Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri bị đột biến gen pura ở các điều kiện bảo quản khác nhau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ CHI
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI
KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ðỘT BIẾN GEN PURA
Ở CÁC ðIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khánh Hòa, năm 2014


i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ CHI
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI
KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ðỘT BIẾN GEN PURA
Ở CÁC ðIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU
Chuyên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản
Mã số: 60 62 03 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. VÕ VĂN NHA
2. TS. LÊ MINH HOÀNG

CHỦ TỊCH HỘI ðỒNG

KHOA SAU ðẠI HỌC

Khánh Hòa, năm 2014


ii
LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan các số liệu và kết quả ñã nêu trong luận văn này là công trình
nghiên cứu của tôi cùng với sự cho phép sử dụng chung số liệu của nhóm tác giả thực
hiện ñề tài thuộc chương trình Công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu
Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì, những số liệu này là trung thực, chưa ñược ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả


iii
LỜI CẢM ƠN
Luận văn này ñã ñược thực hiện với sự giúp ñỡ của nhóm nghiên cứu ñề tài
Công nghệ sinh học cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri nhược ñộc dùng làm vắc xin phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) bằng kỹ thuật gây ñột biến gen” do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản III chủ trì, tôi xin chân thành cảm ơn ñến sự giúp ñỡ quí báu ñó.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến sự chỉ dẫn nhiệt tình, chu ñáo của giáo
viên hướng dẫn TS Võ Văn Nha và TS Lê Minh Hoàng ñã giúp tôi trong suốt quá
trình xây dựng ñề cương, triển khai thực hiện các nội dung và hoàn thiện bản luận văn
này.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi của các bạn
ñồng nghiệp thuộc Phòng nghiên cứu Bệnh Thủy sản và dự báo, Trung tâm quốc gia
quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền
Trung-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III ñể tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ñến Khoa Nuôi trồng Thuỷ sản, Khoa sau ðại học,
Trường ðại học Nha Trang, cùng quý thầy cô ñã tận tình giảng dạy tôi trong suốt thời
gian qua.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn ñến gia ñình ñã ñộng viên và giúp ñỡ tôi hoàn thành
luận văn này.
Tác giả


iv
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa …………………………………………………………………

i

LỜI CAM ðOAN ……………………………………………………………...

ii

LỜI CẢM ƠN …………………………………………………………….........

iii

MỤC LỤC ……………………………………………………………...............

iv

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT…………………………………...

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ……………………………………………………..

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ ………………………………………

ix

MỞ ðẦU ……………………………………………………………..................

1

Chương 1 – TỔNG QUAN …………………………………………………….

3

1.1 Những nghiên cứu về chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen cho mục
ñích tạo vaccine phòng bệnh do E. ictaluri ở cá da trơn trên Thế giới và ở

3

Việt Nam
1.1.1 Trên Thế giới ………………………………………………………….

3

1.1.2 Tại Việt Nam ……………………………………………………………...

6

1.2 Những nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học, khả năng gây bệnh trên cá tra của
vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra Việt Nam và cá nheo (catfish)
Hoa Kỳ…………..………………………………………….........
1.2.1 ðặc ñiểm hình thái, sinh lý và sinh vật hóa học vi khuẩn E. ictaluri ……...

6
6

1.2.2 Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E.
ictaluri ……………………………………………………………............

8

1.2.3 Những nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E.
ictaluri …………………………………………………………………………….

11

1.3 Khả năng phát triển của chủng E. ictaluri bị ñột biến gen và chủng E.
ictaluri chưa bị ñột biến gen (chủng “hoang dại”) trên một số môi trường

12

nuôi cấy khác nhau ………………………………………………
1.4 Một số phương pháp bảo quản chủng vi khuẩn E. ictaluri hiện nay trên Thế

giới và Việt Nam ……………..……………………...………………

14

1.4.1 Phương pháp bảo quản thạch nghiêng.…………………………………....

14

1.4.2 Phương pháp bảo quản dưới lớp dầu khoáng …………………..………...

14


v
1.4.3 Phương pháp lạnh sâu ……………………………………………………..

14

1.4.4 Phương pháp ñông khô ……………………………………………………

15

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………….

16

2.1 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu .……………………………………….

16

2.2 Vật liệu nghiên cứu ……………………………………………………….

16

2.3 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu ………………………………………...

18

2.2.1 Thời gian nghiên cứu ……………………………………………………..

18

2.2.2 ðịa ñiểm nghiên cứu ……………………………………………………..

18

2.4 Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu của ñề tài luận văn .…………………...

18

2.5. Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………

19

2.5.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; ño kích thước của
vi khuẩn; nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ……………………………...

19

2.5.2. Phương pháp kiểm tra tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ………………………………..

19

2.5.3. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của chủng E. ictaluri bị ñột
biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau ……………………….

22

2.6. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu …………………………………..

23

Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ………………………………………

24

3.1 Xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến
gen purA …………………………………………………..................

24

3.1.1 Kết quả khảo sát ñường cong sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn
E. ictaluri bị ñột biến gen purA trên môi trường BHI có kháng sinh
kanamycine …………………………..…………................................

24

3.1.2 Kết quả tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến

gen purA với một số loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid ....

25

3.2 Kết quả khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột
biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản …………………………

26

3.2.1 Kết quả tìm hiểu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ………………………………
3.2.2 Kết quả khảo sát kích thước của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị

26


vi
ñột biến gen purA theo thời gian và ñiều kiện bảo quản khác nhau ………

32

3.2.3 Kết quả nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau ……………….

33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ …………………………………………………

43

KẾT. LUẬN …………………………………………………………………….

43

KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………………..

44

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………..

45

PHỤ LỤC ……………………………………………………………................


vii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
API 20E: Hệ thống ñịnh danh vi khuẩn họ Enterobacteriaceae và vi khuẩn Gram âm
hình que
BHIA: Brain Heart Infusion Agar – Môi trường thạch BHI
BHIB: Brain Heart Infusion Broth – Môi trường lỏng BHI
CFU: Colony Forming Unit – ðơn vị khuẩn lạc
Cs: Cộng sự
DMM: Defined Minimal Medium – Môi trường nuôi cấy DMM
EIM: Edwardsiella Ictaluri Medium – Môi trường nuôi cấy EIM
ESC: Enteric Septicemia of Fish – Bệnh ESC
KIA: Klegler Iron Agar – Môi trường thạch KIA
LB: Luria Bertami – Môi trường LB
LDC: Lysine decarboxylase MAC: Mac Conkey Agar – Môi trường thạch Mac Conkey
NN&PTNT: Nông nghiệp và phát triển nông thôn

OD: Optical Density (mật ñộ quang)
ODC: Ornithine decarboxylase
O/F: Oxydation/Fermentation
ONPG: β- Galactosidase
TSA: Tryptone Soya Agar – Môi trường không chọn lọc TSA


viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Kết quả vòng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen
purA và vi khuẩn E. ictaluri chưa bị ñột biến với kháng sinh thuộc
nhóm aminoglycosid …………………….…………………....................

