phân tích đa dạng di truyền một số dòng ngô nếp đơn bội kép nhằm tạo giống ngô nếp lai
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (47.59 MB, 101 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-------
-------
NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ DÒNG NGÔ
NẾP ĐƠN BỘI KÉP NHẰM TẠO GIỐNG NGÔ NẾP LAI
LUẬN VĂN THẠC SĨ
HÀ NỘI - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-------
-------
NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ DÒNG NGÔ
NẾP ĐƠN BỘI KÉP NHẰM TẠO GIỐNG NGÔ NẾP LAI
CHUYÊN NGÀNH
: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ
: 60.42.02.01
NGƯỜI HƯỚNG DẤN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. PHAN HỮU TÔN
2. TS. NGÔ THỊ MINH TÂM
HÀ NỘI - 2014
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào
khác. Mọi sự giúp đỡ để hoàn thành luận văn thạc sĩ này đã được cảm ơn và các
thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2014
Tác giả luận văn
Nguyễn Trịnh Hoàng Anh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn trực tiếp là PGS. TS.
Phan Hữu Tôn – Trưởng Bộ môn Sinh học Phân tử - Học viện Nông nghiệp Việt
Nam và Cô Ngô Thị Minh Tâm – Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện
Nghiên cứu Ngô đã hết sức chỉ bảo, hướng dẫn để tôi có thể hoàn thành bản luận
văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Sinh học Phân tử, Khoa Công
nghệ sinh học, Viện Đào tạo sau đại học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ngô, đặc biệt là
TS. Bùi Mạnh Cường – Phó Viện trưởng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được
thực hiện luận văn tại Bộ Môn Công nghệ Sinh học.
Tôi xin cảm ơn đến gia đình, người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên,
giúp đỡ mọi mặt cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2014
Tác giả luận văn
Nguyễn Trịnh Hoàng Anh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... 0
LỜI CẢM ƠN .........................................................................................................ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... x
DANH MỤC HÌNH ..............................................................................................xii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................................xiii
Phần 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1.1.
Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
1.2.
Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 2
1.3.
Yêu cầu của đề tài ........................................................................................ 3
1.4.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài....................................................... 3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học.......................................................................................... 3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn .......................................................................................... 3
Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC ............................... 4
2.1.
Nguồn gốc, phân loại và đặc tính của ngô nếp .............................................. 4
2.1.1. Nguồn gốc lịch sử của ngô nếp ..................................................................... 4
2.1.2. Phân loại thực vật về ngô nếp ....................................................................... 4
2.1.3. Đặc tính của ngô nếp .................................................................................... 4
2.2.
Tình hình nghiên cứu ngô nếp trong và ngoài nước ...................................... 6
2.2.1. Tình hình nghiên cứu ngô nếp trên thế giới................................................... 6
2.2.2. Tình hình nghiên cứu ngô nếp trong nước .................................................... 7
2.3.
Ưu thế lai - lịch sử nghiên cứu, ứng dụng ..................................................... 8
2.4.
Phân tích đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai trong chọn tạo giống ngô ....... 10
2.4.1. Chỉ thị hình thái .......................................................................................... 11
2.4.2. Chỉ thị sinh hoá .......................................................................................... 12
2.4.3. Chỉ thị phân tử ............................................................................................ 12
2.5.
Dòng thuần và tạo dòng ngô thuần bằng phương pháp đơn bội ................... 18
2.5.1. Khái niệm dòng thuần................................................................................. 18
2.5.2. Tạo dòng ngô thuần bằng phương pháp đơn bội kép ................................... 18
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii
2.6.
Khả năng kết hợp và phương pháp đánh giá khả năng kết hợp .................... 22
2.6.1. Khả năng kết hợp........................................................................................ 23
2.6.2. Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp..................................................... 23
Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 27
3.1.
Vật liệu và hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................... 27
3.2.
Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ................................................ 29
3.3.
Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 30
3.3.1. Phương pháp theo dõi, đánh giá thí nghiệm ngoài đồng ruộng .................... 30
3.3.2. Đánh giá ưu thế lai và khả năng kết hợp ..................................................... 32
3.3.3. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR............ 32
3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 36
Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN....................................... 37
4.1.
Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng ngô nghiên cứu ............ 37
4.1.1. Thời gian sinh trưởng của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu .............................. 37
4.1.2. Đặc điểm hình thái của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu .................................. 39
4.1.3. Khả năng chống chịu của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu............................... 40
4.1.4. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của 25 dòng ngô nếp
nghiên cứu........................................................................................42
4.2.
Kết quả phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR .................... 45
4.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ................................................................. 45
4.2.2. Kết quả đánh giá tỷ lệ khuyết số liệu, số alen và hệ số PIC ......................... 47
4.2.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các dòng .............................. 52
4.3.
Kết quả đánh giá khả năng kết hợp về năng suất của 8 dòng triển vọng
bằng phương pháp luân giao ....................................................................... 57
4.4.
Kết quả khảo sát đánh giá các tổ hợp lai luân giao ...................................... 59
4.4.1. Thời gian sinh trưởng của các tổ hợp lai luân giao ...................................... 59
4.4.2. Đặc điểm hình thái của các tổ hợp lai luân giao .......................................... 61
4.4.3. Khả năng chống chịu của các tổ hợp lai luân giao....................................... 63
4.4.4. Yếu tố cấu thành năng suất, năng suất và chất lượng ăn tươi của các tổ
hợp lai luân giao ......................................................................................... 65
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv
Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 72
5.1.
Kết luận ...................................................................................................... 72
5.2.
Đề nghị ....................................................................................................... 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 73
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 79
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1.
Danh sách 25 dòng ngô nếp nghiên cứu ............................................ 27
Bảng 3.2.
Danh sách 22 mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ............................. 28
Bảng 3.3.
Chỉ tiêu chất lượng ăn tươi ............................................................... 32
Bảng 3.4.
Thành phần của một phản ứng PCR .................................................. 34
Bảng 3.5.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .................................................... 34
Bảng 3.6.
Thành phần gel polyacrylamide 4,5% ............................................... 35
Bảng 4.1.
