bước đầu nghiên cứu kỹ thuật tách, nuôi cấy protoplast khoai tây diploid phục vụ chương trình tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần

Bộ giáo dục và đào tạo
trờng đại học nông nghiệp hà nội
----------

----------

đào ngọc sơn

BC U NGHIấN CU K THUT TCH, NUễI CY
PROTOPLAST KHOAI TY DIPLOID PHC V CHNG
TRèNH TO GING KHOAI TY BNG DUNG HP
T BO TRN

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành: trồng trọt
Mã số: 60.62.01
Ngời hớng dẫn khoa học: ts. nguyễn thị phơng thảo

Hà Nội - 2009


LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan rằng số liệu kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa sử dụng ñể bảo vệ trong một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ trong luận văn này ñã ñược cảm
ơn, mọi thông tin trích trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2009
Tác giả

ðào Ngọc Sơn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp ñỡ về mặt chuyên môn
của các Thầy Cô giáo khoa Nông Học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà
Nội.
Tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến các thầy cô giáo thuộc bộ
môn Công Nghệ Sinh Học và GS. TS. Nguyễn Quang Thạch, TS. Nguyễn Thị
Phương Thảo, người ñã trực tiếp chỉ bảo và hướng dẫn tôi hoàn thành luận
văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến bạn bè và gia ñình giúp ñỡ cũng như hỗ trợ
ñiều kiện ñể tôi thực hiện luận văn này.
Một lần nữa xin trân trọng cảm ơn mọi sự giúp ñỡ quý báu trên./.
Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2009
Tác giả

ðào Ngọc Sơn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

ii


Mục lục
LI CAM OAN............................................................................................i

LI CM N ................................................................................................ii
Mục lục.....................................................................................................iii
DANH MC CC Kí HIU VIT TT....................................................vii
PHN I ..........................................................................................................1
M U .......................................................................................................1
1.1. T VN .........................................................................................1
1.2. MC CH V YấU CU CA TI .............................................3
1.2.1. Mc ủớch ca ủ ti..............................................................................3
1.2.2. Yờu cu ca ủ ti.................................................................................3
PHN II: TNG QUAN TI LIU...............................................................4
2.1. GII THIU CHUNG V CY KHOAI TY:......................................4
2.1.1. Ngun gc: ...........................................................................................4
2.1.2. c ủim thc vt hc: .........................................................................5
2.1.3, Giỏ tr dinh dng ca khoai tõy:..........................................................7
2.2. TèNH HèNH SN XUT KHOAI TY TRONG NC V TRấN
TH GII: .....................................................................................................8
2.2.1. Tỡnh hỡnh sn xut khoai tõy trờn th gii: ............................................8
2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai tây trong nớc ...............................9
2.3 Hiện tợng thoái hoá giống khoai tây .......................................................12
2.4. Các nghiên cứu tạo giống chịu virus ........................................................14
2.5. Giới thiệu chung về protoplast..................................................................16
2.5.1Khái niệm tế bào trần (protoplast ):.........................................................16
2.5.2. Phơng pháp tách Protoplast bằng enzym:............................................16
2.5.3 Các nghiên cứu về Protoplast trong thời kì 1960 - 1970 ........................16
2.5.4 Các nghiên cứu về Protoplast trong thời kì 1980 và 1990. .....................19
Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip

iii

2.5.5. Các phương pháp dung hợp ................................................................ 23
2.5.5.1. Dung hợp tự phát (spontaneuous fusion).......................................... 23
2.5.5.2. Dung hợp cảm ứng (induced fusion)................................................ 23
2.5.6. Khả năng xảy ra khi dung hợp ............................................................ 27
2.5.7. Lựa chọn sản phẩm dung hợp ............................................................. 27
25.7.1. Dựa vào sự khác nhau về hình thái ................................................... 28
2.5.7.2. Phương pháp nhuộm huỳnh quang................................................... 28
2.5.7.3. Dựa vào phương pháp kết hợp từ trường và gene chỉ thị kháng sinh ... 28
2.5.7.4. Dựa trên các biểu hiện di truyền, sử dụng các gene chỉ thị hoặc gene
ñánh dấu ....................................................................................................... 28
2.5.7.5. Dựa trên các dấu chuẩn di truyền ..................................................... 29
PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 30
3.1 ðối tượng vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu.............................. 30
3.2. Nội dung nghiên cứu. ............................................................................ 30
3.2.1 Nghiên cứu, hoàn thiện quy trình tách, nuôi cấy và tái sinh protoplast. 30
3.2.1.1 Thí nghiệm: Xác ñịnh nồng ñộ enzym tối ưu (cellulose/macerozym)
cho các dòng khoai tây nhị bội. .................................................................... 30
3.2.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ñến hiệu quả tách
protoplast...................................................................................................... 30
3.2.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của phương pháp khủ trùng môi trường ñến
khả năng phân chia của protoplast. ............................................................... 30
3.2.1.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy
khác nhau tới thời gian phân chia. ................................................................ 31
3.2.1.5 Thí nghiệm5: Nghiên cứu ảnh hưởng các môi trường rắn tới sự hình
thành microcallus. ........................................................................................ 31
3.2.1.6. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian chuyển sang môi
trường tạo microcallus tới sự hình thành microcallus. .................................. 31

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

iv


3.2.2 Bước ñầu xây dựng quy trình dung hợp protoplast bằng hoá chất PEG.
..................................................................................................................... 31
3.2.2.1 Thí nghiệm 1: nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ PEG khác nhau tới
hiệu suất dung hợp........................................................................................ 31
3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ PEG tới hiệu
quả dung hợp................................................................................................ 31
3.2.2.3 Thí nghiệm: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật ñộ protoplast tới hiệu
suất dung hợp bằng PEG. ............................................................................. 32
3.2.2.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp rửa PEG
khác nhau ñến chất lượng protopast sau dung hợp........................................ 32
3.2.2.5 Thí nghiệm5: Ảnh hưuởng nồng ñộ Ca2+ ñến sự tái tạo thành tế bào và
sự phân chia protoplast. ................................................................................ 32
3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 32
3.3.1. Tạo vật liệu in vitro............................................................................. 32
3.3.2. Tách tế bào trần. ................................................................................. 33
3.3.3.Dung hợp tế bào trần ........................................................................... 35
3.3.4. Các chỉ tiêu theo dõi ........................................................................... 35
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 36
4.1 Thí nghiệm 1: Xác ñịnh nồng ñộ enzym tối ưu (C/M) cho các dòng khoai
tây nhị bội..................................................................................................... 36
4.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ñến hiệu suất tách
protoplast...................................................................................................... 38
4.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của phương thức khử trùng môi trường tới khả
năng phân chia của Protoplast....................................................................... 44
4.4. Thí nghiệm4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và
các dòng khác nhau với thời gian phân chia của protolast............................. 45
4.5. Thí nghiệm 5: Kết quả môi trường thích hợp cho tạo microcallus.......... 48

