phân lập và tuyển chọn nấm men chịu nhiệt từ men bia và rỉ đường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN
CHỊU NHIỆT TỪ MEN BIA VÀ RỈ ĐƯỜNG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
CN. PHẠM HỒNG QUANG

SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN MINH PHÁT
MSSV: 3113747
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37

Cần Thơ, tháng 12/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN
CHỊU NHIỆT TỪ MEN BIA VÀ RỈ ĐƯỜNG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
CN. PHẠM HỒNG QUANG

SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN MINH PHÁT
MSSV: 3113747
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37

Cần Thơ, tháng 12/2014


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

CN. PHẠM HỒNG QUANG

NGUYỄN MINH PHÁT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
.

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


LỜI CẢM TẠ
Em xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban lảnh
đạo Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô bộ môn đả
nhiệt tình giúp đở và giảng dạy em những năm học vừa qua.
Em xin chân thành cám ơn Cô Ngô Thị Phương Dung, anh Huỳnh Xuân Phong,
anh Phạm Ngọc Thành và anh Bùi Hoàng Đăng Long cùng các bạn đang làm luận văn
tại phòng công nghệ sinh học thực phẩm đả giúp đở và tạo điều kiện cho em hoàn
thành tốt luận văn này.
Em xin chân thành cám ơn thầy Phạm Hồng Quang cùng tập thể lớp Vi Sinh
Vật khóa 37 đả ủng hộ và động viên tinh thần giúp em cố gắng hơn trong quá trình
thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cám ơn Thầy Trần Nguyên Tuấn đã giúp đở em rất nhiều
trong quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường.
Xin kính chúc Thầy, Cô luôn dồi dào sức khỏe và luôn thành công trên con
đường giảng dạy và nghiên cứu của mình.
Xin chân thành cám ơn.
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2014.

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Minh Phát


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

TÓM LƯỢC
Đề tài được thực hiện với mục đích phân lập và tuyển chọn nguồn nấm men tự
nhiên từ men bia, rỉ đường, đất và nước thu ở các nhà máy đường có khả năng chịu
nhiệt và lên men phụ phẩm nông nghiệp. Tổng cộng 27 chủng nấm men đã được phân
lập với đặc tính sinh lý sinh hóa đa dạng: 8 chủng có khả năng lên men đường
saccharose, 18 chủng có khả năng lên men đường maltose, 17 chủng có khả năng lên
men đường glucose, 2 chủng có hoạt tính urease, và 6 chủng có hoạt tính gelatinase.
Khả năng chịu nhiệt và chịu cồn của các chủng nấm men được khảo sát, kết quả cho
thấy 2 chủng (PHHO và BIA41) trong 27 chủng nấm men có khả năng phát triển ở
nhiệt độ 43°C và 14 trong tổng số 27 chủng có khả năng chịu được ethanol ở nồng độ
9%. Kết quả khảo sát khả năng lên men dịch rỉ đường ở các điều kiện nhiệt độ khác
nhau của 2 chủng nấm men PHHP và BIA41 cho thấy chủng PHHO lên men tốt nhất ở
37°C đạt 2,43% ethanol và chủng BIA41 lên men tốt nhất ở nhiệt độ 30°C đạt 1,83%
ethanol.
Từ khóa: chịu cồn, chịu nhiệt, nấm men, lên men ethanol.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

i

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
TÓM LƯỢC ....................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................iv
DANH SÁCH HÌNH ......................................................................................................v
TỪ VIẾT TẮT ..............................................................................................................vi
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................3
2.1. Giới thiệu về men bia .......................................................................................... 3
2.2. Rỉ đường. .............................................................................................................4
2.3. Giới thiệu chung về nấm men ............................................................................7
2.3.1. Đặc điểm nấm men......................................................................................... 7
2.3.2. Hình dạng và kích thước. ...............................................................................7
2.3.3. Cấu tạo tế bào nấm men .................................................................................8
2.3.4. Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men ...................................................... 9
2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện nuôi
cấy thu sinh khối tế bào .......................................................................................... 11
2.3.6. Vai trò và ứng dụng của nấm men ............................................................... 14
2.3.7. Nấm men chịu nhiệt ..................................................................................... 15
2.3.8. Một số chủng nấm men chịu nhiệt quan trọng .............................................17
2.4. Sự lên men ethanol ............................................................................................ 20