Thời gian sinh trưởng của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu (Thu
2012) ................................................................................................ 38
Bảng 4.2.
Đánh giá đặc điểm hình thái của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu
(Thu 2012) ........................................................................................ 39
Bảng 4.3.
Khả năng chống đổ và mức độ nhiễm sâu bệnh của 25 dòng ngô
nếp (Thu 2012) ................................................................................. 41
Bảng 4.4.
Một số yếu tố cấu thành năng suất của 25 dòng ngô nếp (Thu
2012) ................................................................................................ 43
Bảng 4.5.
Năng suất hạt của 25 dòng ngô nếp (Thu 2012) ................................ 44
Bảng 4.6.
Tỷ lệ khuyết số liệu (M% dòng) của các dòng ngô nghiên cứu................. 47
Bảng 4.7.
Tỷ lệ khuyết số liệu (M% mồi) của 22 mồi nghiên cứu ..................... 48
Bảng 4.8.
Hệ số PIC, số alen xuất hiện ở 22 mồi nghiên cứu ............................ 49
Bảng 4.9.
Khoảng cách di truyền giữa các cặp dòng trên cơ sở 22 mồi
SSR .................................................................................................. 53
Bảng 4.10.
Khoảng cách di truyền trung bình (GD) giữa các nhóm .................... 56
Bảng 4.11.
Danh sách 8 dòng ngô đánh giá khả năng kết hợp ............................. 57
Bảng 4.12.
Giá trị khả năng kết hợp chung (ĝi), khả năng kết hợp riêng (ŝij)
và phương sai khả năng kết hợp riêng (σ2ŝij) về năng suất bắp
tươi của 8 dòng triển vọng (Xuân 2013)............................................ 58
Bảng 4.13.
Thời gian sinh trưởng của các tổ hợp lai luân giao (Xuân 2013) ....... 60
Bảng 4.14.
Đặc điểm hình thái của các tổ hợp lai luân giao (Xuân 2013)............ 62
Bảng 4.15.
Khả năng chống chịu của các tổ hợp lai luân giao (Xuân 2013) ........ 64
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page x
Bảng 4.16.
Một số yếu tố cấu thành năng suất của các tổ hợp lai luân giao
(Xuân 2013) ..................................................................................... 66
Bảng 4.17.
Năng suất bắp tươi, ưu thế lai chuẩn của các tổ hợp lai luân giao
(Xuân 2013) ..................................................................................... 68
Bảng 4.18.
Đánh giá chất lượng ăn tươi của các tổ hợp lai luân giao (Xuân
2013) ................................................................................................ 70
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page xi
DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1.
Ảnh điện di kiểm tra ADN tổng số trên gel agarose 1% ...................... 46
Hình 4.2.
Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi101049, mồi
phi374118 và mồi phi213984.............................................................. 50
Hình 4.3.
Sơ đồ phả hệ của 25 dòng ngô nghiên cứu trên cơ sở phân tích 22
locus SSR ........................................................................................... 55
Hình 4.4.
Hình thái một số tổ hợp lai luân giao vụ Xuân 2013 ........................... 63
Hình 4.5.
Hình ảnh một số tổ hợp lai và đối chứng ............................................. 67
Hình 4.6.
Đánh giá chất lượng ăn tươi của các tổ hợp lai.................................... 71
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page xii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
Acid Deoxyribonucleic
AFLP
Amplifiel Frangment Lengh Polymorphim (Đa hình các đoạn cắt
khuyếch đại)
AMBIONET Asian Maize Biotechlonogy Network (Mạng lưới công nghệ sinh
học cây ngô vùng Châu Á)
Bp
Base pair - cặp bazơ nitơ
CIMMYT
Centro Internacional de Mejoramiento de Maiz y Trigo (Trung tâm
cải lương ngô và lúa mì quốc tế)
Cs
Cộng sự
CV%
Coefficient of variation (hệ số biến động)
GD
Genetic Distance (Khoảng cách di truyền)
GS
Genetic Similarity (Hệ số di truyền)
Hs
Standard Heterosis (Ưu thế lai chuẩn)
NSTT
Năng suất thực thu
NSBT
Năng suất bắp tươi
NTSYS
Numerical Taxonomy System (Hệ thống phân loại)
Nu
Nucleotide
P. 1000 hạt
Khối lượng 1000 hạt
PCR
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
PIC
Polymorphic Information Content (Chỉ số thông tin đa dạng của
mồi)
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình các đoạn ADN
khuyếch đại ngẫu nhiên)
RFLP
Restriction Fragment Lengh Polymorphism (Đa hình chiều dài các
phân đoạn cắt giới hạn)
SSR
Simple Sequence Repeat (Sự lặp lại trình tự đoạn nucleotide
đơn giản)
TB
Trung bình
UPGMA
Unweighted Pair - Group Method with Arithmetical Averages
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page xiii
Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngô (Zea mays L.) là một cây ngũ cốc có tiềm năng năng suất cao, khả năng
thích ứng rộng, có nhiều ứng dụng đối với đời sống con người. Trên thế giới, ngô
xếp thứ ba về diện tích và thứ nhất về năng suất, sản lượng các cây lấy hạt. Tính đến
năm 2012, diện tích trồng ngô đạt 176,9 triệu ha, năng suất trung bình 5,18 tấn/ha
và sản lượng đạt kỷ lục là 875,1 triệu tấn (Faostat, 2011).
Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực đứng vị trí thứ hai sau cây lúa, được
trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống
canh tác. Hạt ngô có hàm lượng dinh dưỡng tương đối cao: hàm lượng tinh bột ở vỏ
hạt là 7,30%, nội nhũ là 87,6%, mầm là 8,30%. Đặc biệt, trong hạt ngô còn có nhiều
loại amino axit không thay thế quan trọng như: Leucin, isoleucin, tyrosin, threonin,
lyzin,…(Trần Duy Quý, 1994).
Những năm gần đây, nhu cầu sử dụng ngô làm thực phẩm (ngô nếp, ngô
đường) để ăn, phục vụ công nghiệp chế biến ngày càng tăng, đặc biệt là ngô nếp.
