phân lập và tuyển chọn nấm men trong viên men cơm rượu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC



PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN
TRONG VIÊN MEN CƠM RƯỢU






CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NGUYỄN VĂN THÀNH LÊ PHAN ĐÌNH QUÍ
MSSV: 3102854
LỚP: CNSH K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN



PGS.TS. Nguyễn Văn Thành Lê Phan Đình Quí



DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Đầu tiên, con xin chân thành cảm ơn cha mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng,
dạy dỗ con cho đến hôm nay.
Xin cám ơn tất cả quý thầy cô đã tận tình giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập
tại trường Đại học Cần Thơ, cám ơn các thầy cô của Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức bổ ích trong quá trình theo học tại trường.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của tôi đến PGs.Ts. Nguyễn Văn Thành –
người Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành
luận văn này.
Xin cám ơn cô Bùi Thị Minh Diệu – cô cố vấn học tập, người đã dìu dắt, giúp đỡ,
khuyên bảo tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Xin chân thành cám ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Huỳnh Xuân Phong, anh
Phạm Hồng Quang – cán bộ phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm, các anh
chị cao học K18, K19, CNSH TT K35, các bạn VSV K36 đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện luận văn.
Xin cám ơn tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học K36 đã luôn cổ vũ, động viên và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập qua.
Xin ghi ơn cha mẹ và tất cả bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
qua.
Kính chúc quý thầy cô được nhiều sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực và luôn có
những cống hiến quý báu cho sự nghiệp giáo dục và đạo tạo.
Xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày 29 tháng 11 năm 2013



Lê Phan Đình Quí


i

TÓM LƯỢC
Với mục đích tuyển chọn dòng nấm men cho hoạt tính lên men tốt để tiến đến sản xuất
bột men lên men cơm rượu, đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men trong viên men cơm
rượu” đã được tiến hành. Đề tài đã phân lập nấm men từ 10 loại viên men cơm rượu trên thị
trường một số tỉnh Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, Khảo sát hoạt tính các dòng nấm men
đã phân lập để tuyển chọn ra dòng nấm men cho hoạt tính cao. Tiến hành thử nghiệm sản
xuất bột men với dòng nấm men tuyển chọn ở tỷ lệ phối trộn phù hợp nhằm đạt tế bào nấm
men nhiều nhất. Khảo sát tỷ lệ bột men và thời gian sử dụng thích hợp cho quá trình rượu
hóa thông qua hoạt tính bột men sản xuất được.
Kết quả đã phân lập được 27 dòng nấm men, trong đó dòng nấm men TNL2 (phân lập
từ men cơm rượu loại lớn ở Thốt Nốt, Cần Thơ) có hoạt lực lên men mạnh (thời gian lên men
làm đầy cột khí (3 cm) trong ống Durham ngắn nhất (10 giờ) và cho độ rượu là 7,81 %v/v.
Thử nghiệm sản xuất bột men với mật số tổng số nấm men khá cao (2,4 x 10
9
tế bào/gck).
Đồng thời khảo sát hoạt tính của bột men với tỷ lệ bột men 0,75% (mật số nấm men 9 x 10
8

tế bào/gck) và thời gian lên men 4 ngày là hiệu quả, cho ra độ rượu cao (11,66 %v/v).
Từ khóa: bột men, nấm men, phân lập, viên men cơm rượu.

ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2
1.3. Nội dung nghiên cứu 2
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Một số loại bánh men cơm rượu 3
2.1.1 Bánh men thường 3
2.1.2 Bánh men lá 3
2.1.3 Bánh men thuốc Bắc 4
2.2. Hệ vi sinh vật trong viên men cơm rượu 4
2.2.1. Nấm men 4
2.2.2. Nấm mốc 10
2.2.3. Vi khuẩn 10
2.3. Quá trình rượu hóa 11
2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men 13
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16
3.2. Phương tiện nghiên cứu 16
3.2.1. Nguyên vật liệu 16
3.2.2. Dụng cụ, thiết bị 16
3.2.3. Hóa chất 16
3.3. Phương pháp nghiên cứu 17
3.3.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men trong các loại men cơm rượu 17

iii

3.3.2. Thí nghiệm 2: Tuyển chọn nấm men phân lập có hoạt tính lên men cao 18
3.3.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sản xuất bột men 21
3.3.4. Thí nghiệm 4: Thử hoạt tính bột men 22
3.3.5. Phương pháp phân tích 23

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men trong các loại viên men cơm rượu 24
4.2. Thí nghiệm 2: Tuyển chọn nấm men phân lập có hoạt tính cao 25
4.3. Thử nghiệm sản xuất bột men 28
4.4. Thử hoạt tính bột men 29
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31
5.1. Kết luận 31
5.2. Đề nghị 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
PHỤ LỤC viii
PHỤ LỤC 1. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM viii
PHỤ LỤC 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH xi
PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM xv
PHỤ LỤC 4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ xxi










iv

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2. Chiều cao cột khí CO
2
(cm) trong ống Durham của 27 dòng nấm men