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

v


4.6. Thí nghiệm 6: Kết quả ảnh hưởng thời gian chuyển sang môi trường
microcallus tới khả năng hình thành microcallus. ......................................... 49
4.7.Nghiên cứu xây dựng quy trình dung hợp protoplast bằng hoá chất PEG. .... 52
4.7.1 Nghiên cứu quy trình dung hợp protoplast bằng PEG .......................... 52
4.7.1.1 Thí nghiệm1: Kết quả thí nghiệm về ảnh hưởng nồng ñộ PEG khác
nhau tới chất lượng protoplast sau quá trình dung hợp.................................. 53
4.7.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ PEG khác nhau
ñến khả năng kết dính của protoplast............................................................ 54
4.7.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật ñộ protoplast tới hiệu
suất của quá trình dung hợp. ......................................................................... 56
4.7.1.4. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp rửa PEG khác
nhau tới chất lượng protoplast sau dung hợp. ............................................... 59
4.7.1.5. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ Ca2+ bổ sung vào
môi trường nuôi cấy ..................................................................................... 62
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ .......................................................... 66
5.1 KẾT LUẬN. ........................................................................................... 66
5.2 ðề nghị................................................................................................... 67
Tµi liÖu tham kh¶o ............................................................................ 68

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

1. NST: Nhiễm sắc thể
2. PVX: Potaco virus X
3. PVY: Potato virus Y
4. PEG: Polyethylene glycol
5. P/ml: Protoplast/ml dung dịch tách

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

vii


PHẦN I
MỞ ðẦU
1.1. ðẶT VẤN ðỀ.
Khoai tây (Solanum tuberosum) của họ Solanaceae (họ cà dược) là một
trong những loại rau củ ñược sử dụng rộng rãi nhất ở vùng khí hậu ôn ñới
phương Tây và là loại cây thực phẩm có giá trị kinh tế cao. Trong củ khoai
tây chứa nhiều protein, lipit và các loại vitamin như: Caroten, B1, B2, B3, B6
và vitamin C. Ngoài ra khoai tây còn chứa nhiều nguyên tố khoáng quan
trọng như: K, Ca, Mg và P[7].
Hiện nay, trên thế giới khoai tây ñứng hàng thứ 5 về diện tích trong các
loại cây trồng làm lương thực thực phẩm và ñứng thứ 4 về sản lượng[5]. Ở
Việt Nam khoai tây là một cây trồng vụ ñông quan trọng trong công thức luân
canh: lúa xuân-lúa mùa sớm-khoai tây và là một cây trồng lý tưởng cho vụ
ñông của ðồng bằng Bắc Bộ[2].
Một thực tế phải xét ñến là hầu hết các giống khoai tây ở nước ta ñều
cho năng suất thấp và phẩm chất kém dần mà nguyên nhân chủ yếu là do
thoái hoá giống với hai tác nhân: virus và sự già hóa của giống. Hiện tượng

này ñòi hỏi phải sớm ñược khắc phục ñể góp phần phát triển nền sản xuất
khoai tây ở nước ta[7].
Trong sự phát triển của Công nghệ sinh học hiện ñại thì công nghệ tế
bào trần ñã mở ra con ñường khắc phục hiện tượng trên. Công nghệ này ñã
ñược Wenzel (1979) ñề xuất thông qua sơ ñồ, ñó là bằng cách giảm ñộ bội
xuống một nửa (2n=2x=24), sau ñó chọn lọc cá thể lưỡng bội mang các ñặt
tính mong muốn và cuối cùng là dung hợp tế bào trần hai tế bào thể lưỡng bội
ñã chọn lọc ñể tạo giống khoai tây tư bội (tetrapoloid) ñã tổ hợp toàn bộ ñặc
tính mong muốn của hai thể lưỡng bội.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

1


Sơ ñồ tạo giống khoai tây sử dụng tổng hợp kỹ thuật:
Lai tạo, nuôi cấy hạt phấn, nhân ñôi nhiễm sắc thể và dung hợp tế bào
trần. (Wenzel và cộng sự, 1979)
a1*a2a3a4

Các dòng tứ bội
khởi ñầu

a1a2* a3a4

a1a2a3* a4 a1a2a3a4*

(4x)
Tạo dòng nhị bội nhờ kỹ thuật parthenogenetic

Chọn lọc

(2x)

a1*a

a2*a

a3*a

a4 * a

Tạo dòng ñơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn - nhị bội hoá tạo 2x

Chọn lọc

(2x)

a1*a1*

× a2*a2*

a*1a*2

Dòng tứ bội với ñặc tính

a3*a3* ×

(+)

a4*a4*

a*3a*4

a1*a2*a3*a4*

ñịnh hướng ñã tổ hợp.
a: Bộ genom ñơn bội
*: ðặc tính mong muốn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

2


Trên thế giới ñã có rất nhiều những công trình nghiên cứu và cũng
ñã ñạt ñược rất nhiều thành công trong việc tạo giống mong muốn thông qua
kỹ thuật dung hợp tế bào trần. Tuy nhiên ở Việt Nam có rất ít những nghiên
cứu về vấn ñề này. Nhằm nghiên cứu các kỹ thuật tách, nuôi cấy protoplast
của một số dòng khoai tây nhị bội (2n=2x=24) phục vụ cho công tác giống,
chúng tôi thực hiện ñề tài:
“Bước ñầu nghiên cứu kỹ thuật tách, nuôi cấy protoplast khoai tây
diploid phục vụ chương trình tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần”.
1.2. MỤC ðÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI
1.2.1. Mục ñích của ñề tài.
Nghiên cứu ñược kỹ thuật tách, nuôi cấy protoplast các dòng khoai
tây nhị bội nhằm tạo vật liệu cho dung hợp tế bào trần và tạo giống khoai tây
kháng bệnh virus bằng kỹ thuật này.
1.2.2. Yêu cầu của ñề tài.
Xác ñịnh ñược dung dịch enzym thích hợp cho tách protoplast từ mô

lá và kỹ thuật tách protoplast từ mô lá khoai tây
-

Xác ñịnh thời gian ủ enzym thích hợp cho việc tách protoplast từ
mô lá khoai tây.

