Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế hFGF 2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR 2) tái tổ hợp từ escherichia coli

MỤC LỤC
MỤC LỤC ...................................................................................................................i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................vii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................ix
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................3
1.1. HỌ NHÂN TỐ TĂNG TRƢỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF (FIBROBLAST
GROWTH FACTOR) .................................................................................................4
1.1.1. Giới thiệu chung ................................................................................................4
1.1.2. Nhân tố tăng trƣởng FGF-2 ...............................................................................7
1.1.2.1. Cấu trúc của nhân tố tăng trƣởng FGF-2 .......................................................7
1.1.2.2. Hoạt tính sinh học của FGF-2 .......................................................................12
1.1.2.3. Các hƣớng ứng dụng của FGF-2 ....................................................................13
1.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli ..................................16
1.2.1. Giới thiệu chung ................................................................................................16
1.2.2. Các vị trí biểu hiện protein tái tổ hợp ...............................................................18
1.2.2.1. Biểu hiện ở tế bào chất ...................................................................................18
1.2.2.2. Biểu hiện ở chu chất .......................................................................................18
1.2.2.3. Tiết ra môi trƣờng ..........................................................................................19
1.2.3. Một số hệ thống cảm ứng biểu hiện ở E. coli ...................................................19
1.2.3.1. Hệ thống cảm ứng bởi IPTG ..........................................................................19
1.2.3.2. Hệ thống cảm ứng bởi L – arabinose .............................................................22
1.2.3.3. Hệ thống cảm ứng bởi muối ...........................................................................22

i

Luận văn thạc sĩ sinh học


1.3. TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP ..................................................................23

1.3.1. Tủa bằng muối...................................................................................................23
1.3.2. Sự thẩm tích ......................................................................................................23
1.3.3. Sắc ký ................................................................................................................23
1.3.3.1. Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography – IEC)...........................25
1.3.3.2. Sắc ký ái lực (Affinitive chromatography, AC) .............................................26
VẬT LIỆU-PHƢƠNG PHÁP .....................................................................................28
2.1. VẬT LIỆU ...........................................................................................................29
2.1.1. Thiết bị – Dụng cụ............................................................................................29
2.1.2. Hóa chất và môi trƣờng .....................................................................................30
2.1.2.1. Hóa chất .........................................................................................................30
2.1.2.2. Môi trƣờng .....................................................................................................34
2.1.3. Vật liệu sinh học................................................................................................34
2.1.3.1. Chủng vi sinh vật ...........................................................................................34
2.1.3.2. Plasmid ...........................................................................................................34
2.1.3.3. Thang chuẩn ...................................................................................................35
2.2. PHƢƠNG PHÁP ..................................................................................................36
2.2.1. Cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2.....................37
2.2.1.1. Thu nhận gen fgf-2 bằng phản ứng PCR ........................................................37
2.2.1.2. Tách chiết, thu nhận plasmid pET-His...........................................................37
2.2.1.3. Xử lý gen fgf2 và plasmid vector pET-His bằng enzyme cắt hạn chế ...........39
2.2.1.4. Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pET-fgf2 ..................................................39
2.2.1.5. Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α ......................................................40
2.2.1.6. Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 ..............................41
2.2.2. Cấu trúc chủng E. Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 ..........44
2.2.2.1. Thu nhận plasmid pET-fgf2 ...........................................................................44
2.2.2.2. Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E. coli BL21(DE3) ......................................44
2.2.2.3. Sàng lọc thể biến nạp bằng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc .............................44
ii

Luận văn thạc sĩ sinh học

2.2.3. Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong E. coli BL21(DE3) ...........44
2.2.3.1. Cảm ứng biểu hiện protein FGF-2 .................................................................44
2.2.3.2. Thu mẫu và xử lý mẫu ...................................................................................45
2.2.4. Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein
FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan ........................................................................................45
2.2.4.1. Các bƣớc chuẩn bị ..........................................................................................45
2.2.4.2. Lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2 ...............................................................47
2.2.4.3. Đánh giá hiệu quả lên men .............................................................................47
2.2.5. Tinh chế FGF-2 .................................................................................................48
2.2.5.1. Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation..............................................................48
2.2.5.2. Tinh chế bằng sắc ký ái lực heparin ...............................................................49
2.2.6. Các phƣơng pháp phân tích protein ..................................................................50
2.2.6.1. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ..................................................................50
2.2.6.2. Phƣơng pháp nhuộm gel điện di ....................................................................51
2.2.6.3. Kiểm tra bằng phƣơng pháp lai Western Blot ...............................................51
2.2.6.4. Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford...........................................53
2.2.6.5. Định lƣợng FGF-2 bằng phần mềm xác định đậm độ Quantity One ............54
KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN.............................................................................................56
3.1 Cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2.........................57
3.1.1. Thu nhận gen fgf2 bằng phản ứng PCR ............................................................57
3.1.2. Thu nhận và xử lý plasmid pET-His bằng 2 enzyme BamHI và NdeI .............58
3.1.3. Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α .........................................................59
3.1.4. Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 .................................60
3.1.5. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phƣơng pháp PCR và enzyme
cắt giới hạn ..................................................................................................................61
3.1.6. Kiểm tra giải trình tự gen fgf2 ...........................................................................63
3.2. Cấu trúc chủng E. coli BL21(DE3) biểu hiện protein fgf-2 ................................63
3.2.1. Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E. coli BL21(DE3) .........................................63

iii

Luận văn thạc sĩ sinh học


3.2.2. Sàng lọc thể biến nạp bằng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc ................................64
3.3. Xác nhận sự biểu hiện của protein tái tổ hợp FGF-2 trong chủng BL21(DE3) /
pET-fgf2 ......................................................................................................................65
3.4. Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF
-2 tái tổ hợp dạng tan...................................................................................................67
3.4.1. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng ...................................................................67
3.4.2. Khảo sát sự biểu hiện protein FGF-2 theo thời gian cảm ứng ..........................68
3.4.3. Khảo sát chu kì phá tế bào bằng áp suất cao .....................................................69
3.5. Tinh chế FGF-2 ....................................................................................................72
3.5.1. Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation.................................................................72
3.5.2. Tinh chế bằng sắc ký ái lực với heparin ...........................................................73
KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ ...............................................................................................76
KẾT LUẬN .................................................................................................................77
ĐỀ NGHỊ ....................................................................................................................77
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................78
PHỤ LỤC ....................................................................................................................82