đã phân lập 26
Bảng 3. Khả năng lên men của 27 dòng nấm men đã phân lập trên môi trường MF7 27
Bảng 4. Khả năng lên men của từng tỷ lệ bột men qua các thời gian 30
lên men khác nhau 30

v

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Cấu tạo nấm men 5
Hình 2. Biểu đồ thể hiện đường tăng trưởng nấm men 10
Hình 3. Lên men rượu bởi nấm men thông qua con đường glycolysis 12
Hình 4. Quy trình phân lập các dòng nấm men từ 10 loại men cơm rượu trên thị trường 17
Hình 5. Quy trình thí nghiệm đo chiều cao cột khí sinh ra trong ống Durham 18
Hình 6. Quy trình thí nghiệm so sánh độ Brix, pH, độ rượu các dòng nấm men đã phân lập 20
Hình 7. Quy trình sản xuất bột men 21
Hình 8. Quy trình thí nghiệm thử hoạt tính của bột men 22
Hình 9. Hình dạng 5 nhóm nấm men 24
Hình 10.Quy trình đề nghị sản xuất bột men cơm rượu ở quy mô phòng thí nghiệm 32



vi

TỪ VIẾT TẮT
AG: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Châu Phú, An Giang.
BD: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Bạch Đằng, Thốt Nốt, Cần Thơ.
CP: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu Chú Phương, Vĩnh Long.
TNL: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Thốt Nốt (Viên lớn)
TNN: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Thốt Nốt (Viên nhỏ)
TS: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Tập Sơn, Trà Vinh
TO: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Trà Ôn, Vĩnh Long
ST: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Vĩnh Châu, Sóc Trăng
HG: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Phụng Hiệp, Hậu Giang
NK: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Ninh Kiều, Cần Thơ
ĐT: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Lấp Vò, Đồng Tháp

CFU: Colony – forming Unit (đơn vị tạo khuẩn lạc)
OGYA: Oxytetracyline – Glucose Yeast Extract Agar
PGA: Potato – Glucose – Agar bổ sung khoáng
PG: Potato – Glucose bổ sung khoáng
gck: gram chất khô
Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
1

CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Từ hàng nghìn năm trước con người đã biết sử dụng nấm men để chế biến thực phẩm. Và
ngày nay vai trò của nấm men cũng rất to lớn trong đời sống chúng ta. Nấm men có mặt trong
quá trình chế biến nhiều loại thực phẩm và thức uống, không chỉ giúp hoàn tất quá trình chế biến
mà còn rất tốt cho sức khỏe.
Lên men là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất của sự chế biến thực phẩm và mang tầm
quan trọng kinh tế to lớn.
Lên men cổ truyền là một dạng lên men mà thường sử dụng một tổ hợp vi sinh vật tạo nên
nhiều loại thực phẩm lên men có giá trị dinh dưỡng.
Thực phẩm lên men có nhiều ưu điểm như:
+ Hàm lượng protein cao.
+ Các vitamin được bảo tồn.
+ Có lợi cho sức khỏe con người.
Tuy nhiên lên men cổ truyền cũng có nhược điểm: Do đây là quá trình lên men trong điều
kiện tự nhiên, được thực hiện bởi các vi sinh vật tự nhiên và vật chất lên men rất phức tạp,
không đồng đều về chủng loại và số lượng. Mặt khác quá trình lên men tự nhiên là quá trình
không kiểm soát, do đó xảy ra hiện tượng giao thoa trong khối lên men. Quá trình lên men này
là quá trình nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm quá trình lên men không ổn định, chất
lượng sản phẩm kém và không đồng nhất.
Ở Việt Nam, những loại thực phẩm lên men cổ truyền rất được ưa chuộng như thạch dừa,

nước mắm, nước giải khát lên men, rau quả muối chua, chao, bánh mì… Trong đó, cơm rượu là
một thức ăn dân giã, ngon, có hương thơm khá hấp dẫn, vị ngọt đặc trưng nên được nhiều người
ưa thích, được xem như một món ăn “văn hóa” thường phải có trong dịp Tết Đoan Ngọ.
Vì thế, việc tiến hành những đề tài phân lập, tuyển chọn lại các dòng nấm men thuần, có
khả năng lên men cao là rất cần thiết, cần tập trung giải quyết những mặt hạn chế như chất
lượng men kém, không ổn đinh để cho ra những sản phẩm cơm rượu ngon hơn, chất lượng hơn,
đặc trưng của Việt Nam nhằm duy trì “văn hóa” ẩm thực của Việt Nam ngày một tốt hơn. Qua
đó nghiên cứu, phân lập các dòng nấm men có khả năng lên men cao từ các viên men cơm rượu
ở các địa phương nhằm lưu trữ nguồn gen quý bản địa.
Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
2