2.4.1. Khái quát về quá trình lên men ethanol ....................................................... 20
2.4.2. Cơ chế của quá trình lên men .......................................................................20
2.4.3. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men ............................ 22
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................26
3.1. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................... 26
3.1.1. Thời gian và địa điểm ..................................................................................26
3.1.2. Nguyên liệu ..................................................................................................26
3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất ......................................................................26
3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................27
Chuyên ngành Vi sinh vật học

ii

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

3.2.1. Phân lập nấm men ........................................................................................ 27
3.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của nấm men ....................................29
3.2.3. Sơ tuyển nấm men có hoạt tính lên men ...................................................... 31
3.2.4. Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt .................................................................31
3.2.5. Thử nghiệm khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men ...................... 32
3.2.6. Khảo sát khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men ...................... 32
3.2.7. Phương pháp phân tích .................................................................................32
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 33
4.1. Phân lập nấm men ............................................................................................ 33
4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men. ....................................................... 39

4.2.1. Khả năng lên men đường saccharose và maltose. ........................................39
4.2.2. Khả năng phân giải urea và gelatin. ............................................................. 41
4.3. Sơ tuyển nấm men có hoạt tính lên men cao ..................................................44
4.4. Khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men................................................45
4.5. Thử nghiệm khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men ...................... 47
4.6. Khảo sát khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men. ..................... 49
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................51
5.1. Kết luận. .............................................................................................................51
5.2. Đề nghị. ..............................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 52
PHỤ LỤC .........................................................................................................................
Phụ luc 1: Các hình ảnh về thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm ....................
Phụ lục 2. Phương pháp phân tích vi sinh vật ..........................................................
2.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào nấm men ..........
2.2. Phương pháp pha loãng .......................................................................................
2.3. Phương pháp xác định mật số vi sinh vật ...........................................................
2.4. Xác định độ cồn và năng suất cồn bằng phương pháp chưng cất .......................
Phụ lục 3. Số liệu kết quả các thí nghiệm. .................................................................
Phụ lục 4. Kết quả phân tích thống kê .......................................................................

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iii

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Đặc tính lên men của hai loại nấm men ............................................................. 3
Bảng 2. Thành phần dinh dưỡng của rỉ mật mía ............................................................. 5
Bảng 3. Thành phần chất hữu cơ của rỉ mật ....................................................................6
Bảng 4. Thành phần hóa học của nấm men .....................................................................9
Bảng 5. Sự hiện diện và ứng dụng của nấm men trong một số thực phẩm, thức uống có
cồn và sản phẩm lên men............................................................................................... 15
Bảng 6. Những chủng nấm men khả năng phát triển và sản sinh ethanol ở nhiệt độ
37oC đến 45oC ...............................................................................................................17
Bảng 7. Nguồn nguyên liệu, địa điểm thu mẫu, tên các chủng nấm men phân lập ......33
Bảng 8. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men.................................................... 34
Bảng 9. Chiều cao cột khí trong ống Durham khi lên men trong dung dịch đường
saccharose 2%................................................................................................................39
Bảng 10. Khả năng lên men đường maltose của các chủng nấm men .......................... 40
Bảng 11. Kết quả thử hoạt tính urease và gelatinase của các chủng nấm men .............42
Bảng 12. Khả năng lên men đường glucose của các chủng nấm men .......................... 44
Bảng 13. Khảo sát khả năng chịu nhiệt của 27 chủng nấm men sau 48 giờ .................45
Bảng 14. Khảo sát khả năng chịu ethanol của 27 chủng nấm men. .............................. 47
Bảng 15. Độ cồn của các chủng nấm men khi lên men rỉ đường. .................................49
Bảng 16. Kết quả thí nghiệm lên men đường saccharose. ................................ Phụ lục 3
Bảng 17. Kết qủa thí nghiệm lên men đường maltose ...................................... Phụ lục 3
Bảng 18. Kết quả thí nghiệm lên men đường glucose ...................................... Phụ lục 3

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iv

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Saccharomyces cerevisiae .................................................................................. 4
Hình 2. Saccharomyces carlsbergensis ...........................................................................4
Hình 3. Rỉ đường .............................................................................................................5
Hình 4. Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi điện tử ..........................................8
Hình 5. Kluyveromuces sp. ............................................................................................ 18
Hình 6. Saccharomyces spp. ......................................................................................... 18
Hình 7. Candida spp. .....................................................................................................19
Hình 8. Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men (Teusink, 2000) ..................... 22
Hình 9. Hoạt tính urease của chủng LMĐA1 ................................................................ 43
Hình 10. Hoạt tính urease của chủng HO1 ....................................................................43
Hình 11. Hoạt tính gelatinse của các chủng nấm men ..................................................43
Hình 12. Hoạt tính gelatinse của các chủng nấm men ..................................................43
Hình 13. Khuẩn lạc chủng nấm men BIA41 ở nhiệt độ 43°C .......................................47
Hình 14. Khuẩn lạc chủng nấm men PHHO ở nhiệt độ 43°C .......................................47
Hình 15. Khuẩn lạc nấm men ở nồng độ ethanol 9% .................................................... 49
Hình 16. Khuẩn lạc nấm men ở nồng độ ethanol 9% .................................................... 49

