xác định đặc điểm sinh hóa và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (lates calcarifer)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

ĐOÀN QUỐC TỈNH

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG
KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

ĐOÀN QUỐC TỈNH

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG
KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs.Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

2012

LỜI CẢM TẠ
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh - Trưởng
bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản- Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần
Thơ đã tận tình hướng dẫn, đóng góp nhiều ý kiến quý báu, luôn quan tâm chỉ
bảo động viên giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản- Trường Đại Học
Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học thủy sản
đã truyền đạt kiến thức, những kinh nghiêm quý báu trong suốt quá trình em
học tập và nghiên cứu tại trường.
Xin chân thành cảm ơn chị Trương Quỳnh Như và anh Lê Thượng Khởi
đã quan tâm sâu sắc, hướng dẫn, và đóng góp ý kiến tận tình trong suốt thời
gian thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn bạn Huỳnh Nguyễn Xuân Nghi, Lê Hoài Như Ngọc, Lê Kim
Trong , Lê Thanh Cần đã tận tình giúp đỡ, gắn bó, chia sẽ trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.

i


TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện nhằm xác định đặc điểm sinh hóa và khả năng
kháng thuốc kháng sinh của 16 chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm bệnh, nuôi
ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Qua kết quả kiểm tra cho thấy các chủng vi
khuẩn nghiên cứu là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, không di động, cho phản
ứng catalase và oxidase âm tính, vi khuẩn không có khả năng sinh H2S, nitrate
âm tính và vi khuẩn không lên men và oxi hóa đường glucose. Tất cả các
chủng đều không phát triển ở môi trường có bổ sung NaCl 6,5 %, trong đó có

11 chủng tan huyết dạng β, 4 chủng tan huyết dạng α và 1 chủng không tan
huyết. Kết quả định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20 Strep cho thấy vi khuẩn
được phân lập từ cá chẽm là Streptococcus iniae và Streptococcus agalactiae.
Lập kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh cho thấy vi khuẩn nhạy cao nhất với
kháng sinh: Ampicilin, Amoxcillin, Cefazolin, trong khi đó 87,5% (14/16)
chủng vi khuẩn kháng với Gentamycin và Neomycin. Bên cạnh đó kết quả mô
học cũng cho thấy có sự xâm nhập của vi khuẩn ở mô thận. Kết quả nghiên
cứu của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu về chuẩn đoán và phòng trị bệnh ở
cá chẽm.

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................. i
TÓM TẮT...................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH..................................................................................... vi
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU .............................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề............................................................................................. 1
1.1.1 Mục tiêu đề tài................................................................................ 2
1.1.2 Nội dung nghiên cứu ...................................................................... 2
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1 Đặc điểm sinh học của cá chẽm ............................................................ 3
2.1.1 Đặc điểm phân loại cá chẽm ........................................................... 3
2.1.2 Đặc điểm hình thái ......................................................................... 3
2.1.3 Đặc điểm phân bố và dinh dưỡng ................................................... 4
2.1.4 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm ............................................. 4
2.2 Tình hình dịch bệnh trên cá chẽm ......................................................... 5
2.2.1 Bệnh do virus ................................................................................. 5

2.2.2 Bệnh do ký sinh trùng..................................................................... 5
2.2.3 Bệnh do vi khuẩn............................................................................ 6
2.3 Một số nghiên cứu về phương pháp lập kháng sinh đồ .........................11
2.4 Một số nghiên cứu về vi khuẩn kháng thuốc trong nuôi trồng thủy sản ở
Việt Nam ...................................................................................................11
CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................14
3.1 Vật liệu nghiên cứu..............................................................................14
3.2 Phương pháp nghiên cứu......................................................................14
3.2.1 Phục hồi vi khuẩn ..........................................................................14
3.2.2 Kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa...................................................15
3.2.3 Định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep.....................................17
3.2.4 Lập kháng sinh đồ .........................................................................17

iii


3.2.5 Phương pháp mô bệnh học ............................................................19
CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................21
4.1 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu cơ bản ...............................................21
4.2 Kết quả kiểm tra bằng kít API 20 Strep................................................22
4.3 Kết quả kiểm tra NaCl 6,5 % và tan huyết............................................23
4.4 Kết quả kháng sinh đồ.........................................................................25
4.5 Kết quả mô học....................................................................................27
CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.....................................................29
5.1 Kết luận ...............................................................................................29
5.2 Đề xuất ................................................................................................29
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................30
PHỤ LỤC .....................................................................................................34
Phụ lục I ....................................................................................................34
Phụ lục II ...................................................................................................36

Phụ lục III..................................................................................................37

iv


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Đường kính vòng vô trùng theo tiêu chuẩn CLSI 2011.................. 17
Bảng 3.2 Qui trình xử lý mẫu trong máy tự động.......................................... 18
Bảng 3.3 Quy trình nhuộm mô. .................................................................... 19
Bảng 4.1 Kết quả NaCl 6,5% và Tan huyết. ................................................. 22

v


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Cá Chẽm (Lates calcarifer)............................................................ 3
Hình 4.1 Kết quả nhuộm gram...................................................................... 20
Hình 4.2 Kết quả test O/F............................................................................. 20
Hình 4.3 Kết quả test API 20 Strep sau 4 giờ................................................ 21
Hình 4.4 kết quae test API 20 Strep sau 24 giờ............................................. 21
Hình 4.4 Kết quả NaCl................................................................................. 23
Hình 4.5 Đĩa tan huyết dạng β ...................................................................... 23
Hình 4.6 Đĩa tan huyết dạng α ...................................................................... 23
Hình 4.7 Đĩa kháng sinh đồ .......................................................................... 24
Hình 4.8 Vi khuẩn xâm nhập trong mô thận cá chẽm.................................... 27