Do đó, việc thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men trong viên men cơm rượu”
là rất cần thiết và phù hợp với thực tiễn.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm men từ viên men cơm rượu để sản xuất bột nấm
men thuần.
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các dòng nấm men trong viên men cơm rượu từ các tỉnh Cần Thơ, An Giang,
Vĩnh Long, Hậu Giang, Trà Vinh, Đồng Tháp, Sóc Trăng.
- Tuyển chọn những dòng nấm men trong viên men cơm rượu có khả năng rượu hóa cao
nhất.
- Thử nghiệm sản xuất bột nấm men ở mức độ phòng thí nghiệm: kiểm tra hoạt lực men
giống thông qua khả năng rượu hóa.

Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
3

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Một số loại bánh men cơm rượu
Ở các nước châu Á, theo truyền thống, người ta hay dùng các loại bánh men để sản
xuất rượu, cồn từ tinh bột. Lúc đầu người ta sản xuất hoàn toàn nhờ vào hệ vi sinh vật tự nhiên
được rơi vào khối ủ. Tuy nhiên, cách làm này thường cho kết quả không ổn định. Do đó, bằng
kinh nghiệm, người ta chọn khối ủ tốt nhất để lại một phần để làm mẻ sau. Cách làm này tốt
hơn cách làm trên nhưng khi thực hiện vẫn không thu được kết quả ổn định do không bảo quản
được lâu. Sau đó, người ta tiến hành sản xuất bánh men. Lúc đầu, bánh men cũng được tạo ra từ
những mẻ ủ tốt nhất bằng cách tạo hình chúng, đem sấy khô, rồi bảo quản để dùng dần. Bằng
cách này, người ta đã hoàn toàn chủ động được quá trình sản xuất và đảm bảo được chất lượng
sản phẩm. Từ đó, phương pháp sản xuất bánh men phát triển khá hoàn thiện, và tạo ra được
nhiều loại bánh men khác nhau, tuỳ theo từng dân tộc và thị hiếu của người tiêu dùng.
Các loại bánh men được sản xuất theo phương pháp truyền thống về nguyên tắc là
giống nhau, nhưng tùy theo đặc điểm khí hậu, nguyên liệu và sở thích của từng địa phương mà
người ta có thể bổ sung vào bánh men một số thành phần khác.
2.1.1 Bánh men thường
Thành phần chính của bánh men thường là bột gạo và giống vi sinh vật. Một trong
những cách làm bánh men thường được thực hiện như sau:
Gạo ngâm nước (3 giờ) để ráo → xay thành bột → nhào bột với men giống + nước → định
hình bánh men → ủ men ở 29°C-30°C, trong 48 giờ → sấy khô ở 40°C hay phơi nắng → bánh
men thành phẩm (Bùi Ái, 2005).
2.1.2 Bánh men lá
Bánh men lá thường được đồng bào dân tộc thiểu số sản xuất và tiêu thụ. Đồng bào các dân
tộc thiểu số thường dùng bánh men lá để sản xuất rượu cần. Ở bánh men lá thay cho các
vò thuốc Bắc, người ta dùng các loại lá sử dụng có thể khác nhau. Chất lượng rượu phụ thuộc
rất nhiều và số lượng và thành phần các loại lá này. Thường bánh men có 3 loại: loại bánh

men một lá, hai lá và ba lá (Bùi Ái, 2005).


Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
4

2.1.3 Bánh men thuốc Bắc
Thành phần ngoài bột gạo, giống vi sinh vật còn có các vò thuốc bắc. Trong bánh
men thuốc bắc ở Mai Đông- Vân Hà (Hà Bắc) có 10 – 20 vò thuốc bắc như bạch truật, nhục đậy
khấu, nhục quế…
Đây chính là loại bánh men để làm món cơm rượu. Việc cho thuốc bắc vào được cho rằng
có tác dụng kích thích sinh trưởng của vi sinh vật trong bánh men, có khả năng sát trùng, ngoài
ra còn có tác dụng tạo hương vò đặc trưng cho món cơm rượu (Bùi Ái, 2005)
2.2. Hệ vi sinh vật trong viên men cơm rượu
2.2.1. Nấm men
Mỗi gam bánh men chứa vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm men. Chúng gồm 2
giống: Endomycopsis (chủ yếu là Endo fibuligenes) và Saccharomyces (chủ yếu là S.
cerevisiae).
Endo fibuligenes là loài nấm men rất giàu enzyme amylase, glucoamylase nên chúng vừa
có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa. Có khả năng lên men nhiều loại đường như:
glucose, saccharose, maltose, fructose, rafinose, galactose. Đồng thời, chúng có thể lên men ở
nhiệt độ cao (36 ÷ 40
o
C) và có khả năng chịu được độ acid. Đặc điểm này rất thuận lợi trong
trường hợp lên men có sử dụng thuốc sát trùng. Điều quan trọng hơn là có khả năng lên men
nhiều loại nguyên liệu: gạo, ngô, khoai, sắn với đường trong dung dịch 12 – 14%, có khi 16 –
18%. Nồng độ rượu cao nhất trong dịch lên men mà nấm men có thể chịu được là 10 – 12%.
Nhiệt độ lên men thích hợp nhất là 28 – 32
o