iv

Luận văn thạc sĩ sinh học


Ket-noi.com dien dan giao duc

LỜI MỞ ĐẦU

Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) là một
protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể nhƣ
cân bằng nội mô, duy trì và tăng sinh tế bào thần kinh, chữa lành xƣơng bị tổn thƣơng,
kích thích hình thành tế bào bạch cầu và sự hình thành mạch máu mới từ mạch máu sẵn
có, kích thích sự tăng trƣởng của tế bào cơ mềm, ngăn chặn quá trình xơ hóa ở phổi,
chữa lành vết thƣơng và sửa chữa mô…
Do sự đa dạng về chức năng, FGF-2 đang đƣợc quan tâm nghiên cứu để ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực. Nhờ khả năng kích thích tăng sinh, ức chế biệt hóa, FGF-2
đang đƣợc sử dụng nhƣ là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy tế bào gốc phôi
ngƣời. Trong công nghệ mỹ phẩm, một số nghiên cứu cho thấy FGF-2 có khả năng làm
đen tóc, ngăn ngừa sự lão hóa da nên ngày càng đƣợc các hãng mỹ phẩm tin tƣởng và
bổ sung vào các bộ sản phẩm chăm sóc da, tóc. Bên cạnh đó, trong lĩnh vực y học, việc
sử dụng FGF-2 đã đem lại nhiều kết quả khả quan trong việc điều trị nhiều căn bệnh
nhƣ bệnh thiếu máu tim cục bộ, điều trị bỏng, ngăn ngừa sẹo lồi do phẫu thuật, chữa
bệnh viêm nha chu…
Trƣớc đây, sản phẩm FGF-2 thƣờng đƣợc thu nhận bằng cách tách chiết từ các
dòng tế bào động vật. Việc sản xuất FGF-2 bằng phƣơng pháp này đảm bảo về hoạt
tính của sản phẩm nhƣng sản lƣợng thấp và giá thành cao. Nhằm khắc phục những
nhƣợc điểm trên, ngƣời ta đã tiến đến việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ để sản xuất
nhân tố FGF-2. Do đặc điểm của FGF-2 là không có cấu nối disulfide nội phân tử và
không cần sự biến đổi sau dịch mã cho hoạt tính sinh học nên hệ thống chủng chủ
E.coli có thể đảm nhiệm việc sản xuất FGF-2 có hoạt tính thay cho các dòng tế bào
động vật.
Ở Việt Nam, FGF-2 chủ yếu đƣợc nhập từ các công ty nƣớc ngoài nên giá thành
rất cao (1mg protein FGF-2 ngƣời đƣợc sản xuất nhờ kĩ thuật gen có giá khoảng 1260

-1-

Luận văn thạc sĩ sinh học

USD, hãng ProSpec) gây khó khăn trong việc ứng dụng. Do đó, việc sản xuất FGF-2
trong nƣớc nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng trên diện rộng với giá thành thấp cần đƣợc
quan tâm đầu tƣ.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Tạo dòng, biểu
hiện và tinh chế hFGF-2 (human fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp từ Escherichia
coli” nhƣ là bƣớc đầu để nghiên cứu, sản xuất FGF-2 hiệu quả, kinh tế cho những ứng
dụng trong nƣớc. Tuy nhiên, một trong những hạn chế của việc sử dụng E. coli làm tế
bào chủ là protein thƣờng đƣợc tạo ra dƣới dạng thể vùi không có hoạt tính, cần phải
trải qua quá trình gấp cuộn phức tạp, tốn kém. Do vậy, luận văn này đƣợc thực hiện với
mục đích xây dựng quy trình sản xuất FGF-2 trong đó sử dụng chủng chủ E. coli để
cảm ứng biểu hiện protein dạng tan trong tế bào chất. Đây là hƣớng chiến lƣợc hiệu
quả và triển vọng cho phép sản xuất FGF-2 có hoạt tính một cách đơn giản với hiệu
suất cao, giúp hạ giá thành sản phẩm.
Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện luận văn với những nội dung sau:
- Tạo dòng vi khuẩn E. coli DH5α mang vector pET-fgf2.
- Tạo dòng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) mang vector pET-fgf2 có khả năng biểu
hiện rhFGF-2 trong tế bào chất.
- Tiến hành lên men và thu nhận đƣợc protein rhFGF-2 từ 1L dịch lên men, đánh
giá hiệu quả lên men.
- Tinh chế protein rhFGF-2 từ dịch lên men bằng sắc ký trao đồi ion và sắc kí ái
lực; đánh giá độ tinh sạch và hiệu suất của quá trình tinh chế.

-2-

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tài liệu tham khảo

TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. HOÀNG VĂN QUỐC CHƢƠNG. (2004). Kỹ thuật lên men công nghiệp. Khoa
Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí
Minh. Trang 3-4, 9-20.
2. NGUYỄN THỊ MỸ TRINH. (2011). Nghiên cứu sản xuất protein FGF-2
(Fibroblast growth factors-2) tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli. Khoa Sinh
học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
3. TRẦN LINH THƢỚC, ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO. (2010) Thực tập kỹ thuật
thao tác trên gen. Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc
gia Thành phố Hồ Chí Minh.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
4. A. BIKFALVI, S. KLEIN, G. PINTUCCI ET AL., (1997) “Biological Roles of
Fibroblast Growth Factor-2,” Endocrine Reviews, vol. 18, no. 1, pp. 26-45.
5. A. LOGAN, A. BAIRD, (1996) "Fibroblast growth factors," Growth Factors and
Cytokines in Health and Disease, L. Derek and B. Carolyn, eds., pp. 147-178: JAI.
6. A. BEENKEN, M. MOHAMMADI. (March 2009). The FGF family: biology,
pathophysiology and therapy, Nature Reviews Drug Discovery vol. 8, 235-253.
7. BAIRD, A., & KLAGSBRUN, M. (1991). The Fibroblast growth factor family.
New York, N.Y., New York Academy of Sciences.
8. B. ENSOLI, C. SGADARI, G. BARILLARI ET AL. (2003), "Chapter 31 - The
fibroblast growth factors," The Cytokine Handbook (Fourth Edition), W. T. Angus and
T. L. Michael, eds., pp. 747-XVII, London: Academic Press.
9. CHOI, J., & LEE, S. (2004). Secretory and extracellular production of recombinant
proteins using Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 64, 625-635.