Chuyên ngành Vi sinh vật học

v

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

TỪ VIẾT TẮT

Chuyên ngành Vi sinh vật học

g/L

gram per liter

kg

kilogam

mL

milliliter

v/v

volume/volume-thể tích/thể tích

w/v

weight/volume-khối lượng/thể tích

vi

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Ethanol là một loại nhiên liệu sinh học thân thiện với môi trường đang được nước
ta và các nước trên thế giới đẩy mạnh phát triển. Nhận thấy được những lợi ích ưu việt
của nhiên liệu sinh học nhiều quốc gia đã đầu tư phát triển nhiên liệu sinh học, các
nước thành công tiêu biểu là Brazil và Hoa Kỳ. Hiện nay Hoa Kỳ là nhà xuất khẩu
ethanol lớn nhất thế giới và có tỉ lệ pha trộn ethanol và xăng trung bình trên cả nước là
8-9%

( />
sinh-hoc-o-my.html). Ở Brazil, sản xuất ethanol từ đường, có giá rất rẻ (GS. Nguyễn
Lân Dũng 2011). Theo quy chuẩn Việt Nam 1: 2009/BKHCN: Xăng pha 5% và 10%
ethanol hay còn gọi là xăng sinh học E5, E10 đã có đầy đủ cơ sở khoa học cũng như
pháp lý cho việc sử dụng tại Việt Nam và công ty Petrolimex là công ty tiên phong đi
đầu trong lĩnh vực xăng sinh học tại Việt Nam. Theo đó, từ ngày 1/12/2014, xăng
được sản xuất, phối chế, kinh doanh để sử dụng cho phương tiện cơ giới đường bộ tiêu
thụ trên địa bản 7 tỉnh, thành phố lớn, gồm: Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh, Hải
Phòng, Đà Nẵng, Cần Thơ, Quảng Ngãi và Bà Rịa - Vũng Tàu phải là xăng E5 (Xăng
E5 có tỷ lệ 5% ethanol tinh khiết).
Do sử dụng ethanol nên giá xăng E5 rẻ hơn so với giá xăng truyền thống. Tuy
nhiên đảm bảo giá thành cũng như tính cạnh tranh đối với các loại xăng truyền thống,
cần sử dụng nguồn nhiên liệu rẻ tiền và tối ưu hóa điều kiện sản xuất ethanol.
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men sinh ethanol (Nguyễn

Hữu Tường et al., 2013) của nấm men, đặc biệt đối với nước ta. Nước ta nằm trong
vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiệt độ trung bình tháng trên 18oC. Do đó việc sản
xuất ethanol bằng nấm men gặp nhiều khó khăn và tốn nhiều chi phí cho việc làm lạnh
trong quá trình lên men, nên việc phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men chịu
nhiệt có ý nghĩa hết sức quan trọng trong giảm chi phí sản xuất và tận dụng được điều
kiện sẵn có của Việt Nam và góp phần phát triển nền nhiên liệu sinh học của Việt
Nam.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài nhằm phân lập và tuyển chọn được các chủng nấm men chịu nhiệt từ 3045°C ứng dụng trong quá trình lên men ethanol.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

1

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Nội dung thực hiện:
− Phân lập các chủng nấm men từ men bia, rỉ đường, đất và nước thải của nhà
máy đường.
− Khảo sát khả năng chịu nhiệt, chịu cồn và khả năng lên men ethanol của các
chủng nấm men, tuyển chọn các chủng có đặc tính tốt.
− Thử nghiệm khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men trong môi
trường rỉ đường ở các nhiệt độ khác nhau.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về men bia
Bia là đồ uống bắt nguồn từ Ai Cập cổ đại (Nguyễn Hoài Thương, 2009). Độ còn
bia thấp (3-8%) và nhờ có CO2 khi rót ra tạo nên nhiều bọt tạo sảng khoái khi uống.
Bia có giá trị dinh dưỡng khá cao, trong bia có nhiều vitamin nhóm B và các nguyên tố
vi lượng khác. Vì vậy công nghệ sản xuất bia trên thế giới không ngừng phát triển và
hoàn thiện.
Để tạo được một thương hiệu bia nổi tiếng cần khá nhiều yếu tố: nguồn nguyên
liệu, nguồn nước, công nghệ lên men,… và quan trọng hơn hết là nguồn men bia tạo
nên hương vị đặc trưng của các thương hiệu bia hiện nay.
Nấm men Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces carlsbergensis là hai loại
nấm men thường được sử dụng để lên men bia (Nguyễn Hoài Thương, 2009). Các loài
nấm men lên men bia thuộc loại kỵ khí không bắt buộc. Khi có oxy chúng tăng sinh
khối nhờ hô hấp tế bào, khi không có oxy chung lên men tạo thành ethanol và CO2
theo phương trình:
Đường + Nitơ amine tự do + Nấm men + Oxy → Ethanol + CO2 + Nấm men
Đặc tính lên men của hai loại nấm men này có nhiều điểm khác nhau dung để lên
men các loại bia khác nhau.
Bảng 1. Đặc tính lên men của hai loại nấm men

