nghĩa quan trọng trong giai đoạn cấp thiết hiện nay.
Vì vậy, nhằm mục đích xác định các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sài đất
nên đề tài: “Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Sài đất (Wedelia chinensis M.) trồng
ở thành phố Cần Thơ” được thực hiện sẽ mang nhiều ý nghĩa thực tiễn.
1.2.

Mục tiêu đề tài
Phân lập và khảo sát được một số đặc tính tốt như: tính kháng khuẩn, khả năng

cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn sống nội
sinh trong cây Sài đất (Wedelia chinensis M.) trồng ở thành phố Cần Thơ.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1.

Điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ

2.1.1. Vị trí địa lý
Cần Thơ là một thành phố trực thuộc trung ương nằm ở vùng hạ lưu của Sông
Mê Kông và ở vị trí trung tâm đồng bằng châu thổ Sông Cửu Long, phía hữu ngạn
của sông Hậu, trong giới hạn tọa độ 105o13’38”-105o50’35” kinh độ Đông và
9o55’08” – 10o19’38” vĩ độ Bắc, trải dài trên 55 km dọc bờ Tây sông Hậu. Phía bắc
giáp tỉnh An Giang, phía đông giáp tỉnh Đồng Tháp và tỉnh Vĩnh Long, phía tây
giáp tỉnh Kiên Giang, phía nam giáp tỉnh Hậu Giang. Diện tích nội thành là
53 km². Thành phố Cần Thơ có tổng diện tích tự nhiên là 1409 km².
(Nguồn , ngày 12/6/2014)

Hình 1: Bản đồ hành chính thành phố Cần Thơ
(Nguồn ngày 12/06/2014)

2.1.2. Địa hình và đất đai
Địa hình nhìn chung tương đối bằng phẳng, với độ cao trung bình khoảng 1 –
2 mét dốc từ đất giồng ven sông Hậu và sông Cần Thơ thấp dần về phía nội đồng tức
là từ phía đông bắc sang phía tây nam. Bên cạnh đó, thành phố còn có các cồn và cù

Chuyên ngành Vi sinh vật học

3

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

lao trên sông Hậu như Cồn Ấu, Cồn Khương, Cồn Sơn, Cù lao Tân Lập. Thành phố
Cần Thơ có dạng địa hình chính là địa hình ven sông Hậu hình thành dải đất cao là đê
tự nhiên và các cù lao ven sông Hậu.
Đất đai ở khu vực này chủ yếu là đất phù sa thể holoxen giàu chất phù sa. Do đó
loại đất này cung cấp những điều kiện rất tốt cho các ngành nông nghiệp thâm canh
năng xuất cao.
(Nguồn , ngày 12/06/2014)

2.1.3. Khí hậu
Cần Thơ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ít bão, quanh năm nóng ẩm,
không có mùa lạnh. Mùa mưa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng
12 tới tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình năm khoảng 28°C, số giờ nắng trung bình
cả năm khoảng 2249,2 giờ, lượng mưa trung bình năm đạt 1600 mm. Độ ẩm trung
bình năm giao động từ 82% - 87%. Do chịu ảnh hưởng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có
lợi thế về nền nhiệt độ, chế độ bức xạ nhiệt, chế độ nắng cao và ổn định theo hai mùa
trong năm.
(Nguồn , ngày 12/06/2014)

2.1.4. Thủy văn
Thành phố Cần Thơ có Sông Hậu chảy qua với tổng chiều dài là 65 km, trong
đó đoạn qua Cần Thơ có chiều rộng khoảng 1,6 km. Tổng lượng phù sa của sông Hậu

