TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN và TINH CHẾ HFGF 2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR 2) tái tổ hợp từ ESCHERICHIA COLI 2

Vật liệu – Phương pháp

CHƢƠNG II.
VẬT LIỆU-PHƢƠNG PHÁP

- 28 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Thiết bị – Dụng cụ
- Bộ pipetman 10, 20, 100, 1000, 5000 μl, các loại đầu tip tƣơng ứng
- Các loại eppendof 0,2ml, 1,5ml
- Erlen 100ml, 250ml, 1000ml, ống đong, bercher, đĩa petri
- Đèn cồn, que cấy, bình tia chứa cồn, nƣớc cất
- Bộ chuyển màng lai (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech)
- Bộ điện di ngang DNA (HORIZON ®58, Life Technology™, Mỹ) và hộp đèn soi
UV (Hoefer, Mỹ)
- Bộ điện di protein (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech) và bộ nguồn
(Amersham Biosciences)
- Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ)
- Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ)
- Cột tinh chế Hitrap SP FF 5ml, Hitrap Heparin HP 5ml (GE Healthcare)
- Hệ thống lên men tự động BioTron-LiFlus GX GX-05-12302 và các thiết bị phụ
trợ nhƣ: máy nén khí, hệ thống nƣớc giải nhiệt…
- Hệ thống tinh chế AKTA (GE Healthcare)
- Máy chụp hình gel (Amersham Biosciences)
- Máy đo nồng độ DNA Nanodrop

- Máy điều nhiệt theo chu kỳ Eppendorf Mastercycler Personal
- Máy đo quang phổ chuyên dụng GeneQuantpro (Amersham Biosciences) dùng
cho DNA, RNA và protein
- Máy đo pH (ORION, Anh)
- Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh)
- Máy lắc nƣớc Grant GLS400 (Cambridge, Anh) và thiết bị làm lạnh đi kèm
- Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich, Nhật)
- Máy lắc ổn nhiệt Orbital Incubator S150 (Stuard Scientific, Anh)

- 29 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

- Máy phá tế bào Model M-110EH-30 Microfluidizer Processor và hệ thống làm
lạnh đi kèm
- Máy Vortex (IKA, Mỹ)
- Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY)
- Phần mềm Quantity One (Biorad)
- Tủ ấm Memmert (Nhật)
- Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ)
- Tủ lạnh -20oC (Medical Class, Nhật)
- Tủ lạnh -80oC (MDF 382-SANYO, Nhật)
- Tủ mát 4oC
- Tủ sấy Memmert (Nhật)
2.1.2. Hóa chất và môi trƣờng
2.1.2.1. Hóa chất
a) Hóa chất dùng cho phản ứng PCR

- Dung dịch MgCl2 25mM (Fermentas, Đức)
- dNTPs 8mM (Fermentas, Đức)
- Taq polymerase 1u/µl (Fermentas, Đức)
- Buffer Taq polymerase 10X (Fermentas, Đức)
- Pfu DNA polymerase 1u/µl (Fermentas, Đức)
- Buffer Pfu DNA polymerase 10X(Fermentas, Đức)
b) Dung dịch tách plasmid bằng phương pháp SDS- kiềm
- Dung dịch I: Tris-HCl 25mM; EDTA 10mM; glucose 50mM, pH 8
- Dung dịch II: NaOH 0,2N; SDS 1% (pha trƣớc khi dùng)
- Dung dịch III: CH3COOK 3M, pH 4,8
- Chloroform
- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM; EDTA 1M, pH 8,0
- Ethanol 70% và ethanol tuyệt đối lạnh (giữ ở -20oC)
- Isopropanol lạnh (giữ ở -20oC)
- 30 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0)
- Sodium acetate 3M (pH 4,8)
c) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt và nối
- Enzyme BamHI, NdeI (Fermentas, Đức)
- Buffer Tango 10X (Fermentas, Đức)
- Buffer ligation 10X (Fermentas, Đức)
- T4 DNA ligase (Fermentas, Đức)
- Nƣớc cất MiliQ
d) Hóa chất tinh chế sản phẩm PCR và sản phẩm cắt

- Chloroform
- Ethanol 70% và ethanol tuyệt đối lạnh (giữ ở -20oC)
- Isopropanol lạnh (giữ ở -20oC)
- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0)
- Hóa chất dùng cho tinh chế DNA
- Bộ kit tinh chế EZ-10 spin column (Biobasic)
e) Hóa chất dùng cho biến nạp DNA plasmid vào E. coli
- Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng
- Dung dịch MgCl2 20mM, CaCl2 80mM vô trùng (giữ ở 4oC)
- Dung dịch glycerol 80% vô trùng
f) Hóa chất dùng cho điện di DNA trên gel agarose
- Agarose (Biobasic)
- Dung dịch chạy điện di TAE 50X: Tris acetate 40mM, EDTA 0,1M (pH 8,0)
- Dung dịch nạp mẫu DNA: 0,05% xylene cyanol, 0,09% bromophenol blue; 60%
glycerol và 60mM EDTA
- Ethidium bromide 10 mg/ml
g) Hoá chất dùng cho điện di SDS - PAGE
- Dung dịch điện di 5X (Tris - glycine buffer pH 8,3): Tris 15,1g, SDS 5g, glycine
94g pha trong 1 lít nƣớc.
- 31 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

- Tris - HCl 1,5M pH 8,8 (giữ ở 4oC)
- Tris - HCl 0,5M pH 6,8 (giữ ở 4oC)
- SDS 10%
- 40% acrylamide - 0,8% bis acrylamide (giữ ở 4oC)