Đặc tính

Nấm men nổi

Nấm men chìm

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces carlsbergensis

Loại bia: Ale

Loại bia: Lager

10-25oC

0-10oC

Nhiệt độ lên men

Chủ yếu lên men đường đơn
Cơ chất

(glucose, fructose), đường đôi
(saccharose, maltose), khó lên men
đường tam (raffinose)

Khả năng lên men

Lên men tốt glucose, mannose,
galactose, fructose,

saccharose,maltose và cả raffinose.

Lên men mạnh trên bề mặt môi

Lên men mạnh trong lòng môi

trường

trường

Nguyễn Hoài Thương, 2009

Chuyên ngành Vi sinh vật học

3

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Hình 1. Saccharomyces cerevisiae

Hình 2. Saccharomyces carlsbergensis

( />
( />
2879/sachharomyces_cerevi 23/11/2014)

yces-carlsbergensis/ 23/11/2014)

2.2. Rỉ đường.
Rỉ đường hay rỉ mật, mật rỉ, mật rỉ đường, còn được gọi ngắn gọn là mật, là chất
lỏng đặc sánh còn lại sau khi đã rút đường bằng phương pháp cô và kết tinh. Đây là
sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến đường (đường mía, đường nho, đường củ cải).
Khoảng 75% tổng lượng rỉ mật của thế giới có nguồn gốc từ mía (Saccharum
officinarum), gần 25% từ củ cải đường (Beta vulgaris). Nói chung, sản lượng rỉ mật
bằng khoảng 1/3 sản lượng đường sản xuất, khoảng 100 tấn cây mía đem ép có 3-4 tấn
rỉ mật được sản xuất
( />23/11/2014).
Thành phần chính của rỉ đường chủ yếu là saccharose và một ít glucose và fructose.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

4

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Hình 3. Rỉ đường
( />%91%C6%B0%E1%BB%9Dng 23/11/2014)

Thành phần chính xác của rỉ mật rất khó dự đoán do phụ thuộc vào điều kiện thổ
nhưỡng và thời tiết, khí hậu, giống mía và giai đoạn thu hoạch cũng như quy trình sản

xuất đường trong từng nhà máy. Do vậy rỉ mật thay đổi đáng kể về thành phần dinh
dưỡng, mùi vị, màu sắc và độ nhớt.
Bảng 2: Thành phần dinh dưỡng của rỉ mật mía
Thành phần

Trung bình (%)

Biến động (%)

Nước

20

17-25

Saccharose

35

30-40

Glucoza

7

4-9

Fructoza

9

5-12

Các chất khử khác

3

1-5

Các glucid khác

4

2-5

Khoáng

12

7-15

Các chất chứa N

4,5

2-6

5

2-8

0,4

0,1-1

Sắc tố

-

-

Vitamin

-

-

Các acid không chứa N
Sáp, sterol và phôtpholipid

Nguôn: Wolfrom và Binkley, 1953; Nguyễn Xuân Trạch, 2009

Thành phần tiêu chuẩn của rỉ mật thường được chia thành 3 phần: đường, chất
hữu cơ không đường và chất khoáng.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

5

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Đường
Các loại gluxid hoà tan (đường đôi và đường đơn) là thành phần dinh dưỡng
chính của rỉ mật, trong đó saccharose là chủ yếu (Bảng 2). Rỉ mật mía có đặc điểm là
có tỷ lệ đưởng khử tương đối cao. Trong chu trình kết tinh các loại đường khử tăng lên
tới mức mà saccharose không thể kết tinh được nữa bởi vì đường khử làm giảm khả
năng hoà tan của saccharose. Các chất khoáng có xu hướng giữ saccharose trong dung
dịch, cho nên cân bằng giữa đường khử và chất khoáng sẽ quyết định sản lượng
saccharose lý thuyết có từ cây mía. Phần sirô còn lại thường được coi là rỉ mật. Tồng
lượng đường trong rỉ mật củ cải đường thường thấp hơn trong rỉ mật mía, nhưng lại
chứa hầu như toàn bộ là saccharose.
Bảng 3. Thành phần chất hữu cơ của rỉ mật
Thành phần

Rỉ mật cải đường (%)

Rỉ mật mía (%)