25

Bảng 3.2 ðặc ñiểm khuẩn lạc, hình dạng và kích thước chủng vi khuẩn E.
ictaluri bị ñột biến gen purA và chủng chưa ñột biến gen purA………

27

Bảng 3.3 ðặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen
purA, E. ictaluri chưa ñột biến gen purA ……………………………..

29

Bảng 3.4 Kích thước chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen purA (E.
ictaluri PAM) và E. ictaluri chưa ñột biến gen purA (E. ictaluri WT)

32

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát sự phát triển của chủng bị ñột biến gen purA ở các
ñiều kiện bảo quản khác nhau bằng thạch nghiêng …………………… 41


ix
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ
Hình 1.1

Con ñường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA .............. 4

Hình 2.1

Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu của ñề tài ……………………………. 18

Hình 2.2

Sơ ñồ xác ñịnh ñường cong sinh trưởng, phát triển của chủng E.
ictaluri ñột biến gen purA trong môi trường BHIB có bổ sung
kanamycine và không bổ sung kanamycine ............................................. 20

Hình 2.3

Sơ ñồ thực hiện kháng sinh ñồ vi khuẩn ..................................................

Hình 3.1

ðồ thị kết quả khảo sát ñường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi

21

khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA trên môi trường nuôi cấy BHIB có
bổ sung kanamycine và không bổ sung kanamycine ...............................
Hình 3.2

24

Kháng sinh ñồ của vi khuẩn E. ictaluri chưa ñột biến gen bị ñột biến
gen purA (A) và vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA (B) ................... 26

Hình 3.3

Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA (A, B) ........................ 28

Hình 3.4

Vi khuẩn E. ictaluri chưa ñột biến gen bị ñột biến gen purA (A) và vi
khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA (B) ..................................................

Hình 3.5

28

Sinh trưởng quần thể vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA trên môi
trường DMM có bổ sung adenine và không bổ sung adenine OD – mật
ñộ quang ..................................................................................................

Hình 3.6

31

Kết quả khảo sát ñường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuẩn E.
ictaluri chưa bị ñột biến gen bị ñột biến gen purA và E. ictaluri ñột
biến gen purA trên môi trường nuôi cấy BHIB .......................................

Hình 3.7

34

Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E. ictaluri chưa bị ñột biến
gen và E. ictaluri ñột biến gen purA bảo quản bằng thạch nghiêng ở
4oC theo thời gian ....................................................................................

Hình 3.8

35

Kết quả khảo sát giá trị OD vi khuẩn E. ictaluri chưa bị ñột biến gen và
E. ictaluri ñột biến gen purA bảo quản bằng thạch nghiêng ở 4oC theo
thời gian ...................................................................................................

Hình 3.9

35

Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E. ictaluri chưa bị ñột biến
gen và E. ictaluri ñột biến gen purA bảo quản bằng thạch nghiêng có
phủ dầu khoáng ở 48C theo thời gian........................................................ 37

Hình 3.10 Kết quả khảo sát giá trị OD vi khuẩn E. ictaluri chưa bị ñột biến gen và
E. ictaluri ñột biến gen purA bảo quản bằng thạch nghiêng có phủ dầu

x
khoáng ở 4oC theo thời gian...................................................................... 37
Hình 3.11 Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA
và E. ictaluri chưa bị ñột biến gen theo thời gian bằng lạnh sâu -30oC ..

39

Hình 3.12 Kết quả khảo sát sát giá trị OD vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA
và E. ictaluri chưa bị ñột biến gen theo thời gian bằng lạnh sâu -30oC ..

39

Hình 3.13 Kết quả khảo sát giá trị OD vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA bảo
quản ở các ñiều kiện khác nhau theo thời gian ........................................

40

Hình 3.14 Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA
bảo quản ở các ñiều kiện khác nhau theo thời gian .................................

41


1

MỞ ðẦU
Trên thế giới, các nghiên cứu ñã phát hiện ra rằng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
là tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá nheo (catfish) ở Mỹ, cá trê trắng (Clarias

batrachus) ở Thái Lan và trên một số loài cá da trơn khác ở Indonesia, Trung Quốc.
Ở Việt Nam, các nghiên cứu của Crumlish (ðại học Stirling-Anh); Công ty Bayer
Việt Nam; Công ty Pharma Nauy và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II kết hợp
với NAVETCO ñã cùng ñi ñến kết luận tại hội thảo ở Tp.Hồ Chí Minh tháng 9/2007:
“Mặc dù có thể phát hiện nhiều tác nhân vi khuẩn trên cá tra bệnh nhưng chỉ có duy
nhất vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá
tra”. Ngày 11/8/2009 hội thảo bàn về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra do Bộ
NN&PTNT tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh cũng ñã ñi ñến kết luận rằng: Vi khuẩn
E. ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam.
Bệnh nhiễm khuẩn gây ra bởi Edwardsiella ictaluri ñã làm tổn thất lớn cho nghề
nuôi cá da trơn ở Mỹ hàng năm từ 20 – 30 triệu USD [47]. Ở Việt Nam, Edwardsiella
ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở ñồng bằng sông Cửu Long với tỷ lệ
chết từ 10 – 90%, gây thiệt hại ñáng kể cho người nuôi cá tra hàng năm [10].
Vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra ñã kháng với một số loại thuốc kháng sinh như
oxytetracylin, oxolinic acid, sulphonamid [3]; Bactrime, colistin, amoxicilin,
tetracyclin, doxycyclin [8], [19]. Hơn nữa, các sản phẩm thủy sản sau ñó thường
không ñược ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt cá. Do vậy, việc phòng
bệnh gan thận mủ cá tra bằng vaccine là vấn ñề ñược ñặt ra cho công nghiệp nuôi cá
tra hiện nay.
Nghiên cứu về E. ictaluri cho thấy vi khuẩn này có ñặc tính sinh miễn dịch rất
mạnh, có sự tương quan giữa kháng thể sinh ra và khả năng bảo hộ chống lại sự cảm
nhiễm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [48], [49], [51]. Do ñó, hiện nay các nghiên
cứu ñang hướng ñến loại bỏ gen aroA hoặc purA hoặc cả 2 của chủng vi khuẩn E.
ictaluri hay một số gen tiềm năng khác nhằm làm giảm ñộc lực của vi khuẩn E.
ictaluri, dùng làm vaccine kích thích sinh miễn dịch dịch thể và kích thích hoạt hóa
sinh miễn dịch trung gian tế bào .
Năm 2010, chương trình công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu
Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì ñã nghiên cứu tạo ñược 3 dòng vi khuẩn E. ictaluri