vi


CHƯƠNG I

GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Việt Nam có vùng biển rộng chiếm diện tích 1.000.000 km2, có đường bờ
biển kéo dài 3.260 km và rất nhiều đảo nhỏ, có hệ thống sông ngòi dày đặc.
Đây là điều kiện rất thuận lợi để nghề nuôi trồng thủy sản nước mặn, lợ phát
triển. Trong bối cảnh kinh tế hiện nay tình hình nuôi cá tra cá basa của Việt
Nam biến động bất thường, thì nghề nuôi trồng thủy sản nước mặn, lợ càng
khẳng định được vị thế của mình góp phần tăng đáng kể nguồn ngoại tệ cho
kinh tế nước nhà. Đặc biệt trong những năm gần đây nghề nuôi cá chẽm (Lates
calcarifer) đã và đang được đầu tư nghiên cứu phát triển góp phần đa dạng
hóa sản phẩm trên thị trường, cải thiện cuộc sống của người dân. Theo Mai
Đình Yên (1979) và Nguyễn Nhật Thi (1991), ở nước ta, cá chẽm phân bố
rộng khắp từ Móng Cái đến Cà Mau. Với diện tích 445.000 ha mặt nước ven
biển và trên 370.000 ha mặt nước vùng sinh thái ngập mặn, những năm qua,
nhu cầu thực phẩm thủy sản của xã hội ngày càng tăng nhanh, chính vì thế
nghề nuôi cá chẽm nước ta đã có những bước phát triển mạnh mẽ (Trích dẫn
bởi Huỳnh Nhật Thi, 2010). Với các ưu điểm như khả năng kháng bệnh cao,
sinh trưởng nhanh, chất lượng thịt ngon, rộng muối ... đã giúp cá chẽm (Lates
calcarifer) dần lên ngôi và được tiến hành nuôi thương phẩm tại nhiều địa
phương trên cả nước như: Hà Tĩnh, Quảng Nam, Bà Rịa- Vũng Tàu…. Tuy
vậy, sản lượng hàng năm vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ nội địa và
phục vụ chương trình xuất khẩu qua các thị trường chính như Úc, châu Âu và
Mỹ…..
Trước nhu cầu thực tế và những lợi nhuận từ cá chẽm (Lates calcarifer)
mang lại, thì người dân tự động mở rộng diện tích nuôi, không theo quy hoạch
cụ thể, đồng thời chưa có sự phối hợp đồng bộ với các cơ quan chức năng,
nuôi cá ở mật độ cao, thiếu kinh nghiệm và kỹ thuật nuôi, kết hợp với quản lý
yếu tố môi trường chưa tốt là những điều kiện rất thuận lợi để dịch bệnh bùng
phát. Trong đó bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại nghiêm trọng nhất. Hiện nay
chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh vi khuẩn trên cá chẽm (Lates calcarifer), vì

vậy khi cá mắc bệnh thì người nuôi lung túng trong viêc xử lý bệnh. Để góp
phần bổ sung kết quả nghiên cứu về bệnh của cá chẽm cũng như phổ biến
thiêm kiến thức cho người nuôi thì đề tài “Xác định đặc điểm sinh hóa và
khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ cá chẽm
(Lates calcarifer)” được thực hiện.

1


1.1.1 Mục tiêu đề tài
Xác định đặc điểm sinh hóa và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi
khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer)
1.1.2 Nội dung nghiên cứu
 Xác định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ cá chẽm
(Lates calcarifer).
 Định danh vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bằng bộ kít
API 20 Strep.
 Lập kháng sinh đồ xác định khả năng kháng thuốc của vi khuẩn phân
lập từ cá chẽm (Lates calcarifer).
 Tìm hiểu về đặc điểm mô bệnh học của cá chẽm (Lates calcarifer) bị
nhiễm bệnh.

2


CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm sinh học của cá chẽm
2.1.1 Đặc điểm phân loại cá chẽm
Cá chẽm còn gọi là cá Vược có hệ thống phân loại như sau:

Ngành:

Chordata

Lớp:

Osteichthyes

Bộ:

Perciformes

Họ:

Latidae

Giống:

Lates

Loài:

Lates calcarifer (Bloch, 1790)

Hình 2.1 Cá Chẽm (Lates calcarifer)
Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược , tên tiếng Anh: Sea bass, Barramundi, Giant
seaperch.
2.1.2 Đặc điểm hình thái
Cá chẽm có thân hình thon dài và dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu. Đầu
nhọn, nhìn bên cho thấy phía trên hơi lõm xuống ở giữa và hơi lồi ở lưng.

Miệng rộng và hơi so le, hàm trên kéo dài đến phía dưới sau hốc mắt. Răng
dạng nhung, không có răng nanh, trên nắp mang có gai cứng, vây lưng gồm có
2 vi: vi trước có 7-9 gai cứng và vi sau có 10-11 tia mềm. Vi hậu môn có 3 gai
cứng, vi đuôi tròn và có hình quạt. Vẩy dạng lược và có kích cỡ vừa phải, có
61 vẩy đường bên.
Màu sắc cá thay đổi theo vùng nước, trên mặt lưng có màu nâu, mặt bên
và bụng có màu bạc khi sống trong môi trường nước biển, màu nâu vàng khi

3


sống trong môi trường nước ngọt. Khi cá ở giai đoạn trưởng thành sẽ có màu
xanh lục hay vàng nhạt trên lưng và màu vàng bạc ở mặt bụng.
2.1.3 Đặc điểm phân bố và dinh dưỡng
Phân bố theo địa lý: cá chẽm phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới thuộc Tây Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương, ngoài ra chúng còn
phân bố ở khắp phần Bắc Châu Á, phía Nam kéo dài đến Queensland (Úc),
phía Tây Châu Phi.
Phân bố theo vùng sinh thái: Cá chẽm là loài rộng muối có thể sống
được ở các vùng nước ngọt, lợ, mặn và có tính di cư xuôi dòng. Cá thành
thục sinh dục thường tìm thấy ở các vùng cửa sông, hồ, hay các vùng nước lợ
có độ mặn cao và ổn định 30 –32 ‰, độ sâu 10 – 15 m. Ấu trùng mới nở (10
– 15 ngày tuổi, chiều dài dưới 1cm) thường phân bố ở các vùng biển ven bờ
gần các cửa sông nước lợ. Cá bột cỡ trên 1cm có thể gặp trong các thuỷ vực
nước ngọt (Lê Vũ Liệt, 2008).
Đặc điểm dinh dưỡng: Cá chẽm là loài cá dữ ăn thịt, tuy nhiên ở giai
đoạn cá giống lại là loài ăn tạp. Khi phân tích dạ dày cá thu ngoài tự nhiên (cỡ
1 – 10 cm) thấy 20% là phiêu sinh vật, chủ yếu là nhóm tảo khuê và thực vật
phù du, phần còn lại là tôm cá nhỏ. Khi cá lớn hơn 20cm, 100% thức ăn là
động vật bao gồm 70% giáp xác và 30% cá nhỏ (Kungvankij,1971).