Saccharose

66

44

Fructose

1

13

Glucose

1

10

Acid amin

8

3

Các chất khác

24

30

Nguồn: Sreg và Van de Meer, 1985, Nguyễn Xuân Trạch,2009

Chất hữu cơ không đường
Các chất hữu cơ không phải là đường của rỉ mật quyết định nhiều tính chất vật lý
cuả nó, đặc biệt là độ nhớt dính. Nó bao gồm chủ yếu là các loại gluxit như tinh bột,
các hợp chất chứa N và các acid hữu cơ. Nói chung hàm lượng các chất hữu cơ không
phải là đường của rỉ mật củ cải đường cao hơn là rỉ mật mía. Trong rỉ mật không chứa

xơ và lipit. Tỷ lệ protein thô trong rỉ mật mía tiêu chuẩn là rất thấp (3-5%). Trong rỉ
mật mía còn có một lượng đáng kể các acid hữu cơ, trong đó chủ yếu là acid acotinic.
Rỉ mật cũng chứa một lượng acid béo bay hơi, trung bình khoảng 1,3% (Nguyễn Xuân
Trạch, 2009).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

6

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Chất khoáng
Rỉ mật là một nguồn giàu khoáng. So với các nguồn thức ăn năng lượng thông
dụng khác như hạt ngũ cốc hàm lượng Ca trong rỉ mật mía cao (tới 1%), trong khi đó
hàm lượng P lại thấp. Rỉ mật mía giàu Na, K. Mg và S. Rỉ mật cũng chứa một lượng
đáng kể các nguyên tố vi lượng như Cu (7 ppm), Zn (10 ppm), Fe (200 ppm), Mn (200
ppm) (Nguyễn Xuân Trạch, 2009).
2.3. Giới thiệu chung về nấm men
2.3.1. Đặc điểm nấm men
Nấm men là vi sinh vật chân hạch, hiện tại có khoảng hơn 1500 loài được tìm
thấy, chiếm khoảng 1% trong tổng số các chủng nấm. Hầu hết nấm men có cấu tạo đơn
bào. Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi. Đặc biệt chúng có mặt nhiều ở đất trồng nho và
các nơi trồng hoa quả. Ngoài ra, chúng có mặt trên trái cây chín, trong nhụy hoa, trong
không khí và cả nơi sản xuất rượu vang (Lương Đức Phẩm, 2006).
2.3.2. Hình dạng và kích thước

Hình dạng tế bào nấm men
Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình cầu, hình elip, hình
trứng, hình bầu dục và cả hình dài. Chúng hầu hết tồn tại dưới dạng đơn bào, một số
loài như Candida albicans không chỉ nảy chồi mà các tế bào nối lại với nhau tạo thành
khuẩn ty giả và Eremothecium gossypii hình thành khuẩn ty thật (Kurtzman và Piškur,
2006).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

7

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Hình 4. Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi điện tử
(*Nguồn: ngày
16/06/20014)

Kích thước tế bào
Tế bào nấm men thường có kích thước rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn.
Kích

thước

trung

bình:

chiều

dài

9-10

µm,

chiều

rộng

2-7

µm

( 23/11/2014). Kích thước nấm
men không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các giai đoạn phát triển khác nhau và
điều kiện nuôi cấy khác nhau.
2.3.3. Cấu tạo tế bào nấm men
Thành tế bào: võ tế bào nấm men cấu tạo bởi carbohydrat, lipid, protein dầy
khoảng 0,5 µm (Cao Ngọc Điệp, 2010).
Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất có 3 tầng kết cấu khác nhau,
được cấu tạo chủ yếu từ protein (50% khối lượng khô), phần còn lại là lipid và một ít
polysaccharide (Nguyễn Lân Dũng, 1999).
Chất nguyên sinh: Chất nguyên sinh của nấm men cũng tương tự như chất
nguyên sinh của vi khuẩn, thành phần chủ yếu là nước, protein, glucid, lipid, enzyme.
Nhân tế bào: Nhân tế bào nấm có phần trên là trung thể và centrochrometin

và phần đáy của nhân có them không bào, bên trong có chứa 6 cặp nhiểm sác thể và
bên ngoài màng nhân có nhiều bào tử bám quanh (Cao Ngọc Điệp, 2010)
Các bào quan và thành phần khác: ty thể, không bào, ribosome,…

Chuyên ngành Vi sinh vật học

8

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

2.3.4. Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men
Sinh dưỡng của nấm men
Cấu tạo của tế bào nấm men thay đổi khác nhau tùy theo loài, độ tuổi và môi
trường sống, nhưng nhìn chung bao gồm:
- Nước: 75-85%
- Chất khô: 15-25%. Trong đó chất khoáng chiếm 2-14% hàm lượng chất khô
(Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Bảng 4. Thành phần hóa học của nấm men
Các chất

Thành phần (% chất khô)

