Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch streptokinase tái tổ hợp từ chủng streptococcus pyogenes trong e coli

Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch Streptokinase
tái tổ hợp từ chủng Streptococcus pyogenes
trong E. coli.

Nguyễn Thị Thƣơng

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học
Luận văn ThS Chuyên ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Quyền Đình Thi
Năm bảo vệ: 2011


Abstract: Tổng quan các vấn đề cần nghiên cứu: chứng tắc nghẽn mạch máu;
Streptokinase; Streptococcus pyogenes. Trình bày vật liệu (nguyên liệu và thiết bị)
và phƣơng pháp nghiên cứu (phƣơng pháp vi sinh vật, sinh học phân tử; hóa sinh).
Đƣa ra một số kết quả nghiên cứu: Nhân dòng gên mã hóa mSK-nonhis; Thiết kế
plasmid biểu hiện mSK; Biểu hiện streptokinase nonhis; Tinh sạch streptokinase
nonhis; Hoạt hóa SK

Keywords: Vi sinh vật học; Sinh học; Chủng Streptococus pyogenes

Content
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong xã hội hiện đại, khi nền kinh tế ngày một phát triển cộng với áp lực về công việc và thời
gian khiến cho chế độ ăn của con ngƣời trở nên mất cân đối là một trong những nguyên nhân lớn
dẫn đến bệnh tim mạch, đặc biệt là ở các nƣớc phát triển. Bệnh tim mạch đang là nguyên nhân
gây tử vong số 1 trên thế giới [50]. Trong đó chứng tắc nghẽn mạch máu có thể dẫn tới đột quỵ,
nhồi máu cơ tim thƣờng để lại hậu quả nghiêm trọng hơn.
Trên thị trƣờng hiện nay có một số thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu nhƣ Durakinase, Streptase,
Alteplase, Tenecteplase Tuy nhiên đây hầu hết là các sản phẩm của nƣớc ngoài với giá thành
rất đắt.

Ở Việt Nam chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về các thuốc tan huyết. Đề tài KC10.28 có thể
coi là công trình nghiên cứu cấp Bộ đầu tiên về lĩnh vực này. Trong đề tài này các nhà nghiên
cứu đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch thành công streptokinase. Streptokinase đƣợc biểu hiện
cả ở dạng có signal và không có signal (mSK), trong đó mSK với hoạt tính cao. Streptokinase tái
tổ hợp bƣớc đầu đƣợc thử nghiệm trên đối tƣợng thỏ thí nghiệm cho kết quả tốt.
Để hạn chế thấp nhất các biến chứng của chứng tắc nghẽn mạch máu thì thời gian xử lý huyết
khối trong mạch là một yếu tố vô cùng quan trọng. Thuốc tan huyết khối dạng tiêm đƣợc sử dụng
rộng rãi hơn. Tuy nhiên, thuốc dạng tiêm đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao. Các enzyme tái tổ hợp
thông thƣờng thƣờng dung hợp đuôi 6xhistidine để thuận tiện cho quá trình tinh sạch, nhƣng việc
dung hợp đuôi 6xhistidine đƣợc xem là có thể gây tác dụng phụ cho con ngƣời. Trên cơ sở đó,
trong khuôn khổ đề tài KC10.28 “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm
enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị”
tôi thực hiện đề tài luận văn “Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch streptokinase tái tổ hợp trong
Escherichia coli” tiến tới sản xuất dƣợc phẩm sinh học điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu, có ý
nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao.
III. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SK
SK đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới trong điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu. Tuy nhiên các
chủng tổng hợp SK tự nhiên là những chủng gây độc cho con ngƣời và hiệu suất tổng hợp thấp.
Do đó việc nghiên cứu SK trên thế giới chủ yếu đi theo hƣớng nghiên cứu sản xuất SK tái tổ
hợp. Streptococcus pyogenes, S. equisimilis, S. uberis là ba loài đƣợc sử dụng phổ biến trong
nhân dòng và biểu hiện gene SK. Hiện nay đã có 142 trình tự gene mã hóa SK (sk) đƣợc đăng kí
trong GeneBank, trong đó có 115 gene từ các chủng S. pyogenes, 23 gene từ các chủng S.
equisimilis và 4 gene từ các chủng S. uberis.
Nhân dòng và biểu hiện trong E. coli
Năm 1984, Malke et al. đã nhân dòng thành công gene mã hóa SK từ chủng S. equisimilis H46A,
biểu hiện trong E. coli và S. sanguis thu đƣợc SK có hoạt tính sinh học nhƣ chủng tự nhiên. Tác
giả sử dụng vector pACYC184 và pBR322 để biểu hiện trong E. coli thu đƣợc hoạt tính từ 8 đến
100 U/ml dịch nuôi cấy.
Năm 1989, Walter et al. đã nhân dòng thành công gene mã hóa SK từ chủng S. pyogenes type 1.
Sau đó đến năm 1992, Esrtrada et al. đã biểu hiện gene này trong E. coli W3110 cho SK có hoạt