-

Xác ñịnh ñược môi trường và các yếu tố vật lý thích hợp cho nuôi
cấy protoplast.

-

Xác ñịnh môi trường tạo Microcalus.

-

Xác ñịnh các thông số tối ưu cho quy trình dung hợp bằng hoá chất
PEG (nồng ñộ PEG, thời gian xử lý PEG, phương pháp rửa PEG.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

3


PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY KHOAI TÂY:
2.1.1. Nguồn gốc:

Khoai tây (tên khoa học là solanum tuberosum) có nguồn gốc hơn 8.000
năm truớc tại những khu vực nhiệt ñới cao của peru, nơi mà khoảng 5.500
loài khoai tây ñã ñược trồng bởi nhiều thế hệ nông dân tại vùng này. Chúng
ñược ñem tới Tây Ban Nha và Châu Âu trong thế kỷ 16, loài cây này nhanh
chóng thích nghi và sớm trở thành một loại thực phẩm chính tại thời ñiểm mà
dân số thế giới tăng nhanh.
Thời kỳ ñầu, khoai tây ñược thu hoạch với khối lượng lớn ở quần ñảo
Anh. Nó trở thành thức ăn chính ở Ireland trong thế kỷ 18 và do ñó ñược gọi
là Khoai tây Ireland ñể phân biệt với khoai lang. Ireland cũng phụ thuộc vào
khoai tây nhiều ñến nỗi vụ mà thất thu (do bệnh tàn rụi của cây cối) vào
những năm 1845 – 1846 ñã dẫn ñến bệnh dịch, tử vong và di cư lan rộng.
Khoai tây cũng ñóng vai trò quan trọng trong lịch sử thế kỷ 20 ở Châu
Âu, ñặc biệt là ở ðức. Nó ñã giúp cho nước ðức sống sót trong suốt hai cuộc
thế chiến.
Từ Châu Âu chúng ñược ñưa tới mọi nơi trên thế giới và ngày nay khoai
tây ñã ñược trồng trên một diện tích ước tính ñạt 180.000km2, từ cao nguyên
Vân Nam Trung Quốc tới vùng ñất trũng cận nhiệt ñới của Ấn ðộ, tới khu
vực cao nguyên gần xích ñạo Java và cho tận tới Ukraina. Với hàm lượng
carbohydrate cao, khoai tây là thực phẩm chính của người phương tây hiện
nay. Nó phát triển tốt nhất ở khí hậu lạnh và ẩm. ðức, Nga và Ba Lan là
những nước sản xuất nhiều khoai tây nhất Châu Âu[7].
Khoai tây du nhập vào Việt Nam từ những năm 1890 và chủ yếu ñược
trồng ở ñồng bằng sông Hồng (Nguyễn Quang Thạch, 1993)[3]. Diện tích
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

4


khoai tây trồng vào năm 1992 là 25.748 ha ñã tăng tới trên 35.000 ha vào niên
vụ 2002 – 2003 (ðỗ Kim Chung, 2003)[2]. Mức tiêu thụ khoai tây hàng năm ở

nước ta là 555.827 tấn. Năng suất khoai tây có tăng dần nhưng chậm, dao
ñộng từ 10 – 12 tấn/ha (Hồ Hữu An, 2005)[1]. Khoai tây còn ñược trồng trong
11 công thức luôn canh với lúa và rau màu trong hệ thống canh tác ở ñồng
bằng sông Hồng (ðỗ Kim Chung, 2003)[2].
2.1.2. ðặc ñiểm thực vật học:
Bộ rễ.
Rễ khoai tây thuộc loại rễ chùm (trồng từ củ), rễ móc (khi trồng bằng hạt),
từ rễ cọc phát triển thành nhiều phụ khác. Phần lớn rễ tập trung ở ñộ sâu 30 –
40cm, nhưng cũng có rễ ăn sâu tới 1,5-2m. Ngoài ra rễ còn phát triển ở trên
củ nhưng ngắn, ít phân nhánh và cũng có chức năng giống các rễ khác. Rễ
khoai tây phát triển mạnh ở thời kỳ ra hoa.
Thân.
Thân khoai tây mọc thẳng, ñôi khi có cấu tạo zích zắc, có 3-4 cạnh, cao
trung bình từ 40-70cm ñến 1-1,2m. Phụ thuộc vào giống, thời kỳ chăm
sóc…mà chiều cao cây có thể khác nhau. Thân thường có màu xanh hoặc
xanh nhạt xanh ñậm, ñôi khi có màu phớt hồng hoặc tím…tuỳ thuộc vào
giống.
Lá.
Lá khoai tây tương tự như lá cà chua nhưng có khác ở một số ñiểm, thuộc
lá phức tạp, Bản lá to, mọc cánh xẻ lông chim, có 3-4 ñôi mọc ñối xứng qua
trục và một lá lẻ trên cùng thường lớn hơn gọi là lá chét ñỉnh. Lá khoai tây dài
khoảng 10 – 15cm, mặt lá phẳng hoặc gợn sóng, bản lá thường to hơn lá cà
chua. Nhưng sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, ñiều kiện chăm sóc mà có
thể màu xanh, xanh ñậm hoặc xanh nhạt….