là 35 triệu m3/năm. Tại Cần Thơ, lưu lượng cực đại đạt mức 40.000 m3/s. Mùa cạn từ
tháng 1 đến tháng 6, thấp nhất là vào tháng 3 và tháng 4. Lưu lượng nước trên sông tại
Cần Thơ chỉ còn 2.000 m3/s. Mực nước sông lúc này chỉ cao hơn 48 cm so với
mực nước biển.
Sông Cần Thơ bắt nguồn từ khu vực nội đồng tây sông Hậu, đi qua các quận Ô
môn, huyện Phong Điền, quận Cái Răng, quận Ninh Kiều và đổ ra sông Hậu tại bến
Ninh Kiều. Sông Cần Thơ có nước ngọt quanh năm, vừa có tác dụng tưới nước trong
mùa cạn, vừa có tác dụng tiêu úng trong mùa lũ và có ý nghĩa lớn về giao thông. Sông
Cái Lớn dài 20 km, chiều rộng cửa sông 600 – 700 m, độ sâu 10 – 12 m nên có khả
năng tiêu, thoát nước rất tốt.
Bên cạnh đó, thành phố Cần Thơ còn có hệ thống kênh rạch dày đặc, với hơn
158 con sông, rạch lớn nhỏ là phụ lưu của 2 sông lớn là Sông Hậu và sông Cần Thơ đi

Chuyên ngành Vi sinh vật học

4

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

qua thành phố nối thành mạng đường thủy. Các sông rạch lớn khác là rạch Bình
Thủy, Trà Nóc, Ô Môn, Thốt Nốt, kênh Tham Rôn và nhiều kênh lớn khác tại các
huyện ngoại thành là Thốt Nốt, Vĩnh Thạnh, Cờ Đỏ và Phong Điền, cho nước ngọt
suốt hai mùa mưa nắng, tạo điều kiện cho nhà nông làm thủy lợi và cải tạo đất.
(Nguồn , ngày 12/06/2014)

2.2.

Sơ lược về cây Sài đất

2.2.1. Tên gọi và phân loại
Cây Sài đất còn gọi là Húng tram, Ngổ núi, Cúc nháp, Cúc giáp, Hoa múc,
thuộc Họ Cúc (Asteraceae), Chi Sài đất (Wedelia) (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Tên khoa học là Wedelia chinensis (Osbeck) Merr hay (Wedelia calendulacea)
Less.
2.2.2. Đặc điểm

Hình 2: Cây Sài đất (Wedelia chinensis)
(Hình chụp, ngày 15/6/2014)

Sài đất (Wedelia chinensis M.) là một loại cỏ sống dai, mọc lan bò, chỗ thân
mọc lan tới đâu rễ mọc tới đấy, nơi đất tốt có thể cao hơn 0,05 m. Thân màu xanh có
lông trắng cứng nhỏ. Lá gần như không cuống, mọc đối, hình bầu dục thon dài, hai
đầu nhọn, dài 15-50 mm, rộng 8-25 mm, có lông nhỏ cứng ở hai mặt, mép có 1-3 răng
cưa nông, hai bên gân chính có 2 gân phụ xuất phát gần như từ một điểm ở phía cuống
lá, gân chính và phụ đều nổi ở mặt dưới lá. Cụm hoa hình đầu, cuống hoa thìa lia màu