tính nhƣ tự nhiên với năng suất biểu hiện đạt 25% protein tổng số.
Năm 1995, Ko et al. đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis. Tác giả thay thế trình tự peptide tín
hiệu của sk bằng tín hiệu ompA, sử dụng vector pKK223-3 biểu hiện trong E. coli JM109. Hoạt
tính thu đƣợc đạt 5000 U/ml dịch nuôi cấy sau 12 giờ cảm ứng bằng IPTG. Cũng năm 1995,
Kubo et al đã nghiên cứu hoạt hóa SK tái tổ hợp từ E. coli. Các tác giả xử lý bằng nhiệt độ để tái
cuộn xoắn cấu trúc SK bị biến tính bởi guanidine hydrochloride. Hoạt hóa ở 50°C làm tăng 10%
hoạt tính enzyme và 25% hoạt tính riêng, cao hơn xử lý ở 20°C.
Năm 1997, Avilan et al. đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis và biểu hiện trong E. coli
JM105. SK thu đƣợc giống với dạng tự nhiên. Ba sản phẩm SK thu đƣợc có khối lƣợng phân tử
lần lƣợt tƣơng ứng là 47,5; 45 và 33 kDa.
Năm 1999, Johnsen et al. Nhân dòng sk từ chủng S. uberis NCTC 3858 và đọc trình tự cho thấy
SK này tƣơng đồng khoảng 26% với SK của S. pyogenes và S. equisimilis. Protein suy diễn có
286 amino acid, trong đó peptide tín hiệu dài 25 amino acid. Trình tự amino acid của SK này bị
thiếu các amino acid đầu C so với trình tự amino acid của SK từ chủng S. pyogenes và S.
equisimillis
Năm 1999, Caballero et al. sử dụng vector pQE30 để biểu hiện SK trong E. coli cho hoạt tính
tƣơng đƣơng với SK tự nhiên [10]. Đồng thời Pupo et al. đã biểu hiện nội bào đối với sk từ S.
equisimilis sử dụng vector biểu hiện pTrp. Hiệu suất biểu hiện đạt 15% protein tổng số (thấp hơn
của Estrada). Tuy nhiên SK tái tổ hợp ở dạng hòa tan nên tinh sạch dễ dàng hơn
Năm 2007, Reza et al. đã sử dụng vector pGEX để biểu hiện SK trong E. coli với năng suất biểu
hiện đạt 50% protein tổng số. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng 3 dòng tế bào E. coli BL21 để biểu
hiện là E. coli BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3) plysS, E. coli BL21 CodonPlus. Các dòng tế
bào này thiếu hụt các sản phẩm gene protease trong bào tƣơng nhƣ Lon, OmpT, DegP và HtpR
với mục đích tạo năng suất biểu hiện cao cho protein hội nhập. Kết quả cho thấy tế bào E. coli
BL21 (DE3) physS cho năng suất cao nhất đạt 15000 U/ml dịch nuôi cấy.
Năm 2008, Babu et al. Tinh sạch SK đạt độ sạch là 99%. Các tác giả cũng nghiên cứu hoạt hóa
SK sau khi xƣ lý bằng guanidine. Theo đó một số chất hoạt động bề mặt không gây ion hóa nhƣ
Trixton X-100, Tween 20, Tween 80 có tác dụng hoạt hóa SK. Việc bổ sung 10% glycerol làm
tăng độ bền của enzyme
Năm 2009, Goyal et al. đã nghiên cứu phƣờng pháp nuôi lắc có bổ sung dƣỡng chất kết hợp với