- Ammonium persulphate (APS) (giữ ở 4oC)
- TEMED (N, N, N’, N’- tetramethylethylene diamine) (giữ ở 4oC)
Thành phần gel phân tích (15%) và gel gom đƣợc trình bày nhƣ bảng 2.1.
Bảng 2.1. Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS-PAGE
Gel phân tách

Gel gom

Nƣớc cất

2,52ml

1,3ml

Tris-HCl 1,5M pH 8,8

1,75ml

0 ml

Tris-HCl 0,5M pH 6,8

0 ml

0,505ml

Acrylamide 40%

2,64ml

0,2ml

SDS 10%

70µl

20µl

(APS) 10%

35µl

10 µl

TEMED

2,8µl

2,0µl

-Dung dịch đệm điện di protein: 3,02g Tris, 18,8g glycine, 1g SDS trong 1 lít nƣớc
cất, pH = 8,3
-Dung dịch nạp mẫu protein: 16ml Tris-HCl 0,5M pH 6,8, 1,54g DTT, 0,4g SDS,
0,9mg bromophenol blue, 4ml glycerol, 5-6ml β-mercaptoethanol
- Dung dịch nhuộm coomassive: Coomassive blue 0,625g, glacial acetic acid 25ml,
ethanol tuyệt đối 112,5ml pha trong 150ml dung dịch
- Dung dịch giải nhuộm: Ethanol tuyệt đối 100ml; glacial acetic acid100ml pha
trong 1l dung dịch.
- Dung dịch nhuộm bạc :
+ Dung dịch cố định mẫu 1: Ethanol 50ml, acetic acid 5ml, nƣớc cất 50ml

+ Dung dịch cố định mẫu 2: Methanol 50ml, nƣớc cất 50ml
+ Natrithiosulfate 0,02%
- 32 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

+ AgNO3 0,2%
+ Developer: Na2CO3 10g, Formaldehyde 0,54ml, nƣớc cất đủ 50ml
+ Stopper: Glycine 0,5g, nƣớc cất đủ 100ml
h) Hoá chất lai Western-Blot
- Dung dịch Towbin: 3g Tris-HCl, 14,4g glycine, 1g SDS trong 800ml nƣớc cất.
Bổ sung 200ml methanol trƣớc khi dùng.
- Dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline): Na2HPO4 80mM, NaH2PO4 20mM,
NaCl 100mM, pH = 7,5.
- Dung dịch PBST: 0,1% Tween 20 trong PBS.
- Dung dịch khoá màng: 0,5g sữa gầy trong 10ml dung dịch PBST.
- Dung dịch chứa kháng thể kháng FGF: 10ml dung dịch PBST; 1µl kháng thể
kháng FGF-2 (10mg/ml) (Sigma).
- Dung dịch chứa kháng thể anti-Ig chuột-HRP: 10ml dung dịch PBST; 1µl kháng
thể anti-Ig chuột-HRP (10mg/ml) (Sigma).
- Dung dịch phát hiện (Amersham): detection 1: detection 2= 1:1.
i) Hóa chất dùng cho tinh chế protein
- Buffer A (dung dịch cân bằng cột): Na2HPO4 0,1M, NaH2PO4 0,1M, EDTA 1mM,
pH 7
- Buffer B (dung dịch dung ly): Na2HPO4 0,1M, NaH2PO4 0,1M, EDTA 1mM,
NaCl 2M, pH 7
- Dung dịch Ethanol 20%

- Nƣớc cất
j) Một số hóa chất khác
- Ampicillin 100mg/ml (Biobasic) (giữ ở -30oC)
- IPTG (Isopropyl1-β-D-thiogalactoside) 1M (giữ ở -30oC)
- Các chất điều chỉnh pH trong quá trình lên men: NH4OH 15%, H3PO4 30%
- Chất phá bọt trong quá trình lên men: polyglycon

- 33 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

2.1.2.2. Môi trƣờng
- Môi trƣờng LB: Trypton 10g, NaCl 5g, cao nấm men 5g pha trong 1 lít môi
trƣờng, hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút
- Môi trƣờng LB agar: môi trƣờng LB lỏng bổ sung thêm 2% agar, hấp khử trùng
ở 121oC trong 20 phút
- Môi trƣờng LB-Amp100: môi trƣờng LB bổ sung thêm ampicillin để nồng độ
cuối là 100g/ml ở 40-45oC sau khi hấp khử trùng (giữ ở 4oC)
- Môi trƣờng LB-Amp100 agar: môi trƣờng LB-Amp100 lỏng bổ sung thêm 2%
agar (giữ ở 4oC)
- Môi trƣờng lên men:
+ Trace: ZnSO4.7H2O 0,288g/l; MnSO4.7H2O 0,142g/l; H3BO3 0,062g/l;
NaMoO4.2H2O 0,048g/l; CoCl2.6H2O 0,048g/l; KI 0,083g/l; CaSO4.5H2O 0,125g/l;
H2SO4 0,25M 1ml/l
+ Môi trƣờng lên men (pH = 7): glycerol 0,3%, trypton 0,5%; cao nấm men 0,5%;
KH2PO4 50mM; Na2HPO4 50mM; NH4Cl 0,5g/l; MgSO4 4mM; Na2SO4 5mM;
glucose 0,5%; trace 1ml/l