Diện tích ngô nếp tính đến năm 2014 ước đạt 1- 12% diện tích trồng ngô trên cả
nước, đặc biệt phát triển mạnh ở vùng ven đô đã đem lại hiệu quả kinh tế cao cho
người trồng ngô. Tuy nhiên, hệ thống giống ngô nếp chủ yếu do nước ngoài cung
cấp. Chính vì vậy, nhiệm vụ cấp bách của các nhà nghiên cứu ngô trong nước là phải
nhanh chóng tạo ra các giống ngô nếp nội có năng suất cao, chất lượng tốt, thời gian
sinh trưởng ngắn, đáp ứng yêu cầu sản xuất.
Việc khai thác tiềm năng năng suất thông qua ưu thế lai và đưa nhanh các
giống ngô lai vào sản xuất trên quy mô rộng lớn là một trong những đóng góp quan
trọng làm tăng sản lượng lương thực. Muốn tạo giống ngô lai tốt, các nhà chọn giống
phải tạo ra các dòng tự phối từ các nguồn nguyên liệu không đồng nhất về mặt di
truyền, sau 6 - 8 thế hệ tự phối mới thu được thế hệ đồng hợp tử cần thiết gọi là dòng
thuần. Sau đó các nhà chọn giống phải tiếp tục nghiên cứu, đánh giá khả năng kết hợp
và thử nghiệm các con lai. Như vậy, theo phương pháp truyền thống phải mất nhiều
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1
thời gian (5 - 7 năm) các nhà tạo giống mới tạo ra được giống lai mới (Hallauer A. R.
et al., 1988).
Tạo dòng thuần là công việc đầu tiên và quan trọng trong chương trình tạo
giống ngô lai. Tuy nhiên, phương pháp chọn tạo và đánh giá dòng truyền thống còn
hạn chế: đòi hỏi thời gian dài, tốn nhiều công sức, các dòng tạo ra sử dụng được cho
chương trình tạo giống lai thấp. Hiện nay, việc ứng dụng rộng rãi những thành tựu
của ngành Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ đắc lực cho phương pháp truyền thống
trong cải tạo giống cây trồng. Đối với cây ngô, việc tạo dòng thuần bằng kỹ thuật
nuôi cấy bao phấn hay còn gọi là tạo dòng đơn bội kép (double haploid lines) không
chỉ rút ngắn được thời gian tạo dòng thuần mà các dòng tạo ra có thể mang những
đặc điểm ưu việt hơn phương pháp tự phối.
Bên cạnh đó, việc chọn tạo giống ngô kết hợp sử dụng chỉ thị phân tử đang
được ứng dụng rộng rãi. Các nhà khoa học đã sử dụng một số kỹ thuật sinh học
phân tử như RFLP, RAPD, AFLP, SSR,… để đánh giá quan hệ di truyền nhanh
chóng hơn, chính xác hơn. Trong đó, chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat - trình
tự lặp lại đơn giản) cho độ đa hình cao nên được sử dụng phổ biến để nghiên cứu đa
dạng di truyền, sự liên kết giữa các tính trạng số lượng, đánh giá sự sai khác hệ gen
của các dòng chọn lọc giúp các nhà tạo giống xác định nhanh các tổ hợp lai năng
suất cao, chống chịu tốt đáp ứng yêu cầu của sản xuất, giảm bớt thời gian, chi phí và
mang lại độ tin cậy cao.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích
đa dạng di truyền một số dòng ngô nếp đơn bội kép nhằm tạo giống ngô nếp lai”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng ngô nếp được tạo ra từ
phương pháp nuôi cấy bao phấn bằng chỉ thị SSR giúp phân nhóm cách biệt di
truyền, hỗ trợ xác định các tổ hợp lai cho ưu thế lai cao, đánh giá năng suất phẩm chất
của con lai phục vụ công tác chọn tạo giống ngô nếp lai.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 2
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Đánh giá đặc điểm nông sinh học của một số dòng ngô nếp đơn bội kép.
- Xác định mức độ đa hình của các dòng ngô nếp đơn bội kép bằng chỉ thị
phân tử SSR, xây dựng sơ đồ phả hệ, phân nhóm cách biệt di truyền và dự đoán ưu
thế lai.
- Đánh giá khả năng kết hợp về năng suất của các dòng ngô nếp đơn bội kép
triển vọng.
- Đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất, ưu thế lai của các tổ hợp lai.
- Cung cấp thêm thông tin góp phần định hướng cho công tác chọn tạo giống.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài nghiên cứu được thực hiện chi tiết và có hệ thống các vấn đề có liên
quan đến việc đánh giá đặc điểm hình thái, năng suất, khả năng chống chịu của một
số dòng ngô nếp đơn bội kép và phân tích đa dạng di truyền bằng phương pháp chỉ
thị phân tử SSR với mong muốn cung cấp thêm số liệu, thông tin về khả năng ứng
dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống ngô nếp lai trong điều kiện cụ
thể ở Việt Nam.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Rút ngắn thời gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lượng công việc lai tạo trên
đồng ruộng. Đồng thời kết hợp với các phương pháp đánh giá đồng ruộng nhanh
chóng xác định được các dòng có khả năng kết hợp cao về năng suất, có xác suất
tham gia vào các tổ hợp lai cho năng suất cao, chất lượng tốt.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC
2.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc tính của ngô nếp
2.1.1. Nguồn gốc lịch sử của ngô nếp
Về nguồn gốc địa lý chính xác của ngô nếp cho đến nay vẫn chưa được xác
định. Tuy nhiên, theo nhà thực vật học Colins, ngô nếp được phát hiện ở Trung
Quốc vào đầu những năm 1900. Kể từ khi phát hiện ra nó ở Trung Quốc, loại này
cũng đã được tìm thấy nhiều nơi khác ở Đông Nam Á như Miến Điện, Philipin
(Collins G. N., 1909).