tối ƣu các điều kiện nuôi cấy để biểu hiện SK tái tổ hợp trong E. coli cho năng suất cao. Theo đó,
nồng độ oxy hòa tan từ 30% đến 50% không ảnh hƣởng đáng kể đến điều kiện nuôi lắc; bổ sung
dƣỡng chất năng suất biểu hiện tăng vƣợt bậc, từ 188 mg/L lên 720 mg/L. Việc bổ sung cao nấm
men và kiểm soát pH môi trƣờng làm năng suất biểu hiện tăng gấp 2 lần. Tổng hợp các điều kiện
nuôi cấy, năng suất biểu hiện đạt 1120 mg/L, tăng gấp 14 lần so với ban đầu.
Nhân dòng và biểu hiện trong Pichia pastoris
Năm 1989, Hagenson et al. sử dụng promoter của alcohol oxidase từ P. Pastoris để biểu hiện sk
trong nấm men cho năng suất đạt 77 mg/L và hoạt tính đạt 3000 U/ml.
Năm 2000, Pratap et al. đã nhân dòng sk từ S. equisimilis và biểu hiện trong Pichia pastoris. SK
thu đƣợc có khối lƣợng phân tử là 55 kDa, cao hơn SK gốc nhƣng có hoạt tính tƣỡng đƣơng. Các
tác giả chỉ ra rằng SK có khối lƣợng cao hơn là do hiện tƣợng glycosyl hóa. Hoạt tính SK đạt
3200 U/ml dịch nuôi cấy.
Năm 2009, Vellanki et al. sử dụng gene sk nối ghép xuôi chiều với promoter glyceraaldehyde -3-
phosphate dehydrogenase và biểu hiện trong P. pastoris với hoạt tính đạt 1120 U/ml.
Nhân dòng và biểu hiện trong Bacillus
Năm 1986, Klessen et al. biểu hiện sk trong Bacillus subtilis, hoạt tính SK bị giảm ở cuối pha
sinh trƣởng do các protease của chính B. subtilis tiết ra làm bất hoạt.
Năm 1994, Wong et al. sử dụng gene nhân dòng sẵn có để biểu hiện trong B. subtilis WB600 (đã
gây đột biến mất 6 protease ngoại bào). Kết quả cho thấy 10-20% SK tiết ra ngoài môi trƣờng bị
thoái hóa từ dạng 47 kDa thành 44 kDa, làm giảm hoạt tính sinh học của SK. Sự thoái hóa này là
do một số gốc amino acid kị nƣớc trong phân tử SK là đích của chymotrypsin (protease do tế bào
tiết ra). Do đó các tác giả đã tạo chủng đột biến pSKC-27 có glutamate tại vị trí 29 đƣợc thay
bằng lysine, SK thu đƣợc có hoạt tính tăng 2,5 lần.
Nhân dòng và biểu hiện trong các tế bào chủ khác
Năm 1985, Dao và Ferretti sử dụng vector pSA3 (kháng ery, chlo, tet) để biểu hiện SK trong S.
sanguis thu đƣợc protein có khối lƣợng phân tử 42 kDa nhƣng có hoạt tính sinh học nhƣ SK tự
nhiên. Kích thƣớc protein thấp hơn có thể là do kết quả của quá trình sau dịch mã.
Năm 2004, Kumar và Singh biểu hiện SK trong nấm men Sz. pombe đã bị đột biến mất protease
ngoại bào. Kết quả thu đƣợc SK biểu hiện ở dạng ngoại bào với năng suất 50-100%, đạt 2450
U/ml dịch nuôi cấy. Hiệu suất biểu hiện đạt 24,5 mg/L và hoạt tính riêng đạt 1581 U/mg protein.