Chuyên ngành Vi sinh vật học

5

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

vàng tươi. Quả bế không có lông, đầu thu hẹp lại, tận cùng mang một vòng có răng
(Đỗ Tất Lợi, 2004).
Lưu ý khác với cây Lỗ địa cúc (Wedelia prostrata) thường dùng nhầm với cây
Sài đất. Cây Lỗ địa cúc có lá ngắn hơn, hoa màu vàng nhạt, quả bế không có lông, ở
đầu không thu hẹp, không có vòng lồi lên, và đầu cụt.
2.2.3. Phân bố
Cây Sài đất thường phân bố phổ biến ở Việt Nam, miền nam Trung Quốc, Nhật
Bản cũng như các quốc gia nhiệt đới khác như: Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Philippin,
Lào,.... Thường gặp mọc hoang nơi ẩm ướt trên các bãi ven suối, bờ sông. Ở nước ta
cây Sài đất cũng thường được trồng làm rau ăn (ở một số tỉnh như Bắc Ninh, Bắc
Giang) và dùng làm thuốc.
Trồng Sài đất rất đơn giản: chọn nơi đất tốt, hơi ẩm, cắt những mẫu thân thành
từng đoạn dài 20-30 cm, hay chọn những đoạn thân có rễ sẵn, vùi 2/3 xuống đất.
Trong vòng 15-20 ngày cây đã mọc tốt, sau một tháng đã có thể thu hoạch, cắt cây Sài
đất sát đất, tưới nước bón phân tốt thì sau nữa tháng lại thu hoạch được nữa. Thu
hoạch gần như quanh năm, nhưng tốt nhất vào vụ hè các tháng 4, 5 và tháng 8 lúc cây
đang ra hoa.
Thường người ta dùng Sài đất tươi để làm thuốc. Có thể dùng dạng phơi khô
nhưng tác dụng không bằng dạng tươi.
2.2.4. Thành phần hóa học
Trong các nghiên cứu đã được thực hiện trên cây Sài đất thì thành phần hóa học
thu được từ 100g dịch ép của cây bao gồm: tanin – 220mg, carotene - 1,14mg, chất
diệp lục - 3,75mg, saponin – 500mg, phytosterol - 3,75mg, hợp chất sáp 29,7mg, nhựa
– 44mg, chloroform chiết xuất –27mg, chất dẻo – 80mg, đường tổng số -1040mg
(Sameksha Koul et al., 2012).
Theo Sameksha Koul et al. (2012), tinh dầu của các phần trên cây Sài đất được
phân tích bằng GC và GC/MS. Mười chín hợp chất đã được xác định chiếm 94%
lượng dầu. Nó được tạo thành chủ yếu là monoterpene hydrocarbon (50,6%),

sesquiterpene hydrocarbon (22,5%), sesquiterpene oxy hóa (20,3%) với một lượng
nhỏ monoterpene oxy hóa (0,7%). Các thành phần chính được tìm thấy là alphapinen (21,7%), spathulenol (20,3%) và limonene (14,3%). Luteolin, apigenin,
wedelolactone và indole-3-cacboxyaldehyde cũng được ghi nhận.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

6

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

Từ lá của cây Sài đất người ta đã trích lấy ra được một chất lacton gọi là
wedelolacton (có công thức phân tử là C16H10O7) với tỷ lệ 0,05%. Trọng lượng phân tử
314,2 đvC (đơn vị Carbon), theo cấu trúc wedelolacton vừa là một flavonoid vừa là
một cumarin, nhiệt độ nóng chảy 242-244oC (Sameksha Koul et al., 2012)
2.2.5. Công dụng của cây Sài đất trong Đông y
Đông y cho rằng, Sài đất có vị ngọt, hơi chua, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt,
tiêu độc, chữa viêm tấy ngoài da, mụn nhọt, bắp chuối, sưng vú, rôm sảy, chốc đầu,
đau mắt, giải độc, cầm ho, mát máu; thường được dùng để chữa cảm mạo, sốt, viêm
họng, viêm phế quản phổi, ho gà, tăng huyết áp, trĩ rò, phòng sởi. Theo kinh nghiệm
trong nhân dân và một số bệnh viện ở nước ta, cây Sài đất có tác dụng chữa mụn nhọt,
chốc, lở ngứa, viêm bang quang, viêm tuyến vú, hạ sốt, giảm đau, uống phòng sởi biến
chứng,…
2.2.6. Tác dụng của cây Sài đất trong y học hiện đại
a. Tác dụng kháng khuẩn
Theo báo cáo của bệnh viện Bắc giang năm 1999, tác dụng kháng sinh của cây
Sài đất có thể chống lại nhiều loại vi khuẩn: vòng vô khuẩn đối với cầu trùng

Staphyllococcus 5 mm, với bạch cầu 3 mm, với liên cầu trùng Streptococcus 1
mm với Typhi 1 mm (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Cấy trải 500µg dịch trích của cây Sài đất lên môi trường chứa nước gây chết
tôm, kết quả thu được là dịch trích của cây Sài đất có khả năng chống lại 19 dòng vi
khuẩn khác nhau. Đồng thời chiếc xuất methanol của cây Sài đất thể hiện hoạt tính
kháng khuẩn với đường kính vòng kháng khuẩn từ 8-17 mm, và chiếc xuất ethanol
cũng có khả năng kháng khuẩn với đường kính từ 8-13 mm (Manjamalai et al., 2010).
b. Tác dụng bảo vệ gan
Theo Wagner et al. (1986) chiết xuất alcoholic của toàn bộ cây Sài đất thể hiện
hoạt động bảo vệ chống lại Carbon tetrachloride (CCl4) gây ra tổn thương gan trong cơ
thể.
Chiết xuất của cây này đã được thử nghiệm trên động vật cho tác dụng bảo vệ
gan. Chiết xuất ethanol của cây Sài đất đã được nghiên cứu với CCl4, nguyên nhân
gây ra nhiễm độc gan cấp tính ở chuột. Việc điều trị với chiết xuất ethanol của cây Sài