Về nguồn gốc di truyền, hiện nay các nhà khoa học đã xác định rằng ngô nếp
bắt nguồn từ đột biến đơn gen từ ngô thường, do đột biến gen trội Wx thành gen lặn
wx nên ngô nếp có thể xuất hiện ở nhiều vùng khác nhau của trái đất. Ngô nếp là
kết quả đột biến từ dạng ngô răng ngựa, được tìm thấy và thuần hóa ở Mỹ vào
những năm 1930. Gần đây, các nhà khoa học cũng chứng minh được rằng ngô nếp
còn được thuần hóa từ dạng ngô đá ở Trung Quốc (Liu H. et al., 2008).
2.1.2. Phân loại thực vật về ngô nếp
Ngô nếp (Zea mays var. ceratina Kulesh.) là một trong những loài phụ
của Zea mays L. Hạt ngô nếp có bề mặt ngoài bóng hơn ngô tẻ, lớp ngoài cùng của
mặt cắt nội nhũ không có lớp sừng như ngô tẻ, có tính chất quang học giống như
sáp và được gọi là ngô sáp, khi nấu chín có độ dẻo, mùi vị thơm ngon. Tinh bột nội
nhũ của ngô nếp chứa gần như 100% amylopectin, trong khi ngô thường chứa 75%
amylopectin và 25% amylose. Khi nhuộm tinh bột ngô nếp với dung dịch I2/KI 2%
thì chuyển thành màu nâu đỏ, trong khi tinh bột ngô thường chuyển thành màu xanh
tím. Theo Fergason (1994) và Hallauer (1994) thì ngô nếp có biểu hiện gen opaque
(waxy opaque-2) nên rất giàu axzit amin không thay thế là lyzin, tryptophan và
protein. Do đó, nó có giá trị dinh dưỡng cao (Fergason V., 1994).
2.1.3. Đặc tính của ngô nếp
Đặc tính ngô nếp được quy định bởi gen lặn, đó là gen wx do đột biến từ gen
trội Wx. Gen waxy định vị trên cánh tay ngắn ở nhiễm sắc thể số 9. Cấu trúc gen
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4
waxy có kích thước 3718 bp bao gồm 14 exons kích thước từ 64 – 392 bp và 13
introns có kích thước từ 81 – 139 bp, ở các exons và vùng promoter rất giàu G/C
(chiếm trung bình khoảng 60%, thậm chí lên đến 75 – 85%) (Klosgen R. B. et al.,
1986; Zhao Y. et al., 2008).
Gen waxy mã hóa cho enzyme granule-buond starch synthase (GBSS), đây
là một trong những isoenzyme chính xúc tác sự tổng hợp amylose từ ADP glucose,
được biểu hiện ở nội nhũ và hạt phấn. Ở ngô thường, isoenzyme GBSS có hoạt tính
mạnh và sản phẩm của nó là amylose, khi đó trong con đường chuyển hóa tinh bột
thì ADP glucose không thể được chuyển hóa hoàn toàn thành amylopectin. Vì vậy
sẽ còn khoảng ¼ tinh bột trong nội nhũ còn lại là amylose và có kiểu hình là ngô
thường. Ở ngô nếp, gen trội Wx bị đột biến thành gen lặn wx và hoạt động của
enzyme GBSS bị ức chế đồng thời tất cả isoenzyme khác tổng hợp amylose cũng
hoạt động rất yếu và ADP glucose sẽ được chuyển thành amylopectin bởi enzyme
starch branching (SBE). Khi đó, chỉ có amylopectin được tích lũy trong nội nhũ và
có kiểu hình là ngô nếp (Creek R. G., 1968).
Wessler và cs (1985) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để xác định cấu trúc của
gen Wx trong các dạng đột biến wx. Trong nghiên cứu này đã xác định 13 trường
hợp di truyền khác nhau có thể làm tăng kiểu hình ngô nếp ở ngô, bao gồm đột biến
mất đoạn và chèn đoạn. Những đoạn bị chèn vào có kích thước thay đổi từ 150bp
đến 6.1kb. Và đã xác định được 4 đột biến do mất đoạn, 2 đột biến điểm trong gen
Wx (Wessler S. R. and Varagona M. J., 1985).
Liu và cs (2007) cũng xác định được một loại đột biến gen waxy do sự
chuyển vị của gen aldehyde dehydrogenase rf2 vào đầu 3’ của locus waxy (Liu J. et
al., 2007).
Những đột biến điểm, chèn đoạn hoặc mất đoạn tại các vị trí khác nhau trên
locus waxy dẫn đến thay đổi cấu trúc protein GBSS, do đó sẽ ức chế sinh tổng hợp
amylose. Một vài đột biến là có ý nghĩa, làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme
GBSS và kết quả là mang kiểu hình ngô nếp (Huang B. Q. et al., 2010).
Trong quá trình chọn lọc tự nhiên đã tạo ra một số đột biến gen lặn làm thay
đổi chất lượng và hàm lượng tinh bột trong nội nhũ như: Đột biến gen amyloseHọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5
extender 1 (ae1) làm tăng hàm lượng đường sucrose gấp 3 lần ngô thường, giảm
hàm lượng amylopectin, tăng sự tích lũy của glucopolysaccaride phytoglycogen cao
gấp 10 lần ngô thường (Jame M. G. et al., 1995); Đột biến gen waxy ức chế sinh
tổng hợp amylose, làm cho tinh bột trong nội nhũ và hạt phấn cấu tạo bởi gần như
100% amylopectin (Goralski G. et al., 2002). Giống như các loại rau thực phẩm
khác, chất lượng ngô nếp cũng bị ảnh hưởng bởi hàm làm protein, thành phần axit
amin, độ dày vỏ hạt và một số đặc tính khác.
2.2. Tình hình nghiên cứu ngô nếp trong và ngoài nước
2.2.1. Tình hình nghiên cứu ngô nếp trên thế giới
Trên thế giới, ngô nếp đã được nghiên cứu từ lâu nhưng do năng suất thấp và
nhu cầu sử dụng trước đây không cao nên ít được quan tâm. Một số nước Châu Á
như Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc… đã đưa ngô nếp vào gieo trồng và sử dụng
trong hơn 1 thế kỷ nay.