2
nhược ñộc làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng kỹ
thuật ñột biến gen. Tuy nhiên, cho ñến nay việc lưu giữ, bảo quản chủng E. ictaluri bị
ñột biến gen purA chưa có tài liệu nào ñề cập ñến, có chăng chỉ nhằm phục vụ trực
tiếp cho những nghiên cứu về khả năng sử dụng chúng làm vaccine phòng bệnh gan
thận mủ cho cá tra.
Trước thực tế trên, cùng với việc hoàn thành khóa học, ñược sự ñồng ý của
Trường ðại học Nha Trang, Viện trưởng Viện Nuôi trồng Thủy sản, thầy giáo hướng
dẫn, tôi thực hiện ñề tài “Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau”
Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài luận văn:
+ Xác ñịnh ñược khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
bị ñột biến gen purA trong môi trường có chứa kháng sinh ñồng thời xác ñịnh ñược
khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ở
các ñiều kiện bảo quản khác nhau. Từ ñó có ñược ñiều kiện bảo quản phù hợp.
Nội dung nghiên cứu của ñề tài luận văn:
+ Xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị
ñột biến gen purA.
+ Khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột
biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài luận văn:
- Về khoa học: Kết quả của luận ñề tài luận văn ñã xác ñịnh ñược khả năng phát triển
của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA trong các ñiều kiện bảo
quản từ ñó làm tiền ñề cho những nghiên cứu tiếp theo về việc lưu giữ chủng vi khuẩn
này.
- Về thực tiễn: ðề tài luận văn góp phần nâng cao hiểu biết cho chính học viên về lĩnh
vực vi sinh vật ñột biến gen. ðồng thời cũng chỉ ra ñược ñiều kiện lưu giữ chủng vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA, làm cơ sở ban ñầu ñể lưu giữ
nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất vaccine nhược ñộc phòng bệnh gan thận mủ cá
tra.

3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1 Những nghiên cứu về chủng E. ictaluri bị ñột biến gen cho mục ñích tạo
vaccine phòng bệnh do E. ictaluri ở cá tra trên Thế giới và Việt Nam.
1.1.1. Trên Thế giới
Năm 1996, Cooper và các cộng sự ñã tạo thành công chủng E. ictaluri ñột biến
gen ch bằng cách sử dụng mini-transposon lai giữa Tn10 và Tn903, chủng ñột biến
ñược tạo ra bị mất hoạt tính enzyme chondroitinase [23]. Khi sử dụng chủng E.
ictaluri ñột biến gen ch tiêm cho cá da trơn ở nồng ñộ 108 cfu/cá ñể kiểm tra ñộc lực,
tác giả nhận thấy, sau 2 tuần theo dõi, cá không có dấu hiệu bệnh lý ñặc trưng của
bệnh nhiễm trùng do E. ictaluri gây ra. Sau ñó tác giả tiếp tục tiêm E. ictaluri hoang
dại (gây bệnh) cho cá, cá cũng không có dấu hiệu bệnh nhiễm trùng ñặc trưng trong
khi cá ñối chứng chưa ñược tiêm chủng ñột biến gen ch từ trước bị chết toàn bộ [23].
Năm 1997, Lawrence và cộng sự lần ñầu tiên ñã tạo thành công chủng E.
ictaluri ñột biến gen purA, mất khả năng tổng hợp adenine, dùng làm nguyên liệu sản
xuất vaccine nhược ñộc [34]. ðoạn gen purA, mã hóa cho enzyme tổng hợp adenine,
ñược cắt bỏ trình tự nucleotide ở giữa và thay vào ñó là gen kháng kháng sinh
kanamycin; gen purA ñột biến ñược dòng hóa vào plasmid pGP704, sau ñó , plasmid
sản phẩm (pEI17) ñược biến nạp vào E. coli SM10 λpir. Chủng E. ictaluri bị ñột biến
gen purA (LSU-E2) ñược tạo ra khi cho E. coli SM10 λpir mang pEI17 tiếp hợp với
chủng E. ictaluri hoang dại.
ðoạn gen purA, mã hóa cho enzyme tổng hợp adenine, bị gây ñột biến mất
ñoạn 598 bp và thay bằng gen kháng kanamycin. Khi loại bỏ gen purA, gen mã hóa
cho enzyme adenylosuccinate synthase là enzyme ñầu tiên xúc tác cho quá trình tổng
hợp AMP- tham gia vào quá trình tổng hợp purin ribonucleotide (US Patent 6010705).
Do vậy, nếu ñột biến gen purA thì enzyme adenylosuccinate synthase không ñược tạo

thành và quá trình chuyển hóa inosine monophosphate (IMP) thành adenylosuccinate
sẽ không xảy ra, dẫn ñến ATP không ñược hình thành ñể cung cấp năng lượng cho quá
trình chuyển hóa từ XMP thành GMP), tạo ra GTP tham gia quá trình tổng hợp DNA
và RNA (Hình 1.1). Từ ñó làm ảnh hưởng trược tiếp ñến khả năng sinh trưởng vi
khuẩn E. ictaluri, gây ảnh hưởng gián tiếp ñến ñộc lực của chủng vi khuẩn này [1].


4

Hình 1.1 Con ñường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA
Chủng vi khuẩn khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen purA (LSU-E2) không gây
chết cho cá nheo Mỹ khi tiến hành gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp cho ăn
hay ngâm nhưng gây chết khoảng 50% khi sử dụng phương pháp tiêm với liều khoảng
107 – 108 cfu/cá. ðiều này có thể do các gen qui ñịnh ñộc tính của chủng LSU-E2 vẫn
nguyên vẹn [34].
Thune và cộng sự (1997) [48] tạo thành công chủng E. Ictaluri khuyết dưỡng
adenine bằng phương pháp ñột biến gen purA dựa trên nguyên tắc của hiện tượng tái
tổ hợp tương ñồng của các trình tự AND. Chủng E. Ictaluri bị ñột biến gen purA
(LSU-E2) tạo ra ñược ñem thử nghiệm ñộc lực cho thấy, cá thí nghiệm tiêm chủng
LSU-E2 ở nồng ñộ 105 và 106 cfu/cá cho tỉ lệ cá chết tích lũy là 0%, trong khi ñó với
nồng ñộ tiêm tương tự ñối với chủng E. ictaluri hoang dại tỉ lệ tương ứng là 96,7% và
100% . Với phương pháp tiêm, chủng ñột biến có liều gây chết LD50 là 5,1 x 107 cfu/cá
so với chủng hoang dại (<130 cfu/cá), nghĩa là LD50 của chủng hoang dại thấp hơn
5log10 so với chủng ñột biến. Ngoài ra, khi thử nghiệm ñộc lực bằng phương pháp