2.1.3. Vật liệu sinh học
Tất cả các vật liệu sinh học đƣợc dùng trong đề tài này đƣợc cung cấp bởi Bộ
môn Công nghệ Sinh học phân tử - môi trƣờng, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên,
ĐHQG TPHCM.
2.1.3.1. Chủng vi sinh vật
Chủng E. coli DH5 [F-, 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA,
supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1] dùng để dòng hóa.
Chủng E. coli BL21(DE3) (F+ ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm(DE3)) là chủng E.
coli đột biến khiếm khuyết protease ompT và lon, dùng để biểu hiện.
2.1.3.2. Plasmid

- 34 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

Plasmid do Bộ môn Công nghệ Sinh học phân tử - môi trƣờng, trƣờng Đại học
Khoa học tự nhiên, ĐHQG TPHCM cung cấp.
Plasmid pIDT-fgf2 chứa gene mã hóa protein FGF-2 với các vị trí cysteine đã
đƣợc biến đổi đƣợc gửi tổng hợp hoá học ở công ty IDTDNA, Hoa Kỳ.
Plasmid pET-His có kích thƣớc 4636bp, có chứa gen kháng kháng sinh ampicillin
(ampr), trình tự khởi đầu sao chép pBR322 ori, promoter T7. Đây là một promoter
mạnh giúp cho việc biểu hiện protein trong vi khuẩn. Ngoài ra, trên vùng MCS còn có
vị trí cắt giới hạn duy nhất của hai enzyme BamHI và NdeI giúp gắn chèn đoạn gen
mong muốn vào vector. Gen quan tâm có thể đƣợc dung hợp với đuôi His 6x tại đầu Nterminal giúp cho việc tinh chế dễ dàng hơn.

Hình 2.1. Plasmid pET-His.
2.1.3.3. Thang chuẩn

- 35 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

Hình 2.2. Các thang chuẩn
A, thang 1 Kb (Fermentas); B, thang 1Kb plus (Fermentas);
C, thang phân tử lượng protein (Sigma)
2.2. PHƢƠNG PHÁP
Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 và dòng hóa tế bào E. coli DH5α đƣợc
thể hiện nhƣ trên hình 2.3.

Hình 2.3. Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

- 36 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

2.2.1. Cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2
2.2.1.1. Thu nhận gen fgf-2 bằng phản ứng PCR
Gene fgf-2 đƣợc thu nhận với lƣợng lớn nhờ phản ứng PCR plasmid pIDT-fgf2
với cặp mồi đặc hiệu của gene nhằm phục vụ cho công đoạn tạo dòng vào plasmid
pET-His với chƣơng trình đƣợc thiết kế nhƣ hình 2.4.

Hình 2.4. Chương trình PCR thu nhận gen fgf2
Thành phần của phản ứng PCR:
MgSO4

5,0µl

dNTP

5,0µl

Buffer Pfu 10X

5,0µl

Mồi FGF-2F

1,0µl

Mồi FGF-2R

1,0µl

DNA plasmid pIDT

1,0µl

Pfu DNA polymerase

1,0µl
đủ 50µl

dH2O

Gen fgf2 thu nhận sau phản ứng PCR đƣợc tinh chế bằng bộ kít EZ-10 Spin
Column DNA Gel Extraction Kit.
2.2.1.2. Tách chiết, thu nhận plasmid pET-His
a) Nguyên tắc của phƣơng pháp tách chiết bằng SDS-kiềm

- 37 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

Có thể tách chiết plasmid bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ dùng nhiệt độ cao,
lithium, SDS kiềm… Trong đó, sử dụng SDS kiềm là cách tách chiết phổ biến nhất do
thực hiện đơn giản nhƣng cho hiệu quả tách chiết cao. Phƣơng pháp dựa trên sự hồi
tính nhanh chóng của DNA plasmid so với DNA bộ gen. Tế bào đƣợc xử lý lần lƣợt
với dung dịch 1, 2 và 3. Dung dịch 1 chứa glucose tạo môi trƣờng nhƣợc trƣơng giúp tế
bào dễ vỡ và EDTA ức chế DNAse. Màng tế bào bị phá vỡ bởi NaOH và SDS. Dƣới
tác dụng của SDS trong dung dịch 2, protein của tế bào sẽ bị biến tính. Sự hiện diện
của kiềm ở nồng độ cao trong giai đoạn đầu của quá trình tách chiết làm DNA bộ gen
và DNA plasmid bị biến tính. Việc trung hòa nhanh bằng dung dịch 3 có tác dụng làm
phục hồi cấu trúc DNA. Do kích thƣớc của plasmid nhỏ hơn nên phục hồi dễ dàng và
hiện diện trong phần dịch nổi sau ly tâm. Trong khi đó DNA bộ gen có kích thƣớc lớn
nên khó phục hồi và tạo phức hợp với các protein bị biến tính thành tủa trong dung
dịch. DNA plasmid đƣợc tủa dƣới tác dụng của ethanol tuyệt đối và sau đó hòa tan lại
trong dung dịch TE [12].
b) Các bƣớc tiến hành

- Nuôi cấy dòng E. coli mang plasmid pET-His trong 5ml môi trƣờng LB có bổ
sung Ampicillin 100g/ml, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút qua đêm ở 37oC.
- Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút để thu sinh khối.
- Bổ sung 100µl dung dịch I vào eppendorf 1,5ml chứa sinh khối, vortex thật kỹ.
- Bổ sung 200µl dung dịch II, đảo nhẹ.
- Bổ sung ngay 150µl dung dịch III, đảo nhẹ.
- Ly tâm thu dịch nổi ở 10.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC .
- Bổ sung vào dịch nổi 1,5µl RNase (1 mg/ml), ủ ở 37oC, 1 giờ.
- Thêm 250µl phenol pH 8 và 250µl chloroform, đảo đều, ly tâm 10.000rpm, 5
phút, thu dịch nổi.
- Tủa DNA plasmid bằng 1ml ethanol 99o lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút, 30 phút,
4oC.
- Rửa tủa trong 500µl ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút, 5 phút, 4oC.
- 38 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