Để tạo dòng ngô nếp thuần, đa dạng về mặt di truyền các nhà khoa học đã
dùng nguyên liệu ban đầu là các giống nếp địa phương và nhập nội, sau đó bằng
phương pháp truyền thống thông qua tự phối và chọn lọc cá thể dựa vào nội nhũ và
các đặc tính nông học.
Năm 2001, K. Lertrat và N. Thongnarin đã thành công trong nghiên cứu cải
thiện chất lượng và độ ngọt của ngô nếp địa phương từ hỗn hợp hạt siêu ngọt
(Lertrat K. and Thongnarin N., 2001). Những tổ hợp lai được tạo ra khi lai giữa ngô
nếp và ngô đường có thành phần bao gồm 75% hạt ngô nếp và 25% hạt ngô ngọt và
rút ngắn được thời gian sinh trưởng, nâng cao năng suất và cải thiện chất lượng dinh
dưỡng của con lai.
Ngoài ra, dòng ngô nếp có thể được cải tạo từ các dạng ngô thường bằng cách
cho lai ngô nếp với ngô thường, sau đó trải qua quá trình tự phối và lai ngược
(backcross) được thực hiện luân phiên nhau. Sử dụng phương pháp này sẽ tích lũy
được tính trạng tốt của bố mẹ đồng thời nâng cao tần suất gen quy định tính trạng ngô
nếp (tránh mất đi gen lặn wx từ bố mẹ). Các gen lặn wx được xác định bằng đánh giá
bề mặt bóng của hạt ở thế hệ tự thụ và xác định bằng phân tích hạt phấn qua phản ứng
với dung dịch KI/I2 (Feng Z. L. et al., 2008). Quá trình tạo dòng ngô nếp có thể được
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 6
rút ngắn bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử (chỉ thị chọn lọc trong gen) để xác định
ngay được các các thể mang kiểu gen dị hợp tử hay đồng hợp tử (WxWx, Wxwx và
wxwx) từ quần thể phân ly của thế hệ F2 khi lai giữa dòng ngô nếp và dòng ngô
thường mà bỏ qua các thế hệ tự phối phân ly chọn lọc (Liu J. et al., 2007).
Như vậy, việc ứng dụng chỉ thị chọn lọc trong gen có ý nghĩa rất lớn đối với
quá trình chọn lọc từng cá thể mà không mất nhiều thời gian, công sức. Từ đó, giúp
cho nhà tạo giống có thể nhanh chóng xác định cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử
lặn ở ngay giai đoạn cây con mà không cần sự biểu hiện kiểu hình của nó ở giai
đoạn chín và thậm chí xác định được cá thể mang kiểu gen dị hợp tử. Vì vậy, có thể
loại bỏ cây con không mang gen lặn wx.
2.2.2. Tình hình nghiên cứu ngô nếp trong nước
Cho đến nay chỉ có một số công trình nghiên cứu về ngô nếp phục vụ cho
chương trình tạo giống ngô nếp lai được công bố như:
Ngô Hữu Tình và cs (1990) đã nghiên cứu chọn tạo được giống ngô nếp
trắng tổng hợp với năng suất trung bình 25 – 30 tạ/ha, có khả năng thích ứng rộng
và được công nhận giống quốc gia (Ngô Hữu Tình và Nguyễn Thị Lưu, 1990).
Nguyễn Thị Lâm và cs (1997) đã phân loại 72 giống ngô nếp địa phương
thuộc 3 biến chủng: nếp trắng (48 mẫu), nếp vàng (6 mẫu) và nếp tím (16 mẫu).
Trong đó, biến chủng nếp tím có thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, chiều cao
đóng bắp và số lá là lớn nhất (Nguyễn Thị Lâm và Trần Hồng Uy, 2007).
Nguyễn Hữu Đống và cs (1997) đã nghiên cứu gây tạo đột biến bằng tia
gamma kết hợp với xử lý diethylsunfat ở ngô nếp. Kết quả thu được một số dòng
biến dị có các đặc tính nông học quý so với giống ban đầu (Nguyễn Hữu Đống và
cs, 1997).
Phan Xuân Hào và cs (2007) tiến hành đánh giá đặc điểm nông sinh học,
đánh giá độ thuần, đa dạng di truyền và khả năng kết hợp của 30 dòng ngô nếp. Kết
quả xác định được 5 dòng nếp ưu tú có khả năng kết hợp chung cao và 6 tổ hợp lai
triển vọng phục vụ cho chương trình chọn tạo giống nếp lai Việt Nam (Phan Xuân
Hào và Nguyễn Thị Nhài, 2007).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7
Nguyễn Thị Nhài và cs (2009) đã nghiên cứu chọn tạo được giống nếp lai số
1 đạt năng suất trung bình 54,88 tạ/ha, có chất lượng ngon và thích ứng với nhiều
vùng sinh thái. Giống nếp lai số 1 đã được công nhận cho sản xuất thử (Nguyễn Thị
Nhài và Phan Xuân Hào, 2009).
Tính đến năm 2010, Viện Nghiên cứu Ngô đang lưu giữ 234 mẫu ngô nếp
địa phương. Trong đó, có 177 nguồn nếp trắng, 33 nguồn nếp vàng, 24 nguồn nếp
tím, nâu đỏ. Công ty Cổ phần giống cây trồng miền Nam lưu giữ trên 100 mẫu
giống ngô nếp thụ phấn tự do địa phương với các màu hạt phổ biến như trắng, vàng,
tím (Công ty Cổ phần giống cây trồng miền Nam, 2010).