5
ngâm (nồng ñộ 106, 107 cfu/ml) và cho ăn (nồng ñộ 107, 108 cfu/cá) với chủng LSUE2, tỷ lệ cá chết tích lũy là 0% sau thí ngiệm; trong khi ñó với chủng E. ictaluri hoang
dại khi cá ñược ngâm (nồng ñộ 107 cfu/ml) hoặc cho ăn (nồng ñộ 109 cfu/cá) thì tỷ lệ
cá chết tương ứng là 63,3% và 54,8%. Cá ñược ngâm với E. ictaluri hoang dại sau khi

ngâm với chủng LSU-E2 có tỷ lệ chết tích lũy trung bình 11,1% trong khi ñó ở lô ñối
chứng tỷ lệ này là 33,3%.
Gen mục tiêu phổ biến nhất ñược quan tâm là aroA, mã hóa enzyme 5 –
enolpyruvoylshikimate-3-phosphate synthase. Các trình tự gen aroA của một số tác
nhân gây bệnh gram (-) ñã ñược công bố, và ñột biến gen aroA ñã chứng minh là có
hiệu quả trong ứng dụng vaccine. Nhóm tác giả Thune, ñại học bang Louisiana ñã tạo
thành công chủng E. ictaluri ñột biến gen aroA bằng phương pháp tiếp hợp với chủng
E. ictaluri hoang dại vào năm 1999 [49]. Trong cùng nghiên cứu, chủng E. ictaluri ñột
biến ñược thử nghiệm vaccine bằng các phương pháp ngâm ở các nồng ñộ 107 cfu/ml
và 108 cfu/ml. Sau 4 tuần, cá ñược ngâm tăng cường với chủng ñột biến một lần nữa
với cùng nồng ñộ lần ñầu (107 cfu/ml và 108 cfu/ml). Bốn tuần sau, cá tiếp tục ñược
ngâm với chủng E. ictaluri hoang dại với nồng ñộ 107 cfu/ml. Cá chết ñược ghi nhận
trong mỗi 24 giờ sau khi ngâm cho ñến khi không còn cá chết trong 3 ngày. Kết quả
thu ñược như sau: Tỷ lệ sống của cá ñạt 54,1 – 63,8% khi ñược ngâm một lần và 77,3
– 94,4% khi ñược ngâm tăng cường với chủng ñột biến. Nhóm nghiên cứu ñã ñưa ra
kết luận lần ngâm thứ 2 giúp tăng ñáng kể khả năng bảo vệ của vaccine [49].
Nghiên cứu gần ñây của Javier Santander và cộng sự (2011) khi thực hiện loại bỏ
gen crp của chủng E. ictaluri cho thấy, chủng bị loại bỏ gen crp giảm sự phát triển,
mất khả năng sử dụng maltose, và thiếu khả năng tạo tiêm mao [32]. Chủng E. ictaluri
hoang dại gây chết 50% cá ở nồng ñộ tiêm 105 cfu/cá và 100% ở nồng ñộ 107, 108
cfu/cá; trong khi ñó chủng E. ictaluri ñột biến gen crp không gây chết cá ở nồng ñộ
tiêm 107 cfu/cá và nhỏ hơn 20% ở 20% ở 108 cfu/cá. Khả năng bảo hộ của E. ictaluri
bị loại bỏ gen crp trong nghiên cứu này ñạt 100% sau 30 ngày thí nghiệm công cường
ñộc với chủng E. ictaluri hoang dại cho cá ñã ñược kích thích miễn dịch với E. ictaluri
ñột biến gen crp [32].
Như vậy, trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về chủng E. ictaluri bị
ñột biến gen cho mục ñích tạo vaccine sống nhược ñộc phòng bệnh do E. ictaluri gây
ra trên cá da trơn. Những sản phẩm vaccine tạo ra ở dạng này có khả năng kích thích

6
sinh kháng thể và kích hoạt miễn dịch trung gian tế bào, vi khuẩn bị làm yếu ñộc lực
không có khả năng hoàn ñộc do không tái tạo lại ñoạn gen gây bệnh hay gen khuyết
dưỡng ñã bị loại bỏ.
1.1.2. Tại Việt Nam
Nhiều nghiên cứu trong nước tạo vi khuẩn E. ictaluri bất hoạt bằng nhiều phương
pháp khác nhau ñể dung làm nguyên liệu sản xuất vaccine. Nguyễn Hữu Thịnh và
cộng sự (2009) thử nghiệm vaccine bất hoạt vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp
ngâm kết hợp cho ăn 2 lần, kết quả cho tỷ lệ bảo hộ ñạt 52% [47].
Tuy nhiên, kể từ khi sử dụng vaccine phòng bệnh cho vật nuôi thủy sản năm
1987 [38], ñến nay vẫn có ít những sản phẩm vaccine sống ñược tạo ra ñáp ứng nhu
cầu của thị trường. Việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo các vi sinh vật ñột biến
dung làm nguyên liệu sản xuất vaccine trong lĩnh vực thủy sản Việt Nam hiện nay chỉ
có ở giai ñoạn bắt ñầu. Trong ñề án phát triển và ứng dụng công nghệ xinh học trong
lĩnh vực thủy sản của chính phủ Việt Nam, năm 2010 ñã triển khai thực hiện ñề tài cấp
Nhà nước “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhược ñộc dung làm
vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng kỹ thuật
gây ñột biến gen” do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì. Nhóm nghiên
cứu phối hợp với Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh ñã tạo thành
công 03 chủng vi khuẩn: E. ictaluri bị ñột biến gen purA, E. ictaluri bị ñột biến gen
aroA và E. ictaluri bị ñột biến gen ch [11]. Các chủng vi khuẩn ñột biến này ñã ñược
xác ñịnh là ổn ñịnh về mặt kiểu gen và kiểu hình so với chủng vi khuẩn gốc ban ñầu
[11], [12].
Như vậy, có thể thấy rằng việc nghiên cứu chủng E. ictaluri bị ñột biến gen cho
mục ñịch tạo vaccine sống nhược ñộc phòng bệnh gan thận mủ cá tra ở Việt Nam chỉ
mới ñược bắt ñầu từ năm 2010 khi chính phủ khởi ñộng chương trình ứng dụng công
nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản. Cho ñến nay, chưa có công trình và sản phẩm
nào trong nước công bố về vaccine nhược ñộc phòng bệnh gan thận mủ cá tra do E.
ictaluri gây ra.
1.2 Những nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học, khả năng gây bệnh trên cá tra của vi

khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra Việt Nam và cá nheo (catfish) Hoa Kỳ.
1.2.1 ðặc ñiểm hình thái, sinh lý và sinh vật hóa học vi khuẩn E. ictaluri