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

5

Hoa.
Hoa khoai tây thường mọc tập trung trên một chùm, thuộc loại hoa lưỡng
tính. Màu sắc hoa thường trắng, cũng có thể là phớt hồng, tím, vàng hoặc
ñỏ…phụ thuộc vào từng loại và giống.
Quả.
Quả thuộc loại quả mọng. Hình dạng tròn hoặc trái xoan. Khi chín quả
màu trắng bạc phớt hồng, mùi dễ chịu. Quả có từ 2-3 ngăn, trong ñó chứa
nhiều hạt (30-300 hạt).
Hạt.
Hạt khoai tây có dạng hình dẹt, màu cà phê sáng hoặc màu ñen. Khối
lượng 1.000 hạt = 0,5g. Thời gian ngủ nghỉ của hạt lâu.
Củ.
Củ là bộ phận dùng làm thực phẩm, có dạng hình tròn, elíp, tròn dài,
ñôi khi là hình vuông. Mùa sắc củ tuỳ thuộc vào giống, có thể là màu trắng,
trắng nhạt, vàng hay vàng nhạt…Trên củ có nhiều mắt củ, phân bố không
ñều, số lượng mắt củ nhiều hay ít phụ thuộc vào từng giống. Trên mỗi mắt củ
thường có 2-3 mầm ngủ và thường tập trung nhiều trên ñỉnh củ. Tuỳ thuộc
vào từng giống, thời vụ, ñất trồng, ñiều kiện chăm sóc mà có trọng lượng củ
khác nhau.
Khoai tây ưa khí hậu ấm áp, ôn hoà. Cụ thể: ở thời kỳ phát triển thân lá
nhiệt ñộ phụ hợp là 20-25oC; Thời kỳ hình thành và phát triển củ có giới hạn
nhiệt ñộ là 15 – 22oC nhưng ở nhiệt ñộ 16 – 18oC là thích hợp nhất cho việc
tích luỹ tinh bột vào củ. Khoai tây là cây ưa sáng, thời gian chiếu sáng dưới
14 giờ/ngày sẽ rút ngắn thời gian phát triển của cây: Thời kỳ bắt ñầu mọc ñến
khi xuất hiện nụ hoa cần ánh sáng dài ngày, thời kỳ phát triển củ cần ánh sáng
ngắn ngày.
Nhu cầu về nước của cây khoai tây cũng khác nhau theo từng thời kỳ,
thiếu hay thừa ñều ảnh hưởng ñến sinh trưởng, phát triển và khả năng cho
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

6


năng suất của cây: Theo kết quả nghiên cứu thì trong giai ñoạn từ khi trồng
ñến khi xuất hiện củ cần ẩm ñộ ñất là 60-80%, giai ñoạn phát triển củ cần ñộ
ẩm là 80%.
Khoai tây có thời gian sinh trưởng ngắn, từ 80 – 100 ngày, nhưng có năng
suất từ 15 -30 tấn củ/ha với giá trị dinh dưỡng cao [6].
2.1.3, Giá trị dinh dưỡng của khoai tây:
Khoai tây có thể cung cấp cho cơ thể những thành phần dinh dưỡng cao
nếu chúng ñược chế biến tốt. Theo các chuyên gia dinh dưỡng trung tâm y tế
Texas (Mỹ) thì dùng khoảng 203 g khoai tây/ngày có thể cung cấp ñược 50%
số lượng vitamin C và B6 cần thiết cho một người lớn/ngày. Trong 100g
khoai tây có 19g hydratcacbon (15g tinh bột và 2.2g chất xơ), 0.1g chất béo,
3g protein và 79 g nước. Ngoài ra khoai tây còn chứa nhiều vi chất dinh
dưỡng giá trị, ñặc biệt là các vitamin như: Các vitamin nhóm B (B1 -0.08mg,
B2-0.03mg, B3-1.1mg, B6-0.19mg), Vitamin C (20mg), cùng với nhiều
kháng chất như: Canxi, sắt, magie, photpho, kali…khoai tây còn ñược dùng
trong chăn nuôi: cứ 6.5kg khoai tây có thể chế biến thành 1kg thịt – ñó là
phương pháp cổ truyền biến tinh bột thành ñạm [7].
Hàm lượng protein của khoai tây cao nhất trong các loại cây lấy rễ và củ
(khảng 2,1% trong tổng số hàm lượng tươi). Protein trong khoai tây thường
có chất lượng cao, hợp chất amino axit của loại thực phẩm này phù hợp với
nhu cầu của con người. Chúng cũng giàu vitamin C - một củ khoai tây cỡ vừa
có khoảng hơn một nửa lượng vitamin mà con người cần trong một ngày.
Bên cạnh giá trị lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, khoai tây là
nguồn nguyên liệu cho ngành dược phẩm, cũng như sử dụng khoai tây làm
mỹ phẩm [2].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

7


2.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT KHOAI TÂY TRONG NƯỚC VÀ TRÊN
THẾ GIỚI
2.2.1. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới
Trên thế giới khoai tây ñược ñánh giá là cây lương thực quan trọng thứ tư
sau lúa mỳ, lúa nước và ngô. Các vùng ñất trũng ở Banglades và phái ðông
Ấn ðộ, trồng khoai tây giúp ñáp ứng ñược nhu cầu ngày càng tăng trong
ngành công nghiệp sản xuất thức ăn nhanh trong khi các khu vực lân cận vùng
Sahara (Châu Phi), khoai tây là một thực phẩm ñược ưa chuộng tại những khu
vực thành thị và là một loại cây trồng chính, ñem lại lợi nhuận ở những vùng
canh tác trên cao nguyên của các nuớc Cameroon, Kenya, Malawi, Nigeria,
Rwanda và Nam Phi…
Tuy nhiên bệnh mốc sương của khoai tây (potato late blight) – do một loại
nấm mốc phát tán theo gió gây ra- là một loại bệnh nguy hại nhất ở cây khoai
tây trên thế giới. Các nhà nghiên cứu tại trung tâm Khoai tây quốc tế (CIP)
ngày nay ñáng phát triển hệ thống quản lý dịch hại tổng hợp cho bệnh mốc
sương ở khoai tây bằng cách sử dụng những giống kháng bệnh lâu dài và ổn
ñịnh, kết hợp với các Trường chuyên ngành thử nghiệm và áp dụng những
tiến bộ kỹ thuật về quản lý bệnh.
Tại mỗi châu lục cũng như ở mỗi quốc gia, số lượng các nước trồng khoai
tây cũng như năng suất, sản lượng ñạt ñược là rất khác nhau: trong khi sản
lượng khoai tây ở các nước Châu Âu giảm, thì ở các nước ñang phát triển sản
lượng lại ngày một tăng, ñặc biệt là ở Trung Quốc và Ấn ðộ - ñiều này ñã dẫn
tới sản lượng khoai tây toàn cầu tăng gấp ñôi trong vòng 2 năm qua. Trong
các thập kỷ gần ñây, việc mở rộng diện tích trồng trọt khoai tây lớn nhất là ở
Châu Á, nơi có khoảng 8% số lượng khoai tây ñược trồng trên thế giới. Còn
với các quốc gia Châu Âu thì diện tích ñang có chiều hướng thu hẹp: Diện

tích trồng khoai tây tại ðức là 183.500 ha, tại Anh là 141.000 ha và tại Pháp
là 131.000 ha. Kể từ khi Liên Xô bị giải tán, Trung Quốc trở thành quốc gia
sản xuất khoai tây lớn nhất thế giới, tiếp theo là Ấn ðộ [7].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………