Năm 2006, Sriraman et al biểu hiện SK trong L. lactic với promoter P170. SK thu đƣợc bị thủy
phân do tác động của môi trƣờng nuôi cấy. Ở môi trƣờng nuôi cấy có pH thấp, có glucose, acid
lactic sẽ tích tụ gây đáp ứng kháng acid cho tế bào làm giảm khả năng sản xuất streptokinase.
Khi cải thiện môi trƣờng nuôi cấy, tăng pH và nồng độ phosphate ban đầu làm tăng khả năng
tổng hợp SK lên 2,5 lần
Tại Việt Nam
Năm 2001-2002, Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng đã thực hiện một nhiệm vụ nghiên
cứu khoa học và phát triển công nghệ hằng năm của Sở Khoa học, mã số 240: “Nghiên cứu ứng
dụng điều trị bệnh nhồi máu cơ tim cấp bằng Streptokinase tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng”
(Sở khoa học và Công nghệ Hải Phòng).
Năm 2003, Lê Văn Nam và Lê Thị Cẩm Dung đã nghiên cứu cách điều trị khối huyết trong tai
biến mạch máu não. Các tác giả đã đƣa ra công thức và phác đồ điều trị khối huyết. Các thuốc
làm phân hủy huyết khối đƣợc thành lập trong lòng mạch máu, các thuốc này đa số hoạt động
theo cở chế kích hoạt plasmin, plasmin sẽ phân giải huyết khối. Các thuốc làm tan huyết khối
gồm streptokinase, urokinase, scu-PA, rTPA.
Năm 2004, Trần Minh Tâm et al. đã thực hiện đề tài nghiên cứu:“Điều trị tiêu sợi huyết bằng
streptokinase trong nhồi máu cơ tim thấp”. Tác giả nên nhận xét bƣớc đầu về sử dụng thuốc
streptokinase để điều trị tiêu sợi huyết cho 27 ca bị nhồi máu cơ tim ở Bệnh viện đa khoa tỉnh
Phú Yên từ 5/2001 đến 12/2004 cho tỷ lệ thành công là 63%. Theo dõi trong 30 ngày, bệnh nhân
phục hồi tốt, ít biến chứng, chi phí điều trị chấp nhận đƣợc.
Các nghiên cứu về các chất có bản chất tƣơng tự nhƣ nattokinase, lumbrokinase cũng rất hạn
chế.
II. PHƢƠNG PHÁP
- Các phƣơng pháp vi sinh vật.
- Các phƣơng pháp sinh học phân tử.
- Các phƣơng pháp hóa sinh.
IV. KẾT QUẢ.
1. Nhân dòng thành công gene mã hóa streptokinase nonhis từ DNA tổng số
của chủng Streptococcus pyogenes DT7.
2. Biểu hiện gene msk-nonhis với vector biểu hiện pET21a(+) trong tế bào E.

coli JM109. Protein biểu hiện đạt năng suất 72% protein tổng số, hoạt tính đạt
khoảng 10200 U/mg tế bào tƣơi.
3. Tinh sạch mSK-nonhis bằng phƣơng pháp phá siêu âm, dịch enzyme tinh
sạch có hoạt tính cao nhất đạt 11318 U/mg protein. Dịch enzyme đƣợc hoạt hóa
bằng Tween 20 (1,5%) có bổ sung 10% glycerol ở 4°C trong 6 sau khi xử lý bằng
guanidine có hoạt tính tăng 8 lần; hoạt tính cao nhất đạt 95463 U/mg protein.

References
Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Văn Nam and Lê Thị Cẩm Dung, Điều trị chống huyết khối trong tai biến mạch máu não.
Tạp chí Y học TP HCM, 2003. 7(1): p. 14-19.
2. Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn Thị Hiền, and Quyền Đình Thi, Biểu hiện gene mã hóa
streptokinase từ Streptococcus pyogenes DT17 trong Bacillus subtilis. Hội nghị 35 năm
thành lập Viện Công nghệ sinh học, 2010: p. 262-267.
3. Trần Minh Tâm, Lê Phải, Châu Khắc Toàn, Cao Văn Diệu, Nguyễn Thị Hồng Ngọc, and
Nguyễn Thành Huy, Điều trị tiêu sợi huyết bằng Streptokinase trong nhồi máu cơ tim cấp.
Tạp chí Y học thực hành, 2005. 8: p. 15-18.
4. Vũ Hồng Diệp, Nghiên cứu biểu hiện Streptokinase. Luận án tiến sĩ, Viện công nghệ sinh
học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, 2010.
5. Vũ Hồng Diệp, Nguyễn Thị Ngọc Dao, and Quyền Đình Thi, Nhân dòng và phân tích trình
tự gene mã hóa streptokinase từ chủng Streptococcus pyogenes DT7. Tạp chí CNSH, 2008.
6(4A): p. 757-763.