7
Trong hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc
giống

Edwardsiella,

họ

Enterobacteriaceae,

bộ

Enterobacteriales,

lớp

Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Giống Edwardsiella có các ñặc ñiểm
là: vi khuẩn dạng hình que thẳng, nhỏ, kích thước 1µm x 2-3 µm, gram âm, có khả
o

năng di ñộng bằng vành lông rung (peritrichous flagella) ở nhiệt ñộ 25 C, không di
o

ñộng ở 37 C, yếm khí tùy tiện. Loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là một trong những
loài khó nuôi cấy trên môi trường nhân tạo nhất trong số các loài thuộc giống
Edwardsiella. Chúng sinh trưởng yếm khí tùy tiện và phát triển chậm trên môi trường

o

thạch BHI (Brain Heart Infusion), sau 48 giờ nuôi cấy ở 28 C, vi khuẩn tạo nên khuẩn
lạc hình tròn, bóng có kích thước khoảng 2 mm, màu trắng, không có nhân, rìa có dạng
không ñồng nhất [3], [24], [42]. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn hình que,
gram âm, phần lớn ở dạng ñơn, ñôi và một số dạng chuỗi, kích thước khoảng 0,75 x
o

2,5 µm ở 26oC [28], chuỗi vi khuẩn kéo dài 5-7 µm khi ở 37 C [39] hoặc có thể biến
thiên 1,2-15 µm [54]. Vi khuẩn có khả năng chuyển ñộng bằng tiêm mao, di ñộng yếu
ở 25-30oC nhưng không di ñộng ở nhiệt ñộ cao hơn [40].
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có khả năng phát triển tốt ở khoảng nhiệt ñộ tối
ưu 22 – 28oC [41]. pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,0 – 7,5 và phát triển tốt
nhất trong môi trường có nồng ñộ muối là 0,5%, nhưng không chịu ñược ñộ muối cao
hơn 1,5% [39], [40]. E. ictaluri thường ñược phân lập từ môi trường nuôi, từ nội quan
hoặc mô não cá bị bệnh. Trong môi trường nước, vi khuẩn E. ictaluri có thể tồn tại
khoảng 9 ngày [41], còn trong môi trường bùn, ñáy ao vi khuẩn E. ictaluri có khả năng
tồn tại trong vòng 1 tháng [26] ñến 95 ngày khi ở nhiệt ñộ lạnh [30], [41].
Vi khuẩn E. ictaluri có khả năng sử dụng D-glucose và một số ñường khác kết
quả sinh ra a xít và thường sinh hơi. Oxidase âm tính, catalase dương tính, Vogesproskauer và simmon citrate âm tính, LDC dương tính, ODC dương tính, khử Nitrate
thành Nitrite. Vi khuẩn cho phản ứng destrose, dulcitol, fructose, galactose, maltose,
mannose và salicin dương tính. Ngoài ra, E. ictaluri cũng cho kết quả dương tính với
lysine, ornithine,glucose, mannitol và mellibiose [29], [33]. Vi khuẩn này là nguyên
nhân gây bệnh ở cá da trơn (catfish) và một số ñộng vật khác, hiếm khi là là tác nhân
gây bệnh cơ hội cho người.


8
1.2.2 Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E.
ictaluri

Vi khuẩn E. ictaluri lần ñầu tiên ñược xác ñịnh là tác nhân gây bệnh gan thận mủ
trên cá tra ở ñồng bằng sông Cửu Long bởi Crumlish và cs (2002) [24]. Các kết quả
nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2004) [3], Trần Thị Minh Tâm (2003) [14], Nguyễn
Hữu Thịnh và cộng sự (2007) [16], Lý Thị Thanh Loan (2007) [9] trên cá tra bị bệnh
gan thận mủ cho thấy một phức hợp gồm nhiều tác nhân gây bệnh gồm: Edwardsiella
ictaluri, E. tarda, Aeromonas sp., Pseudomonas, Hafnia alvei, Plesiomonas
shigelloides, Vibrio, Klebsiella, Bacillus, Entercoccus, Enterobacter, Clostridinium
spp.. . Tuy nhiên, có hai nghiên cứu ñáng chú ý nhất ñó là: Kết luận của ñề tài “Nghiên
cứu bệnh ñốm trắng trên cá tra nuôi công nghiệp” của Trần Thị Minh Tâm (2003) [14]
ñã phỏng ñoán tác nhân gây bệnh ñốm trắng tức bệnh gan thận mủ trên cá tra là do vi
khuẩn Hafnia alvei và Plesiomonas shigelloides dựa trên tần suất bắt gặp cao nhất
(73,1% cho Hafnia alvei và 31,9% cho Plesiomonas shigelloides), kết quả cảm nhiễm
ñể thử ñộc lực và phản ứng vi ngưng kết với kháng nguyên toàn phần. Tuy nhiên,
thông tin gần ñây lại cho thấy, sau khi kiểm chứng lại bằng kỹ thuật PCR thì vi khuẩn
Hafnia alvei chính là vi khuẩn E. ictaluri [14]. Nghiên cứu thứ 2 ñó là sản phẩm hợp
tác của trường ðại Học Stirling (Anh) với Trường ðại học Cần Thơ kết luận: tác nhân
gây bệnh gan thận mủ trên cá tra là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [24]. Sau ñó,
Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II phối hợp với Công ty thuốc thú y trung ương II
(NAVETCO) tiến hành ñiều tra thu mẫu cá tra bệnh tại các vùng ñịa lý khác nhau ở
các ổ dịch và xác ñịnh chính vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân gây bệnh gan
thận mủ nhờ vào kết quả phân lập ñịnh danh vi khuẩn, kiểm tra sinh hóa và kiểm
chứng bằng kỹ thuật PCR [14]
Cho ñến nay, các nghiên cứu về tác nhân gây bệnh gan thân mủ trên cá tra nuôi ở
ñồng bằng sông Cửu Long Việt Nam như: Crumlish (ðại học Stirling-Anh) [24];
nghiên cứu của nhóm Công ty Bayer Việt Nam; nghiên cứu của nhóm công ty Pharma
Na uy; nghiên cứu của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II kết hợp với
NAVETCO; nghiên cứu của ðặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (ðại
học Cần Thơ) năm 2009 [13]; nghiên cứu của ðồng Thanh Hà và ðỗ Thị Hòa (ðại
học Nha Trang) năm 2009 [6] ñã cùng ñi ñến kết luận mới nhất tại tại hội thảo bàn về
tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra do Bộ NN&PTNT tổ chức tại Tp. Hồ Chí