Trong thời gian qua, diện tích trồng ngô nếp không ngừng tăng do nhu cầu
sử dụng sản phẩm này ngày càng nhiều, không những được dùng làm lương thực,
làm đồ ăn tươi (nướng, luộc…) mà còn được chế biến thành các món ăn được nhiều
người ưa chuộng như súp ngô, snack ngô,… đồng thời ngô nếp đáp ứng được nhu
cầu luân canh tăng vụ, mang lại hiệu quả cao cho người sản xuất. Hiện nay, giống
ngô nếp địa phương có chất lượng ngon nhưng năng suất thấp, còn giống ngô nếp
lai nhập nội có độ đồng đều, năng suất cao, đảm bảo chất lượng nhưng giá thành lại
rất cao (khoảng 10 – 15 USD/kg). Do đó, để đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng và
giảm giá thành sản phẩm, đặt ra cho các nhà chọn tạo giống ngô Việt Nam nhanh
chóng tạo ra các giống ngô nếp lai năng suất cao, chất lượng tốt áp dụng vào sản
xuất là rất cần thiết. Chính vì vậy, việc ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt là sử
dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa hình di truyền là cần thiết để hỗ trợ
cho phương pháp truyền thống góp phần rút ngắn được thời gian, công sức trong
công tác chọn tạo giống nhằm nhanh chóng xác định được các tổ hợp lai triển vọng
phục vụ cho chương trình tạo giống ngô nếp lai.
2.3. Ưu thế lai - lịch sử nghiên cứu, ứng dụng
Ưu thế lai là sự tăng cường về sức sống, khả năng phát triển, khả năng thích
nghi và khả năng sinh sản của con lai thế hệ thứ nhất so với dạng bố mẹ (Luân Thị
Đẹp, 2002).
Hiện tượng ưu thế lai bắt nguồn lần đầu tiên được nhà thực vật học người
Nga gốc Đức I. Koelreuter (1733 - 1806) mô tả vào năm 1760, khi ông quan sát thấy
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8
hiện tượng tăng sức sống của con lai giữa Nicotinanan tabacum và Nitotinana robusta
so với các dạng bố mẹ của chúng (Nguyễn Thị Lưu, 1999). Sau này, nhiều nhà khoa
học khác cũng đề cập tới hiện tượng này, tuy nhiên những vấn đề lý luận đầu tiên về
ưu thế lai chỉ được Darwin nêu ra sau những nghiên cứu của ông. Darwin là người
đầu tiên quan sát thấy hiện tượng ưu thế lai ở ngô vào năm 1871 khi ông thấy những
cây giao phấn phát triển cao hơn các cây tự phối 20%. Sau nhiều thí nghiệm ông
tổng kết: Sự tự phối (tự thụ phấn) thường làm giảm sức sống (có hại) và quá trình
giao phấn (thụ phấn chéo) thường có lợi, trong công trình “Tác động của giao phấn
và tự phối trong thế giới thực vật” xuất bản 1876 Charles Darwin được coi là người
đầu tiên đưa ra lý thuyết về ưu thế lai (Ngô Hữu Tình và cs, 1997).
Đến năm 1904, George Herrison Shull đã tiến hành tự phối cưỡng bức ở
ngô để thu được các dòng thuần và tạo ra những giống ngô lai đơn từ những
dòng thuần này. Ông là người đầu tiên công bố về năng suất của con lai cao hơn
hẳn thế hệ bố mẹ. Qua kiểm chứng, Shull và các nhà khoa học đều cho rằng ưu
thế lai là hiện tượng con lai có sức sống mạnh hơn, sinh trưởng và phát triển
nhanh hơn, cho năng suất và phẩm chất cao hơn hẳn bố mẹ của chúng. Dựa vào
những quan sát, Shull đã vạch ra kế hoạch sử dụng ưu thế lai trong sản xuất nông
nghiệp. Thuật ngữ “Heterosis” chỉ ưu thế lai được Shull sử dụng lần đầu tiên vào
năm 1913 (Ngô Hữu Tình, 2009).
Sau thành công của ngô lai, hiện tượng ưu thế lai trong chọn tạo giống cây
trồng đã được thừa nhận rộng rãi. Cho đến nay, ưu thế lai đã được nghiên cứu khá
chi tiết từ khái niệm đến giả thuyết giải thích hiện tượng, đánh giá và duy trì ưu thế
lai cũng như việc ứng dụng trong thực tiễn sản xuất. Ưu thế lai biểu hiện ở hầu hết
các tính trạng và được các nhà di truyền chọn tạo giống cây trồng chia thành 5 dạng
biểu hiện chính: Ưu thế lai về hình thái; Ưu thế lai về năng suất; Ưu thế lai về tính
thích ứng; Ưu thế lai về tính chín sớm; Ưu thế lai về sinh lý, sinh hóa (Dai J. R. et
al., 1989; Hallauer A. R. et al., 1990).
Ưu thế lai thường được biểu hiện thông qua các tính trạng. Để đánh giá mức
độ biểu hiện ưu thế lai, các nhà khoa học đã đưa ra một số phương pháp (Trần Duy
Quý, 1994), (Lê Duy Thành, 1999):
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9
- Xác định ưu thế lai trung bình (Hm): Được sử dụng trong giai đoạn lai thử.
Con lai biểu hiện sự hơn hẳn ở tính trạng nghiên cứu so với số đo trung bình của bố
mẹ ở cùng tính trạng
- Xác định ưu thế lai thực (Hb): Được sử dụng trong giai đoạn lai lại và đánh
giá con lai. Con lai biểu hiện sự hơn hẳn trên tính trạng nghiên cứu so với bố mẹ có
số đo cao nhất.
- Xác định ưu thế lai chuẩn (Hs). Được sử dụng để đánh giá các tổ hợp lai tốt.
Con lai biểu hiện sự hơn hẳn trên tính trạng nghiên cứu (đặc biệt là năng suất) so với
một giống đang phổ biến rộng trong vùng (giống chuẩn) mà giống lai định thay thế.
Sức sống của con lai F1 có biểu hiện tăng lên so với bố mẹ ở một số tính
trạng nhất định được gọi là ưu thế lai dương, và ngược lại thì gọi là ưu thế lai âm.
Để sử dụng ưu thế lai trong sản xuất, tổ hợp lai F1 không những tỏ ra hơn hẳn giống
bố mẹ mà còn phải hơn hẳn giống thương mại tốt nhất. Chính vì vậy, ưu thế lai
chuẩn là chỉ số được quan tâm hơn cả trong công tác tạo giống lai.