- Thu tủa, phơi khô tự nhiên. Bảo quản mẫu trong 30µl TE, -20oC. Điện di kiểm
tra kết quả trên gel agarose 1%.
2.2.1.3. Xử lý gen fgf2 và plasmid pET-His bằng enzyme cắt hạn chế
a) Xử lý gen fgf2 bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và NdeI
Thành phần phản ứng cắt:
Gen fgf2

30µl

Buffer Tango 10X

10µl

Enzyme BamHI (10u/µl)

1µl

Enzyme NdeI (10u/µl)

1µl

dH2O

8µl

Tổng thể tích

50µl

b) Xử lý plasmid pET-His bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và NdeI
Thành phần của phản ứng cắt:
Plasmid pET-His

30µl

Buffer Tango 10X

10µl

Enzyme NdeI (10u/µl)

1µl

Enzyme BamHI (10u/µl)

1µl

dH2O

8µl

Tổng thể tích

50µl

Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 37oC, 4 giờ. Sản phẩm cắt đƣợc tinh chế bằng bộ EZ10 Spin Column PCR Products Purification Kit.
2.2.1.4. Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pET-fgf2
Nhằm mục đích dòng hoá, gen mục tiêu đƣợc đƣa vào vector thông qua phản ứng
nối dƣới hoạt động của enzyme T4 DNA ligase. T4 DNA ligase có khả năng nối hai
trình tự DNA thông qua việc hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu 5’phosphate
và đầu 3’OH của hai đoạn DNA.

- 39 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

Dƣới tác dụng của T4 DNA ligase, gen fgf-2 đƣợc nối vào plasmid pET-His,

plasmid tái tổ hợp đƣợc tạo thành gọi là pET-fgf2.
Thành phần phản ứng nối như sau:
Buffer T4 DNA ligase

1,5l

Plasmid pET

3,0l

Gen fgf-2

9,5l

T4 DNA ligase

1,0l

Tổng thể tích

15,0l

Phản ứng nối đƣợc tiến hành ở 11 oC trong 4 giờ. Sau đó hỗn hợp sản phẩm nối
đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.
2.2.1.5. Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α
a) Chuẩn bị tế bào E. coli DH5 khả nạp
Phƣơng pháp hóa biến nạp dựa trên sự xáo trộn của màng tế bào do ion Ca2+ gây
ra giúp DNA xâm nhập vào tế bào dễ dàng hơn. Quá trình sốc nhiệt ở 42 oC trong 90
giây kích thích sự chuyển plasmid vào bên trong tế bào. Sau đó tế bào đƣợc nuôi lại
trong môi trƣờng LB giúp tế bào hồi phục.

Thực hiện:
- Cấy một khuẩn lạc đơn E. coli DH5 vào 5ml môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy lắc
qua đêm ở 37oC. Hút 2,5ml dịch nuôi cấy trên vào erlen 1 lít chứa 250ml môi trƣờng
LB lỏng, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút ở 37oC cho đến khi giá trị OD600 của dịch nuôi
cấy đạt 0,6-0,8.
- Ngâm các erlen vào nƣớc đá trong 20-30 phút. Cho dịch nuôi cấy vào các ống
falcon ly tâm đã đƣợc làm lạnh sẵn và ly tâm thu sinh khối tế bào ở 5.000 vòng/phút,
10 phút, 4oC.
- Rửa sinh khối tế bào bằng dung dịch CaCl2-MgCl2 (20mM-80mM), vortex nhẹ,
ly tâm thu sinh khối tế bào ở 5.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC.

- 40 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

- Thêm 3ml CaCl2 100mM và 1ml glycerol 80%, trộn nhẹ đều và cất giữ tế bào ở
tủ âm.
Tất cả các bƣớc đƣợc thực hiện vô trùng.
b) Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả nạp
15µl hỗn hợp sản phẩm nối đƣợc trộn đều vào 100µl tế bào E. coli DH5α khả nạp
trong eppendorf. Rồi thực hiện sốc nhiệt theo qui trình sau:
- Để lạnh 4oC trong 10 phút.
- Giữ 42oC trong 90 giây.
- Giữ lạnh 4oC trong 15 phút.
Sau đó trải hỗn hợp này lên đĩa LB-Amp100, ủ 37oC trong khoảng 16-18 giờ.
Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng là tế bào khả nạp E. coli DH5α không đƣợc biến
nạp sản phẩm nối.