9
Minh vào ngày 11/8/2009: Vi khuẩn E. ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan
thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam [11]. Thêm vào ñó, nhóm nghiên cứu của
Crumlish (ðại học Stirling-Anh) khẳng ñịnh rằng chủng vi khuẩn E.ictaluri ở Hoa Kỳ
và chủng vi khuẩn E. ictaluri ở Việt Nam có một số sai khác ñáng kể [24].
Cá tra bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri có thể có hoặc không xuất hiện
dấu hiệu bất thường ở bên ngoài. ða số thể hiện dấu hiệu xuất huyết nhẹ ở các gốc vây,
xung quanh miệng và vùng bụng, hoặc kèm theo dấu hiệu trắng mang (mang nhợt nhạt,
tiết nhiều nhớt). Giải phẫu nội tạng cho thấy 100% cá bệnh ñều tồn tại của các ñốm
trắng có ñường kính 0,5-3,0mm ở các tổ chức nội tạng như gan, thận, lá lách. Các ñốm
trắng thường xuất hiện trước tiên ở thận, làm thận sưng to gấp 2-3 lần bình thường và
mềm nhũn, khi bệnh nặng mới có thể quan sát thấy ở tỳ tạng và gan, các ñốm trắng ở
gan thường thưa và nhỏ hơn ở thận [6].
Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra ở ñồng bằng sông Cửu Long xuất
hiện hàng năm và theo mùa vụ, thường vào tháng 8-11 trong ñó ñỉnh cao nhất vào
tháng 9 [10]. Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh cho cá tra ở mọi lứa tuổi, thường gặp nhất
và gây chết nhiều nhất ở cá tra dưới 3 tháng tuổi [10]. Việc phòng và trị bệnh do vi
khuẩn E. ictaluri cho cá tra hiện nay ở Việt Nam vẫn hoàn toàn dựa vào kháng sinh và
hóa chất. Phần lớn khi có bệnh xảy ra trên cá tra, người nuôi sử dụng nhiều loại kháng
sinh kết hợp nhằm ñiều trị có hiệu quả cho tất cả các bệnh nhiễm khuẩn nói chung.
Việc sử dụng thuốc như vậy dẫn ñến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày một gia
tăng, ñồng thời gây ảnh hưởng lớn ñến chất lượng thực phẩm và gây ô nhiễm môi
trường [10]. Do vậy, phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng vaccine là vấn ñề ñược ñặt
ra cho công nghiệp nuôi cá tra hiện nay.
Những nghiên cứu về cơ chế xâm nhập của vi khuẩn E. ictaluri vào trong dạ dày
của cá cho thấy: E. ictaluri xâm nhập vào lớp biểu mô, sau ñó ñược thực bào bởi các
ñại thực bào ngoại vi nằm dưới lớp biểu mô [21], [37], [50]. Tuy nhiên, lại không phát
hiện thấy các tổn thương ở vùng tế bào biểu mô nên người ta cho rằng E. ictaluri

xuyên qua lớp tế bào biểu mô nền nhờ vào các hệ thống vận chuyển bình thường của
tế bào. Lập luận này cũng ñược củng cố bởi quan sát của Thune (1993) rằng thời gian
cho sự xâm nhập nhanh chóng của E. ictaluri qua lớp tế bào biểu mô nền không ñủ ñể
tổng hợp các protein chức năng cho quá trình xâm nhập này [50]. Nhìn chung, vi


10
khuẩn E. ictaluri có thể xâm nhập vào cá tra theo 2 con ñường chủ yếu là từ môi
trường nước qua da hoặc mang cá và qua miệng theo ñường thức ăn gây bệnh gan thận
mủ. Vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ quan khứu giác, sau ñó lên não gây viêm não.
Ngoài ra, vi khuẩn E. ictaluri còn có thể xâm nhiễm từ ñường tiêu hóa qua niêm mạc
ruột vào máu và gây hiện tượng nhiễm trùng máu. Nghiên cứu của Baldwin và Newton
(1993) [19] cho thấy vi khuẩn có thể vượt qua lớp màng nhầy ruột sau khi gây nhiễm
15 phút, xuất hiện trong không bào của phagocyte sau 24 giờ và trong các không bào
ñã thoái hóa sau 72 giờ. Trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh, vi khuẩn gây viêm
ruột, viêm gan và viêm cầu thận. Các cơ quan nội tạng bị hoại tử hoặc xuất hiện ñốm
trắng, trong ruột chứa ñầy dịch máu.
Các nhân tố gây ñộc liên quan ñến quá trình phát sinh bệnh do vi khuẩn E.
ictaluri

bao

gồm:

Các

polysaccharide

của

vỏ

capsule,

các

hemolysin,

lypopolysaccharide và một số enzyme chondroitin sulfate [23]. Tương tự với các
chủng vi khuẩn gây bệnh khác, E. ictaluri có thể tạo ra lớp polysaccharide dày giống
như chất nhày bao phủ các protein kháng nguyên giúp vi khuẩn tránh khỏi sự ñáp ứng
miễn dịch của tế bào vật chủ [35]. Màng tế bào E. ictaluri có liên ñới với các
hemolysin, nhưng hemolysin không phải là nhân tố gây ñộc quan trọng ở cá tra [53].
Theo Lawwrence và cộng sự (2003), lypopolysaccharide (LPS) ñược xem như là nhân
tố gây ñộc chính của E. ictaluri [35]. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri có LPS có khả
năng kháng ñối với sự phân hủy tế bào vi khuẩn bởi hệ thống bổ thể hoặc quá trình
thực bào tốt hơn các chủng thiếu LPS [35]. Cooper và cộng sự (1996) cho rằng hoạt
tính chondroitinase cũng góp phần vào ñộc tính của E. ictaluri [23].