2.1.4 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm
Cá chẽm là một loài có giá trị kinh tế cao, có tốc độ sinh trưởng nhanh,
thịt thơm ngon có thể nuôi ở các thủy vực nước ngọt, nước lợ và nược mặn, là
đối tượng nuôi quan trọng. kỹ thuật nuôi cá chẽm được phát triển lần đầu tiên
ở phòng thí nghiệm Songkhla Marine (Thái Lan) từ những năm đầu của thập
niên 70 và sau đó phát triển rộng ra các nước trong khu vực Như Trung Quốc,
Đài Loan, Ấn Độ, Malaysia, Inddooneessia, Singapore, Việt Nam…. Gần đây
được nuôi ở một số quốc gia như Mỹ, Hà Lan, Anh, Israel (Nguyễn Thị Thoa,
2011). Theo thống kê của FAO (2006) tổng sản lượng cá chẽm nuôi của thế
giới tăng 37,4% so với năm 1990.
Từ năm 1997 đến năm 2006, sản lượng cá chẽm hàng năm ở khu vực
châu Á - Thái Bình Dương luôn ở trong khoảng từ 20.000 - 27.000 tấn, phần
lớn cá chẽm được nuôi hồ hoặc lồng ở nước lợ cửa sông hoặc bờ biển. Năm
2004, sản lượng cá chẽm khoảng 25.399 tấn, năm 2005 khoảng 26.584 tấn và
năm 2006 tăng lên 27.522 tấn. Theo thống kê của FAO (2006) thì sản lượng cá
chẽm nước mặn, lợ của Thái Lan tăng hằng năm từ 3.884 tấn (1995) tăng lên
14.550 tấn (2004). ở Malaysia sản lương cá chẽm là 4.003,73 tấn (2002) tăng
4


lên 4.210,93 tấn (2003).ở Indonesia sản lượng khoảng 2.900 tấn (2004).
Từ năm 2005, khi công nghệ sản xuất giống nhân tạo cá chẽm đã hoàn
thiện, đối tượng này được nuôi khá phổ biến ở nước ta ở các ao nuôi ven biển
hay nuôi lồng tập trung ở các tỉnh Khánh Hòa, Quảng Ninh, Phú Yên, Hải
Phòng, Bạc Liêu, Sóc Trăngđã mang lại lợi nhuận cho người nuôi. Năm
2007, Trung tâm khuyến ngư Thừa Thiên Huế đã thực hiện thành công mô
hình nuôi thử nghiệm cá chẽm thương phẩm bằng lồng ở nước lợ tại xã Hải
Dương, Huyện Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế đến năm 2010 có hơn 118 hộ
với hơn 300 lồng nuôi cá chẽm.ở huyện Quảng Điền diên tích nuôi khoảng 21
ha (Trần Nam Hà và Trương Thị Hoa, 2010). Năm 2010 sau giai đoạn nuôi

thử nghiệm thành công, CTCP Vĩnh Hoàn đã tiến hành thả đợt giống đầu tiên
của Dự án nuôi cá Chẽm tại vùng nuôi ở tỉnh Bến Tre với diện tích là 170 ha
sẽ mở rộngdiện tích lên 300 héc ta vào năm 2012. Dự kiến, sản lượng cá
Chẽm của Vĩnh Hoàn trong năm 2011 là 700 tấn và 6.100 tấn vào năm 2013.
2.2 Tình hình dịch bệnh trên cá chẽm
2.2.1 Bệnh do virus
Bệnh hoại tử thần kinh lần đầu tiên được mô tả ở cá chẽm Dicentrarchus
iabrax bởi Bllance và Gallede (1988) và cá chẽm (Lates calcarifer Bloch,
1790) ở Úc (Glazebook et al.,1990). Cá chẽm 15–21 ngày tuổi nhiễm virus
Nordavirus đã gây chết từ 60–90% trong suốt quá trình nuôi (Vương Thị
Thoa, 2009).
2.2.2 Bệnh do ký sinh trùng
Leong và Wong (1990), kiểm tra 642 con cá chẽm giống (501 từ Thái
Lan, 141 từ Malaysia) có 10 loài KST được phát hiện, bao gồm 2 loài
Protozoa, 2 loài Monogenea, 4 loài Trematoda, 1 loài Cestoidea, 1 loài
Nematoda, 1 loài Isopoda. Khi kiểm tra 102 con cá giống bệnh từ Thái Lan,
kết quả tìm thấy 13 loài KST, gồm có 2 loài Protozoa, 2 loài Monogenea, 4
loài Trematoda, 1 loài Cestoidea, 2 loài Nematoda, 2 loài Isopoda. Số loài ký
sinh trùng phát hiện trên cả cá bệnh và cá khỏe là 16 loài, trong đó ở Thái
Lan cá đều bị cảm nhiễm nặng bởi Trichodina sp, Cryptocaryon irritans,
Pseudorhabdosynochus latesi và Diplectanum sp (Vũ Thị Ngọc, 2008).
Năm 1994, Leong và Wong thông báo gặp ít nhất 4 loài thuộc sán lá đơn
chủ (Monogenea) kí sinh trên mang cá chẽm. Bao gồm:
Pseudodorhabdosynochus latesi, P. monosquamodiscus và 2 loài khác thuộc
giống Diplectanum (Vũ Thị Ngọc, 2008).

5


Theo Đỗ Thị Hòa (2001) thì tại trại thực nghiệm hải sản trường đại học

Thủy sản Nha Trang, trong năm 2001 cá chẽm bố mẹ bị chết rải rác. Khi kiểm
tra mang cá đã phát hiện ký sinh trùng Pseudorhabdosynochus latesi cảm
nhiễm với cường độ cao 50 - 60 con / tơ mang
Năm 2003, Mai Đăng Nhân đã phân lập được 5 loại ký sinh trùng 1 loài
thuộc Monogenea, 1 loài Trematoda và 3 loài thuộc Nematoda trên 8 con cá
chẽm. Ngô Thu Hiền, 2004 khi kiểm tra trên 45 con cá chẽm giống phất hiện
được 3 loài kí sinh trùng thuộc Ciliata kí sinh ở nhớt da.
Theo kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Khuyên (2006), đã phát hiện
được 15 loài ký sinh trùng thuộc 12 giống trên cá chẽm. Năm 2007 Bùi Thị
Huyền cũng xác định được 17 loai ký sinh trùng thuộc 13 giống trong đó có 1
loài thuộc lớp Digenea. Gần đây nhất (2008) Vũ Thị Ngọc đã phân lập đươc
10 loài ký sinh trùng thuộc 3 giống Trichodinidae, Henneguyosis, Trùng loa
kèn.
Nhóm ngoại ký sinh là giáp xác chân chèo Copepoda và Isopoda cũng
gây những thiệt hại không nhỏ cho nghề nuôi cá chẽm, thậm chí đôi khi còn
gây nên tỷ lệ chết cao, đặc biệt là giai đoạn cá con. Chúng thường tấn công
vào mang, miệng, da, vây gây ra sự thiếu máu, bỏ ăn, chậm lớn. Một số giống
thường gặp là Lernanthropus, Caligus (Vương Thị Thoa, 2009).
Theo Huỳnh Thanh Thiện (2010) cho rằng ngoài nhóm nguyên sinh
động vật ký sinh, bệnh do ký sinh trùng ở cá chẽm còn liên quan đến nhóm
giun sán ký sinh. Có thể nói bệnh do giun sán ký sinh không gây ra những vấn
đề nghiêm trọng nhưng vẫn có ảnh hưởng nhất định đối với sức khỏe của cá,
làm chậm lớn cũng như làm giảm giá trị thương phẩm. Đã tìm thấy ở cá chẽm
các loài thuộc lớp sán lá đơn chủ, sán lá song chủ, giun tròn và giun đầu gai ký
sinh.
2.2.3 Bệnh do vi khuẩn
Theo báo cáo của Wong và Leong (2002) khi nghiên cứu so sánh về sự
cảm nhiễm Vibrio ở cá chẽm khỏe và cá chẽm bị bệnh nuôi lồng ở Penang,
Malaysia thì cho biết vi khuẩn Vibrio có thể gặp ở cả nước mặn và nước ngọt.
Nhưng tỷ lệ cảm nhiễm ở cá bệnh là 81%, cao hơn nhiểu so với cá khỏe là