Các nghiên cứu về ưu thế lai cho thấy hiện tượng ưu thế lai tăng khi cách
biệt di truyền giữa bố và mẹ lớn. Sự khác biệt càng lớn thì tính dị hợp tử càng cao,
do đó ở những tổ hợp lai này ưu thế lai càng cao. Ngô là loại cây giao phấn điển
hình, quần thể rất đa dạng các cá thể dị hợp tử về kiểu gen. Tomov (1990) cho rằng,
sự khác biệt về di truyền của bố mẹ có ảnh hưởng mạnh mẽ tới ưu thế lai trong tổ
hợp lai đơn (Ngô Thị Minh Tâm, 2004).
Trong những năm gần đây, phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các
dòng thuần dựa vào chỉ thị phân tử để phân nhóm cách biệt di truyền đã giảm bớt
được khối lượng công việc lai tạo trên đồng ruộng, rút ngắn thời gian đánh giá.
Phương pháp này không bị phụ thuộc vào môi trường và mùa vụ, do đó tiết kiệm
được rất nhiều thời gian, công sức cho các nhà tạo giống.
2.4. Phân tích đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai trong chọn tạo giống ngô
Trong công tác chọn tạo giống cây trồng, ý tưởng sử dụng đa dạng di truyền
để đạt ưu thế lai cao được các nhà chọn tạo giống công nhận và áp dụng rộng rãi.
Khai thác những thông tin về đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các nguồn vật
liệu có ý nghĩa to lớn, là sức mạnh của công tác cải tạo giống cây trồng (Hallauer A.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10
R. et al., 1988). Vì thế, việc xác định đa dạng di truyền, khai thác những khác biệt di
truyền có lợi của nguồn gen hiện có là một trong những mục tiêu của nhà chọn giống.
Cây ngô là loài giao phấn điển hình, quần thể rất đa dạng và phong phú về kiểu
gen, những thông tin về đa dạng di truyền của các nguồn gen là rất cần thiết và vô cùng
hữu ích trong công tác đánh giá dòng, phân nhóm ưu thế lai, dự đoán các tổ hợp lai ưu
tú có khả năng cho năng suất cao (Ngô Thị Minh Tâm, 2004).
Đa dạng di truyền có tầm quan trọng rất lớn đối với chương trình chọn tạo
giống ngô lai. Việc đánh giá đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ giữa các
nguồn vật liệu, tìm ra sự khác biệt di truyền của các vật liệu nghiên cứu đòi hỏi cả
công sức, thời gian và chi phí tốn kém. Người ta không chỉ dựa vào chỉ thị hình thái
để nhận biết riêng rẽ mà còn cần phải phân tích dựa trên các tính trạng số lượng, các
chỉ tiêu sinh hóa hay phân tích bằng chỉ thị phân tử.
Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền được tiến hành dựa trên các chỉ thị di
truyền, mỗi loại chỉ thị cung cấp cho người sử dụng các thông tin khác nhau. Có hai
phương pháp được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền là
nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền thông qua các tính trạng hình thái (chỉ thị
hình thái - kiểu hình) và thông qua chỉ thị phân tử (kiểu gen).
2.4.1. Chỉ thị hình thái
Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái là phương pháp đánh
giá thông qua các đặc điểm chính về hình thái (hình dạng, màu sắc, kích thước của
thân cây, lá, hạt,…) và dựa trên các tính trạng cơ bản đó để nhận biết và phân biệt
giữa các giống với nhau.
Chỉ thị hình thái rất dễ nhận biết và được sử dụng như một chỉ thị di truyền.
Tuy nhiên, số lượng các chỉ thị hình thái lại tương đối ít và sự biểu hiện của chúng
phụ thuộc rất nhiều vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể do đó việc sử
dụng các chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những hạn chế: (1)
số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn; (2) chúng bị ảnh hưởng bởi sự tương tác gen
và sự tác động của các nhân tố môi trường; (3) các chỉ tiêu hình thái thể hiện những
giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể. Có thể nói, cùng với sự ra đời và
phát triển mạnh mẽ của các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử, thì chỉ thị hình
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11
thái vẫn được cho là không thể thay thế trong nghiên cứu đa dạng di truyền và phân
loại thực vật (Kipling W. W. and Daniel R., 2004).
Sự đa dạng di truyền ở mức hình thái của cây ngô được thể hiện qua các tính
trạng số lượng như: thời gian sinh trưởng, số lá, kích thước lá, chiều cao cây, chiều
cao đóng bắp, số hàng hạt và các tính trạng chất lượng (màu sắc thân cây, màu của
bao phấn, màu hạt,…). Dựa vào các tính trạng hình thái để các nhà nghiên cứu phân
biệt các giống ngô khác nhau phục vụ công tác phân loại, chọn lọc, lưu giữ và bảo
tồn sự đa dạng của các nguồn gen ngô. Sự đa dạng về các đặc điểm hình thái còn
giúp các nhà chọn tạo giống nghiên cứu về khả năng kết hợp, dự đoán ưu thế lai và
xác định cặp lai trong quá trình chọn tạo giống ngô lai.
2.4.2. Chỉ thị sinh hoá
Chỉ thị sinh hóa (chỉ thị isozyme) là loại chỉ thị có bản chất đa hình protein.
Isozyme là những dạng enzyme có hoạt tính xúc tác tương tự hoặc giống nhau
nhưng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau. Có thể chia làm hai dạng là
isozyme đơn gen (các isozyme chịu sự kiểm soát của một gen) và isozyme đa gen
(các isozyme chịu sự kiểm soát của nhiều gen hay nói cách khác là được mã hóa bởi
đa gen) (Bùi Mạnh Cường, 2007).
Chỉ thị isozyme thuộc loại đồng trội, có độ tin cậy cao và có thể phân biệt cá
thể đồng hợp tử hay dị hợp tử. Sự đa hình của isozyme là một công cụ để xác định
đa dạng di truyền giữa các dạng bố mẹ. Tuy nhiên, do số lượng không nhiều, khả
năng phát hiện nhiều bản sao enzyme ở cùng một locus thấp và sự biểu hiện của
chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cá thể nên các chỉ thị
isozyme được ứng dụng tương đối hạn chế trong đánh giá đa dạng di truyền, phân
nhóm ưu thế lai.