8


2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai tây trong nớc
Khoai tây đợc những ngời Pháp mang đến Việt Nam từ những năm
1890. Từ đó đến nay, tình hình sản xuất khoai tây nớc ta đ trải qua rất
nhiều bớc thăng trầm. Nếu nh trớc năm 1970, ở nớc ta khoai tây chỉ
đợc coi nh một loại rau với diện tích trồng rất nhỏ thì ngày nay khoai tây đ
có vị trí nhất định trong nền nông nghiệp nớc nhà. Diện tích khoai tây tăng từ
104.400 ha năm 1979 lên 25.784 ha năm 1992 và tính đến năm 2002 2003
nớc ta đ canh tác lên diện tích 34.5968 ha với năng suất đạt 12,04 tấn /ha
(tiềm năng có thể đạt 18 20 tấn/ha){2}.
Khoai tây đ thực sự trở thành một cây lợng thực quan trọng, một cây
trồng lý tởng trong các công thức luân canh vụ đông. Với 99 % diện tích cây
khoai tây (34.617 ha) đợc trồng trong vụ đông, chủ yếu luân canh với lúa,
khoai tây cung cấp nguồn thực phẩm cân bằng và tăng thu nhập trên một đơn
vị canh tác trong vòng 03 tháng cao hơn lúa, ngô hay khoai lang.
Mức cung về khoai tây ở nớc ta năm 2002 2003 là 521.036 tấn, trong
đó sản xuất trong nớc chiếm 81% và 19% phải nhập khẩu. Sản lợng khoai
tây trong nớc cung ứng ra thị thờng năm 2002 2003 là 421.036 tấn. Trong
khi đó, năm 2002 2003 tổng nhu cầu khoai tây ở Việt Nam là 530.000 tấn.
Tiêu dùng khoai tây ở nớc ta là 480.040 tấn (2003) và đạt khoảng 530.000
tấn năm 2005. Nhu cầu khoai tây chế biến là 12.200 tấn/năm. Nhu cầu cho
xuất khẩu là 4.300 tấn/năm (2003){2}. Mặc dù cho đến nay sản lợng khoai

tây cả nớc đ đạt khoảng 25.000 40.000 tấn/năm, ở nhiều vùng đ đạt năng
suất trung bình 20 27 tấn /ha nhng Viêt Nam vẫn tiếp tục là nớc nhập
khẩu khoai tây vì: nhu cầu về khoai tây không ngừng tăng vợt so với cung và
lợng khoai tây trong nớc chỉ n có trong vòng 06 tháng trong năm trong
khi nhhu cầu đòi hỏi phải có khoai tây quanh năm {30}. Lợng khoai tây
nhập khẩu hàng năm vào nớc ta khoảng 114.000 tấn. Trong đó 30% đợc
dùng làm giống, 62% đợc dùng làm khoai tây thịt và 8% đợc dùng chế biến.
Khoai tây đợc nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan, Mỹ. Giống khoai tây đợc
Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip

9


nhập khẩu chủ yếu là Diamant và Nicola (Hà Lan), Mariela (Đức), VT2
(Trung Quốc){2}. Dù vậy lợng khoai tây nhập từ Trung Quốc vẫn là chủ yếu,
chiếm 99,4% lợng nhập khẩu năm 2002.
Do điều kiện khí hậu, giống khoai tây của Việt Nam lại thoái hoá
nhanh, chỉ sau 3- 4 vụ trồng nên cần từ 5 10% khoai tây bị nhiễm virus là
bắt buộc phải thay giống mới. Mặt khác nông dân có thói quen sử dụng củ của
vụ trớc để làm giống cho vụ sau làm cho các bệnh hại khoai tây càng có điều
kiện lây lan và phát triển. Cùng với kĩ thuật thâm canh, sản xuất cũng nh
công tác bảo quản sau thu hoạch của ta còn hạn chế, vì vậy năng suất khoai
tây đạt thấp chỉ 10 12 tấn/ha, trong khi năng suất khoai tây của Đức là
35tấn/ha, Hà Lan 40tấn/ha
Bởi vậy nhiệm vụ trớc mắt là phải xây dựng đợc hệ thống sản xuất và
cung cấp giống sạch bệnh, chất lợng cao, bền vững đáp ứng nhu cầu của
nông dân. Nhằm nghiên cứu, nhân rộng giống khoai tây mới có năng suất,
chất lợng cao, tổ chức nông nghiệp không biên giới (Pháp) vừa chuyển giao
cho Viện Di truyền Nông nghiệp 5 giống khoai tây: Apolo, Binje, Claustar,
Deisir, Spunta (mỗi giống 25kg). Viện sẽ trồng thử nghiệm các giống khoai

tây mới này nhằm cải tạo chất lợng và ổn định năng suất nông sản, gia tăng
tính thân thiện của sản phẩm với môi trờng, đáp ứng nhu cầu sản phẩm sạch,
chất lợng cao của thị trờng.
Tính đến nay sau nhiều năm nghiên cứu, bằng công nghệ nuôi cấy mô,
Viện Sinh học Nông nghiệp đ cơ bản hoàn thiện hệ thống khoai tây sạch
bệnh. Viện đ sản xuất đợc 1,2 triệu củ giống siêu nguyên chủng có khả
năng trồng trên diện tích 10 15 ha trong năm 2005. từ diện tích trên, Viện sẽ
nhân đợc 100ha củ giống xác nhận (tơng đơng 100 tấn) nh các giống
Diamant, Solara, 3810 và ATC 53, nên tiềm năng sản xuất còn rất lớn. Song
khó khăn lớn nhất là vấn đề chuyển giao các loại giống này vào sản xuất đại
trà cho bà con nông dân. Để tháo gỡ khó khăn trên, Bộ Nông nghiệp và phát
triển Nông thôn đ đa: Dự án khoai tây Việt - Đức (do chính phủ CHLB Đức
Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip

10


tài trợ) tham gia vào chơng trình này và theo kế hoạch đ đợc kiến nghị
trong năm 2005 dự án sẽ hỗ trợ 50% giá củ bi và 5 triệu đồng cho 01 ha giống
nguyên chủng. Đồng thời kết hợp tập huấn khoa học kĩ thuật cho nông dân và
xây dựng mô hình áp dụng giống xác nhận và những giống khoai tây mới,
nhân rộng mô hình sản xuất khoai tây trên cả nớc.{32}
Hiện nay, tình hình sản xuất khoai tây ở nớc ta đ có những bớc phát
triển đáng kể. Vụ Đông năm 2005, HTX Lai Hạ huyện Lơng Tài đ thực
hiện thành công mô hình sản xuất khoai tây Diamant trên diện tích 10 mẫu với
năng suất trung bình đạt 700 kg/sào. Năm 2006 Lai Hạ tiến hành mở rộng
diện tích khoai tây lên 30 mẫu. ở Bắc Ninh, nhờ áp dụng các biện pháp sản
xuất tiên tiến, sử dụng giống chất lợng cao, năng suất khoai tây đ tăng từ
137 tạ năm 2000 lên 157 tạ năm 2005 {33}. Tại Bắc Giang, cùng với việc chỉ
đạo trồng hết diện tích 4000 ha khoai tây (trong đó có 1000 ha sử dụng giống

khoai tây chất lợng cao) theo kế hoạch, ngành nông nghiệp tỉnh đ hỗ trợ đầu
t xây dựng 04 kho lạnh bảo quản giống với quy mô 35tấn/kho. Đến nay vùng
sản xuất khoai tây ở Bắc Giang có quy mô 6000 ha sản lợng 96.000 tấn/năm.
Không những phát triển khoai tây bằng củ, cũng nh một số nớc Châu á
khác, công nghệ khoai tây bằng hạt lại tỏ ra phù hợp với điều kiện của Miền
Bắc Việt Nam. Từ những năm 1992 với sự trợ giúp của CIP, Viện khoa học kĩ
thuật Nông nghiệp Việt Nam đ nghiên cứu khả năng trồng khoai tây bằng hạt
lai ở cả đồng bằng Sông Hồng và miền núi phía Bắc. Năm 2005 kết quả cho
thấy:
- Năng suất của khoai tây trồng bằng hạt lai cao hơn so với giống
Thờng Tín trồng bằng củ 67%. Tỷ lệ khoai thơng phẩm có trọng lợng lớn
hơn 40gr gấp 02 lần so với trồng bằng củ.
- 07 tổ hợp lai đa vào thử ngiệm đều cho năng suất cao hơn giống địa
phơng. Tổ hợp Hồng Hà 2 và Hồng Hà 7 có những u điểm nổi bật về sinh
trởng, độ đồng đều và khả năng chịu bệnh sơng mai.

Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip

11


- Hiệu quả kinh tế của loại cây lai hạt cao hơn trồng bằng củ, dễ thay
thế giống hơn. Với 100g thay thế 02 tấn củ giống cho 01 ha.
Nông dân các tỉnh đồng bằng sông Hồng đặc biệt là Thái Bình rất nhạy
bén với công nghệ khoai tây lai. Năm 1996, Thái Bình tiếp nhận 20,5kg hạt lai
(chiếm 70% lợng hạt lai của cả nớc) trồng 230 ha ở 87 HTX. Qua 03 vụ sản
xuất giống ở vờn ơm thu l i gấp 10 lần, đời G0 (trồng từ hạt lai) thu l i hơn
07 lần, đời G1 (trồng từ cử G0) l i hơn 08 lần trồng bằng củ giống khoai tây
Thờng Tín. Năm 2002, diện tích khoai tây trong toàn tỉnh khoảng 15.000 ha
{33}.

Do nhu cầu thị trờng tăng lên và do tiến bộ kỹ thuật đợc áp dụng
trong sản xuất khoai tây đ làm cho năng suất khoai tây tăng lên. Cây khoai
tây ở Việt Nam đ thực sự đợc chú trọng phát triển. Cả nớc hiện còn khoảng
200.000 ha đất có thể trồng đợc khoai tây ở các vùng nh đồng bằng Sông
Hồng, miền núi phía bắc, Bắc trung bộ, Tây nguyên với tiềm năng năng suất
tối đa có thể đạt 30 40 tấn/ha. Với sự đầu t trên, nếu phát triển thuận lợi
trong 2 -3 năm tới, khoai tây giống nớc ta sẽ hoàn toàn chiếm lĩnh thị trờng
trong nớc và chúng ta rất có thể xuất khẩu khoai tây
2.3 Hiện tợng thoái hoá giống khoai tây
Sự thoái hoá giống khoai tây là một hiện tợng chung xảy ra ở tất cả
các nớc đ và đang trồng khoai tây. Hiện tợng này đ đợc Parmentier phát
hiện từ năm 1788 (Leviel, 1986). Macxuen (1872) đ mô tả hiện tợng này.
Khi sử dụng giống tại chỗ, sau một số vụ trồng liên tiếp, cây có biểu hiện sinh
trởng và phát triển kém. Một số khóm thấp lùn xuống, một số khóm lá bị
xoăn, thân lá loang lổ, dị dạng, củ nhỏ, năng suất giảm (Vũ Triệu Mân, 1986).
Giải thích hiện tợng thoái hoá khoai tây có nhiều quan điểm khác
nhau, nhng có thể tập trung lại thành 02 nhóm quan điểm lớn : Thoái hoá do
bệnh virus (nguyên nhân bệnh lý) và thoái hoá do các điều kiện sinh thái
(nguyên nhân sinh lý)

Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip

12


Kể từ khi phát hiện ra hiện tợng thoái hóa giống khoai tây của
Parmentier, phải đợi đến một thế kỷ sau con ngời mới xác định đợc những
đặc tính của virus và quy trách nhiệm cho chúng đ làm thoái hoá khoai tây.
Quan niệm cho sự thoái hoá khoai tây là một bệnh truyền nhiễm đ xuất phát
từ các phát minh nổi tiếng về virus gây bệnh cây của các nhà bác học