38%. Cũng vậy, trong nghiên cứu của mình về các tác nhân gây bệnh là vi
khuẩn có liên quan đến cá chẽm, Loganathan & ctv cho rằng Vibrio là tác
nhân chính gây nên bệnh lở loét trên da cá (Vương Thị Thoa, 2009).
Theo Ruangpan (2003), cá bệnh xuất hiện dấu hiệu đặc trưng là lở loét,
xuất huyết trên da và mô cơ, xung quanh hậu môn xuất hiện các vết viêm tấy

6


và đỏ. Ngoài ra còn có sự xuất huyết trên gan, lách, thận kèm theo có cả sự
hoại tử. Ruột đặc biệt là trực tràng có thể bị sưng to và chứa đầy dịch. Cũng đã
phân lập được V. alginolyticus, V. parahemolyticus, V. anguillarum từ cá bệnh
(Huỳnh Thanh Thiện, 2010).
Nghiên cứu của Renaul et al. (2009) thì sự xuất hiện bệnh do Vibriosis
gây ra trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng ở Malaysia gây tỷ lệ chết cao,
thường mắc bệnh ở giai đoạn cá nhỏ biểu hiện là bỏ ăn, cơ thể sậm màu, xuất
huyết quanh hậu môn và các gốc vây, sau đó chết hàng loạt. Từ các mẫu bệnh
phẩm tác giả đã phân lập được 21 chủng vi khuẩn từ các cơ quan như: gan,
thận, tim, tỳ tạng, dựa vào các đặc điểm sinh hóa và hình thái đã xác định
được sự có mặt của vi khuẩn V. alginolyticus (Nguyễn Thị Thoa, 2011)
Theo nghiên cứu của Ransangan et al. (2009) thấy sự xuất hiện bệnh do
Vibriosis gây ra cá chẽm (Lates calcarifer ) nuôi lồng ở Malaysia gây tỷ lệ
chết cao, tác động rất lớn đến sản lượng cá nuôi ở nước này. Thông thường cá
ở giai đoạn nhỏ biểu hiện bỏ ăn, cơ thể sậm màu, sau đó chết hàng loạt. Ở giai
đoạn trưởng thành, cá có biểu hiện xuất huyết quanh hậu môn và các gốc vây.
Từ các mẫu bệnh nghiên cứu đã phân lập được 21 chủng vi khuẩn từ các cơ
quan bên trong như thận, tim, tỳ tạng và gan. Dựa vào đặc điểm hình thái và
hóa sinh đã xác định sự có mặt của V. alginolyticus (Nguyễn Thị Thoa, 2011)
Nguyễn Thị Thoa (2011) khi phân lập vi khuẩn gây bệnh lở loét trên cá
chẽm đã thu được 4 chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus. Sau khi tiêm vi

khuẩn vởi cá khỏe khoảng 8 đến 15h thì cá có dấu hiệu lở loét tại vết tiêm,
trên thân, dấu hiệu được xác định là tương tự như bệnh ngoài tự nhiên.
Bên cạnh đó, bệnh do Aeromonas xảy ra phổ biến ở cá lớn với những dấu
hiện như: lờ đờ, mắt lồi nhẹ, xuất huyết dạng hạt ở vây hậu môn, xuất huyết
nhiều ở cơ và cả những mô khác. Ở nội quan có thể gặp các dấu hiệu như: xuất
huyết ở gan, lách sưng, thận có thể bị hoại tử (Sunieszko, 1985; Carthy and
Roberts, 1980). Giai đoạn này của bệnh thường gây tỷ lệ chết thấp và cá có thể
sống sót mặc dù những con sống sót thì có những vết sẹo ở quanh vùng bị u
nhọt (Carthy, 1975). Giai đoạn mãn tính của bệnh thì không xảy ra thường
xuyên, không thể hiện được triệu chứng điển hình của bệnh (Sunieszko, 1958)
(Vương Thị Thoa, 2009).
Ngoài ra các vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Aeromonas sorbia,
Aeromonas cavie….. thường nhiễm ở cá chẽm nuôi nước ngọt làm cho cá
xuất huyết ở da, lờ đờ, chứa dịch trong xoang bụng, mang nhợt nhạt (Nguyễn
Thị Thoa, 2011).

7


Với các biểu hiện xuất huyết thì bệnh nhiễm trùng máu và xuất huyết do
Pseudomonas sp cũng gây tỉ lệ chết cao từ 20- 60% trên cá chẽm ở tất cả các
giai đoạn. Kumaran (2009) khi nghiên cứu cá chẽm nuôi ở một trang trại vùng
bờ biển Đông Nam của Ấn Độ đã phân lập ở cá mắc bệnh và định danh được
tác nhân gây bệnh là Pseudomonas sp. Sau đó gây cảm nhiễm trên cá chẽm
khỏe, thấy cá chết sau 2 ngày tiêm và tỷ lệ chết tích lũy sau 12 ngày là 70%.
Ngoài ra vi khuẩn Flexibacter cũng liên quan đến bệnh lở loét ở cá.
Flexibacteriosis nước mặn gây bệnh ở cá nuôi và cá ngoài tự nhiên ở châu
Âu, Nhật Bản, Bắc Mỹ và Australia. Căn bệnh này đã được báo cáo ở cá
chẽm. Bệnh xuất hiện trên cả cá trưởng thành và cá giống, tuy nhiên cá nhỏ
chịu ảnh hưởng bệnh nặng hơn cá lớn. Bệnh gia tăng về tỷ lệ và mức độ