C.
Ngoài 2 chi nấm men cơ bản trên, trong men thuốc bắc còn nhiều loài men dại khác. Chúng
vừa có khả năng thủy phân tinh bột vừa có khả năng chuyển đường thành rượu tuy nhiên sự
chuyển hóa này thấp. Đặc biệt các loài men dại này chịu được nhiệt độ rất cao (Walker, 1998).
2.2.1.1. Hình thái, kích thước và thành phần cấu tạo của nấm men
a. Hình thái và kích thước
- Hình dạng tế bào nấm men
Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau. Tùy loại, tùy giống, chúng có thể là hình tròn,
hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả
chanh như Saccharomyces apicultus, đôi khi hình chai như Saccharomyces ludwigii hoặc hình
ống dài như Pichia. Nói chung, hình dáng của tế bào nấm men ở các loài khác nhau thì khác
Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
5

nhau, trong cùng một loài hình dáng tế bào cũng có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi
trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào (Lê Xuân Phương, 2001).
- Kích thước tế bào nấm men
Kích thước của tế bào nấm men khác nhau rất nhiều, tùy theo loài giống, điều kiện sinh
trưởng có thể thay đổi trong khoảng 1,5 – 5,3 µm hay có khi dài hơn nữa, các loài nấm men
thường dùng trong sản xuất rượu vang có kích thước khoảng 4 – 7 µm.
b. Thành phần cấu tạo và hóa học của nấm men
- Thành phần cấu tạo của nấm men
CW: vách tế bào chất
P: tế bào chất
CM: màng tế bào
CMI: sự lõm vào
BS: vết sẹo sinh
C: tế bào chất
N: nhân

M: ty thể
ER: lưới nội chất
SV: bọng secretory
V: không bào
PER: peroxisome. (Walker,
1998)
Hình 1. Cấu tạo nấm men
( ngày 02/08/2013)
Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản
sau:
- Thành tế bào: Thành tế bào nấm men được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau.
Trong đó đáng kể nhất là: glucan, protein, lipd,…và một số thành phần nhỏ khác như kitin.
- Màng nguyên sinh chất: Có cấu tạo tương tự như màng nguyên sinh chất của tế bào vi
khuẩn, gồm có các hợp chất phức tạp như protein, phospholipids,… Trong thời kỳ còn non,
màng nguyên sinh chất bám sát thành tế bào làm cho khả năng trao đổi chất của nấm men gặp
Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
6

rất nhiều khó khăn. Ở thời kỳ tế bào già màng nguyên sinh chất co lại, tạo thành một khoảng
trống giữa thành tế bào và chất nguyên sinh vì thế mà khả năng trao đổi chất của nấm men cũng
gặp khó khăn.
- Chất nguyên sinh: Chất nguyên sinh thường có màu xám. Khi tế bào còn non hầu như
không nhận thấy, càng về già ta càng thấy có sự thay đổi rõ rệt.
Tế bào còn non chất nguyên sinh thường đồng nhất hơn, càng về già tế bào càng không
đồng nhất vì xuất hiện nhiều không bào và hạt volutin. Trong thành phần của chúng cũng giống
như của các vi sinh vật khác chủ yếu được cấu tạo từ nước, protid, glucid, lipid, các muối
khoáng, enzyme và các bào quan.
Tế bào chất luôn luôn chuyển động. thường chuyển động theo một chiều xung quanh thành
tế bào.