Ivanopaki (1892) và Beijerinck (1896). Các tác giả này phát hiện dịch chiết đ
làm sạch vi khuẩn của cây thuốc lá bị bệnh khảm lá có thể gây bệnh khảm lá
cho cây thuốc lá khác.
Vào những năm đầu thập kỉ 20, ngời ta mới chỉ phát hiện đợc 03 loại
bệnh virus chính hại khoai tây đó là : bệnh cuốn lá, bệnh khảm, bệnh hoa lá
(Leviel, 1986). Tiếp sau đó hàng loạt các tác giả đ tập trung nghiên cứu và
phát hiện nhiều virus gây bệnh hại khoai tây trong đó có 06 loại virus chính
là : PLRV gây bệnh cuốn lá, PVY gây bệnh xoăn lá, hoa, khảm, PVA gây
khảm hoa, PVX gây khảm, PVS, PVM.
Nói chung sự biểu hiện triệu chứng của bệnh virus phụ thuộc đồng thời
vào nhiều yếu tố: dinh dỡng, độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm, giống khoai tây
và chủng virus. Các triệu chứng thể hiện rõ nhất khi dinh dỡng cân đối, đầy
đủ ánh sáng và nhiệt độ thích hợp. Ngợc lại khi thừa Nitơ hoặc thiếu ánh
sáng trong nhà kính có thể che dấu hiện tợng khảm. Đối với cùng virus, có
tồn tại nhiều chủng khác nhau, tuỳ theo sự xâm nhập của chúng mà có thể gây
ra triệu chứng mạnh yếu khác nhau. Thí dụ virus Y có chứa nhóm Virus Y0 (Y
ordinaite) rất phổ biến thờng gây ra triệu chứng xoăn trong khi đó chủng Yn
(Y necrotique) gây khảm hoa là chính. ở virus cuốn lá và virus X cũng tơng
tự nh vậy.
Bệnh virus có những đặc tính rất nguy hiểm :
Không chữa đợc, làm thay đổi về quá trình trao đổi chất của cây, qua
đó ảnh hởng nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất cây trồng.

Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip

13


Bệnh virus nói chung và đặc biệt là virus hại khoai tây có đặc tính tấn
công không ngừng tất cả các tế bào, các cơ quan của cây bắt đầu từ điểm bị

nhiễm (Marlet, 1979). Virus không có sự trao đổi chất riêng và độc lập, nó
hoàn toàn phụ thuộc vào cây chủ. khi xâm nhập, virus sẽ làm cho hệ thống
ADN của tế bào cây chủ thay đổi đến mức tế bào cây chủ sẽ liên tục sản sinh
ra protein và axit nucleic của virus. Nh vậy tế bào chủ đ làm nhiệm vụ nhân
virus lên (Meyer.1986). Do sự giao thoa của virus vào sự trao đổi chất của cây
chủ, bất cứ một tác nhân nào ngăn chặn sự nhân lên ADN của virus thì cũng
ức chế sự sinh tổng hợp ADN của cây chủ. Chính vì thế có thể nói bệnh virus
là một bệnh không chữa đợc.
Bệnh virus có đặc tính di truyền nhất là khi khoai tây đợc nhân giống
bằng con đờng vô tính qua củ. Bệnh virus lan truyền nhờ côn trùng truyền
bệnh và tiếp xúc cơ giới. Nh vậy, hiện tợng thoái hoá khoai tây hay nói cách
khác sự còi cọc, biến dạng và giảm năng suất của cây khi sử dụng giống liên
tục tại chỗ, thực chất chỉ là hoạt động của các loài virus khác nhau vốn không
ngừng lây lan trong suốt quá trình trồng trọt.
2.4. Các nghiên cứu tạo giống chịu virus
Đ có rất nhiều nghiên cứu tạo giống chống chịu virus trên thế giới
đợc tiến hành và đ đạt những thành công nhất định. Do việc phòng chống
các môi giới truyền bệnh nh( rệp, nhện,) rất khó khăn, nên các nghiên cứu
tập trung vào việc chọn tạo ra các giống chống chịu virus. Quá trình chọn tạo
giống khoai tây bằng các phơng pháp kinh điển nh lai tạo, đột biến, chọn
lọc (Kuchkuck và cộng sự, 1985) vấp phải những khó khăn về mặt di truyền.
Trên cơ sở bộ genom tứ bội (2n = 4x = 48) tạo ra tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo
khiến quá trình chọn lọc sau đấy rất khó khăn với một quần thể lớn. Quá trình
tạo một giống mới mất rất nhiều công sức và thời gian. Tối thiểu phải trên 10
năm để ra một giống mới (Fischen, 1984). Mặt khác, các đặc tính di truyền đa
gen cần đợc chuyển nạp khi lai tạo giữa các dòng hoang d và dòng trồng
trọt thờng bị thất thoát nhiều, thậm chí mất hẳn qua quá trình giảm phân của
Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip

14

các thế hệ con cháu (Moller, 1990). Ngay từ năm 1963, Chase đ đề nghị một
sơ đồ tạo khoai tây dựa trên khả năng giảm mức bội thể nhị bội. Cây khoai tây
nhị bội (2n = 2 = 24) có thể thu đợc qua kĩ thuật nuôi cấy bao phấn từ các
dòng tứ bội (Foroughi Wehr và cộng sự, 1977; Mix,1983) hay cũng có thể thu
đợc theo con đờng mẫu sinh khi lai khoai tây tứ bội với loài khoai tây dại
Solamum phureja (Hougas và cộng sự, 1958). Việc đa các thể nhị bội vào
công tác chọn giống khoai tây đ làm đơn giản hoá tỷ lệ phân ly sau lai tạo.
Hơn thế nữa, nhờ có kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn từ các dòng nhị bội này lại có
thể thu đợc các dòng đơn bội (1n = 1x = 12). Thể đơn bội này sau khi nhân
đôi nhiễm sắc thể sẽ trở thành nhị bội đồng hợp tử. Những vật liệu nhị bội
đồng hợp tử này là những vật liệu khởi đầu rất quan trọng cho việc tạo giống
chống chịu. Tuy nhiên chọn tạo giống trên cơ sở những dòng nhị bội này gặp
phải hai khó khăn chính: Khả năng thụ tinh của các thể dị bội giảm mạnh đôi
khi bất thụ. Khi trở lại dạng trồng trọt bằng cách nhân đôi một cách đơn giản
các thể dị bội này sẽ làm giảm độ dị hợp tử, làm giảm năng suất và sức sống
của cây tứ bội tạo ra. Để khắc phục những hiện tợng trên, sự ra đời của sơ đồ
tạo giống tổng hợp phân tích của Wenzel và cộng sự (1979) là bớc ngoặt
quyết định trong việc sử dụng phối hợp các phơng pháp kinh điển và hiện đại
vào công tác chọn tạo giống khoai tây. Khâu cuối của sơ đồ tạo giống này là
sự dung hợp của hai tế bào trần nhị bội để cuối cùng tái sinh nên con lai tứ
bội. Hai dạng nhị bội dị hợp tử đ qua chọn lọc sẽ tổ hợp nên một thể tứ bội
định hớng hoàn toàn dị hợp không hề phải trải qua một quá trình giảm phân
nào. Thể tứ bội này có thể đợc nhân vô tính và ngay lập tức trở thành một
giống ổn định. (Deimling, 1986). Mặt khác, thông qua dung hợp, hàng rào lai
tạo giữa các cây xa nhau về mặt di truyền cũng đợc vợt qua. (Nguyễn
Quang Thạch, 1993){2}.

Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip

15


2.5. Giới thiệu chung về protoplast
2.5.1Khái niệm tế bào trần (protoplast ):
Tế bào trần (protoplast) là tê bào vi khuẩn và tế bào thực vật bị tách bỏ
thành tế bào nhờ phơng pháp vật lý hoặc enzym, chỉ còn phần nguyên sinh
chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt bên
trong và bên ngoài tế bào.
Haberland (1902) ln ủu tiờn ủó quan nim rng mi t bo bt k ca
mt c th sinh vt ủu cú kh nng tim tng ủ phỏt trin thnh 1 cỏ th
hon chnh. Tuy nhiờn phi ch ủn nhng nm cui ca thp k 60 mi cú
nhng kt qu v s tỏi sinh thnh cụng cỏc cõy hon chnh t cỏc t bo tỏch
ri, mt phỏt trin vt bc ca k thut nuụi cy thc vt invitro.
Kĩ thuật tách protoplast do Cooking khởi xớng (1960), sau đó đợc cải
tiến và sử dụng thành công trên nhiều đối tợng cây trồng khác nhau. Đặc biệt
là các cây họ hoà thảo và họ cà Protoplast là cơ sở quan trọng cho các biện
pháp lai soma và chuyển nạp gen nhằm cải tạo các giống cây trồng.{4}
2.5.2. Phơng pháp tách Protoplast bằng enzym:
Đây là phơng pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: từ 1g lá tơi có
thể thu nhận đợc 6 12 triệu tế bào trần. Nguyên tắc chung của phơng pháp
này là sử dụng hỗn hợp enzym: Xelluloza, hemixelluloza và pectinaza để phân
giải thành tế bào và giải phóng các tế bào trần.
Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào đợc tách ra, tế bào trần
phải đợc phóng thích ngay vào môi trờng có áp suất thẩm thấu cao để tránh
nớc xâm nhập vào không bào gây vỡ tế bào chất.
Nồng độ chất tạo áp suất thẩm thấu và thời gian lu trữ tối đa là thay
đổi thích hợp cho từng loại cây trồng.
2.5.3 Các nghiên cứu về Protoplast trong thời kì 1960 - 1970

Việc giới thiệu về quy trình sử dụng enzym để tách tế bào trần thực vật
(Cooking, 1960){11} đ đa ra bộ mặt mới đầy hứa hẹn cho tế bào thực vật,

Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip

16


nuôi cấy mô và mở ra một lĩnh vực mới trong sinh học tế bào thực vật. Dới
tác động của hệ enzym phân huỷ vách tế bào làm lộ ra bề mặt màng tế bào
một rào cản giữa môi trờng bên trong và bên ngoài tế bào giúp tiếp cận đến
màng sinh chất có ý nghĩa là thí nghiệm có thể đợc thiết lập để nghiên cứu và
thao tác trên các thuộc tính của màng tế bào.
Do tính sẵn sàng có thể sử dụng tế bào trần cho các phơng pháp phá vỡ
tế bào để nhanh chóng thâu nhận các bào quan và các đại phân tử mà không
gặp phải sự biến dạng, h hỏng nh các phơng pháp trích ly thông thờng
(Howland, 1975) nên tế bào trần đợc sử dụng rộng r i trong nhiều lĩnh vực
thí nghiệm, từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất (Ruesink,
1973) đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu những phần tử (Willison,
1971), các bào quan ( Potrykus, 1975) và vi sinh vật (Davey, 1972){7}.
Giai đoạn chính trong sự phục hồi trở lại của tế bào trần trong môi
trờng nuôi cấy nguyên vẹn là quá trình tổng hợp và phát sinh trở lại vách tế
bào (Pojinar, 1967). Tế bào trần phân lập từ mô cà chua đợc khảo sát chi tiết
đầu tiên quá trình cung cấp enzym để phục hồi trở lại vách tế bào
(Pojinar,1967). Mặc dù báo cáo đầu tiên về enzym phân lập tế bào trần đợc
công bố vào năm 1960 (Cooking, 1960){11} nhng m i đến 10 năm sau sự
phân chia tế bào đầu tiên từ tế bào trần mới đợc báo cáo) Nagata và Takebe,
1970){20}: Thí nghiệm khảo sát tế bào thịt thuốc lá thuốc lá tái tạo nhanh
chóng vách tế bào mới và khoảng 60 80% số vách tế bào mới đ phân cắt tế
bào trong môi trờng nuôi cấy. Mô sẹo đợc hình thành thúc đẩy sự tạo thành

cành non rồi sau đó là cây thuốc lá nguyên vẹn (Takebe, 1971). Cùng thời
gian đó, Kao (1974){16} cũng quan sát sự tái tạo và phân chia tế bào trần của
cây đậu nành trong môi trờng nuôi cấy. Và đến cuối năm 1970 thì nó đ trở
thành quy trình trong nhiều phòng thí nghiệm. Tuy nhiên theo Evans và
Cooking (1978) thì còn có một số vấn đề cần khắc phục đó là môi trờng nuôi
cấy, yếu tố vật lý, môi trờng và yếu tố di truyền.

Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip

17