nghiêm trọng khi nhiệt độ nước nuôi cao (trên 150C). Ngoài ảnh hưởng bởi
nhiệt độ nước, bệnh này ảnh hưởng bởi điều kiện gây sốc của môi trường
(stress) và yếu tố liên quan đến vật chủ (tổn thương bề mặt da). Nhìn chung, cá
bị bệnh biểu hiện miệng bị xuất huyết và mòn cụt, lở loét ở da, vây bị xơ và
thối đuôi (Nguyễn Thị Thoa, 2011)
Nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv. (2004), ở Việt Nam, trong nghề nuôi
cá lồng trên biển, bệnh Flexibacter đã xảy ra ở một số loài cá biển có giá trị
kinh tế như cá mú, cá chẽm, vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, vào mùa
mưa ở miền Nam.
Đỗ Thị Hòa và ctv. (2007), cũng xác định một loài vi khuẩn dạng sợi có
đặc điểm sinh hóa tương tự như Flexibaterium maritimus đã được xác định là
tác nhân gây bệnh ở cá chẽm, cá mú bị bệnh thối đuôi, mòn vây cũng như một
số loài cá biển nuôi ở Khánh Hòa. Bệnh thường gặp ở cá nuôi lồng hơn là ao
nuôi, tính chất mùa vụ không rõ ràng. Sự xảy ra của bệnh liên quan đến nhiều
yếu tố gây sốc như mật độ nuôi quá cao, biến động môi trường, sau những trận
mưa to.
Ngoài ra, ở cá chẽm nuôi tại Australia, người ta còn phân lập được một
loại trực khuẩn gram(-), sợi mảnh, trơn trượt, được xác định là Cytophaga
johnsonae. Cá bị nhiễm nhiều nhưng chỉ bị mòn trên bề mặt da, chủ yếu lầ
phần sau lưng, các con cá bị nặng ở cả vây ngực và miệng dưới. Loganathan
và ctv. (1989), nghiên cứu thành phần các loài vi khuẩn hiện diện trên cá chẽm
lở loét đã tìm thấy vi khuẩn dạng sợi thuộc giống Flavobaterium – Cytophaga
(Vương Thị Thoa, 2009).
Theo kết quả nghiên cứu của Vương Thị Thoa (2009) cho biết bệnh mòn
cụt, thối đuôi, lở loét do vi khuẩn là bệnh rất thường gặp ở cá chẽm và gây tỷ
lệ tử vong rất cao, gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Bệnh xảy ra ở giai

8

đoạn phát triển của cá đặc biệt thường gặp gây tác hại lớn ở giai đoạn cá nhỏ.
Kết quả tìm thấy 4 loài vi khuẩn Flexibacterium sp1, Aeromonas sp, Vibrio
alginolyticus, Vibrio sp… trong đó thì Flexibacterium sp1. Có tần số bắt gặp
cao nhất (33/33). Tiến hành cảm nhiễm ngược trở lại cá trong phòng thí
nghiệm với loài Flexibacterium sp1, sau 50 giờ theo dõi thì 100% cá chết với
các dấu hiệu bệnh lý tương tự như cá bị nhiễm ngoài tự nhiên. Qua nuôi cấy
phân lập thu được 1 loài vi khuẩn có đặc điểm hình thái sinh hoá hoàn toàn
trùng khớp với vi khuẩn cảm nhiễm ban đầu. Trong đó lô đối chứng hoàn toàn
không phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn cảm nhiễm. Qua đó đã chứng
minh được vi khuẩn dạng sợi Flexibacterium sp1. Là tác nhân chính gây bệnh
mòn cụt, thối đuôi, lở loét ở cá chẽm.
Các giống cầu khuẩn như: Streptococcus, Staphilococcus, Entercoccus,
Micrococcuss … được coi là tác nhân chính gây bệnh xuất huyết ở cá chẽm
với các dấu hiệu bệnh như: màu sắc cơ thể tối, mắt lồi, mang nhợt nhạt, xuất
huyết ở gốc vây bụng, vây ngực, đôi khi gặp tổn thương ở miệng dưới. Cá có
thể chết hàng loạt sau khoảng thời gian ngắn. Từ cá chẽm bệnh, đã phân lập
được Streptococcus iniae, là vi khuẩn gram(+), hình cầu, tồn tại dạng chuỗi,
có khả năng tan huyết, do vậy sự xuất huyết là một dấu hiệu điển hình của
bệnh (Vương Thị Thoa, 2009).
Streptococcosis là một bệnh truyền nhiễm xảy ra không chỉ ở cá nước
ngọt, cá nước mặn trong các trang trại nuôi mà còn thấy ở ngoài tự nhiên.
Theo thống kê đã có trên 27 loài cá nước ngọt và nước mặn nhiễm bệnh. Các
đối tượng nuôi nước mặn được báo cáo thấy xuất hiện bệnh như: yellowtail
(Kitao, 1982), cá chẽm (Lates calcarifer), Angullla japonica, Menhaden
(Brevoortia patronus) (Plumb et al., 1974, Cook và Lofton 1975), striped
mullet (Mugi1 cephalus), bluefish (Pomatomus saltatrix), striped bass
(Morone saxatilis) (Baya et al., 1990) và hybrid striped bass (Evans et al.,
2000). Bệnh cũng có thể xảy ra ở một số loài cá nước ngọt như: cá rô phi
(Press et al., 1998), cá hồi (Eldar và Ghittino 1999), cá ba sa (Pangasius
bocourti), cá chép (Cyprinus carpio) . Các chủng Streptococcus gây ra bệnh ở

động vật thủy sản là:, S. iniae và S. parauberis, S. agalactiae.
Các nhà khoa học phát hiện bệnh Streptococcus xảy ra đầu tiên ở châu Á
vào năm 1957 ở cá hồi vân tại Nhật Bản (Hoshina et al., 1958) và bắt gặp lần
đầu ở châu Âu vào năm 1993. Hiện nay, bệnh cũng đã thấy xuất hiện ở nhiều
quốc gia trên thế giới như: Nhật, Israel, Mỹ, Indonesia, Malaysia, Thái Lan….
Bệnh Streptococcus cũng đã gây ra các vấn đề nghiêm trọng cho thủy sản ở
Nam Phi và Nhật Bản. Ngoài ra cũng đã phát hiện Streptococcus sp trong