Hoạt tính

chondroitinase phân giải mô sụn tạo nên những lỗ thủng trên ñầu cá (thườn goi là triệu
trứng “hole in the head”) [23].
E. ictaluri tồn tại trong các lớp chất ñáy ao hồ tới 95 ngày ở nhiệt ñộ lạnh [33],
[41]. Vì vậy, dưới những ñiều kiện tối ưu, nó có thể cảm nhiễm vào cá ở mọi lứa tuổi
[26]. Sự lây nhiễm theo trục ngang của bệnh có thể diễn ra thông qua sự phát tán vi
khuẩn vào môi trường nước nuôi bởi các cá thể cá bị nhiễm bệnh hoặc do sự ăn thịt lẫn
nhau giữa cá khỏe với cá bị bệnh [30]. Ngoài ra, chim và các trang thiết bị từ các ao/bể
cá bị bệnh cũng góp phần vào sự lan truyền bệnh giữa các ao/hồ hoặc giữa các trại cá
[30].

11
1.2.3. Những nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E.
ictaluri
ðã có một số nghiên cứu về khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E.
ictaluri ở các ñối tượng thủy sản khác nhau. Hawke (1979) [29] là người ñầu tiên kiểm
tra tính nhạy cảm của vi khuẩn E. ictaluri ñối với kháng sinh. Sau ñó, Waltman và
Shotts (1986) [52] ñã thử nghiệm tính nhạy cảm của 118 chủng vi khuẩn E. ictaluri
ñược phân lập trên cá nheo tại Hoa Kỳ với 37 loại kháng sinh khác nhau. Kết quả
nghiên cứu cho thấy hơn 90% các chủng vi khuẩn ñề kháng ñược với colistin và
sulfonamid. Reger và cộng sự (1993) [43], cũng ñã xác ñịnh chủng E. ictaluri phân lập
trên cá nheo còn nhạy với enrofloxacin, gentamycin và doxycucline. Stock và
Wiedemann (2001) [45] xác ñịnh vi khuẩn thuộc giống Edwardsiella, kể cả vi khuẩn
E. ictaluri nhạy với các kháng sinh thuộc nhóm quinolones. Tuy nhiên, Akinbowale và
cộng sự (2007) ñã thông báo vi khuẩn E. ictaluri ñã bắt ñầu kháng với nhóm kháng
sinh này. Theo báo cáo của Cục kiểm ñịnh thuốc ở Châu Âu, quinolon là nhóm thuốc
kháng sinh rất quan trọng chuyên dùng trị các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho người
và ñộng vật. Do ñó, việc dùng thuốc kháng sinh này trong thủy sản cần hết sức thận
trọng và cần ñược kiểm soát chắt chẽ bởi các cơ quan có thẩm quyền.
Hiện tượng kháng thuốc càng trở nên nghiêm trọng hơn, khi trong môi trường
nuôi thủy sản có sự kháng thuốc hình thành gián tiếp thông qua thể R – plasmid. R –
plasmid có 2 nhóm, nhóm mang gen kháng sulphonamid và tetracycline và nhóm
mang gen kháng chloramphenicol, sulphonamid và streptomycine. Các R – plasmid
có thể làm trung gian cho sự kháng một hay nhiều loại thuốc kháng sinh thông qua các
gen mã hóa theo cơ chế bất hoạt hóa một hay nhiều loại thuốc kháng sinh [18].
Mcphearson và cộng sự (1991) [36] ñã phát hiện trên một số vi khuẩn gây bệnh cá
chứa plasmid kháng thuốc kháng sinh chloramphenicon, trimethoprim, sulphonamid
và tetracylin.
Ở Việt Nam, chủng vi khẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bị nhiễm bệnh gan thận

mủ ở ñồng bằng song Cửu Long Việt Nam ñược xác ñịnh là kháng lại với một số loại
thuốc kháng sinh thông thường và rất có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh xuất huyết
nội tạng (ESC) trên cá nheo Mỹ như: Oxytetracylin, oxonilic acid, sulphonamid [3],
[10], [24]; bactrime, colostin, amoxicillin, tetracylin, doxycyclin [8].


12
Từ Thanh Dung và cộng sự (2008, 2010) khảo sát tính kháng kháng sinh của
chủng E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra ở ñồng bằng song Cửu Long cho
thấy vi khuẩn ñã có hiện tượng kháng thuốc ñáp ứng với kháng sinh streptomycin
(83% trong số 64 chủng ñã kháng thuốc), trimethoprim (71% trong tổng số 64 chủng
ñã kháng thuốc), tetracycline (64% trong tổng số 50 chủng ñã kháng thuốc), doxycylin
(56% trong tổng số 50 chủng) và có trên 705 trong tổng số 50 chủng E. ictaluri kháng
với thuốc kháng sinh nhóm phenicol (chloramphenicol và florfenicol) [4], [25]. ðồng
thời kết quả cũng ñã xác ñịnh nồng ñộ ức chế tối thiểu (MIC) khá cao (MIC90
128µg/ml) cũng ñã thể hiện tính kháng cao của vi khuẩn ñối với nhóm kháng sinh
phenicol. Vi khuẩn này ñã bắt ñầu có hiện tượng kháng với nhóm quinolone như:
flumequin và enrofloxacin ở mức giá trị MIC50 là 4 µg/ml và MIC90 là 64 µg/ml;
streptomycin với giá trị MIC90 ≥ µg/ml, chloramphenicol, enrofloxacine MIC90 (128
µg/ml) và oxytetracyline với giá trị MIC90 (64 µg/ml) [4], [25].
Ngoài ra, hiện tượng ña kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn E. ictaluri cũng ñang
là mối lo không chỉ của người nuôi mà còn là mối lo ñối với các nhà quản lý sức khỏe
cộng ñồng bởi nó không chỉ làm giảm hiệu quả ñiều trị mà còn tiềm ẩn nhiều nguy cơ
ñối với sức khỏe con người, nhất là các kháng sinh ñã bị cấm. Nghiên cứu của nhóm
tác giả ðại học Cần Thơ năm 2010 cho thấy có ñến 86% chủng vi khuẩn E. ictaluri thể
hiện tính ña kháng. Trong ñó vi khuẩn kháng ñồng thời với 8 loại kháng sinh chiếm tỉ
lệ 20,9%, với 9 loại kháng sinh chiếm tỉ lệ 11,6%; có 73% trong tổng số 64 chủng E.
ictaluri khảo sát ña kháng sinh với ít nhất 3 loại kháng sinh.
Tóm lại, những nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học của chủng E. ictaluri cho thấy
vi khuẩn E. ictaluri gây nhiễm trùng máu trên cá nheo ở Hoa Kỳ, cá trê trắng ở Thái