Ngoài ra, nó còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của nấm men. Thí dụ nấm men trong
trạng thái hô hấp tế bào chất thường đồng nhất, trong khi đó ở trạng thái lên men thấy xuất hiện
nhiều chất làm mất tính đồng nhất của không bào. Độ nhớt của tế bào chất lớn hơn độ nhớt của
nước 800 lần.
- Nhân tế bào: Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men đã có nhân thật. Nhân thường có
hình bầu dục hay hình cầu.
Nhân được bao bọc một lớp màng, bên trong là lớp dịch nhân, có trong đó một thể rắn gọi
là hạch nhân hay nhân con, nhân nấm men có chứa protein và acid nucleic.
- Những thành phần khác:
+ Không bào:
Trong mỗi tế bào nấm men có một hoặc nhiều không bào. Không bào chứa đầy dịch tế bào,
bên ngoài được bao bọc bởi một lớp màng không bào (tonoplaste). Hình dạng không bào có thể
thay đổi tùy theo tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào. Vị trí không bào trong tế bào cũng khác
nhau. Nếu có một không bào thì chúng nằm ở một đầu, có hai thì chúng nằm ở hai đầu và nhiều
thì chúng nằm chung quanh. Không bào là nơi chứa đựng các protease. Các enzyme tham gia
quá trình tự phân rất mạnh.
+ Volutin:
Thường thấy trong không bào. Nó không phải là thành phần cấu trúc của tế bào. Chúng chỉ
thấy xuất hiện ở điều kiện đặc biệt khi nuôi cấy trên môi trường giàu hydrade carbon và
phosphate vô cơ. Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C:N, sự có mặt của S và vitamine,
Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
7

pH trong môi trường. Trong điều kiện lên men tế bào thường chứa ít hạt volutin hơn khi phát
triển trong điều kiện hiếu khí.
Volutin đóng vai trò quan trọng sau:
_ Là chất dự trữ các chất dinh dưỡng của tế bào
_ Tham gia vào việc điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào
_ Làm nguồn năng lượng cho tế bào như polyphosphate của volutin dung làm nguồn năng

lượng cho quá trình sinh hóa học của tế bào, thông qua hệ thống ATP. Polyphosphate của
volutin có thể tham gia vào quá trình lên men, hô hấp, acid nuclein của volutin là nguồn dự trữ
dung để tổng hợp acid nucleic tế bào chất và một số enzyme.
Ngoài volutin ra còn thấy hạt mỡ, glycogen, lipid…
+ Ty thể, lạp thể: Ty thể, lạp thể của nấm men cũng giống như ty thể, lạp thể của nhiều
sinh vật khác. Nghĩa là cũng tham gia như một nhà máy cung cấp cho tế bào hoạt động. Về cấu
tạo thì ty thể, lạp thể được chia ra thành những lớp sau:
Màng phía ngoài chia thành 3 lớp
Màng phía trong có vách cũng chia thành 3 lớp
Khoảng cách giữa các lớp là nơi xảy ra những phản ứng tạo ATP.
+ Ribosome: Tham gia mọi quá trình tổng hợp các chất trong cơ thể. Khác với vi khuẩn,
ribosome của nấm men tồn tại hai loại:
- Loại 80S (gồm hạt 60S + 40S) tồn tại tự do
- Loại 70S (gồm 50S + 40S) liên kết với cấu trúc màng. Loại này thể hiện khả
năng tổng hợp mạnh (Nguyễn Đức Lượng, 1996).
- Thành phần hóa học của nấm men
Bảng 1. Thành phần hóa học của nấm men
Các chất Thành phần (%)
Carbon 49,8
CaO 12,4
Nitơ 6,7
Hydro 3,54
P
2
O
5
2,34
K
2
O 0,04

SO
3
0,42
MgO 0,38
Fe
2
O
3
0,035
SiO 0,09
(
N
gu
ồn: Nguyễn Đức L
ư
ợng, 1996)

Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
8

2.2.1.2. Sự biến dưỡng và sinh sản của nấm men
a. Quá trình biến dưỡng
Quá trình biến dưỡng của nấm men gồm giai đoạn chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất
vào tế bào và các chuỗi phản ứng hóa học để biến đổi các chất dinh dưỡng tổng hợp và vật liệu
cho tế bào. Theo Walker (1998), trong điều kiện có oxy thì pyruvate bị oxy hóa cho ra CO
2
và
ATP để nấm men phát triển sinh khối. Trong điều kiện không có oxy thì Pyruvate sẽ bị mất CO
2

và tạo thành acetaldehyde
CH
3
COCOH CH
3
CH=O + CO
2

Sau đó acetaldehyde được khử thành ethanol do enzyme alcoldehydrogenase xúc tác
CH
3
CH=O + NADH + H
+
CH
3
CH
2
OH + NAD
+

Tùy theo điều kiện của môi trường mà sự lên men có thể theo các kiểu:
- Kiểu lên men bình thường: xảy ra khi pH = 4 – 5, sản phẩm của kiểu lên men này là:
C
6
H
12
O
6
+ 2(P) + 2ADP 2C

2
H
5
OH + 2CO
2
+ 2ATP + 2H
2
O
- Kiểu lên men rượu trong môi trường kiềm, sản phẩm của kiểu lên men này là:
2C
6
H
12
O
6
+ H
2
O 2CH
2
CH
2
CH(OH) + CH
3
COOH + C
2
H
5
OH + 2CO
2
b. Sự sinh sản của nấm men (Lê Xuân Phương, 2001)