9


nước và trong dạ dày- ruột ở một số ít cá cảnh nhập khẩu ở Bắc Mỹ từ các
quốc gia ở khu vực Đông Nam Á (Trust và Bartlett 1974, Shotts et al., 1975).
Những loài cá khác nhau khi bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus đều xuất
hiện một số dấu hiệu chung, bao gồm: màu sắc đen tối, bơi lội không bình
thường, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang. Các vết
xuất huyết lan rộng thành lở loét, nhưng các vết loét thường nông hơn các
bệnh có lở loét khác. Cá bị bệnh vận động khó khăn, không định hướng, cá
bệnh có hình thức bơi xoắn, thận và tỳ tạng tăng lên về thể tích do phù nề. Sự
tổn thương nội quan là lý do gây chết. Tuy vậy, bệnh cũng có thể xảy ra ở thể
nhẹ (mãn tính), chỉ có một vài nốt xuất huyết trên thân mà không có hiện
tượng tổn thương nội tạng. Nhưng nếu bệnh ở dạng cấp tính, tỷ lệ gây chết cao
. Từ các mẫu cá nhiễm bệnh, người ta đã phân lập được ba nhóm Streptococci:
có khả năng gây tan huyết dạng alpha, beta va gamma (Đỗ Thị Hòa và ctv.,
2004).
Vào năm 1985, đã có báo cáo về bệnh xảy ra ở đối tượng cá chẽm tại
Singapore (Foo et al., 1985) và tại Trung Quốc vào năm 1990. Chủng vi
khuẩn gây bệnh được xác định là Streptococcus iniae, với tỉ lệ tử vong 16,7%32,6% (Huang et al., 1990) . Ngoài ra còn có các báo cáo về bệnh xảy ra trên
cá chẽm ở Port Hurt, Bathhurst (2005) với những dấu hiệu đặc trưng như đã
nêu trên ( trích dẫn bởi Nguyễn Xuân Nguyên, 2011).

Bệnh do Streptococcus nhiễm trên cá được xem là một bệnh ảnh hưởng
đến cá nuôi và cá ngoài tự nhiên trên khắp thế giới. Trong đó S. iniae là tác
nhân gây bệnh chính của bệnh Streptococcosis ở cá rô phi (Oreochromis spp)
và cá hồi vân tại Mỹ và Israel. S. iniae khi gây cảm nhiễm bằng phương pháp
ngâm trên cá chẽm tại Australia với liều gây chết LD50 là 2,5 x 105 CFU/ml
trong 2 ngày và 3,2 X 104 CFU/ml trong 10 ngày thì tỉ lệ chết >40% (Bromage
et al., 1999).
Theo Bromage và Owens (2002) ngâm S. iniae với liều gây chết LD50 là
2.0 x 10 4 và 3,2 x 104 CFU/ml trên cá chẽm bị tổn thương ở da trong 10 ngày
thì tỉ lệ cá chết rất cao. Khi tiêm vi khuẩn trong vòng 8 giờ thì cá chết và có
biểu hiện mắt mờ, kết quả mô học cho thấy có vi khuẩn hiện diện trong tất cả
các cơ quan ngoại trừ ruột cá. S. iniae gây ra tỉ lệ chết cao ở cá chẽm so với cá
rô phi khi cảm nhiễm vi khuẩn này với 2 loài cá trên ở nồng độ gây chết LD50
là 1.08 x 10 4 và 1.14 x 107. S. iniae được tìm thấy trong một số cơ quan như
gan, tuyến tụy, mắt, tim và não. Kết quả mô bệnh học phát hiện bao gồm hoại
tử tế bào, xâm nhập các tế bào lympho và hình thành u hạt trong các cơ quan
bị nhiễm bệnh ( Suanyuk et al., 2010).

10


S. iniae được tìm thấy ở cá ngoài tự nhiên tại vịnh Eilat. Bệnh có thể xảy
ra ở cá chẽm nuôi nước ngọt và nước mặn làm cho cá chết với tỷ lệ cao. Bệnh
đã được ghi nhận ở cá chẽm nuôi lồng ở biển tại miền bắc nước Úc vào năm
2005, cá bệnh có thể có các dấu hiệu như xuất huyết da và các vây xuất huyết
lan rộng thành lở loét, mắt bị mù, cầu mắt bị lồi và xuất huyết bên trong mắt,
mang bị sung huyết, da cá sẫm màu bơi lội không định hướng (Nguyễn Thị
Thoa, 2011).
2.3 Một số nghiên cứu về phương pháp lập kháng sinh đồ
Nghiên cứu của Geert (2002) đã chon cách trãi vi khuẩn lên môi trường

bàng que trãi thủy tinh độ đục của vi khuẩn được so sánh với ống chuẩn 0,5
McFarland và cho 0,1 ml dung dịch vi khuẩn trãi trên môi trường thạch. Đặng
Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (2002) đã sử dụng phương pháp
tráng dung dịch vi khuẩn lên môi trường MHA và NA để xác định loại kháng
sinh mẫn cảm với vi khuẩn gây bệnh. Trong thí nghiệm 2 tác giả đã cho khuẩn
lạc vi khuẩn vào 5ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng, cho lên môi trường thạch
khoảng 2/3 dung dịch vi khuẩn trong ống nghiệm, sau đó dùng pipet hút bỏ
dung dịch dư thừa.
Năn 2007, Tiết Ngọc Trân và Huỳnh Chí Thanh đều chọn cách so sánh
đọ đục của dung dịch vi khuẩn với ống McFarland số 3 và đều cho 0,2 ml
dung dịch vi khuẩn với cách trãi dung dịch vi khuẩn lên đĩa môi trường MHA.
Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) đã so sánh phương pháp lập kháng sinh
đồ dùng tâm bông để quét, trải vi khuẩn bằng que trải thủy tinh, tráng vi khuẩn
bằng pipet so sánh độ đục của vi khuẩn bằng 2 phương pháp đo bằng máy
quang phổ và ống McFarland số 3 trên 2 môi trường là MHA và NA kết quả
cho thấy cách trãi vi khuẩn ít dao động hơn cách quét và tráng, kích thước
vòng vô trùng trên môi trường MHA nhỏ hơn hoặc bằng so với đường kính vô
trùng trên môi trường NA, phương pháp so mật số vi khuẩn bằng máy quang
phổ cho đường kính vô trùng ít dao động hơn so với phương pháp dựa theo
ống McFarland số 3.
2.4 Một số nghiên cứu về vi khuẩn kháng thuốc trong nuôi trồng thủy sản
ở Việt Nam
Với nỗ lực tăng nhanh sản lượng thuỷ sản và kim ngạch xuất khẩu, các
nước đang phát triển nói chung hay Việt Nam nói riêng đều đang rất chú trọng
tới nuôi trồng thuỷ sản. Ðể đạt được sản lượng và lợi nhuận cao nhất, nhiều
ngư dân hiện đang áp dụng các phương thức nuôi thâm canh. Nhưng các vật
nuôi lại bị ảnh hưởng nhiều hơn bởi những áp lực và bệnh tật dẫn đến những