Tài liệu tiếng Anh
6. Avilan L, A Yarzabal, and C Jurgensen, Cloning, expression and purification of recombinant
streptokinase: partial characterization of the protein expressed in Escherichia coli. Braz J
Med Biol Res, 1997. 30(12): p. 1427-1430.
7. Babu PVC, VK Srinivas, VK Mohan, and E Krishna, Renaturation, purification and
characterization of streptokinase expressed as inclusion body in recombinant E. coli. J
Chromatogr, 2008. 861: p. 218-226.

8. Bajaj AP and FJ Castellano, Activation of human plasminogen by equimolar levels of
streptokinase. J Biol Chem, 1977. 252: p. 492–498.
9. Bradford MM, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
proteins utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-254.
10. Burket MW, MR Smith, TE Walsh, PS Brewster, and TD Fraker, Relation of effectiveness of
intracoronary thrombolysis in acute myocardial infarction to systemic thrombolytic state. Am
J Cardiol, 1985. 55: p. 1453-8.
11. Caballero AR, R Lottenberg, and K Johnston, Cloning, expression, sequence analysis, and
characterization of streptokinase secreted by porcine and equine isolates of Streptococcus
equisimilis. Infect Immun, 1999. 67(12): p. 6478-6486.
12. Christensen LR, Streptococcal fibrinolysin: a proteolytic reaction due to serum enzyme
activated by stretococcal fibrinolysin. J Gen Physiol, 1945. 28: p. 363-383.
13. Colin DM and L Dejan, Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to
2030. PloS Med, 2006. 3(11): p. 442.
14. Craven LL, Acetylsalicylic acid: possible preventive of coronary thrombosis. Ann West Med
Surg, 1950. 4: p. 95-99.
15. Dao ML and JJ Ferretti, Streptococcus Escherichia coli shuttle vector pSA3 and its use in the
cloning of streptococcal genes. Appl Environ Microbiol, 1985. 49(1): p. 115-119.
16. Estrada MP, L Hernandez, A Perez, P Rodriguez, R Serrano, R Rubiera, A Pedraza, G
Padron, W Antuch, DLJ Fuente, and L Herrera, High level expression of streptokinase in
Escherichia coli. Bio Technology, 1992. 10: p. 1138-1142.
17. Fletcher AP, N Alkjaersig, A Davies, M Lewis, J Brooks, W Hardin, W Landau, and ME
Raichle, Blood coagulation and plasma fibrinolytic enzyme system pathophysiology in
stroke. Stroke, 1976. 7: p. 337-348.
18. Fletcher AP, N Alkjaersig, and S Sherry, The maintenance of a sustained thrombolytic state
in man. I. Induction and effects. Clin Invest J 1959. 38: p. 1096-1110.
19. Fletcher AP, N Alkjaersig, FE Smyrniotis, and S Sherry, Treatment of patients suffering
from early myocardial infarction with massive and prolonged streptokinase therapy. Trans
Assoc Am Physicians, 1958. 71: p. 287-296.
20. Fletcher AP, S Sherry, N Alkjaersig, FE Smyrniotis, and S Jick, The maintenance of a