- 78 -

Luận văn thạc sĩ sinh học

Tài liệu tham khảo

10. C. KINSLAND, (2010) "9.19 - Bacterial Protein Overexpression Systems and
Strategies," Comprehensive Natural Products II, M. Editors-in-Chief: Lew and L.
Hung-Wen, eds., pp. 695-721, Oxford: Elsevier.
11. C. RYAN, S. ALEXANDER, R. GREGORY, ET AL. (2011), Cloning and
Expression of Human Recombinant FGF-2 Isoforms.
12. E. F. F. JOSEPH SAMBROOK, TOM MANIATIS, (2001) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual.
13. ELISSAVET KARDAMI, KAREN A. DETILLIEUX, SARAH K. JIMENEZ,
PETERA. CATTINP. (2006). Fibroblast Growth factor-2 As a therapeutic agent
against heart disease. Myocardial ischemia, Basic Science for the Cardiologist.
21, 145-166
14. GARKE G, DECKWER WD, & ANSPACH FB. (2000). Preparative two-step
purification of recombinant human basic fibroblast growth factor from high-celldensity cultivation of Escherichia coli. Journal of Chromatography. B, Biomedical
Sciences and Applications. 737, 1-2.
15. GE HEALTHCARE. (2007). Recombinant Protein Purification Handbook:
Principles and Methods. Uppsala, GE Healthcare Bio-Sciences AB.
16. G. HANNIG, S. C. MAKRIDES, “Strategies for optimizing heterologous protein
expression in Escherichia coli,” Trends in biotechnology, vol. 16, no. 2, pp. 54-60,
1998.
17. I. DELRIEU, (2000) “The high molecular weight isoforms of basic fibroblast
growth factor (FGF-2): an insight into an intracrine mechanism,” FEBS Letters, vol.
468, no. 1, pp. 6-10.
18. J. P. COOKE, R. BHATNAGAR, A. SZUBA ET AL., (2000) “Fibroblast growth
factor as therapy for critical limb ischemia: a case report,” Vascular Medicine, vol. 4,
no. 2, pp. 89-91.

- 79 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tài liệu tham khảo

19. L. MACFARLANE, P. R. MURPHY, (2011) “FGF2 (fibroblast growth factor 2
(basic)),” Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology, pp. 169182.
20. L. MACFARLANE, Y. GU, A. G. CASSON ET AL., (2010) “Regulation of
Fibroblast Growth Factor-2 by an Endogenous Antisense RNA and by Argonaute-2,”
Molecular Endocrinology, vol. 24, no. 4, pp. 800-812.
21. MAI OKADA-BAN, JEAN PAUL THIERY, JACQUELINE JOUANNEAU.
(2000). Molecules in focus Fibroblast growth factor-2. The International Journal of
Biochemistry & Cell Biology. 32, 263 – 267
22. MAKRIDES, S. C. (1996). Strategies for Achieving High-Level Expression of
Genes in Escherichia coli. Microbiological reviews. 60, 512-538.
23. M. OKADA-BAN, J. P. THIERY, AND J. JOUANNEAU, (2000) “Fibroblast
growth factor-2,” The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol.
32, no. 3, pp. 263-267.
24. NOVAGEN (2003). pET System Manual, 10th edition.
25. PADERA, R. F. (2000). Cell signaling by fibroblast growth factor 2: investigations
into interactions between fibroblast growth factor 2, fibroblast growth factor receptor
1 and heparin-like glycosaminoglycans. Thesis (M.D. with honors), Harvard
University, MIT Division of Health Sciences and Technology.
26. POLNASZEK N, KWABI-ADDO B, PETERSON LE, OZEN M, GREENBERG
NM, ORTEGA S, BASILICO C, & ITTMANN M. (2003). Fibroblast growth factor 2
promotes tumor progression in an autochthonous mouse model of prostate cancer.
Cancer Research.63, 5754-60.
27. Quantity One User Guide for Version 4, Windows and Macintosh. Bio-Rad
Technical Service Department.

28. ROSENBERG, I. M. (2004). Protein analysis and purification benchtop
techniques. Boston, Birkhäuser.

- 80 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tài liệu tham khảo

29. RUEL M, LAHAM RJ, PARKER JA, POST MJ, WARE JA, SIMONS M, &
SELLKE FW. (2002). Long-term effects of surgical angiogenic therapy with fibroblast
growth factor 2 protein. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 124, 2834.
30. SØRENSEN HP, & MORTENSEN KK. (2005). Advanced genetic strategies for
recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 115,
113-28.
31. TERPE K, IBA GmbH. (2002) Overview of bacterial expression systems for
heterologous protein production:from molecular and biochemical fundamentals to
commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 2006 Sep;72(2):211-22.
32. VENKATARAMAN, G. R., RAHUL; SASISEKHARAN, V.; SASISEKHARAN,
RAM. (1970). Molecular characteristics of fibroblast growth factor–fibroblast growth
factor receptor–heparin-like glycosaminoglycan complex. The National Academy of
Sciences.
33. WANG, D. I. K. (2000). The effects of fibroblast growth factor 2 on the early
stages on in vitro endothelial wound repair. Ottawa, National Library of Canada
34. Y.-R. YUN, J. E. WON, E. JEON ET AL., (2010) “Fibroblast Growth Factors:
Biology, Function, and Application for Tissue Regeneration,” Journal of Tissue
Engineering, vol. 1, no. 1.

TÀI LIỆU TỪ INTERNET

35. />36. />
- 81 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

CHƢƠNG I.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

-3-

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

1.1. HỌ NHÂN TỐ TĂNG TRƢỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF (FIBROBLAST
GROWTH FACTOR)
1.1.1. Giới thiệu chung
Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF đƣợc Armelin tìm thấy trong dịch
chiết tuyến yên vào năm 1973. Năm 1974, Gospodarowicz công bố nghiên cứu tìm
thấy nhân tố tăng trƣởng này trong dịch chiết não bò. Nghiên cứu này cũng tiến hành
thử nghiệm hoạt tính sinh học và kết luận protein đƣợc tìm thấy có tác dụng làm tăng
sinh các nguyên bào sợi. Sau đó, Gospodarowicz tinh chế phân đoạn dịch chiết đƣợc
tìm thấy ở pH acid và basic. Thí nghiệm đã cô lập đƣợc hai dạng FGF khác nhau tƣơng
ứng với mỗi phân đoạn pH. Nhân tố tăng trƣởng thu nhận đƣợc ở pH acid đƣợc gọi là
FGF-1 còn nhân tố tăng trƣởng thu nhận ở pH bazơ đƣợc gọi là FGF-2. Hai loại
protein có độ tƣơng đồng cao về trình tự amino acid. Hiện nay, trên 20 thành viên của

họ nhân tố tăng trƣởng FGF đã đƣợc tìm thấy và nghiên cứu về cấu trúc, hoạt tính… để
ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau [5, 8].
Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi (FGF) đƣợc tìm thấy ở rất nhiều loài, từ
giun tròn đến con ngƣời. Ở động vật có xƣơng sống, trên 20 thành viên của họ nhân tố
tăng trƣởng FGF đã đƣợc tìm thấy với khối lƣợng phân tử từ 17 đến 34 kDa. Có 18 loại
nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi (FGF1–FGF10 and FGF16–FGF23) đƣợc phân
vào sáu họ nhỏ dựa vào sự tƣơng đồng trình tự cũng nhƣ sự phát sinh giống loài: FGF1
và FGF2; FGF3, FGF7, FGF10, FGF22; FGF4, FGF5 và FGF6; FGF8, FGF17và
FGF18; FGF9, FGF16 và FGF20; FGF19, FGF21 và FGF23. Những nhân tố FGFs
không đƣợc xếp vào họ nào (FGF11-FGF14) có sự tƣơng đồng trình tự cao với họ FGF
nhƣng không gắn đƣợc lên thụ thể của FGF và vì thế không đƣợc coi là thành viên của
họ FGF (nhƣ FGF15 tìm thấy ở chuột là dạng tƣơng đồng với FGF19 ở ngƣời). FGF
hầu hết là những nhân tố cận tiết (paracrine), có vai trò trong sự hình thành mô và các
cơ quan ở những giai đoạn phát triển của phôi (năm phân họ FGF đầu tiên đều nằm
trong nhóm này). Ngƣợc lại, phân họ cuối cùng gồm FGF19, FGF21, FGF23 có vai trò

-4-

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

nhƣ những nhân tố nội tiết (endocrine), có vai trò điều hòa sự cân bằng acid mật,
cholesterol, glucose, vitamin D và phosphate trong cơ thể [6].
Phần lớn các gen fgf nằm rải rác trên toàn bộ gen. Ở ngƣời, 22 gen fgf và vị trí
của chúng (trừ FGF-16) đã đƣợc xác định. Nhiều gen của protein FGF đƣợc nhóm lại
trên cùng một nhiễm sắc thể, ví dụ nhƣ FGF-3, FGF-4 và FGF-19 có gen nằm ở nhiễm
sắc thể số 11, cánh dài, cách nhau lần lƣợt là 40 và 10kb. Điều này cho thấy các gen
mã hóa cho họ protein FGF đƣợc tạo nên bởi cơ chế nhân đôi, chuyển vị gen và nhiễm

sắc thể trong quá trình tiến hóa [8, 18].
Họ nhân tố tăng trƣởng FGF không những tƣơng đồng cao về trình tự amino
acid (13-71%) mà cấu trúc gen của chúng cũng đƣợc bảo tồn cao giữa các loài động
vật có xƣơng sống. Các protein thuộc họ nhân tố tăng trƣởng này có ái lực cao với
heparan sulfate proteoglycan. Sự tƣơng tác với heparan sulfate giúp hoạt hóa một trong
bốn loại receptor của FGF trên bề mặt tế bào [7, 17].

Hình 1.1. Sơ đồ các thành phần trong chuỗi polypeptide của FGF [8].
Tất cả các FGF đều có những peptide tín hiệu. Tuy nhiên, FGF9, 16 và 20 đƣợc
tiết thông qua mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi; còn FGF1 và FGF2 đƣợc tiết theo
những con đƣờng riêng biệt độc lập nhau. Các họ FGFs có một vùng lõi tƣơng đồng
bao gồm 120 – 130 amino acids xếp trật tự tạo thành 12 phiến β không song song (β1β12) nối với nhau bằng những đầu carboxyl và amino. Vị trí gắn của Heparan sulphate
glucosaminoglycan (HSGAG) gọi là các HBS nằm ở bên trong lõi FGF bao gồm một
vòng nối β1-β2 và phần cầu nối giữa β10-β12. Đối với những FGFs cận tiết, những
-5-

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

nhân tố hình thành các HBS là các bề mặt tích điện dƣơng và giáp nhau. Ngƣợc lại, các
HBS của phân họ FGF19, 21 và 23 chứa một trình tự hình thành bởi vòng nối β1-β2 và
phần cầu nối giữa β10-β12 làm hạn chế vùng HSGAG gắn lên lõi FGF, nên những
phân họ này đƣợc tạo ra theo cơ chế nội tiết [6].
Họ nhân tố tăng trƣởng FGF là một họ protein đa chức năng. Trong quá trình
phát triển phôi, FGF có nhiều vai trò trong điều hòa sự tăng sinh tế bào, di chuyển và
biệt hóa. Trong cơ thể trƣởng thành, họ protein FGF là các yếu tố cân bằng nội môi.
Ngoài ra họ protein này còn có chức năng sửa chữa các mô, đáp ứng với các tổn
thƣơng. Một nhóm nhỏ các protein thuộc họ FGF biểu hiện ở các mô trƣởng thành có

vai trò quan trọng trong dẫn truyền tín hiệu thần kinh trong hệ thần kinh trung ƣơng và
ngoại vi. Tuy nhiên, khi biểu hiện bất thƣờng, các nhân tố tăng trƣởng này có thể gây
ung thƣ [5, 8].
Bảng 1.1. Các chức năng cơ bản của họ nhân tố FGF [34].
Chức năng

Phân họ

Tế bào đích

Tăng sinh tế bào

FGF-1, FGF-2

Tế bào mỡ tiền thân
Tế bào biểu mô, tế bào nội mô, tế
bào gốc thần kinh

FGF-4

Tế bào gốc lá phôi

FGF-7, FGF-10

Tế bào biểu mô

FGF-18

Tế bào tạo xƣơng, tế bào sụn,
hủy cốt bào

Sự di trú tế bào

Sự biệt hóa tế bào

FGF-2

Tế bào thần kinh đệm, tế bào cơ

FGF-4

Tế bào cơ

FGF7

Tế bào nội mô, tế bào sừng

FGF8

Tế bào mào thần kinh

FGF1, FGF2

Tế bào thần kinh biểu mô

FGF7

Tế bào sừng

-6-

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

Sự hình thành mạch

FGF20

Tế bào gốc khỉ

FGF1, FGF2

Tế bào biểu mô

1.1.2. Nhân tố tăng trƣởng FGF-2
1.1.2.1. Cấu trúc của nhân tố tăng trƣởng FGF-2

Hình 1.2. Cấu trúc gene mã hóa protein FGF-2[17]
Gen mã hóa FGF-2 ngƣời nằm trên vùng q26-27 của nhiễm sắc thể số 4. Gen
dài khoảng 71kb gồm một vùng không dịch mã 5’UTR (Untranslated Region), 3 exon,
2 intron và vùng không dịch mã lớn 3’UTR (hình 1.2). Vùng không dịch mã 5’UTR và
3’UTR chứa các yếu tố điều hòa sự biểu hiện nhân tố tăng trƣởng FGF-2, mật độ tế
bào, các chất dẫn truyền thần kinh, con đƣờng truyền tín hiện thứ cấp…[17, 20].

-7-

Luận văn thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

Hình 1.3. Cấu trúc ba chiều của FGF-2[6].
FGF-2 có hình dạng gần giống với một hình chóp tam giác. Mỗi mặt bên hợp
thành bởi hai chuỗi β. Ba mặt bên của hình chóp hình thành một khoang trống do sáu
chuỗi β song song ngƣợc chiều nhau tạo thành. Phần đáy của hình chóp gồm thêm sáu
chuỗi β. Nhƣ vậy, toàn bộ phân tử FGF-2 đƣợc cấu tạo bởi 12 chuỗi β xếp song song
ngƣợc chiều nhau (hình 1.3). FGF-2 đƣợc tìm thấy lần đầu tiên là dạng protein có 146
amino acid với trọng lƣợng phân tử khoảng 16,5kDa đƣợc phân lập từ tuyến yên. Khi
cDNA của FGF-2 đƣợc tạo dòng, codon AUG đƣợc xác định nhƣ là codon mở đầu cho
quá trình dịch mã cho protein gồm 155 amino acid. Ngoài ra không còn tìm thấy bất cứ
codon AUG nào khác ở thƣợng nguồn mRNA. Vì vậy, codon AUG đƣợc cho là codon
mở đầu cho quá trình dịch mã. Tuy nhiên, dựa vào trình tự cDNA tìm thấy trong não
lợn, não chuột, gan, phôi ngƣời, tuyến tiền liệt và một số tế bào đƣợc nuôi cấy khác,
ngƣời ta nhận thấy rằng phân tử FGF-2 trên thực tế có dài hơn hoặc ngắn hơn kích
trƣớc đây. Các dạng có ngắn hơn đƣợc cho là kết quả của việc phân giải dạng 155
amino acid. Các dạng dài hơn và có trọng lƣợng phân tử lớn hơn (196, 201, và 210
amino acid) đã đƣợc chứng minh thông quá việc phân tích phiên mã/dịch mã in vitro.
Và kết quả cho thấy codon CUG ở đầu 5’ so với codon AUG (vị trí khởi đầu phiên mã
dạng FGF-2 gồm 155 amino acid) đƣợc sử dụng làm codon mở đầu cho quá trình dịch
mã các dạng FGF-2 có trọng lƣợng phân tử lớn này [4, 5, 11].

-8-

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

Kết quả của quá trình dịch mã này sẽ tạo ra 5 dạng protein FGF-2 khác nhau với
các trọng lƣợng phân tử và đặc điểm khác nhau. Khi cDNA FGF-2 đƣợc biểu hiện
trong tế bào, dạng mở đầu bằng codon AUG có trọng lƣợng phân tử thấp (LMW) là
18kDa. Dạng còn lại đƣợc mở đầu bằng codon CUG có trọng lƣợng phân tử cao
(HMW) lần lƣợt là 22; 22,5; 24; và 34kDa [23].

Hình 1.4. Các dạng FGF-2 được tạo thành [23].
Sự khác biệt về cấu trúc giữa FGF-2 có trọng lƣợng phân tử lớn với FGF-2 có
trọng lƣợng 18kDa là sự kéo dài của đầu N. Dạng trọng lƣợng phân tử lớn có chứa chín
trình tự lặp lại Gly-Arg (hình 1.4). Trong đó, ít nhất sáu arginines trong motif Glu-Arg
đã đƣợc methyl hóa. Chƣa có nghiên cứu nào về ảnh hƣởng của những trình tự
arginines đã đƣợc methyl hóa này nhƣng nó có thể ảnh hƣởng đến sự di chuyển hay ở
lại trong nhân của FGF-2 khi vận chuyển qua màng nhân. Điều này lý giải phần nào
nguyên nhân FGF-2 trọng lƣợng phân tử thấp tồn tại chủ yếu trong tế bào chất và có
vai trò tác động theo cơ chế cận tiết (paracrine) và tự tiết (autocrine). Trong khi đó,
FGF-2 trọng lƣợng phân tử cao tồn tại trong nhân, trong các tiểu phần ribosom và có
vai trò tác động theo cơ chế nội tiết (endocrine) [7, 19, 21].
Kết quả sắp gióng cột các trình tự amino acid của FGF-2 và FGF-1 cho thấy có
độ tƣơng đồng cao về trình tự amino acid (53%), do đó, dạng gấp cuộn của hai phân tử

-9-

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

này cũng giống nhau. Ngoài ra, các amino acid bảo tồn của họ protein FGF đƣợc tìm
thấy trong vùng lõi của FGF-2. Điều này củng cố thêm dự đoán rằng các thành viên
khác thuộc họ protein FGF sẽ có cấu trúc tƣơng tự với FGF-2 [6, 21].

Các vị trí tích điện dƣơng (Lys-138, Lys-134, Lys-128, Arg-129, Lys-144) trên
protein FGF-2 đƣợc xác định là vị trí gắn heparin của protein FGF. Vị trí gắn receptor
của protein đƣợc tạo thành nhờ đoạn peptide 115-124 (chứa Tyr-123 and Trp-124) trên
protein FGF-2. Trên cấu trúc không gian 3 chiều, phân tử FGF có hai gốc cysteine
(Cys-78 và Cys-96) đƣợc lộ ra ngoài và hai gốc cysteine khác (Cys-34 và Cys -101)
đƣợc quay vào phía bên trong lõi kị nƣớc. Do đó, bốn cysteine có thể tạo thành hai cầu
nối diusulfide. Tuy nhiên, khi phân tích cấu trúc tinh thể thì khoảng cách giữa hai cặp
cysteine này quá xa để có thể hình thành cầu nối bội phân tử nhƣng có khả năng hình
thành cầu nối liên phân tử [7, 19].
Phân tử FGF-2 tích điện dƣơng ở vị trí Lys (vị trí gắn với heparin), sinh ra năng
lƣợng trong phân tử, làm cấu trúc của protein không ổn định. Những phân tử tích điện
âm nhƣ heparin tƣơng tác với những vị trí này, làm cho FGF-2 trở nên ổn định hơn,
bảo vệ FGF-2 chống lại tác động của nhiệt độ, pH cũng nhƣ tác động của protease. Do
đó, có thể kết luận rằng, những gốc sulfate trên heparin giúp ổn định hoạt tính của
FGF-2. Hơn nữa, khi có những ion sulfate tồn tại trong dung dịch, nó cũng gắn vào các
vị trí lysine trên FGF và đóng vai trò giúp ổn định hoạt tính của protein này giống nhƣ
heparin. Tuy nhiên, cả ion sulfate và heparin đều không ngăn đƣợc việc hình thành cầu
nối disulfide nội/ngoại phân tử của các cystein tự do trong protein. Ngoài ra, cũng do
có khả năng tƣơng tác đặc hiệu với heparin nên chất này thƣờng đƣợc sử dụng để tinh
chế FGF-2 bằng phƣơng pháp sắc kí ái lực [25, 32].
Sự tƣơng tác giữa heparin và FGF-2 còn làm các phân tử này gắn lại với nhau
tạo các cấu trúc dimer và tetramer. Cơ chế heparin đóng góp vào việc hoạt hóa các
receptor của FGF-2 vẫn chƣa đƣợc biết rõ. Sự dimer hóa của FGF-2 là điều kiện cần
thiết để FGF-2 gắn và hoạt hóa các receptor của chúng. Heparin là một phân tử
glycoaminoglycan đƣợc sulfate hóa. Một đơn vị heparin disaccharide cơ bản của chuỗi
- 10 -

Luận văn thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

heparin bao gồm phân tử L-iduronic acid (Idu) và D-glucosamine (GlcN) nối với nhau
bởi cầu nối α(1-4) glycoside (hình 1.5). Một đơn vị heparin disaccharide có 3 nhóm
sulfate, một nhóm sulfate liên kết với gốc 2-hydroxyl của Idu và hai nhóm sulfate còn
lại liên kết với nhóm 2-amino và 6-hydroxyl của GlcN. Heparin có dạng chuỗi xoắn
quay về bên phải trong đó các đơn vị cấu tạo nên chuỗi heparin lệch nhau một góc 180o
[25, 32].

Hình 1.5. Đơn vị heparin saccharide của chuỗi heparin [32].
Các nghiên cứu cho thấy, chuỗi bên của nhóm các amino acid Asn-27, Arg-120,
Lys-125 tạo thành cầu nối hydrogen với nhóm sulfate liên kết với gốc 2-hydroxyl của
chuỗi heparin [25].
Ngoài tác dụng tƣơng tác với FGF-2 để tạo cấu trúc dimer và tetramer giúp
FGF-2 có thể gắn với receptor của nó với ái lực cao hơn, heparin còn bảo vệ nhân tố
tăng trƣởng FGF-2 khỏi sự bất hoạt do nhiệt hoặc acid và sự phân giải protein (hình
1.6) [25].
FGF-2 có điểm đẳng điện pI = 9,6. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy FGF-2
bền ở pH 7 [25]. Với giá trị pI cực đoan nhƣ vậy nên việc tinh chế FGF-2 bằng sắc kí
trao đổi ion dễ dàng hơn so với các protein có pI gần pH trung tính.

- 11 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

Hình 1.6. Cấu trúc dimer dạng cis (a), dimer dạng trans (b) và tetramer (c)
của FGF (hình tròn)và chuỗi heparin [25].

1.1.2.2. Hoạt tính sinh học của FGF-2
FGF-2 là một nhân tố tăng trƣởng đa chức năng, nó có vai trò trong sự tăng
sinh, di chuyển và biệt hóa tế bào. FGF-2 kích thích tăng sinh nguyên bào sợi, nguyên
bào cơ, nguyên bào xƣơng, tế bào thần kinh, tế bào nội mô, tế bào sừng…. Trong phôi
sớm, FGF-2 có vai trò biệt hóa các mô ngoại phôi bì thành các mô trung phôi, duy trì
tính đa năng của tế bào. FGF-2 cũng có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành
mạch máu nhờ khả năng tăng sinh các tế bào nội mô mạch máu, chữa lành vết thƣơng
và sửa chữa mô. FGF-2 là một chất kích thích phân bào mạnh trên nhiều loại tế bào có
nguồn gốc từ trung phôi bì và thần kinh ngoại bì. Ở cấp độ hệ cơ quan, FGF-2 cũng
đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển các hệ cơ quan khác nhau (bảng 1.2). FGF2 kích thích các nguyên bào sợi tăng sinh tạo mô hạt lấp đầy khoảng trống do vết
thƣơng gây ra trong quá trình làm lành vết thƣơng. FGF-2 tiết ra bởi những tế bào nội
mô lót bên trong thành mạch tác động theo cơ chế autocrine kích thích tế bào nội mô
thành mạch phân bào, tổ chức các tế bào mới tạo thành theo cấu trúc dạng hình ống và
đóng vai trò là chất hóa hƣớng động giúp hình thành mạch máu mới [4, 11, 34].
Gần đây, đã tìm thấy nhiều chất kích thích tế bào nội mô phân bào với khối
lƣợng phân tử 13-18kDa, có ái lực cao với heparin và điểm đẳng điện basic. Những
chất kích thích phân bào đó bao gồm nhân tố tăng trƣởng tế bào hình sao, nhân tố tăng
trƣởng gắn β heparin và các nhân tố tăng trƣởng từ tế bào máu, sụn, võng mạc, đại
thực bào, vùng dƣới đồi… đều là các dạng của FGF-2, chỉ khác nhau ở đầu N. Quá

- 12 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

trình xử lý nhân tố tăng trƣởng FGF-2 ở các mô khác nhau với các dạng protease đặc
trƣng cho từng mô đã tạo nên nhiều dạng FGF-2 nhƣ đã liệt kê ở trên. Tuy chức năng
của FGF-2 trong môi trƣờng invivo vẫn chƣa đƣợc biết rõ nhƣng những tính chất của

FGF-2 trong điều kiện nghiên cứu in vitro cho thấy FGF-2 có vai trò quan trọng trong
hình thành mạch máu mới, làm lành vết thƣơng và có khả năng gây ung thƣ nếu biểu
hiện bất thƣờng [26, 29, 33].
Bảng 1.2. Chức năng của FGF-2 ở các hệ cơ quan khác nhau [4].
Cơ quan

Chức năng

Não

Duy trì và biệt hóa tế bào thần kinh

Mạch máu

Hình thành mạch, tăng sinh tế bào cơ trơn
Hạn chế xơ vựa động mạch và điều hòa huyết áp

Phổi

Phân nhánh hình thái, ngăn ngừa xơ hóa

Chi

Phát triển chi

Cơ

Hình thành cơ

Xƣơng

Chữa lành xƣơng tổn thƣơng, hình thành sụn

Quá trình tạo máu

Kích thích tạo bạch cầu hạt, tăng tế bào nhân khổng lồ,
duy trì tế bào gốc
Chống lại quá trình apoptosis

Hệ sinh sản

Tạo tinh trùng

Mắt

Duy trì tế bào tiếp nhận ánh sáng và truyền tín hiệu

Da

Hình thành hắc tố da
Hình thành tế bào sừng
Sửa chữa mô

1.1.2.3. Các hƣớng ứng dụng của FGF-2
a) Trong nghiên cứu
- Vai trò của FGF-2 trong việc nuôi tế bào gốc phôi người

- 13 -

Luận văn thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

Khi nuôi tế bào gốc phôi ngƣời, cần bổ sung các nhân tố tăng trƣởng nhƣ FGF-2,
activin A, TGFβ1, Wnt1, Wnt3… vào môi trƣờng nuôi để ức chế sự biệt hóa tế bào.
Trong tất cả các cách nuôi tế bào gốc phôi, FGF-2 là thành phần không thể thiếu trong
môi trƣờng.
Ngoài ra, FGF-2 còn đƣợc tạo ra bởi chính tế bào gốc phôi ngƣời. FGF-2 tạo
thành tác động trở lại lên tế bào bằng hai cách. Nếu FGF-2 có trình tự tín hiệu giúp
điều hòa sự biểu hiện của các gen liên quan đến kiểu hình sơ khai của tế bào. Cơ chế
tác động của dạng FGF-2 này đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu. Đối với các FGF-2 không
gắn thêm các trình tự tín hiệu sẽ đƣợc tiết ra ngoài tế bào và tƣơng tác với các thụ thể
giúp tế bào gốc phôi ngƣời tăng sinh trong tình trạng không biệt hóa.
Hiện nay, cách nuôi tế bào gốc phôi trên môi trƣờng xác định trong đó có bổ sung
các nhân tố tăng trƣởng đƣợc ƣu tiên sử dụng hơn khi nuôi tế bào dùng cho các ứng
dụng trong y học vì tránh đƣợc nguy cơ nhiễm chéo mầm bệnh từ lớp tế bào đồng nuôi
cấy. Các nghiên cứu cho thấy việc kết hợp giữa FGF-2 với các nhân tố tăng trƣởng
khác noggin, activin A… giúp duy trì trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc phôi khi
nuôi cấy tế bào gốc phôi trong khoảng thời gian dài [4, 34].
Nhƣ vậy, trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc ngƣời đƣợc duy trì nhờ nhân tố
tăng trƣởng FGF-2. Cơ chế duy trì trạng thái không biệt hóa của FGF-2 trên tế bào gốc
phôi ngƣời cần đƣợc nghiên cứu cụ thể để có thể tối ƣu hóa quy trình nuôi loại tế bào
gốc này [4, 34].
b) Trong y học
- Ngăn ngừa hình thành sẹo lồi
Sự hình thành sẹo lồi đƣợc cho là do tình trạng tăng sinh quá mức của nguyên
bào sợi cơ và mô đàn hồi của da tại lớp trung bì trong quá trình làm lành các tổn
thƣơng trên da hoặc do đƣờng khâu của vết mổ. Những nghiên cứu gần đây cho thấy
việc sử dụng FGF-2 có khả năng ngăn ngừa sẹo hiệu quả do tác dụng ức chế quá trình

chuyển nguyên bào sợi thành tế bào cơ trơn. Ngoài ra, FGF-2 còn thúc đẩy quá trình
lành vết thƣơng, giảm khả năng tạo sẹo bằng cách điều chỉnh sự cân bằng chất nền
- 14 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

ngoại bào. Do đó, FGF-2 đƣợc ứng dụng trong xử lý, ngăn ngừa sự hình thành sẹo lồi
trên da do phẫu thuật [33, 34].
- Điều trị bỏng
Việc điều trị những tổn thƣơng do bỏng gây ra gặp rất nhiều khó khăn so với
những tổn thƣơng khác. Những vết thƣơng do bỏng thƣờng bị nhiễm trùng do vi khuẩn
gây nên những biến chứng không mong muốn, nhất là ở trẻ em. Để khắc phục những
khó khăn này, việc điều trị những tổn thƣơng do bỏng phải đƣợc tiến hành trong thời
gian nhanh nhất để tránh nhiễm trùng gây ra những biến chứng khác. Với mục đích đó,
ngày nay FGF-2 đƣợc sử dụng để điều trị những tổn thƣơng do bỏng gây ra. FGF-2
đóng vai trò làm cho quá trình lành hóa vết thƣơng ở da nhanh hơn bằng cách hoạt hóa
các đại thực bào (macrophage), kích thích tăng sinh tế bào gốc trung mô giúp đẩy
nhanh quá trình co rút đóng kín vết thƣơng [33, 34].
- Điều trị bệnh nhân thiếu máu cục bộ
Trong y học, bệnh thiếu máu cục bộ đƣợc định nghĩa là hiện tƣợng hạn chế sự
cung cấp máu đến các mô, gây ra tình trạng thiếu oxy và các chất dinh dƣỡng cần thiết
cho việc trao đổi chất của tế bào dẫn đến tế bào bị chết và hoại tử mô. Thiếu máu cục
bộ thƣờng xuất hiện trong các bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim, thiếu máu cục bộ não,
thiếu máu cục bộ chi. Tuy nhiên, bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim và chi dƣới thƣờng là
phổ biển nhất và có tỷ lệ tử vọng cao nhất. Nguyên nhân gây ra bệnh thiếu máu cục bộ
thƣờng là do gặp các vấn đề về mạch máu nhƣ xơ vữa động mạch, hạ huyết áp, chèn ép
từ bên ngoài bởi khối u… Bệnh thiếu máu cục bộ thƣờng đƣợc điều trị bằng cách phẫu

thuật. Ví dụ nhƣ bệnh nhân thiếu máu cục bộ tim thƣờng đƣợc điều trị bằng cách khai
thông động mạch bị tắc nghẽn bằng một ống stent hoặc phẫu thuật mở đƣờng lƣu thông
máu đến mô bị thiếu máu. Tuy nhiên, cả hai cách đều có mặt hạn chế là gây nên những
tổn thƣơng, cho nên đó không phải là biện pháp điều trị phát huy hiệu quả lâu dài. Để
khắc phục hạn chế của những phƣơng pháp trƣớc đó, hiện nay ngƣời ta sử dụng nhân
tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF-2 để điều trị chứng thiếu máu cục bộ tim. Một khi

- 15 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

vào mô bị thiếu máu, FGF-2 kích thích sự tăng trƣởng tế bào và thúc đẩy sự phát triển
mạch máu mới từ mạch máu đã tồn tại trƣớc đó [13, 18].
c) Trong mỹ phẩm
Các tính chất cơ học, bảo vệ, phục hồi của da suy giảm dần theo thời gian và tuổi
tác. Ngoài ra, các yếu tố gây stress của môi trƣờng bên ngoài nhƣ ô nhiễm, tia tử
ngoại… làm đẩy nhanh quá trình lão hóa của da. Sự tác động của tuổi tác và môi
trƣờng dẫn đến làn da bị khô ráp, nhăn nheo cũng nhƣ thay đổi sắc tố. Về mặt mô học,
theo thời gian lƣợng collagen trong da sẽ suy giảm, da sẽ mất dần các nguyên bào sợi
và mạng lƣới mạch máu. Để ngăn ngừa ngừa hiện tƣợng đó, FGF-2 đã đƣợc chứng
minh là có khả năng thúc đẩy sự phát triển của các nguyên bào sợi, hỗ trợ quá trình
tổng hợp collagen, hình thành mạch máu giúp ngăn ngừa và đẩy lùi tiến trình lão hóa
của da [4, 34].
Nhờ có khả năng ngăn ngừa sự lão hóa da mà hiện nay FGF-2 đƣợc ứng dụng rất
nhiều trong công nghệ mỹ phẩm. Một số sản phẩm đã đƣợc thƣơng mại chứa FGF-2 đã
đƣợc đƣa ra thị trƣờng chăm sóc sắc đẹp và nhận đƣợc những phản hồi tích cực.
1.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli

1.2.1. Giới thiệu chung
Vào những năm 1970, các thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp đầu tiên đã thành
công ở vi khuẩn nhƣ hormon somatostatin, sau đó là insulin đều có giá trị cao ứng
dụng trong công nghiệp dƣợc phẩm và công nghệ sinh học. Hiện nay, Escherichia coli
là chủng chủ đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp do có
những ƣu thế nổi bật về tốc độ tăng trƣởng nhanh chóng, đạt đƣợc mật độ tế bào cao,
phát triển trên môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền, các đặc tính di truyền đƣợc hiểu biết rõ,
sản lƣợng protein sản xuất cao (có thể lên đến 50%), có nhiều chủng đột biến, nhiều
vector tạo dòng thích hợp và thao tác di truyền dễ dàng [22, 30].
Bảng 1.3. Các chủng E. coli thường được dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp[9].
Chủng

Đặc điểm

- 16 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Tổng quan tài liệu

AD494

Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất

BL21(DE3)

Bất hoạt protease lon và ompT

BL21 trxB

Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất
Bất hoạt protease lon và ompT

BL21 CodonPlus-

Hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm nhƣ

RP

AGG, AGA, CCC. Bất hoạt protease lon và ompT
Đột biến recA làm ổn định các vùng lặp

BLR

Bất hoạt protease lon và ompT

C41/ C43

Đột biến dành cho biểu hiện protein màng

JM 83

Tiết protein tái tổ hợp ra vùng ngoại vi tế bào chất

Origami B

Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt cho việc tạo thành liên kết
disulfide ở tế bào chất. Bất hoạt protease lon và ompT
Hỗ trợ biểu hiện protein của eukaryote với các codon hiếm

Rosetta-gami

nhƣ AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC và GGA
Bất hoạt protease lon và ompT. Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt
cho việc tạo liên kết disulfide ở tế bào chất

Protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất ở E. coli có thể thực hiện theo ba hƣớng: sản
xuất nội bào, trong chu chất, và sản xuất ngoại bào. Trong đó, sản xuất protein tái tổ
hợp trong nội bào là chiến lƣợc đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Protein tái tổ hợp tạo ra
có thể ở dạng tan hay không tan (thể vùi), do đó khuyết điểm chủ yếu của chiến lƣợc
này là hình thành protein ở dạng thể vùi không có hoạt tính, đặc biệt là khi biểu hiện
vƣợt mức. Protein mục tiêu sau khi thu nhận phải đƣợc tái gấp cuộn để có hoạt tính.
Nhiều cải tiến đã đƣợc tiến hành nhƣ nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thấp, thay thế các
acid amin, sử dụng các chủng E. coli khác nhau(bảng 1.3), đồng biểu hiện với
chaperone gấp cuộn, thay đổi pH, nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện ở điều kiện
stress…[9].

- 17 -

Luận văn thạc sĩ sinh học