2.2.1.6. Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2
a) Sàng lọc thể biến nạp trên môi trƣờng kháng sinh
Sau khi ủ ở 37oC, kiểm tra kết quả biến nạp bằng cách quan sát sự phát triển của
vi khuẩn trên đĩa biến nạp và đĩa đối chứng. Trên môi trƣờng LB-Amp100, chỉ những
tế bào E. coli DH5α nào thu nhận đƣợc plasmid pET-fgf2 (plasmid tái tổ hợp) hoặc
plasmid pET (plasmid tự nối) mới mọc đƣợc trên môi trƣờng này. Các tế bào này sẽ
đƣợc thu nhận để kiểm tra trong các bƣớc tiếp theo.
b) Sàng lọc thể biến nạp bằng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc
Nguyên tắc: Phƣơng pháp PCR khuẩn lạc cũng tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp PCR
DNA thông thƣờng. Dƣới tác dụng nhiệt độ cao màng tế bào sẽ bị phá vỡ. DNA
plasmid đƣợc giải phóng ra ngoài và trở thành khuôn cho phản ứng PCR.
Các bước thực hiện:
Lấy một ít sinh khối bằng tăm vô trùng từ khuẩn lạc mọc trên đĩa LB-Amp100
agar. Huyền phù đầu tăm vào các eppendorf 0,2ml đƣợc đánh dấu sẵn.
Thành phần phản ứng:
Buffer Taq 10X

2,5µl
- 41 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

MgCl2

2,0µl

dNTP (8mM)

2,5µl

FGF2-F (10 pmol/µl)

1µl

FGF2-R (10 pmol/µl)

1µl

Taq DNA polymerase (1u/µl)
dH2O

0,5µl
15,5µl

Tổng thể tích

25µl

Chƣơng trình chạy PCR đƣợc trình bày nhƣ hình 2.5.
95oC
5 phút

94oC
72oC

45 giây

72oC

45giây 10 phút
55oC
4oC

45 giây
x(30)

∞

Hình 2.5. Chương trình PCR khuẩn lạc bằng mồi đặc hiệu
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Những khuẩn lạc cho
vạch DNA có kích thƣớc đúng nhƣ dự đoán sẽ đƣợc chọn lọc nuôi cấy và tách chiết
plasmid, chuẩn bị cho các bƣớc kiểm tra tiếp theo.
c) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-fgf2
Thu nhận plasmid của các khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR
theo phƣơng pháp SDS-kiềm. Plasmid sau khi tách đƣợc tiến hành bằng các phƣơng
pháp sau:
- Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi đặc hiệu.
- Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi thƣơng mại.
- Kiểm tra bằng phƣơng pháp enzyme cắt hạn chế.

- 42 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

- Giải trình tự, so sánh độ tƣơng đồng trình tự lý thuyết và sự đồng khung dịch
mã.
* Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R
Plasmid sau khi tách đƣợc PCR kiểm tra với chƣơng trình chạy và thành phần
phản ứng tƣơng tự nhƣ kiểm tra PCR khuẩn lạc ở mục 2.2.1.6b.
* Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi T7promoter/T7terminator
Thành phần phản ứng:
Buffer Taq 10X

2,5µl

MgCl2

2,0µl

dNTP (8mM)

2,5µl

Mồi T7promoter (10 pmol/µl)

1µl

Mồi T7terminator (10 pmol/µl)

1µl

Plasmid

0,5µl

Taq DNA polymerase (1u/µl)

0,5µl

dH2O

15µl

Tổng thể tích

25µl

Chƣơng trình chạy PCR đƣợc trình bày nhƣ hình 2.6.

Hình 2.6. Chương trình PCR plasmid bằng mồi thương mại
* Kiểm tra bằng phương pháp enzyme cắt hạn chế

- 43 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

Ngoài ra, plasmid cũng đƣợc xử lý với enzyme EcoRI để kiểm tra kích thƣớc
plasmid và đồng thời cũng đƣợc xử lý với 2 enzyme NdeI và BamHI để xác nhận sự
hiện diện của gen fgf2 trong plasmid pET-fgf2. Thành phần phản ứng cắt đƣợc trình
bày nhƣ mục 2.2.1.3.
Sản phẩm cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.

* Giải trình tự
Plasmid tái tổ hợp thu nhận sau quá trình kiểm tra đƣợc tiến hành giải trình tự
theo phƣơng pháp Sanger cải tiến trên máy Big DyeTM terminator của công ty
Macrogene, Hàn Quốc. Sau đó đƣợc đem so sánh độ tƣơng đồng trình tự lý thuyết và
sự đồng khung dịch mã bằng phần mềm Jelly fish.
Chủng đƣợc bảo quản trong 20% glycerol, ở -80oC.
2.2.2. Cấu trúc chủng E. Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2
2.2.2.1. Thu nhận plasmid pET-fgf2
Các plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp SDSkiềm tƣơng tự nhƣ mục 2.2.1.2.
2.2.2.2. Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E. coli BL21(DE3)
Chuẩn bị tế bào E. coli BL21(DE3) khả nạp, biến nạp plasmid pET-fgf2 vào tế
bào khả nạp E. coli khả nạp và quá trình biến nạp tƣơng tự nhƣ mục 2.2.1.5.
Sau khi biến nạp và trải lên đĩa LB-Amp100. Đĩa sau khi trải sẽ đƣợc ủ 37oC
trong khoảng 16-18 giờ. Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng là tế bào khả nạp E. coli
BL21(DE3) không đƣợc biến nạp plasmid.
2.2.2.3. Sàng lọc thể biến nạp bằng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc
Khuẩn lạc E.coli BL21(DE3) đƣợc PCR kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu FGF2F/FGF2-R tƣơng tự nhƣ kiểm tra PCR khuẩn lạc E.coli DH5α ở mục 2.2.1.6.
2.2.3. Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong E. coli BL21(DE3)
2.2.3.1. Cảm ứng biểu hiện protein FGF-2
- Hoạt hóa tế bào E. coli BL21(DE3) mang plasmid pET-His-fgf2 tái tổ hợp vào
ống nghiệm chứa 5ml LB-Amp100. Lắc 250 vòng/phút ở 37°C qua đêm.
- 44 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

- Cấy chuyền 500μl dịch vi khuẩn đã nuôi cấy qua đêm vào ống nghiệm chứa 5ml
môi trƣờng LB-Amp100. Lắc 250 vòng/phút ở 37°C qua đêm.