sustained thrombolytic state in man.II. Clinical observations on patients with myocardial
infarction and other thromboembolic disorders. Clin Invest J 1959. 38: p. 1111-1119.
21. Frans VW, B Jeroen, A Betriu, C Blomstrom, F Crea, V Falk, G Filippatos, K Fox, K Huber,
A Kastrati, A Rosengren, PG Steg, M Tubaro, F Verheugt, F Weidinger, and M Weis,
Management of acute myocardial infarction in patients presenting with persistent ST-
segment elevation. Eur Heart J, 2008. 29(23): p. 2909-2945.
22. Goyal D, G Sahni, and DK Sahoo, Enhanced production of recombinant streptokinase in
Escherichia coli using fed-batch culture. Bioresour Technol, 2009. 100(19): p. 4468-4474.
23. Hagenson MJ, KA Holden, KA Parker, PJ Wood, JA Cruze, M Fuke, TR Hopkins, and DW
Stroman, Expression of streptokinase in Pichia pastoris yeast. Enzyme Microb Technol,
1989. 11: p. 650-656.
24. Hager K. Prevent Heart Attack and Stroke with Potent Enzyme that Dissolves Deadly Blood
Clots in Hours, . 2002.
25. Hermentin P, T Cuesta-Linker, J Weisse, K Schmidt, M Knorst, M Scheld, and e al.,
Comparative analysis of the activity and content of different streptokinase preparations. Eur
Heart J 2005. 26(9): p. 933-40.
26. Hernandez L, P Rodriguez, A Castro, R Serrano, MP Rodriguez, R Rubiera, MP Estrada, A
Perez, J de la Fuente, and L Herrera, Determination of streptokinase activity by quantitative
assay. Biotecnol Apl, 1990. 7(2): p. 153-160.
27. Hoffman R, EJ Benz, SJ Shattil, B Furie, and HJ Cohen, Hematology: Basic Principles and
Practice 1991: Churchill Livingstone New York
28. Hubbard WN, The systemic toxic responses of patients to treatment with streptokinase
streptodornase. J Clin Invest, 1951. 30: p. 1171-4.
29. Ichinose A, K Takio, and K Fujikawa, Localization of the binding site of tissue-type
plasminogen activator to fibrin. J Clin Invest 1986. 78(1): p. 163-169.
30. Johnsen LB, K Poulsen, M Kilian, and TE Petersen, Purification and cloning of a
streptokinase from Streptococcus uberis. Infect Immun, 1999. 67: p. 1072-1078.
31. Johnson AJ, The lysis in rabbits of intravascular blood clots by the streptococcal fibrinolytic
system (streptokinase). Exp Med J, 1952. 95: p. 449-494.
32. Ju J, I Kheterpal, JR Scherer, C Ruan, CW Fuller, AN Glazer, and RA Mathies, Design and

synthesis of fluorescence energy transfer dye-labeled primers and their application for DNA
sequencing and analysis. Anal Biochem, 1995. 231(1): p. 131-40.
33. Klessen C and H Malke, Expression of the streptokinase gene from Streptococcus equisimilis
in Bacillus subtilis. J Basic Microbiol, 1986. 26(2): p. 75-81.
34. Ko JH, DK Park, IIC Kim, SH Lee, and SM Byun, High level expression and secretion of
streptokinase in Escherichia coli. Biotechnol Lett 1995. 17: p. 1019-1024.
35. Kubo M and A Nishi, Improved method for prourokinase refolding with inclusion body from
recombinant Escherichia coli. J Ferment Bioeng, 1995. 80(6): p. 622-624.
36. Kumar R and J Singh, Expression and secretion of a prokaryotic protein streptokinase
without glycosylation and degradation in Schizosaccharomyces pombe. Yeast, 2004. 21(16):
p. 1343-1358.
37. Kunamneni A, TT Abdelghani, and P Ellaiah, Streptokinase the drug of choice for
thrombolytic therapy. J. Thromb Thrombolysis, 2007. 23: p. 9-23.
38. Kuppusamy M, VK Srinivas, S Lahiri, K Ella, and GS Khatri, Recombinant streptokinase,
2006, Bharat Biotech International, Ltd.: USA. p. 1-14.
39. Lizano S and KH Johnston, Structural diversity of streptokinase and activation of human
plasminogen. Infect Immun, 2005. 73(7): p. 4451-4453.
40. Malke H and JJ Ferretti, Streptokinase: cloning, expression and excretion by Escherichia
coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1984. 81: p. 3557-3561.
41. Mathers CD, T Boerma, and DM Fat, Global and regional causes of death. Br Med Bull.,
2009. 92: p. 7-32.
42. Nikhil S and B Amit, A history of streptokinase use in acute myocardial infarction. Tex
Heart Inst J, 2007. 34(3): p. 318-27.
43. Pratap J, G Rajamohan, and KL Dikshit, Characteristics of glycosylated streptokinase
secreted from Pichia pastoris: enhanced resistance of SK to proteolysis by glycosylation.
Appl Microbiol Biotechnol, 2000. 53(4): p. 469-475.
44. Pupo E, BA Baghbaderani, V Lugo, J Fernandez, R Paez, and I Torrens, Two streptokinase
genes are expressed with different solubility in Escherichia coli W3110. Biotechnol Lett,
1999. 21: p. 1119-1123.
45. Reddy KN, Streptokinase-biochemistry and clinical application. Enzyme, 1988. 40: p. 79-89.