- Sự sinh sản vô tính
+ Sinh sản bằng hình thức nảy chồi
Bình thường đến một giai đoạn nào đó, tế bào phân chia và tạo thành những tế bào con, lúc
đầu những tế bào này nhỏ hơn tế bào mẹ, sau đó lớn dần, hoặc tách khỏi tế bào mẹ hoặc không
tách khỏi mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau ngay cả khi trường thành tạo thành
chuỗi tế bào gọi là khuẩn ty giả. Đây là hình thức sinh sản vô tính chủ yếu nhất ở nấm men.
+ Sinh sản bằng hình thức phân chia
Một số loài phân đôi tế bào thành 2 tế bào con, lúc đầy chất nhân chia làm 2 phần, sau đó ở
phần giữa tế bào xuất hiện thành tế bào, thành này lớn dần lên và màng nguyên sinh chất lọt vào
bên trong. Lúc này thành tế bào mới phát triển hoàn thiện và chia tế bào mẹ làm 2 tế bào con
độc lập.
- Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore)
Bào tử túi của nấm men là những bào tử được sinh ra trong những túi gọi là túi hay nang
(ascus) mỗi túi chứa 4 – 8 bào tử túi. Túi hay nang bào tử có thể được sinh ra theo 2 phương
thức: tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao.
Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
9

- Sinh sản đơn tính
Tạo thành bào tử trực tiếp từ 1 tế bào riêng lẻ không thông qua tiếp hợp (nhiều loài trong
các giống Pichia, Torulosporus, Saccharomyces. Bào tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện
thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men giới. Tế bào này lại tiếp tục sinh sản theo lối
nảy chồi. Sự hình thành bào tử túi là một quá trình đồng thời mang hai ý nghĩa vừa sinh sản, vừa
tạo dạng bền vững vì bào tử túi có vỏ dày chịu được điều kiện không thuận lợi của môi trường,
chịu được nhiệt độ cao và sự khô hạn.
c. Các quá trình sinh lý của tế bào nấm men
* Sinh dưỡng của nấm men: cấu tạo của nấm men thay đổi khác nhau tùy theo loài, độ tuổi
và môi trường sống, nhưng nhìn chung bao gồm: nước, chất khô, oxy, hydro, cacbon, nitơ,
phosphor, kali, magie, các vitamin và chất khoáng.

* Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men (Nguyễn Đức Lượng,
1996): Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng mà nó
sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo 2 con đường cơ bản: thẩm thấu bị động
và hấp thụ chủ động.
* Quá trình sinh trường và phát triển
Sự sinh trưởng: trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm
men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều.
Sự phát triển: Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho một lượng sinh
khối rất lớn sau một thời gian ngắn. Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời
gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như:
* Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp
trên mặt thạch.
* Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của
mật độ tế bào.






Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
10

Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể chia làm 5 giai đoạn:

Hình 2. Biểu đồ thể hiện đường tăng trưởng nấm men
- Giai đoạn tiềm phát: giai đoạn này tế bào làm quen với môi trường, sinh khối chưa tăng nhiều.
- Giai đoạn logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt, kèm theo sư thay
đổi mạnh mẽ của dịch lên men.
- Giai đoạn chậm dần: tốc độ tăng trưởng nấm men giảm dần, thành phần dịch lên men còn ít,
các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều.
- Giai đoạn ổn định: số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết.
- Giai đoạn chết: tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít, số lượng tế bào nấm men giảm
dần.
2.2.2. Nấm mốc
Trong bánh men thuốc bắc, nấm mốc chủ yếu là các chi: Mucor, Aspergillus, Penicillum,
Rhizopus. Trong đó, đặc biệt là loài Mucor rouxii có nhiều đặc tính quý như sau: có khả năng
chịu nhiệt độ cao 32 – 35
o
C, vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa. Năm 1998,
Lee et al., đã khảo sát hệ sinh vật trong viên men rượu được sản xuất tại Việt Nam, kết quả phân
lập được các dòng nấm mốc như: Rhizopus oryzae, Mucorindicus, Mucorcircinilloides,
Amylomyces rouxii (Nout et al., 1995).
2.2.3. Vi khuẩn
Trong bánh men thuốc bắc có rất nhiều loại vi khuẩn phát triển, nhưng chủ yếu là vi khuẩn
acid lactic như Lactobacillus, Streptococcus và vi khuẩn acid acetic như A. aceti, A.
Suboxydans; vi khuẩn gây thối (Lee và Fujio, 1998).
Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
11

Vi khuẩn sinh sản bằng cách tự nhân đôi, thời gian cho một thế hệ vi khuẩn thường ngắn.