Carbon

49,8

CaO

12,4

Nitơ

6,7

Hydro

3,54

P2O5

2,34

K2O

0,04

SO3

0,42

MgO

0,38

Fe2O3

0,035

SiO

0,09

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, carbon, nitơ,
phospho, kali, magiê,…
- Dinh dưỡng Carbon
Nguồn Carbon cung cấp là các loại đường khác nhau: saccharose, maltose,
lactose, glucose…
Hô hấp hiếu khí:
C6H12O6 + 6O2

Chuyên ngành Vi sinh vật học

6CO2 + 6H2O + 674 cal

9

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Hô hấp kỵ khí
C6H12O6 Lên men 2CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal
- Dinh dưỡng oxy, hydro: được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường
nuôi cấy hay dịch.
- Dinh dưỡng Nitơ:
Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid, nên không thể phân cắt
albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ
hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid, urê. Đạm vô cơ là
các muối amon khử nitrate, sulfate,…
- Các vitamin và chất khoáng:
Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men
+ Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme
của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng
lượng lớn.
+ Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và
enzyme.
+ Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men.
+ Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác.
+ Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men,
tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic.
+ Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê.
Quá trình sinh trưởng và phát triển
- Sự sinh trưởng
Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men
tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều.
- Sự phát triển
Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối
rất lớn sau một thời gian ngắn. Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này trong
dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già. Vì rằng tế bào được phân chia thành hai cứ như
Chuyên ngành Vi sinh vật học

10

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái đang phát triển. Tế bào chỉ già khi môi trường
thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh sản nữa.
Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng
phát hiện tế bào già rất rõ. Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập nơi tách
đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo. Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi
mới. Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian.
Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người
ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như:
+ Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi
hay gián tiếp trên mặt thạch.
+ Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị
chuẩn của mật độ tế bào,…
Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể chia làm 5
giai đoạn (Nguyễn Hoài Thương, 2009):
 Giai đoạn tiềm phát: giai đoạn này tế bào làm quen với môi trường, sinh
khối chưa tăng nhiều.
 Giai đoạn logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt,
kèm theo sự thay đổi mạnh mẽ của dịch lên men.
 Giai đoạn chậm dần: tốc độ sinh trưởng nấm men giảm dần, thành phần
dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều.

 Giai đoạn ổn định: số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh
sản bằng tốc độ chết.
 Giai đoạn chết: tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít do đó số lượng
tế bào nấm men giảm dần.
2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện
nuôi cấy thu sinh khối tế bào
 Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn hydratcarbon,
nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg, Ca và vitamin. Dùng
ngũ cốc làm nguồn nguyên liệu sản xuất sinh khối nấm men rất tốt. Bột hoặc tinh bột
các loại dùng vào mục đích này trước tiên phải thủy phân bằng acid hoặc enzyme của
mầm mạ, của vi sinh vật để biến các polysacarit thành các dạng đường mà nấm men

Chuyên ngành Vi sinh vật học

11

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

đồng hóa được. Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trường mà
nguồn carbon duy nhất là tinh bột, phát triển dễ hơn trên môi trường đường với nguồn
nguyên liệu được nấu chín tốt hơn. Một số giống nấm men phân lập từ men thuốc bắc
có khả năng sử dụng cả môi trường đường và môi trường tinh bột hoặc cấy trực tiếp
vào thức ăn sống mà vẫn phát triển tốt. Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường cám, số
lượng nấm men có thể đạt hàng chục triệu tế bào/ml dịch nuôi cấy.

Môi trường rỉ đường hoặc dung dịch đường được acid hóa với pH = 4, bổ sung
thành phần dinh dưỡng và duy trì nhiệt độ 25-30oC, lượng sinh khối thu được khoảng
25-50 g/L (Trần Minh Tâm, 2002; Nguyễn Thị Hồng Phương, 2006). Theo phòng vi
sinh thuộc Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, từ 1 m3 nước bã rượu nuôi nấm men có thể
thu được 10-15 kg men khô (Lê Văn Việt Mẫn, 2008). Môi trường nước chiết giá đậu
cũng được sử dụng để nuôi cấy nấm men do trong đậu chứa hàm lượng protein cao, là
nguồn thức ăn tốt cho nấm men. Ngoài ra, còn có các vitamin A1, B1, B2, C, E, K và
các chất kích thích tố tăng trưởng khác. Tuy nhiên, vitamin C trong nước chiết giá đậu
có thể làm hạn chế sự phát triển của nấm men. Ngoài ra, môi trường thủy phân từ
cellulose thực vật (gỗ, vỏ bào, rơm rạ, lõi ngô, bã mía,…), hay parafin từ dầu mỏ cũng
có thể sử dụng để nuôi cấy nấm men.
Đặc biệt, nấm men có khả năng sử dụng được môi trường dịch kiềm sulfit (chất
thải của nhà máy giấy), thành phần chủ yếu là đường pentose. Người ta tính được
rằng, khoảng 5 tấn bột cellulose dùng sản xuất giấy sẽ thải một lượng dịch kiềm sulfit
chứa khoảng 180 kg đường. Dịch này hấp thụ nhiều oxy nên khi nuôi cấy nấm men có
thể giảm mức cung cấp oxy tới 60% so với bình thường (Lương Đức Phẩm, 2006).
Hiện nay, môi trường được sử dụng để nuôi cấy nấm men phổ biến nhất vẫn là môi
trường rỉ đường. 90% lượng sinh khối nấm men dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi
trên thế giới được sản xuất từ rỉ đường mía và củ cải đường. Thành phần chính của
loại nguyên liệu này là saccharose, khoảng 35-40%. Trong đường mía chứa các chất
sinh trưởng (biotin, acid pantotenic, inozit) với hàm lượng lớn, nhưng lại nghèo chất
khoáng và các acid amin. Vì vậy, khi sử dụng đường mía làm nguồn carbon nuôi cấy
nấm men cần phải loại bỏ một phần các chất sinh trưởng, đồng thời bổ sung các muối
khoáng cần thiết và có thể phải thêm hỗn hợp các acid amin dạng protein thủy phân
vào giai đoạn nhân giống. Lượng đường trong môi trường khoảng 2-3%, không nên
nhiều hơn hay ít hơn. Nếu lượng đường cao sẽ vừa lãng phí và vừa tạo ra những sản

Chuyên ngành Vi sinh vật học

12

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

phẩm trao đổi chất khác, gây ức chế ngược đến quá trình tạo sinh khối. Nếu lượng
đường quá nhỏ sẽ không đủ nguồn carbon cần thiết cho sự tạo sinh khối. Một điểm
đáng lưu ý là hệ keo và các chất màu có trong mật rỉ. Hệ keo có trong mật rỉ được hình
thành bởi protein và pectin, nó thường có độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi
chất của tế bào, gây ra hiện tượng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém, dẫn
đến hiệu suất sinh khối thu được thấp. Các chất màu có trong rỉ đường như hợp chất
caramen, melanin… sẽ làm sinh khối nấm men có màu sẫm, ảnh hưởng đến cảm quan.
Vì thế, đặc biệt trong sản xuất men bánh mì người ta phải xử lý rỉ đường trước khi
nuôi cấy.
 Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển
của chúng. Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ưu là 28-30oC, trên 43oC và
dưới 28oC sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn. Ở 30oC, nấm men hoang
dại phát triển nhanh hơn S. cerevisiae 2-3 lần, ở 35-38oC chúng phát triển nhanh hơn
6-8 lần. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh; còn ở nhiệt độ thấp
khoảng 20-23oC, hạn chế được mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài
hơn.
 pH
pH của môi trường pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,2-5,5. Ở pH = 4, tốc độ
tích luỹ sinh khối giảm, pH = 3,0 sự sinh sản của nấm men ngừng lại. Mức độ hấp thụ
chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein
đều bị ảnh hưởng bởi pH nên chất lượng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trường

nằm ngoài khoảng 4,5-5,6 (Lương Đức Phẩm, 2006).
 Tốc độ sục khí và khuấy trộn
Tốc độ sục khí và khuấy trộn Trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch men
liên tục bão hoà oxy hoà tan. Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây nên tác động
âm trên hoạt động sống của tế bào nấm men. Oxy không khí di chuyển vào tế bào nấm
men qua 2 giai đoạn: đầu tiên oxy được hoà tan vào môi trường nuôi cấy sau đó nấm
men mới hấp thụ oxy vào trong tế bào. Về lý thuyết, cần 1,066 kg (0,764 m3) oxy để
oxy hóa 1 kg đường, nhưng thực tế chỉ 1 phần nhỏ oxy bơm vào là được nấm men sử
dụng, phần còn lại bị mất đi do các quá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của
môi trường (Lao Thị Nga, 1987). Khi nuôi cấy nấm men ở qui mô công nghiệp, kích
Chuyên ngành Vi sinh vật học

13

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

thước của thiết bị nuôi cấy nấm men là tiền đề cần thiết, ảnh hưởng gián tiếp lên sự
tăng trưởng của nấm men.
2.3.6. Vai trò và ứng dụng của nấm men
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng rất giàu
protein, lipip và vitamin (đặc biệt là vitamin B). Chúng có khả năng lên men các loại
đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí chúng
có khả năng tăng nhanh lượng sinh khối tế bào. Trong quá trình trao đổi chất của hầu
hết giống nấm men đều không sinh ra chất độc hại cho sức khỏe của con người và vật
nuôi nên chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm như sản

xuất rượu, bia, nước giải khát có cồn, làm men bánh mì, chế biến các thực phẩm sữa
lên men kefir, johur,… Cho người và thức ăn gia súc. Trong đó việc ứng dụng nấm
men vào việc lên men các sản phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol rất được quan
tâm, nguồn ethanol giá thành rẻ sẽ đóng góp đáng kể vào việc giải quyết vấn đề về
nhiên liệu và ô nhiễm môi trường. Một số sản phẩm ứng dụng của từng chủng nấm
men cụ thể được liệt kê trong Bảng 1 (Jacobson và Jolly, 1989).
Trong quá trình lên men, ngoài ethanol, CO2, các sản phẩm khác cũng được tạo
ra như glycerol, ester, acid hữu cơ, aldehyde,… Sự hiện diện của các sản phẩm này
phụ thuộc vào chủng nấm men và điều kiện lên men. Chúng góp phần quan trọng
trong việc tạo nên hương vị đặc trưng cho rượu. Để sản phẩm lên men có tính đặc
trưng, chúng ta cần phải chọn lọc các chủng nấm men thích hợp cho từng sản phẩm.
Việc chọn lọc các chủng nấm men thường chọn lọc vào hai yếu tố:
 Tốc độ lên men: để so sánh khả năng lên men của các chủng nấm men, phương
pháp thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm là phương pháp chai
Durham. Phương pháp này so sánh cường độ lên men dựa vào khí CO2 sinh ra
trong quá trình lên men rượu. Trong cùng thời điểm lượng CO2 sinh ra nhiều hơn
chứng tỏ cường độ lên men mạnh hơn.
 Khả năng chịu được nồng độ cồn cao trong môi trường lên men: để so sánh tính
chịu đựng độ cồn cao của các chủng men, có thể sử dụng phương pháp cho lên
men trong dung dịch đường có nồng độ cồn cao, khoảng 15-30% (w/v), hoặc có
thể sử dụng phương pháp lên men lien tục bằng cách bổ sung glucose vào trong
quá trình lên men từ từ, liên tục đến một thời điểm nào đó khi không thấy dấu hiệu
lên men xảy ra nữa. Khi kết thúc quá trình lên men, chủng nấm men nào cho nồng
Chuyên ngành Vi sinh vật học

14

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

độ cồn cao hơn chứng tỏ chủng nấm men đó có tính chịu đựng độ cồn cao hơn.
Khả năng chịu đựng độ cồn của đa số các chủng men trong sản xuất rượu bia vào
khoảng 5-10 độ cồn (Casey và Ingledew, 1986).
Bảng 5. Sự hiện diện và ứng dụng của nấm men trong một số thực phẩm,
thức uống có cồn và sản phẩm lên men
Sản phẩm, ứng dụng

Nấm men

Rượu, bia

Saccharomyces cerevisiae

Bánh mì và bột nhão bánh mì

S. cerevisiae, S. exiguus, S. rosei

D-Arabitol (chất làm ngọt)

Candida diddensiae

Chất tạo nhũ tương

C. lipolytica

Thức ăn gia cầm và cá

Phaffia rhodozyma

Lactose và sữa lên men

C. pseudotropicalis, Kluyveromyces fragilis, K. lactis

Lên men bia lager

S. carlsbergensis

Mannitol (chất hút ẩm)

Torulopsis manitofaciens

Shoyu, Miso

Zygosaccharomyces rouxii

Lên men rượu vang

S. cerevisiae

Xylitol (chất làm ngọt)

T. candida

Lên men D-xylose

C. shehatae, Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Pichia

segobiensis

(*Nguồn: Jacobson và Jolly, 1989)

Người ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất vitamin,
enzyme,… Đặc biệt, loài Saccharomyces cerevisiae đang được sử dụng như một công
cụ đắc lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ
mới của ngành công nghệ sinh học hiện đại. Tuy nhiên, cũng có một số nấm men gây
bệnh cho người và gia súc như Candida albican, Crytoccocus neoforman,… gây hư
hỏng thực phẩm như Endomycopsis fibuligera, Saccharomyces bisporus,…
2.3.7. Nấm men chịu nhiệt
Ngày nay, nấm men được sử dụng trong nhiều quy trình công nghiệp, chẳng
hạn như sản xuất đồ uống có cồn, sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất khác nhau.
Một số các sản phẩm được sản xuất thương mại, đồng thời có giá trị công nghệ sinh
học (Kurtzman và Fell, 1997). Lên men ethanol ở các quốc gia nhiệt đới, nơi mà nhiệt
độ trung bình trong năm luôn ở mức cao. Những ích lợi của quá trình lên men mạnh ở
nhiệt độ cao không chỉ giảm tạp nhiễm mà còn giảm thiểu được cho phí làm mát. Để
Chuyên ngành Vi sinh vật học

15

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học