11

vụ dịch bệnh gây chết hàng loạt. Trong số các bệnh của thuỷ sản thì nguyên
nhân chủ yếu là do vi khuẩn gây ra với những vụ dịch bệnh có qui mô lớn.
Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn
gây bệnh. Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều các loại thuốc
kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng
thuốc kháng sinh trong thịt thuỷ sản. Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng
vi khuẩn kháng thuốc là việc sử dụng các loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ
trong thức ăn của thuỷ sản như một chất kích thích sinh trưởng.
Nguyễn Thanh Phương et al., 2004, vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá
tra ở Cần Thơ và Đồng Tháp đã kháng thêm oxolinic acid. Ngoài ra kết quả
kiểm tra độ nhạy với kháng sinh của 123 chủng vi khuẩn phân lập từ môi
trường đã kháng với chloramphenicol (30µg) (100%), kháng với tetracycline
(30 µg) (90%), trimethoprim/sulfadiazine (25 µg) (89%), ampicillin (10 µg)
(76%) và nitrofurantoin (300 µg) (65%). Trong khi đó chỉ 33% chủng được
kiểm tra là kháng với norfloxacin (10 µg).
Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long đã phân lập được 169 dòng vi khuẩn từ
các ao nuôi thủy sản và thử với 6 loại kháng sinh và kết quả cho thấy 2%
kháng với chloramphenicol, có 59% dòng vi khuẩn kháng với 4 hay 5 loại
kháng sinh trong đó có chloramphenicol, có 34% kháng với nhiều loại kháng
sinh như: chloramphenicol, ampicilline, tetracyline, trimethoprim &
sulfamchoxazone, nitrofurantion (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2005).
Theo nghiên cứu của tác giả Từ Thanh Dung và ctv (2004), cũng cho biết
vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh tại An Giang, Cần Thơ, Đồng
Tháp, Vĩnh Long cũng kháng với oxytetracycline, oxolinic acid và
sulphonamid. Đến năm 2008, tác giả này tiếp tục nghiên cứu trên 64 chủng vi
khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh ở An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp,
qua kết quả MIC cho thấy: đa số vi khuẩn kháng với streptomycin (83%),
oxytetracycline (81%), trimethoprim (71%), flumequine (8%), oxolinic acid
(6%) và enrofloxacin (5%).

Bên cạnh đó, từ kết quả kháng sinh đồ của Trương Thị Mỹ Duyên (2009)
đã có 3/8 chủng vi khuẩn A. hydrophila (37,5%) kháng với oxolinic acid.
Theo nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Xuân (2009) kết quả kháng sinh đồ
cho thấy 100% các chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng hoàn toàn với oxolinic
acid.
Năm 2009, kết quả nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh cho biết E.
ictaluri phân lập ở cá tra bệnh gan thận mủ từ các nghiên cứu tại Khoa Thủy Sản,
Đại Học Cần Thơ, kháng với Oxytetracylin (84,4%), Oxolinic acid (34,6%),
12


Sulphonamid (100%), Flofenicol (12,1%), Flumequin (7,8%) (www.uvvietnam.com.vn)

13


CHƯƠNG III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện tại Bộ
môn Sinh Học và Bệnh Học Thủy Sản – Khoa Thủy Sản – Trường Đại Học
Cần Thơ.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 01 năm 2012 đến tháng 04 năm 2012.
3.1 Vật liệu nghiên cứu
-

Thiết bị: Nồi hấp tiệt trùng, tủ sấy, tủ lạnh, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, máy
Vortex, kính hiển vi, máy lắc, máy so màu UV-Vis, Kính hiển vi, cân điện
tử, micropipet 1-5ml, 100-1000μl và 10-100μl…

-

Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, chai chịu nhiệt 250ml và 500ml, cốc đốt,
ống falcon tiệt trùng 50ml, que cấy, đèn cồn, bình xịt cồn, bộ tiểu phẫu,
găng tay tiệt trùng, que trãi, đầu col 5ml, đầu col xanh, đầu col vàng, khay
nhựa, viết lông dầu…

-

Hóa chất: NaCl, cồn tuyệt đối, NaH2PO4, Na2HPO4 , formalin, H2O2,
Oxidase, Catalase, O/F, ethanol, methanol, H2SO4, BaCl2, crystal violet.

-

Ammonium oxalate, iodine, alcohol, acetone, safranin, nước cất.

-

Loại đĩa kháng sinh: ampicillin (AM/10µg), amoxicillin (AML/25µg),
cefazolin (CZ/30µg), ciprofloxacin (CIP/5µg), doxycyclin (DO/30µg),
enrofloxacine (ENR/5µg), florfenicol (FFC/30µg), gentamicin (GM/10µg),
neomycin (N/30µg), Trimethoprim/sulfamethoxazole (SXT/1.25/23.75µg),
norfloxacin (NOR/5µg), tetracyclin (TE/30µg).

-

Môi trường: BHIB (Brain Heart Broth), TSB (Trypticase soy broth) , BA
(Blood Agar), MHA (Mueller Hinton Agar), BHIA (Brain Heart Agar), bộ
kít API 20 Strep.

-

Các chủng vi khuẩn nghiên cứu: 1 não 2a, 1 não 4, 1 thận 5, 2 thận 1, 2 não
1, 2 thận 2, 2 não 2a, 2 não 2b, 2 não 3, 2 thận 4, 2 não 4, 2 thận 5, 2 não 5,
2 thận 6, 2 não 6, 2 não 7.

3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phục hồi vi khuẩn
Vi khuẩn được lấy từ trong -80 0C, rã đông, sau đó dùng que cấy tiệt
trùng lấy vi khuẩn cấy lên môi trường BHIA + 1,5% NaCl để ở 36 0C sau 2414


48 giờ quan sát hình thái, màu sắc khẩn lạc. Nếu khuẩn lạc đã rời rạc và đồng
nhất thì tiến hành nhuộm gram để kiểm tra độ thuần, nếu chưa thuần thì tiếp
tục tách ròng.
3.2.2 Kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa
Phản ứng oxidae: Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên giấy lọc đã tẩm
dung dịch oxidase. Vi khuẩn cho phản ứng oxidase (+) sẽ làm giấy lọc chuyển
sang màu xanh trong 10 giây và ngược lại là âm tính (-).
Phản ứng catalase: Nhỏ 1 giọt dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 trong
100ml nước cất). Dùng que cấy lấy 1 ít vi khuẩn cho lên giọt H2O2 có sẵn trên
lame. Vi khuẩn cho phản ứng catalase (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong dung
dịch 3% H2O2 và ngược lại âm tính (-).
Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F): Đun và khuấy cho
tan hoàn toàn môi trường O/F.Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội
450C. Thêm 1% glucose tiệt trùng. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm. Cấy
vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường O/F. Sau đó phủ 0,5 – 1ml dầu
paraffin tiệt trùng vào ống nghiệm để tạo môi trường yếm khí trong ống
nghiệm. Để trong tủ ấm 280C theo dõi kết quả 1- 7 ngày.
Khả năng sinh H2S: Đun cho tan hoàn toàn môi trường TSI
(60g/1000ml). Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội 450C. Cho 3ml môi