Một khảo sát khả năng sinh sản của một số dòng vi khuẩn sinh acid acetic trên môi trường tinh
bột ngô ở 30
o
C cho thấy thời gian pha log khoảng 4 – 8 giờ, thời gian cho một thế hệ khoảng 1,2
– 2 giờ, mật số phát triển tối đa có thể đến 10
9
CFU/ml. Sự hiện diện của vi khuẩn trong viên
men rượu được xem là gây hại cho quá trình sản xuất rượu (Holzapel, 1997).
Thời gian đầu của quá trình lên men, các vi khuẩn này phát triển tạo ra pH môi rường thích
hợp cho sự phát triển của nấm men. Tuy nhiên nếu pH quá thấp sẽ ức chế hoạt động của nấm
men. Mặt khác, nếu trong dịch lên men có sự hiện diện của oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa
rượu thành acid acetic làm giảm lượng rượu hình thành.
2.3. Quá trình rượu hóa
Lên men là quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ, về cơ bản là chuyển carbohydrate
thành rượu bởi hoạt động của vi sinh vật. Ethanol là sản phẩm mong muốn của quá trình lên
men carbohydrate, nhưng ngoài rượu còn có rượu bậc cao, acid, ceton và aldehyde có thể hình
thành như là các sản phẩm phụ (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Sản xuất ethanol qua quá trình lên
men được dựa trên việc chuyển đổi đường thành ethanol bằng nấm men trong điều kiện yếm
khí. Để đảm bảo rằng các vi khuẩn kỵ khí phát triển mạnh, cẩn thận kiểm soát nồng độ chất nền,
độ pH, nhiệt độ, chất dinh dưỡng. Hầu hết quá trình lên men rượu cồn được tiến hành dùng
chủng nấm men S. cerevisiae (Berry, 1995). Nấm men có thể chuyển hóa đường theo hai con
đường lên men và hô hấp. Lên men rượu cồn bằng nấm men thông qua con đường glycolysis
(Hình 3).



Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
12

Hình 3. Lên men rượu bởi nấm men thông qua con đường glycolysis
(Nguồn: Walker, 1998)




Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
13

2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men
Nồng độ đường
Tất cả nấm men chỉ có khả năng lên men các đường đơn giản như đường đơn (glucose,
fructose) và đường đôi (maltose, saccarose) riêng đường lactose chỉ có nấm men Saccharomyces
lactic sử dụng được. Nấm men hoàn toàn không có khả năng thủy phân các loại đường đa.
Nồng độ đường thích hợp nhất cho quá trình lên men rượu là 8 – 20%. Khi nồng độ đường lớn
hơn 30% sẽ ức chế quá trình lên men rượu. Tùy thuộc vào sản phẩm của quá trình lên men mà
người ta sử dụng nồng độ đường thích hợp. Trong sản xuất cồn người ta sử dụng nồng độ đường
từ 14 – 20%, quá trình lên men xảy ra mạnh và hết lượng đường sau đó người ta chưng cất để
thu cồn. Đối với việc sản xuất rượu vang người ta sử dụng nồng độ đường từ 16 – 25% và dùng
nấm men chìm, nên quá trình lên men chậm và sau khi lên men vẫn còn một lượng đường trong
rượu vì vậy rượu vang thường có vị ngọt. Còn trong sản xuất bia thường dùng nồng độ đường từ
9 – 12%.
Độ ẩm
Kết quả khảo sát của Lee và Fujio (1999) cho thấy độ ẩm của viên men Việt Nam khoảng
13,6%. Vì nước cần cho sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật, trong đó quan trọng nhất là
nước tự do có nguyên liệu. Do đó khi ủ men vào nguyên liệu có độ ẩm khoảng 50% cho kết quả
quan trọng nhất. Độ ẩm môi trường thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn (Nguyễn
Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005).
Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho phát triển của chúng. Đối với nấm men nhiệt độ
tối ưu cho sự phát triển là 28 – 32
o
C
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae, nhiệt
độ tối ưu nằm trong khoảng 28 – 32
o

C. Ở 40
o
C nấm men ngừng sinh trưởng và bị chết (Lương
Đức Phẩm, 2006). Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt khác, ở điều kiện
nhiệt độ thấp còn hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm
men sẽ giảm nhanh, chủ yếu do nhiễm khuẩn lactic và nấm men dại. Ở nhiệt độ 30
o
C, nấm men
dại sẽ phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2 đến 3 lần và nhanh hơn 6 tới 8 lần nếu lên men ở
nhiệt độ 35 – 38
o
C. Điều kiện bất lợi nữa khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều ester, aldehyde
và tổn thất rượu theo CO
2
(Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005).

Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
14

Độ rượu
Rượu được tích tụ dần trong dịch lên men và chính nó lại là chất độc kìm hãm các nấm
men. Nấm men chịu nồng độ cồn từ 8 – 12%, từ 16 – 18% đại đa số nấm men bị ức chế. Nếu
nồng độ cồn quá cao sẽ ức chế tất cả các nấm men. Khả năng chịu cồn của nấm men là nồng độ
cồn ức chế sự phát triển và hoạt động của nấm men sau 72 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 30
o
C.
Tùy theo khả năng chịu được nồng độ cồn khác nhau mà người ta sản xuất ra các sản phẩm khác
nhau.
pH

Nồng độ ion H
+
trong môi trường lên men ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của nấm men.
Chúng có khả năng làm thay đổi diện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ
thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi sinh vật
chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, phụ thuộc vào pH của môi trường.
Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo ethanol là 4,5 đến 5,0. Đối với dịch đường từ
nguyên liệu tinh bột thường khống chế độ pH 4,8 – 5,2 nhằm kết hợp giữ cho amylase tiếp tục
chuyển hóa tinh bột và dextrin thành đường có thể lên men.
Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, tạo ra nhiều glycerin hơn và do đó làm giảm hiệu
suất lên men. Chính vì vậy, khi gây men giống trong điều kiện sản xuất, người ta điều chỉnh pH
ở 3,8 – 4,0 để hạn chế phát triển của vi khuẩn lactic và nấm men dại.
Theo Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng (2005), ở pH ≤ 4,2 tuy nấm men phát
triển chậm hơn so với ở pH 4,5 – 5,0 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển. Tới lúc nào đó,
nấm men đã phát triển được nhiều và đủ mạnh thì tăng pH đến tối ưu cho nấm men phát triển tốt
hơn. Lúc này điều kiện cũng tốt hơn các tạp khuẩn nhưng vì nấm men đã đủ mạnh để lấn át nên
tạp khuẩn khó gây hại cho nấm men.
Lượng oxy trong môi trường
Oxy cũng ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men diễn ra theo kiểu yếm khí hay hiếu khí và
do đó dẫn đến sự tạo thành sản phẩm là khác nhau. Nấm men là vi sinh vật kị khí không bắt
buộc. Trong điều kiện có oxy, nấm men sử dụng oxy hòa tan để phát triển tăng sinh khối. Lượng
oxy hòa tan trong môi trường là rất ít nên khi nuôi nấm men để thu sinh khối cần sục khí và lắc
đảo nhằm cung cấp đủ lượng oxy cho nấm men sinh trưởng và phát triển. Trong điều kiện thiếu
oxy, nấm men lên men chuyển hóa đường thành ethanol và CO
2
. Chính vì vậy trong quá trình
Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
15

lên men cơm rượu cần tạo môi trường yếm khí bằng cách đậy kín tạo điều kiện cho nấm men lên
men biến đổi đường thành rượu.
Thời gian lên men
Nhiệt độ và pH cũng ảnh hưởng đến thời gian lên men. Nếu nhiệt độ là 25 – 30
o
C thì thời
gian lên men kéo dài từ 15 – 20 ngày. Ở nhiệt độ cao (50 – 60
o
C), quá trình lên men dừng lại, tế
bào nấm men chết dần.
Các yếu tố khác: ánh sang, thế oxy hóa khử, chất sát trùng…

Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
16

CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát
triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian: từ tháng 8/ 2013 đến tháng 12/ 2013.
3.2. Phương tiện nghiên cứu
3.2.1. Nguyên vật liệu
- Men cơm rượu được thu từ các cơ sở sản xuất từ:
+ Thốt Nốt (loại lớn và nhỏ), Cần Thơ
+ Bạch Đằng, Thốt Nốt
+ Trà Cú, Trà Vinh
+ Chú Phương, Vĩnh Long
+ Ninh Kiều, Cần Thơ
+ Bình Minh, Vĩnh Long
+ Châu Phú, An Giang
+ Phụng Hiệp, Hậu Giang
+ Lấp Vò, Đồng Tháp
+ Vĩnh Châu, Sóc Trăng
- Khoai tây
3.2.2. Dụng cụ, thiết bị
Đĩa petri, ống nghiệm, ống trữ giống, bình tam giác 250ml và 500ml, cốc thủy tinh, ống
hút, giấy lọc.

Cân điện tử, nồi khử trùng, bộ micropipet, tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật, tủ sấy, máy
lắc, Brix kế, cồn kế, kính hiển vi quang học, thiết bị chưng cất rượu, buồng đếm hồng cầu, nồi
chưng cách thủy – Waterbath (Gesellschaft, Đức).
3.2.3. Hóa chất
Các hóa chất dùng trong nuôi cấy nấm men: D - Glucose, Agar, (NH
4
)
2
SO
4,
KH
2
SO
4
.
Môi trường nuôi cấy và phân lập vi sinh vật:
- Potato – Glucose – Agar bổ sung khoáng (PGA)
- Potato – Glucose bổ sung khoáng (PG)