46. Reza NM, MM Hossein, B Mohammad, and C Mahmood, Cloning and overexpression of
active recombinant fusion streptokinase: A new approach to facilitate purification. Pakistan
J. of Bio. Sci, 2007. 10(13): p. 2146-2151.
47. Sanger F, S Nicklen, and AR Coulson, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Proc Natl Acad Sci U S A, 1977. 74(12): p. 5463-7.
48. Schmutzler R, F Heckner, P Kortge, J van der Loo, A Pezold, and H Poliwoda, Thrombolytic
therapy of recent myocardial infarction. I. Introduction, plan of trial, general clinical results.
Ger Med Mon, 1966. 11: p. 308-14.
49. Sherry S, A Titchener, L Gottesman, P Wasserman, and W Troll, The enzymatic dissolution
of experimental arterial thrombi in the dog by trypsin, chymotrypsin and plasminogen
activators. J Clin Invest, 1954. 33: p. 1303-1313.
50. Shi GY, BI Chang, SM Chen, DH Wu, and HL Wu, Function of streptokinase fragments in
plasminogen activation. Biochem J, 1994. 304(1): p. 235-241.
51. Sikri N and A Bardia, A history of streptokinase use in acute myocardial infarction. Tex
Heart Inst J, 2007. 34(3): p. 318-327.
52. Smith RAG, RJ Dupe, and J Green, Fibrinolysis with acyl-enzymes: a new approach to
thrombolytic therapy. Nature, 1981. 290: p. 505-508.
53. Sriraman K and G Jayaraman, Enhancement of recombinant streptokinase production in
Lactococcus lactis by suppression of acid tolerance response. Appl Microbiol Biotechnol,
2006. 72: p. 1202-1209.
54. Sumi H, H Hamada, and H Mihara, A novel strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the
vegetable cheese "natto" International 5. J Thromb Thrombolysis, Amsterdam, 1988. 2: p. 67.
55. Thomas A, Gaziano, A Bitton, S Anand, SA Gessel, and A Murphy, Growing epidemic of
coronary heart disease in low- and middle- income countries. Curr Probl Cardiol., 2010.
35(2): p. 72-115.
56. Tillett W and S Sherry, The effect in patients of streptococcal fibrinolysin (streptokinase) and
streptococcal desoxyribonuclease on fibrinous, purulent, and sanguinous pleural exudations.
Clin Invest J 1949. 28: p. 173-190.
57. Tillett WS and RL Garner, The fibrinolytic activity of hemolytic streptococci. J Exp Med,
1933. 58: p. 485–502.

58. Tillett WS, AJ Johnson, and WR McCarty, The intravenous infusion of the streptococcal f
ibrinolytic principle (streptokinase) into patients. J Clin Invest, 1955. 34: p. 169-185.
59. Tollefsen D, Blood coagulation. coagulation, 2009.
60. Vellanki RN, R Potumarthi, and LN Mangamoori, Constitutive expression and optimization
of nutrients for streptokinase production by Pichia pastoris using statistical methods. Appl
Biochem Biotechnol, 2009. 158(1): p. 25-40.
61. Vermeer F, ML Simoons, FW Bar, JGv Tijssen, RT Domburg, PW Serruys, and e al., Which
patients benef it most from early thrombolytic therapy with intracoronary streptokinase.
Circulation, 1986. 74: p. 1379-1389.
62. Wakeham N, S Terzyan, P Zhai, LA Loy, J Tang, and XC Zhang, Effects of deletion of
streptokinase residues 48-59 on plasminogen activation. Protein Eng, 2002. 15: p. 753-761.
63. Walley T, Y Dundar, R Hill, and R Dickson, Superiority and equivalence in thrombolytic
drugs: an interpretation. QJM, 2003. 96(2): p. 155-160.
64. Walter F, M Siegel, and H Malke, Nucleotide sequence of the streptokinase gene from a
group-G Streptococcus. Nucleic Acids Res, 1989. 17(3): p. 1261-1262.
65. Wang X, J Tang, B Hunter, and XC Zhang, Crystal structure of streptokinase beta-domain.
FEBS Lett, 1999. 459: p. 85-89.
66. Wong SL, R Ye, and S Nathoo, Engineering and production of streptokinase in a Bacillus
subtilis expression-secretion system. Appl Environ Microbiol, 1994. 60(2): p. 517-523.