2.4.3. Chỉ thị phân tử
Nguyên tắc cơ bản trong công tác chọn tạo giống cây trồng là việc xác
định và khai thác các kiểu ưu thế lai giữa các nguồn vật liệu nghiên cứu
(Hallauer A. R. and Miranda J. B., 1988). Đối với cây ngô, thông tin về đa dạng
di truyền giữa các dòng giúp các nhà chọn tạo giống quyết định được kế hoạch
lai tạo, cải tạo dòng và phân nhóm ưu thế lai. Chính vì thế, các nhà chọn tạo
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 12
giống mong muốn mô tả được sự đa dạng di truyền của các nguồn vật liệu và
mối quan hệ di truyền giữa chúng (Messmer M. M. et al., 1992).
Chỉ thị phân tử ADN khác với hai loại chỉ thị hình thái và chỉ thị sinh
isozyme bởi sự đa dạng và phong phú của phân tử ADN. Chỉ thị ADN có tính ổn
định cao, có sự liên kết với các tính trạng trội và siêu trội, không bị ảnh hưởng
bởi yếu tố môi trường cũng như các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của thực
vật (Bùi Mạnh Cường, 2007). Sự đa hình dựa trên cơ sở sự biến đổi ở mức độ
phân tử là công cụ mạnh để đánh giá đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu
cho lai tạo.
Các chỉ thị phân tử ADN có thể chia theo 2 nhóm chính: (1) nhóm chỉ thị
phân tử dựa trên cơ sở lai phân tử ADN: Chỉ thị RFLP dựa vào các băng ADN
trên gen điện di có thể phát hiện các thể đồng hợp tử hoặc dị hợp tử; (2) nhóm chỉ
thị phân tử dựa trên cơ sở khuyếch đại gen mong muốn bằng kỹ thuật PCR là: Chỉ
thị RAPD, chỉ thị AFLP, chỉ thị SSR,… Trong những năm gần đây, nhiều chỉ thị
thuộc nhóm này đã thành công trong đánh dấu hệ gen thực vật và trong nghiên cứu
đa dạng di truyền.
Chỉ thị RFLP ((Restriction Fragment Lengh Polymorphism)
Chỉ thị RFLP (đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn) được phát triển và
sử dụng đầu tiên trong nghiên cứu lập bản đồ hệ gen người (Botstein D. et al.,
1980). Nguyên lý của kỹ thuật RFLP dựa trên cơ sở sử dụng mẫu dò đặc hiệu
(một trình tự DNA đã biết) để xác định sự thay đổi trong locus đặc hiệu đó ở bộ
gen của các cá thể cần nghiên cứu. Đây là phương pháp đầu tiên được áp dụng để
xác định mức độ sai khác giữa của các trình tự nucleotide: do mỗi cá thể sinh vật có
một bộ ADN genome đặc trưng về trình tự nucleotide trong cấu trúc, vì vậy khi sử
dụng những enzyme giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận
biết được những đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với
những mẫu dò đã được đánh dấu (bằn phóng xạ hoặc bằng phương pháp hóa học).
Theo lý thuyết, sự đa hình trong phân tích RFLP có thể được ghi nhận như
sự có mặt hay vắng mặt của một băng riêng biệt trên gel. Đó chính là những biến
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13
đổi về cặp bazơ nitơ có thể xuất hiện hoặc do biến đổi chuỗi ADN trên phạm vi
rộng lớn như là kết quả của sự đảo đoạn, chuyển đoạn, khuyết đoạn....
Chỉ thị RFLP được ứng dụng khá phổ biến để lập bản đồ di truyền, phân tích
các locus tính trạng số lượng, đánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu quá trình tiến
hóa và phân loại dưới loài đối với nhiều loại cây trồng. Chỉ thị RFLP cũng được sử
dụng để xây dựng các bản đồ di truyền ở ngô (Gardiner J. M. et al., 1993); xác định
mối quan hệ di truyền giữa các dòng ngô nội phối và phân chúng thành các nhóm
khác nhau (Melchinger A. E., 1993); đánh giá đa dạng di truyền và nghiên cứu mối
quan hệ di truyền của chúng (Pejic I. et al., 1998).
Chỉ thị RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể
đồng hợp tử (AA hoặc aa) và cá thể dị hợp tử (Aa). Tuy nhiên, phương pháp này có
nhược điểm là quy trình thực hiện phức tạp, tốn kém, đòi hỏi nhiều trang thiết bị
phòng thí nghiệm, cần một lượng lớn ADN có chất lượng cao và sử dụng chất đồng
vị phóng xạ gây nguy hiểm cho con người. Do đó, hiện nay có xu hướng sử dụng các
chỉ thị phân tử đơn giản hơn trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR.
Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Các chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR mở ra một hướng mới có thể giảm
thời gian, công sức và chi phí trong lập bản đồ di truyền. Kỹ thuật RAPD cho phép
phát hiện đa hình các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên, được phát triển bởi
William, Welh và Mc. Clellan (1990) đã trợ giúp đắc lực cho các phương pháp đánh
giá ưu thế lai truyền thống (Bùi Mạnh Cường, 2007).
Nguyên lý của phương pháp RAPD là sử dụng một đoạn oligonucleotide có
chiều dài từ 9 - 12 nucleotide sắp xếp theo trình tự ngẫu nhiên làm mồi cho phản
ứng PCR (Bùi Mạnh Cường, 2007). Đoạn mồi có thể bám vào bất kỳ vị trí bổ sung
nào trên mạch DNA khuôn, có thể ở nhiều locus khác nhau. Sau khi điện di và quan
sát sản phẩm PCR trên bản gel agarose nhuộm với EtBr (ethidium bromide) dưới
đèn tử ngoại, người ta đã phát hiện thấy sự khác nhau trong phổ giữa các phân đoạn
DNA được khuyếch đại. Kỹ thuật RAPD đã được sử dụng với nhiều mục đích khác
nhau như lập bản đồ di truyền liên kết, đánh dấu gen, xác định giống cây trồng,
đánh giá sự biến dị di truyền trong quần thể và loài…
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14