Chuyên ngành Vi sinh vật học

7

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

đất cho thấy chiết xuất còn có khả năng duy trì tình trạng chức năng gan hoạt động
bình thường (Mishra et al., 2009).
c. Tác dụng giảm căng thẳng
Tác dụng của chiết xuất ethanol trong cây Sài đất được đánh giá dựa trên sự

thay đổi của tác nhân gây căng thẳng trong dây thần kinh não và mức độ monoamine
oxidase enzyme trên chuột bạch. Chiết xuất này được nhận thấy có hoạt tính chống lại
những căng thẳng gây ra những thay đổi trong norepinephrine (NE), dopamine (DA),
5-hydroxy indole acid (5-HIAA),

5-hydroxy

tryptamine (5-HT)

và

enzyme

monoamine oxidase (MAO). Kết quả trên thu được, cho thấy bằng chứng sinh hóa
của hoạt động chống căng thẳng của các chất chiết xuất đã được thử nghiệm (Verma
và Khosa, 2009).
d. Tác dụng chữa lành vết thương
Hiệu quả của dịch trích từ lá của cây Sài đất để chữa lành vết thương, làm mờ vết
thương khâu, quan sát thấy hiệu quả rất đáng kể. Hiệu quả điều trị vết thương của chất
ethanolic trích từ lá cây Sài đất được đánh giá cao trong việc chữa lành các vùng mô bị
tổn thương. Chất ethanolic được biết, có tác dụng làm lành vết thương, trong giai đoạn
hình thành biểu mô, tăng tỷ lệ thu nhỏ của vết thương (Sameksha Koul et al.,2012).
e. Tác dụng chống loãng xương
Tác dụng chống loãng xương của chất ethanol chiết xuất từ cây Sài đất trong thí
nghiệm ở chuột ovariectomized loãng xương ở hai cấp độ liều lượng khác nhau của
500 và 750 mg/kg thể trọng đã được nghiên cứu. Những phát hiện, đánh giá trên cơ sở
các thông số sinh học và sinh hóa, cho thấy chiết xuất ethanol của cây đã tạo hiệu quả
nhất định. Điều này đã được hỗ trợ thêm bởi các mô hình bệnh học đã được nghiên
cứu (Kobori et al., 2011).
f. Tác dụng chống ung thư

Dịch trích methanolic của cây Sài đất (methanolic Wedelia chinensis- MEWC)
được đánh giá cho hoạt động chống ung thư của nó đối với Ehrlich Ascites Carcinoma
(EAC) ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ. Vào ngày 1, chiết xuất cây Sài đất được dùng với
liều 250 và 500 mg/kg thể trọng và tiếp tục trong 9 ngày liên tiếp. Các hoạt động
chống ung thư của MEWC đã được kiểm tra bằng cách xác định khối lượng khối u, số
lượng tế bào khối u, số lượng tế bào khối u có thể sống, số lượng tế bào khối u không

Chuyên ngành Vi sinh vật học

8

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

thể sống, thời gian tồn tại và gia tăng tuổi thọ ở động vật thực nghiệm. Chiết xuất này
dùng cho điều trị chuột bị EAC và phục hồi các thông số huyết học so với những con
chuột mang EAC. Vì vậy, nghiên cứu này cho thấy rằng các MEWC cho thấy hoạt
động chống ung thư trong động vật thử nghiệm (Gupta et al., 2007).
2.3.