- Bổ sung IPTG đạt nồng độ cuối 0,3mM vào ống nghiệm. Lắc 250 vòng/phút ở
37°C qua đêm.
- Tiến hành song song trong cùng điều kiện mẫu nghiệm thức đối chứng là
BL21(DE3) mang plasmid pET-His-fgf2 không đƣợc cảm ứng với IPTG.
2.2.3.2. Thu mẫu và xử lý mẫu
- Hút 1ml dịch vi khuẩn vào eppendorf và thu 2 eppendorf. Ly tâm thu sinh khối
ở 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Rửa tủa bằng nƣớc cất: Hòa tủa thu đƣợc trong 1ml nƣớc cất, vortex cho tủa hòa
đều vào nƣớc cất, li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi và thu tủa.
- Hòa tủa trong 300µl nƣớc cất.
- Tiến hành sonicate dịch vừa thu nhận ở 4oC trong ba chu kì (mỗi chu kì phá 30
giây và nghỉ 30 giây) với công suất 15watts. Ly tâm một eppendorf ở 13000 vòng/phút
ở 4oC trong 10 phút, thu tủa và nổi riêng. Eppendorf còn lại chỉ sonicate mà không ly
tâm để làm mẫu tổng.
2.2.4. Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận
protein FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan
2.2.4.1. Các bƣớc chuẩn bị
a. Chuẩn bị và hoạt hóa giống:
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF đƣợc cấy chuyền hoạt hóa lên đĩa petri chứa
môi trƣờng thạch LB có bổ sung ampicillin để sàng lọc chủng. Đĩa petri này đƣợc ủ ở
37oC trong 10 - 14 giờ, sau đó giữ ở tủ mát 4oC.
Cấy một khuẩn lạc đơn của chủng từ đĩa petri vào ống nghiệm chứa 5ml môi
trƣờng LB-Amp100. Lắc 250 vòng/phút, 37oC trong 12-14 giờ.
Sử dụng 5ml giống trên cho vào erlen 250ml có chứa 100ml môi trƣờng lên men
đƣợc bổ sung kháng sinh ampicillin ở nồng độ 100μg/ml. Lắc 250 vòng/phút ở 37oC

- 45 -

Luận văn thạc sĩ sinh học

Vật liệu – Phương pháp

trong 12 - 14 giờ. Erlen chứa dịch nuôi cấy này đƣợc dùng để nạp giống vào bình lên
men theo tỷ lệ 1/10 (v/v).
b. Lắp ráp hệ thống lên men, nạp môi trƣờng và giống:
Các sensor pH, sensor DO đƣợc lắp vào các vị trí trên bình lên men theo hình 2.7.

Hình 2.7. Các vị trí lắp đặt thiết bị trên bình lên men
Bình lên men đƣợc hấp vô trùng, sau đó tiến hành nạp giống vào bình lên men và
tiếp tục bổ sung Ampiciline đạt nồng độ cuối 100µg/ml, các thao tác trên đƣợc tiến
hành trong tủ cấy vô trùng.
Sau đó, bình lên men đƣợc lấy ra khỏi tủ cấy vô trùng và lắp ráp vào hệ thống, lắp
ráp hệ thống đƣờng ống nƣớc giải nhiệt, động cơ khuấy, đƣờng khí vào (air inlet), hệ
thống đƣờng ống nối với các bình đựng dung dịch acid, base, antifoam. Hệ thống lên
men sau khi đã đƣợc lắp ráp hoàn chỉnh nhƣ hình 2.8.

- 46 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

Hình 2.8. Hệ thống thiết bị lên men
2.2.4.2. Lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2
Các thông số cài đặt cho quá trình lên men chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF
nhƣ sau: pH=7,00, DO>20%, khuấy ở tốc độ 250 vòng/phút, sục khí ở 1vvm. Trong 8
giờ đầu, cài đặt nhiệt độ ở 37oC. Sau 8 giờ lên men, bổ sung IPTG đạt nồng độ cuối là
0,3mM và chỉnh nhiệt độ về 25oC, tốc độ khuấy về 150 vòng/phút. Lên men trong thời

gian 24 giờ.
Tiến hành thu dịch nuôi cấy và phân tích trọng lƣợng khô tế bào (DCW) sau mỗi
hai giờ kể từ thời điểm bắt đầu lên men nhằm khảo sát động học tăng trƣởng của
chủng. Kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp bằng phƣơng pháp
SDS-PAGE và định lƣợng bằng phần mềm Quantitive One. Mỗi 2 giờ sau khi cảm ứng
với IPTG, thu mẫu để kiểm tra khả năng biểu hiện của chủng theo thời gian cảm ứng.
Sau 24 giờ lên men, tiến hành ly tâm 1L dịch lên men để thu sinh khối và hòa lại trong
300ml dịch phá tế bào. Dịch tế bào đƣợc phá bằng máy phá tế bào M-110EH-30
Microfluidizer Processor để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp trong pha tan. Dịch nổi
sau khi thu nhận sẽ đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp đo Bradford nhƣ trình bày ở
mục 2.2.6.4. để đánh giá hiệu quả của quá trình lên men.
2.2.4.3. Đánh giá hiệu quả lên men
a. Phân tích trọng lƣợng khô tế bào (DCW):