trường vào ống nghiệm. Để nghiên ống nghiệm tạo thành một mặt phẳng
nghiên, chừa khoảng 2cm thạch đứng trong ống nghiệm để nguội.
Đọc kết quả sau 14-28 giờ. Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống
nghiệm. Vi khuẩn lên men đường glucose cho kết quả màu đỏ ở phần thạch
nghiên và màu vàng ở phần thạch đứng. Vi khuẩn lên men đường glucose và
lactose hoặc sucrose cho kết quả màu vàng ở phần thạch nghiên và thạch
đứng. Vi khuẩn lên chỉ men đường lactose hoặc sucrosecho kết quả màu
vàngở phần thạch nghiên và màu đỏ ở phần thạch đứng. Vi khuẩn không lên
men đường glucose và lactose hoặc sucrose cho kết quả màu đỏ ở phần thạch
nghiên và thạch đứng.
Phản ứng tạo Nitrate: Môi trường Nitrate Broth. Cho 3ml môi tường
vào ống nghiệm. Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội, cấy một ít vi
khuẩn vào trong ống nghiệm để ở tủ ấm 360C.
Thuốc thử: A: hòa tan 0,8% sunphanilic acid trong 5- N acid acetic
B: hòa tan 0,5 alpha- napthymin 5- N acid acetic

15


Sau 48 giờ nhỏ 1ml thuốc thử A và 1ml thuốc thử B vào ống nghiệm. Sau
1-2 phút môi trường chuyển sang màu đỏ (+) ngược lại (-).
Nhuộm gram
Chuẩn bị tiêu bản: nhỏ 1 giọt nước cất lên lame, dung que cấy lấy 1 ít vi
khuẩn trải đều trên giọt nước cất. Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó hơ lướt trên
ngon lửa đền cồn để cố định vi khuẩn trên lame.
Các bước thực hiên:
-

Nhỏ dung dịch crystal violet (dung dịch 1) lên lame để yên 1 phút

-

Rửa bằng nước cho hết màu tím trên lame ( khoảng 2 giây), để khô

-

Nhỏ dung dịch iodine (dung dịch 2) lên lame dể khoảng 1 phút

-

Lật nghiên lame cho dung dịch 2 chảy ra hết khỏi lame

-

Dung dung dịch cồn aceton (dung dịch 3) để tẩy màu bằng cách nghiên
lame nhỏ từ từ dung dịch 3 cho đến khi giọt cuối cùng trên lame không
còn màu tím. Rửa qua nước và để khô.

-

Nhỏ dung dịch safranin (dung dịch 4) lên lame, để khoảng 2 phút. Rửa
và để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát ở vật kính 100X
Đọc kết quả
-

Vi khuẩn Gram dương (G +) có màu tím xanh

-

Vi khuẩn Gram âm (G -) có màu hồng đỏ

Kiểm tra tính di động.
-

Sự di động của vi khuẩn có thể quan sát bằng phương pháp giọt treo
ở vật kính 40X

-

Cho Vaselineleen 4 góc của lamelle, đạt ngử lamelle lên bàn.

-

Nhỏ một giọt nước cất lên lamelle

-

Tiệt trùng que cấy, lấy 1 ít vi khuẩn cho lên lamelle hòa tan vào giọt
nước cất

-

Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sau cho lame không chạm vào
giọt nước cất chứa vi khuẩn.

-

Cẩn thận lật lame để giọt nước treo ngược lên lamelle, xem tính di
động ở vật kính 40X.

Khả năng phát triển ở môi trường có bổ sung 6,5 % NaCl
Pha môi trường TSB + 6,5% NaCl, sau đó rút 5ml dung dịch cho vào ống
nghiệm đem thanh trùng ở nhiệt độ 121 0C trong 15 phút. Tiếp theo dùng que
cấy đã tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy 1 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm.
Đọc kết quả sau 24- 48 giờ: vi khuẩn cho phản ứng (+) thì ống nghiệm có
chứa dung dịch bị đục ngược lại thì kết quả (-)
16


Khả năng gây tan huyết
Sử dụng môi trường BA (Blood Agar) + 5% máu cừu, dùng que cấy tiệt
trùng lấy 1 khuẩn lạc cấy lên đĩa petri có chứa BA (Blood Agar) + 5% máu
cừu, để trong tủ ấm ở nhiệt độ 360C đọc kết quả sau 24- 48 giờ.
-

Tan huyết dạng β: sự tan huyết lan rộng ra từ đường cấy tạo thành
những vòng tan huyết

-

Tan huyết dạng α: trên đường cấy vi khuẩn sử dụng máu biến đổi
thành màu xanh trên đường cấy

-

Tan huyết dạng γ: không có biến đổi gì khác

3.2.3 Định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep
Cho 5ml nước cất vào các giếng của khuôn nhựa. Đặt kit API 20 Strep
vào khuôn nhựa. Dùng que cấy hoặc tâm bông vô trùng lấy vi khuẩn cho vào

ống chứa 20 ml API Suspension Medium (dung dịch gốc). So màu đục vi
khuẩn trong ống API Suspension Medium sao cho tương đồng độ đục trong
ống McFarland số 4. Cho 500 μl vi khuẩn ở dung dịch gốc vào API GP
Medium (dung dịch 1). Lắc trộn điều vi khuẩn. Tiếp theo hút 100 μl dung dịch
gốc cho vào các ô VP, HIP, ESC, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP.
Cho đầy (nửa ô bên dưới) dung dịch gốc vào ô ADH. Cho cho đầy (nửa ô bên
dưới) dung dịch 1 vào các ô còn lại từ ô RIB đến ô GLYG . Tiếp tục cho dầu
(Mineral oil) đã được tiệt trùng vào (nửa ô bên trên) vào các ô từ ADH đến
GLYG. Đậy nắp khuôn nhựa. Ủ mẫu ở nhiệt độ 360C±2 0C.
Đọc kết quả:
Sau 4 – 4,5 giờ, cho thuốc thử vào các ô
VP: 1 giọt VP1 + VP2
HIP: 2 giọt NIN
PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP: 1 giọt Zym A + 1 giọt Zym B.
Xem kết quả sau 10 phút
Sau 24 giờ
Đọc kết quả các ô ESC, ADH, RIB đến GLYG
Không đọc lại kết quả các ô HIP, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP.
Đọc kết quả các ô dựa vào (Bảng C Phụ lục III)
3.2.4 Lập kháng sinh đồ

17