Vi khuẩn nội sinh

2.3.1. Định nghĩa vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian trong chu kì
sống của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà những loại vi khuẩn
này có lợi ích đối với cây (Kobayashi et al., 2000; Bandara et al., 2006).

2.3.2. Sơ lược về vi khuẩn nội sinh
Những tương tác có lợi giữa thực vật – vi khuẩn thúc đẩy sự sinh trưởng, phát
triển của cây trồng, vấn đề này đang được các nhà nghiên cứu quan tâm. Gần đây, họ
đang nghiên cứu tiềm năng cho giải pháp nâng cao khả năng phân hủy sinh học của
các chất gây ô nhiễm trong đất. Hầu hết các nghiên cứu này tập trung vào các vi khuẩn
ở rễ (Lindow và Brandl, 2003; Berg et al, 2005). Cụm từ “Endophytic bacteria” có thể
được định nghĩa là những vi khuẩn cư trú trong nội mô của thực vật, chúng không có
biểu hiện ra bên ngoài và gây tác động xấu đến thực vật mà chúng ký sinh (Schulz và
Boyle, 2004), có khoảng 300.000 loài thực vật tồn tại trên Trái Đất, mỗi loài là một ký
chủ cho một đến nhiều các dạng nội ký sinh cư trú. Chỉ có một số loài thực vật được
nghiên cứu hoàn chỉnh về các mối quan hệ nội ký sinh của chúng. Do đó cơ hội nghiên
cứu và tìm ra các dạng nội ký sinh mới và có lợi trong sự đa dạng sinh học của các hệ
sinh thái khác nhau là đáng kể.
Vi khuẩn nội sinh có mặt trong nhiều loại cây trồng và thực vật hoang dại,
chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo nhiều cách: bám ở bề mặt rễ
và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên, thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô
rễ hay biểu bì rễ để sống như: Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas, Azoarcus
Gluconacetobacter, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum, Paenibacillus
(Elmerich, 2007). Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí
khổng hay các vị trí tổn thương của lá (Roos và Hattingh, 1983). Sau khi xâm nhập
vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán
khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào

Chuyên ngành Vi sinh vật học

9

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002). Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến
thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, nhưng cũng
phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và
Nowak, 1997; Tan et al., 2003).
Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh đối với cây chủ mà
nhiều loài còn có khả năng tổng hợp IAA, cố định đạm từ không khí và hòa tan lân
khó tan, kích thích cây tăng trưởng và làm tăng năng suất cho cây trồng
(Muthukumarasamy et al., 2002). Một số dòng đã mang lại hiệu quả cao trong kiểm
soát bệnh của cây, nhất là hạn chế nguồn bệnh trong đất như Fusarium oxysporum,
Gaeumannomyces graminis, Pythium spp… Thật vậy, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng
vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát được mầm bệnh trên thực vật (Sturz và
Matheson, 1996; Duijff et al., 1997; Krishnamurthy và Gnanamanickam, 1997), ở côn
trùng (Azevedo et al., 2000) và cả ở tuyến trùng (Hallmann et al., 1997). Trong một số
trường hợp chúng có thể đẩy mạnh tốc độ nẩy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành
cây con trong điều kiện bất lợi (Chanway, 1997) và nâng cao khả năng tăng trưởng của
thực vật ( Bent và Chanway, 1998). Vi khuẩn nội sinh còn có thể ngăn chặn mầm bệnh
phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp
các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới. Nghiên cứu cơ chế sản sinh chất
chuyển hóa mới trong sự đa dạng sinh học của vi khuẩn nội sinh có thể phát hiện các
loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả các bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel
et al., 2004).
Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các
chất trong các cây còn non (Rovira et al., 1983). Azospirillum brasilense đã thúc
đẩy sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ ở Panicum
miliaceum (Harari et al.,1988). Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa giúp cây hấp thu
nhiều nitơ, lân, kali và sắt tăng từ 10 – 64% (Biswas et al., 2000). Chaintreuil et al.

(2000) đã phát hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza
breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển
(Sesbania sp.) mọc chen lẫn với cây lúa hoang.
Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm
vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

10

Viện NC & PT Công nghệ sinh học