- 47 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

Tại mỗi thời điểm thu mẫu, hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf đã đƣợc sấy
đến khối lƣợng không đổi và khối lƣợng của eppendorf đã đƣợc xác định bằng cân.
Tiến hành ly tâm bỏ dịch nổi và sấy ở 80oC trong 4 giờ đến khi khối lƣợng khô tế bào
không đổi. Mẫu sau khi sấy đƣợc đem đi cân để xác định giá trị DCW.
b. Chuẩn bị mẫu cho điện di SDS-PAGE để kiểm tra khả năng biểu hiện FGF-2
theo thời gian cảm ứng:
- Tại mỗi thời điểm thu mẫu, hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf.
- Ly tâm thu sinh khối ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Rửa tủa bằng nƣớc cất: Hòa tủa thu đƣợc trong 1ml nƣớc cất, vortex cho tủa hòa

đều trong nƣớc cất, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi và thu tủa.
- Hòa tủa trong 600μl nƣớc cất.
- Tiến hành sonicate dịch vừa thu nhận ở 4oC cho đến khi dịch trong. Ly tâm
13000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút, thu tủa và nổi riêng.
- Tiến hành điện di SDS-PAGE các mẫu thể tan để đánh giá sự biểu hiện của
protein FGF-2 tái tổ hợp trong tế bào chất E. coli trong suốt quá trình lên men.
c. Cách tính hiệu quả thu nhận FGF-2 [1]
Hiệu quả thu nhận FGF-2 tối đa (E) đƣợc tính dựa trên lƣợng FGF-2 (T) thu
đƣợc từ sinh khối khô tế bào (X) trong 1L (V) dung dịch sau 24 giờ lên men.

E% 

Tx100
X

T đƣợc tính dựa vào lƣợng protein tổng (Y) tính đƣợc thông qua nồng độ đƣợc
đo bằng phƣơng pháp Bradford ([Protein tổng]) và % FGF-2 trên protein tổng (Z) của
dịch nổi bằng phần mềm Quantity One do công ty Biorad cung cấp.
T = Y x Z = [Protein tổng] x V x Z
2.2.5. Tinh chế FGF-2
2.2.5.1. Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation

- 48 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

Do pH=7 là pH giúp ổn định hoạt tính của FGF-2 nên chúng tôi tiến hành tinh chế

protein mục tiêu ở pH=7. Do FGF-2 có pI=9,8 nên ở pH=7, protein tái tổ hợp FGF-2
tích điện dƣơng nên phƣơng pháp sắc ký trao đổi cation đƣợc sử dụng để tinh chế.
Trong luận văn này, cột trao đổi cation Hitrap SP FF 5ml (GE Healthcare) đƣợc sử
dụng để thu nhận FGF-2 ở bƣớc đầu tiên.
Các bước thực hiện:
- Rửa hệ thống tinh tế AKTA FPLC bằng nƣớc cho đến khi đƣờng nền UV 280 trở
nên cân bằng.
- Lắp cột tinh chế cation SP FF 5ml vào hệ thống, rửa cột bằng nƣớc.
- Cân bằng cột bằng dung dịch A đến khi đƣờng nền UV280 trở nên cân bằng.
- Nạp 30ml mẫu vào cột với tốc độ dòng 2ml/phút, tái cân bằng cột bằng dung
dịch A đến khi cân bằng.
- Dung ly theo bậc thang:
+ Chỉnh tốc độ dòng 2ml/phút, 20% dung dịch B (80% dung dịch A). Thu nhận
phân đoạn protein tƣơng ứng với 20% dung dịch B.
+ Khi đƣờng nền UV280 cân bằng, chỉnh nồng độ dung dịch B lên 40% (60% dung
dịch A). Thu nhận phân đoạn protein tƣơng ứng với 40% dung dịch B.
+ Tiến hành tƣơng tự với nồng độ dung dịch B 60%, 80% và 100%.
2.2.5.2. Tinh chế bằng sắc ký ái lực heparin
FGF-2 có tƣơng tác đặc hiệu với heparin. Do vậy, trong khóa luận này, chúng tôi
sử dụng cột tinh chế Hitrap Heparin HP 5ml (GE Healthcare) để thu nhận FGF-2 dạng
tinh sạch.
- Rửa hệ thống tinh tế AKTA FPLC bằng nƣớc cho đến khi đƣờng nền UV280 trở
nên cân bằng.
- Lắp cột tinh chế cation Heparin HP 5ml vào hệ thống, rửa cột bằng nƣớc.
- Cân bằng cột bằng dung dịch A đến khi đƣờng nền UV280 trở nên cân bằng.
- Nạp 30ml mẫu vào cột với tốc độ dòng 2ml/phút, tái cân bằng cột bằng dung
dịch A đến khi cân bằng.
- 49 -

Luận văn thạc sĩ sinh học

Vật liệu – Phương pháp

- Dung ly theo bậc thang:
+ Chỉnh tốc độ dòng 2ml/phút, chỉnh nồng độ dung dịch B lên 40% (60% dung
dịch A). Thu nhận phân đoạn protein tƣơng ứng với 40% dung dịch B.
+ Tiến hành tƣơng tự với nồng độ dung dịch B 60%, 80% và 100%.
* Các phân đoạn protein thu đƣợc đƣợc tiến hành phân tích bằng điện di SDSPAGE và khẳng định bằng phƣơng pháp lai Western Blot để xác nhận sự hiện diện của
FGF-2. Phần mềm Quantity One (Biorad) và phƣơng pháp Bradford đƣợc sử dụng để
tính hiệu suất của phƣơng pháp tinh chế.
2.2.6. Các phƣơng pháp phân tích protein
2.2.6.1. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE
Gel polyacrylamide là sản phẩm trùng ngƣng của các phân tử acrylamide và
N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình trùng ngƣng đƣợc xúc tác bởi hệ thống
amonium persulfate (APS) - N,N,N’,N’-tetramethylenediamine (TEMED). Sau khi
trùng ngƣng sẽ tạo thành một hệ thống lƣới cho phép các protein có kích thƣớc khác
nhau đi qua các lỗ với vận tốc khác nhau.
SDS là tác nhân biến tính mạnh. Phân tử này bám lên các phần kị nƣớc của
protein, làm âm tính hóa protein và ngăn cản các liên kết hydro. Thêm vào đó, để loại
bỏ các cầu nối disulfide trong phân tử protein, ngƣời ta có thể sử dụng thêm 2mercaptoethanol hay dithiothreitol (DTT). Khi đó, protein đƣợc đƣa về cấu trúc bậc I
và đƣợc phân biệt qua gel dựa trên chiều dài của chúng [35].
* Chuẩn bị mẫu điện di SDS-PAGE
- Bổ sung dung dịch nạp mẫu 5X vào mẫu cần phân tích với tỷ lệ 4:1, votex nhẹ.
- Đun ở 100oC trong 20 phút, sau đó ủ ngay vào đá 5 phút để biến tính protein.
* Chuẩn bị gel điện di
Gel điện di polyacrylamide 15% gồm gel gom và gel phân tách có thành nhƣ đã
nói ở trên.
* Tiến hành điện di SDS – PAGE

- 50 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

Nạp 10µl mẫu và 5µl thang protein vào các giếng. Tiến hành điện di trong điều
kiện 2mA/giếng, 220V trong khoảng 1 giờ. Khi hoàn tất điện di, lấy gel ra khỏi kính,
cắt bỏ phần gel gom, nhuộm phần gel phân tích.
2.2.6.2. Phƣơng pháp nhuộm gel điện di
a. Phƣơng pháp nhuộm Comassive
- Nhuộm gel với dung dịch nhuộm comassive trong 30 phút.
- Giải nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm, thay dung dịch giải nhuộm sau mỗi giờ
cho đến khi nền gel trở nên trong suốt và vạch protein hiện rõ.
b. Phƣơng pháp nhuộm bạc
- Lắc gel trong dung dịch cố định 1 trong 30 phút.
- Đổ bỏ dung dịch cố định 1, lắc gel trong dung dịch cố định 2 trong 10 phút.
- Đổ bỏ dung dịch cố định 2, rửa gel với nƣớc và lắc gel trong natrithiosulfate
trong 90 giây.
- Đổ bỏ dung dịch natrithiosulfate, rửa lại gel bằng nƣớc sạch rồi ngâm trong
dung dịch AgNO3 trong 20 phút ở 40C.
- Rửa lại gel bằng nƣớc sạch rồi hiện gel bằng dung dịch developer cho đến khi
các vạch protein hiện lên.
- Dừng phản ứng bằng dung dịch stopper.
2.2.6.3. Kiểm tra bằng phƣơng pháp lai Western Blot
Để phát hiện protein FGF-2, thực hiện lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu
kháng FGF-2. Sau đó, sử dụng kháng thể thứ cấp anti-Ig chuột-HRP để phát hiện phản
ứng chuyên biệt giữa kháng thể kháng FGF-2 với FGF-2. Khi HRP gặp cơ chất H2O2
và luminol, HRP sẽ thủy phân H2O2 và đồng thời oxi hóa luminol. Luminol bị oxy hóa

ở trạng thái không bền sẽ phát ra ánh sáng để trở về trạng thái bền hơn. Ánh sáng này
có bƣớc sóng ngắn sẽ làm cháy phim hình thành vệt trên phim. Nhƣ vậy, chỉ có những
vị trí mang protein mục tiêu (protein FGF-2) mới tạo vệt trên phim [28].
Thực hiện
* Điện di SDS-PAGE
- 51 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Vật liệu – Phương pháp

Tiến hành điện di SDS-PAGE với các mẫu nhƣ trên cùng với thang prestained
(2,5l). Điện di với điện thế 220V, 2mA/giếng trong khoảng 1 giờ.
* Chuyển màng lai
- Ngâm giấy thấm, màng lai nitrocellulose và gel trong dung dịch Towbin trong
10 phút, lắc nhẹ.
- Đặt tất cả vào bộ chuyển màng theo thứ tự: cực dƣơng-xốp đệm-giấy thấmmàng nitrocellulose-gel-giấy thấm-xốp đệm-cực âm (hình 2.9) với hiệu điện thế 10V,
cƣờng độ 100mA trong 30 phút.

Hình 2.9. Sơ đồ minh họa thứ tự các thành phần trong bước chuyển màng
* Khóa màng
- Màng đƣợc đặt trong sữa gầy, lắc nhẹ trong 1giờ ở nhiệt độ phòng hay ủ qua
đêm ở 4oC.
- Lắc và rửa màng lai 5 lần với 15-20 ml PBST/lần, mỗi lần 5 phút.
* Ủ với kháng thể đặc hiệu
- Bổ sung 1l kháng thể kháng FGF-2 đặc hiệu đƣợc pha loãng trong 10ml PBST,
lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
- Lắc và rửa màng lai 5 lần với 15-20 ml PBST/lần, mỗi lần 5 phút.
* Ủ với kháng thể thứ cấp

- 52 -

Luận văn thạc sĩ sinh học