Lan và gây hoại tử nội quan của một số loài cá da trơn (cá tra, cá basa) nuôi ở
Indonesia, Trung Quốc và Việt Nam. ðồng thời vi khuẩn này ñã kháng với nhiều loại
thuốc kháng sinh thường ñược sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Do vậy, việc nghiên
cứu ñặc ñiểm sinh học và ñiều kiện bảo quản chủng E. ictaluri ñã bị làm yếu ñộc lực
bằng công nghệ ñột biến gen nhằm ổn ñịnh nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm vaccine
phòng bệnh cho cá là hết sức cần thiết và thiết thực.
1.3. Khả năng phát triển của chủng E. ictaluri bị ñột biến gen và chủng E. ictaluri
chưa ñột biến gen (chủng “hoang dại”) trên một số môi trường nuôi cấy khác
nhau


13
Shots và Waltman (1990) [44] ñã nghiên cứu và thử nghiệm các môi trường nuôi
cấy vi khuẩn E. ictaluri bao gồm: Môi trường MAC, TSA và EIM (Edwardsiella
ictaluri medium). Kết quả cho thấy, EIM ñược xem là môi trường chọn lọc của vi
khuẩn E. ictaluri so với môi trường MAC và TSA. EIM có khả năng ức chế hầu hết sự
phát triển của: Vi khuẩn gram âm ngoại trừ Proteus sp., Serratia marcescens,
Aeromonas hydrophila và Yersinia ruckeri; Vi khuẩn gram dương trừ cầu khuẩn
ñường ruột, ức chế ñược các chủng Pseudomonas spp. mà không ảnh hưởng ñến sự
phát triển của E. ictaluri. Vi khuẩn E. ictaluri phát triển trên EIM có thể dễ dàng phân
biệt với các vi khuẩn khác dựa trên hình thái khuẩn lạc. trên EIM, sau 48 giờ nuôi cấy,
khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri có ñường kính 0,5 – 1,0 mm, màu xanh mờ [44].
Năm 1996, Collins và Thune ñã xác ñịnh thành phần môi trường tối thiểu ñể vi
khuẩn E. ictaluri có thể phát triển ñược (môi trường DMM) [22]. Năm 1998, Hawke
ñã sử dụng môi trường BHIA và TSA ở nhiệt ñộ 25 – 300C ñể nuôi cấy chủng vi
khuẩn E. ictaluri. Tuy nhiên, sự phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri rất chậm và
không thể xác ñịnh ñược sau 24 giờ. Sau 48 giờ nuôi cấy, các khuẩn lạc ñiển hình với
số lượng lớn hình thành [30].
Lawrence và cộng sự (1997), Nguyễn Quốc Bình và cộng sự (2010) [1] cho rằng,
khi ñột biến gen khuyết dưỡng (gen purA, gen aroA), chủng vi khuẩn bị ñột biến cần

ñược bổ sung chất dinh dưỡng phù hợp thì mới có thể sống ñược [37]. ðối với chủng
vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen purA, chất dinh dưỡng cần bổ sung là adenine. ðối
với chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen aroA, chất dinh dưỡng cần bổ sung là
chorismate. Hàm lượng adenine cung cấp tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn:
25 µg/ml adenine ñối với môi trường DMM [37], 50 µg/ml adenine ñối với môi trường
BHIB, [11]. Ngoài ra, Nguyễn Trọng Bình và cộng sự (2011) , Trần Thị Bích Thủy
(2012) sử dụng các môi trường BHIB, LB và EIM ñể nuôi cấy tăng sinh chủng vi
khuẩn E. ictaluri sau khi ñột biến gen purA, aroA và ch, sau 48 giờ nuôi cấy ở 280C
cho thấy vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến có khả năng phát triển trên các môi trường
này [2], [17].
Tóm lại, những nghiên cứu về môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn E. ictaluri
hoang dại (chưa ñột biến) và chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen cho thấy chúng
có sự tương ñồng nhau. Ngoại trừ một số chủng bị ñột biến gen khuyết dưỡng thì cần
phải ñược bổ sung dinh dưỡng trước khi tiến hành nuôi cấy.


14
1.4. Một số phương pháp bảo quản chủng vi khuẩn E. ictaluri hiện nay trên Thế
giới và Việt Nam.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp bảo quản vi khuẩn khác nhau, tuy nhiên với
vi khuẩn E. ictaluri thì có một số phương pháp sau thường ñược nhiều người sử dụng.
1.4.1. Phương pháp bảo quản thạch nghiêng
ðây là phương pháp khả phổ biến, rất ñơn giản và tiện lợi, tuy nhiên thời gian
lưu giữ lại khá ngắn, sau ñó phải cấy truyền lại trên môi trường thạch mới. Do phải
cấy truyền nhiều lần nên tốn khá nhiều công sức và chủng cũng dễ bị mất ñi các ñặc
tính di truyền ban ñầu.
1.4.2. Phương pháp bảo quản dưới lớp dầu khoáng
Phương pháp này ñã ñược Lumiere và Chevotier ñề nghị ñầu tiên năm 1914,
tương tự như phương pháp bảo quản bằng thạch nghiêng nhưng ñể ngăn cản vi khuẩn
phát triển, phủ một lớp dầu khoáng lên trên mặt môi trường thạch nghiêng, làm vi

khuẩn không thể tiếp xúc trực tiếp với không khí nên không thể phát triển. Phương
pháp này ñơn giản, nhưng thời gian bảo quản có thể kéo dài ñến 12 tháng, ñỡ tốn công
cấy truyền và ít có nguy cơ giống bị thoái hóa hoặc nhiễm tạp. Phương pháp này ñược
khuyến cáo là không thích hợp với một số vi sinh vật như: Aerobacter, Alcaligens,
Erwinia, Cytophaga, Leuconostoc, Pseudomonas, Streptococcus và Vibrio [5].
1.4.3. Phương pháp lạnh sâu
ðây là phương pháp dựa trên cơ sở phát triển của vi khuẩn bị ức chế ở nhiệt ñộ
lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan
mẫu. Một nguyên nhân dẫn ñến việc làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất ñiện giải
trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. ðể khắc phục nhược
ñiểm này, người ta ñã bổ sung các chất làm hạn chế tốc ñộ lạnh sâu và làm tan nhanh
như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu
này ñược thể hiện ở các thang nhiệt ñộ khác nhau như -200C, -300C, -400C, -700C, 1400C và -1900C. Nói chung, ở mức nhiệt ñộ cao hơn -300C cho hiệu quả thấp do tế
bào chịu nồng ñộ muối cao sinh ra từ các chất ñiện giải. Phương pháp bảo quản này có
hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ
khuẩn và vi rút. ðặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong môi trường nitơ
lỏng là phương pháp tốt hơn cả. Tuy nhiên phương pháp này cũng bộc lộ một số
nhược ñiểm như ñầu tư kinh phí cho thiết bị và ñiện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy,