TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CAO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
-------------------------

Nguyễn Thị Hà

TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM
SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME
CHITINASE CAO
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
- Luận văn này là công trình nghiên cứu khoa học của tôi
- Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố

Tác giả luận văn


LỜI CÁM ƠN
Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy là giảng viên khoa sinh học trường
Đại học su phạm TP HCM, người đã định hướng đề tài cho tôi, quan tâm, giúp đỡ và thông cảm cho

hoàn cảnh của tôi. Người đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quí báu cho tôi, đã nhiệt tình
hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cám ơn TS. Dương Thị Hương Giang là giảng viên giảng dạy môn Enzyme
học, viện công nghệ sinh học trường Đại học Cần Thơ, người đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện đề tài
Tôi xin cám ơn các em sinh viên: Phạm Thị Mỹ Ánh, Cao Thị Mỹ Phương, Nguyễn Huỳnh
Trang Thu Hương, Nguyễn Trần Khiết lớp Công nghệ sinh học tiên tiến K33, Quang Anh Thư,
Trần Kim Thoa, Vương Thị Hồng Thắm lớp Sư phạm Sinh học K34 đã nhiệt tình hỗ trợ tôi trong
quá trình thực nghiệm và tổng hợp kết quả.
Tôi xin cám ơn cha mẹ, chồng và các người thân của tôi, những người đã chăm sóc cho con tôi,
và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình đi học và thực hiện đề tài.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2011
Nguyễn Thị Hà


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................................ 2
15T

15T

LỜI CÁM ƠN ...................................................................................................................................... 3
15T

T
5
1

MỤC LỤC ........................................................................................................................................... 4
15T

T
5
1

DANH MỤC VIẾT TẮT ..................................................................................................................... 8
15T

15T

MỞ ĐẦU .............................................................................................................................................. 1
15T

T
5
1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................. 2
15T

15T

1.1. NS trong hệ sinh thái RNM ...................................................................................................... 2
15T

15T

1.1.1. Giới thiệu về RNM ............................................................................................................. 2
T
5

1

15T

1.1.2. Đặc điểm sinh học NS ở RNM .......................................................................................... 3
T
5
1

T
5
1

1.1.2.1. Đặc điểm hình thái ....................................................................................................... 3
T
5
1

15T

1.1.2.2. Đặc điểm sinh sản ........................................................................................................ 4
T
5
1

15T

1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí – sinh hóa .......................................................................................... 4
T
5

1

T
5
1

1.1.2.4. Đặc điểm phân loại nấm sợi ......................................................................................... 7
T
5
1

T
5
1

1.1.2.5. Vai trò của NS trong hệ sinh thái RNM ........................................................................ 9
T
5
1

1.2.

T
5
1

Chitin và chitinase ................................................................................................................ 10

15T

15T

1.2.1. Nguồn chitin: ................................................................................................................... 10
T
5
1

15T

1.2.2. Chitinase ........................................................................................................................... 13
T
5
1

15T

1.2.2.1. Nguồn chitinase: ........................................................................................................ 13
T
5
1

15T

1.2.2.2. Cơ chế hoạt động: ...................................................................................................... 13
T
5
1

15T

1.2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase: .................................................................. 14
T
5
1

T
5
1

1.2.2.4. Tính chất sinh hóa của chitinase ................................................................................. 14
T
5
1

T
5
1

1.2.2.5. Phân loại chitinase ..................................................................................................... 15
T
5
1

15T

1.2.2.6. Ứng dụng của chitinase .............................................................................................. 16
T
5
1

15T

1.2.3. NS với khả năng sinh enzyme chitinase ........................................................................... 19
T
5
1

T
5
1


1.2.3.1. Một số chủng NS có HT chitinase cao........................................................................ 19
T
5
1

T
5
1

1.2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp chitinase ở NS ............................................... 20
T
5
1

T
5
1

1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitinase trong và ngoài nước ............................................ 21
15T

T
5
1

1.3.1. Ngoài nước...................................................................................................................... 21
T
5
1

15T

1.3.2. Trong nước....................................................................................................................... 24
T
5
1

15T

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................................................. 25
15T

T
5
1

2.1. Vật liệu .................................................................................................................................... 25
15T

T
5
1

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................................... 25
T
5
1

15T

2.1.2. Hóa chất, nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ ......................................................................... 25
T
5
1

T
5
1

2.1.3. Môi trường ....................................................................................................................... 26
T
5
1

15T

2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................................... 27
15T

15T

2.2.1. Phương pháp kích hoạt giống .......................................................................................... 27
T
5
1

T
5
1

2.2.2. Phương pháp bảo quản nấm sợi ...................................................................................... 27
T
5
1

T
5
1

2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại NS .............................................................. 28
T
5
1

T
5
1

2.2.4. Phương pháp xác định mật số BT vi sinh vật [5] ............................................................. 28
T
5
1

T
5
1

2.2.5. Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng KL ............... 29
T
5
1

T
5
1

2.2.6. Phương pháp nuôi cấy NS trên MT bán rắn thu enzyme chitinase ................................. 29
T
5
1

T
5
1

2.2.7. Phương pháp tách chiết enzym thô từ canh trường nuôi cấy .......................................... 29
T
5

1

T
5
1

2.2.8. Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường
T
5
1

kính vòng phân giải ................................................................................................................... 30
15T

2.2.9. Phương pháp xác định HT của enzyme chitinase bằng phương pháp so màu ................ 30
T
5
1

T
5
1

2.2.10. Phương pháp định lượng protein [8] ............................................................................. 33
T
5
1

T
5

1

2.2.11 Khảo sát MT và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase của các chủng
T
5
1

NS. [4], [10], [23], [32], [33] ...................................................................................................... 35
15T

2.2.11.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon trong MT nuôi cấy ..................................... 35
T
5
1

T
5
1

2.2.11.2.Khảo sát thời gian nuôi cấy....................................................................................... 35
T
5
1

T
5
1


2.2.11.3. Khảo sát pH của MT ................................................................................................ 35

T
5
1

15T

2.2.11.4. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy ....................................................................................... 36
T
5
1

T
5
1

2.2.11.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl .................................................................... 36
T
5
1

T
5
1

2.2.11.6. Khảo sát hàm lượng cơ chất chitin ........................................................................... 36
T
5
1

T

5
1

2.2.12. Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm P. citrinum bằng qui hoạch thực nghiệm [10], [17]..... 36
T
5
1

T
5
1

2.2.13. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P. citrinum [4], [43], [44] ............. 39
T
5
1

T
5
1

2.2.13.1. Thu nhận tủa protein ................................................................................................ 39
T
5
1

15T

2.2.13.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CPE chitinase thô [9] ......................... 39
T

5
1

T
5
1

2.2.13.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của chitinase ..................................................... 39
T
5
1

T
5
1

2.2.14. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm tăng sinh khối NS Rhizoctonia solani của
T
5
1

chế phẩm enzyme chitinase [4], [20] .......................................................................................... 40
T
5
1

2.2.15. Ứng dụng chế phẩm chitinase vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm
T
5
1

[4], [46]....................................................................................................................................... 41
T
5
1

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................................... 42
15T

T
5
1

3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ
15T

........................................................................................................................................................ 42
3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng thu được ................................................. 43
15T

T
5
1

3.2.1. Chủng nấm số 16 ............................................................................................................. 43
T
5
1

15T

3.2.2. Chủng nấm số 10 ............................................................................................................. 45
T
5
1

15T

3.3. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2
15T

chủng NS P. citrinum và A. protuberus ......................................................................................... 47
T
5
1

3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn C trong MT nuôi cấy ................................................................... 47
T
5
1

T
5
1

3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .................................................................................. 48
T
5
1

T
5
1

3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy ............................................................................. 51
T
5
1

T
5
1

3.3.6. Ảnh hưởng của HL chitin trong MT nuôi cấy ................................................................. 53
T
5
1

T
5
1

T
5
1


3.3.7 Kết quả qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả
T
5

1

năng sinh tổng hợp chitinase của chủng P. citrinum ................................................................ 55
T
5
1

3.4. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P. citrinum ........................................ 58
15T

T
5
1

3.4.1. Thu nhận CP chitinase thô bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 ......................................................... 58
T
5
1

R

R

R

R

R

R1

T
5

3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CP chitinase ............................................ 58
T
5
1

T
5
1

3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của CPE chitinase thô ........................................... 60
T
5
1

T
5
1

3.5. Bước đầu thử nghiệm ứng dụng CPE chitinase thô để phòng trừ nấm hại cây trồng ........ 62
15T

T
5
1

3.5.1. Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc kìm hãm tăng sinh khối nấm Rhizoctonia solani. 62
T

5
1

T
5
1

3.5.2. Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm 64
T
5
1

T
5
1

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 66
15T

T
5
1

4.1. Kết luận ................................................................................................................................... 66
15T

T
5
1

4.2. Kiến nghị ................................................................................................................................. 67
15T

T
5
1

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................................. 67
15T

15T

PHỤ LỤC........................................................................................................................................... 74
15T

T
5
1

PHỤ LỤC 1 - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE ............................................................... 74
15T

T
5
1

PHỤ LỤC 2 – LẬP ĐƯỜNG CHUẨN BRADFORD ..................................................................... 75
15T

T

5
1

PHỤ LỤC 3. CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM ............................................................................... 76
15T

T
5
1

PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH ................................................................................................ 77
15T

15T

PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 2 CHỦNG NS NGHIÊN CỨU .......................................... 79
15T

T
5
1


DANH MỤC VIẾT TẮT

BT: bào tử
BSA: Bovine serum albumin
CPE: chế phẩm enzyme
DNS: 3,5 – dinitrosalicylic axit
HT: hoạt tính

HTC: hoạt tính chung
HTR: hoạt tính riêng
HL: hàm lượng
KL: khuẩn lạc
MT: môi trường
NC: nuôi cấy
OD: mật độ quang
∆OD: hiệu số giữa mật độ quang của mẫu đối chứng và mẫu thật
PTHQ: phương trình hồi qui
RNM: rừng ngập mặn
U: đơn vị hoạt độ enzyme
TTN: thuốc trừ nấm


MỞ ĐẦU
RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú, điều kiện khí hậu khắc nghiệt ở đây đã làm
cho sinh vật, cũng như NS có tính thích nghi cao và tạo ra sản phẩm trao đổi chất đặc biệt hơn so với
điều kiện khác. Hệ vi sinh vật ở đây rất đa dạng, phong phú, sinh tổng hợp nhiều chất có HT sinh học
như các loại enzyme xenlulase, protease, chitinase, lipase… và chất kháng sinh để có thể phân hủy các
chất có trong hệ sinh thái RNM thường xuyên bị ô nhiễm.
Một trong những nguồn rác thải dồi dào ở RNM đó là các loại vỏ của động vật chân khớp ở biển
như: tôm, cua, ghẹ…có thành phần chủ yếu là chitin. Chitin là chất khó phân hủy. Có thể sử dụng
nhiều biện pháp hóa lý khác nhau để phân hủy chitin nhưng chi phí rất cao. Hiện nay người ta đã
nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase phân giải chitin từ các nguồn khác nhau: động vật, thực vật, vi
khuẩn, nấm… nhưng chỉ có enzyme chitinase do vi sinh vật tổng hợp đặc biệt là do nấm tổng hợp mới
có HT cao, ổn định với nhiệt độ và pH.
Ngoài ra enzyme chitinase còn có rất nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y học.
Khả năng khử chitin làm cho chitinase có giá trị trong phòng trừ dịch bệnh, giảm ô nhiễm MT.
Chitinase được khai thác sử dụng như là tác nhân phòng trừ sinh học. Chúng cũng có vai trò quan trọng
trong sự hình thành thể nguyên sinh nấm, phòng trừ muỗi, sản xuất các chitooligosaccharid hoạt hóa.

Trong vitro những thí nghiệm thử HT kháng nấm bằng cách sử dụng Trichderma harzianum đã làm
phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh Colletotrichum gloeosporioides.
Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn một số chủng NS từ RNM Cần
Giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao”

Mục tiêu của đề tài:
Góp phần tìm hiểu đặc điểm và vai trò của enzyme chitinase từ các chủng NS có nguồn gốc từ
RNM Cần Giờ làm cơ sở cho việc ứng dụng trong thực tiễn
Nhiệm vụ của đề tài
1. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có
trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư phạm TPHCM. Chọn ra 2 chủng có khả
năng sinh enzyme chitinase cao
2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài 2 chủng thu được


3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2 chủng NS đã
chọn. Chọn ra 1 chủng NS có HT enzyme chitinase cao để tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch
thực nghiệm.
4. Thu nhận và nghiên cứu một số đặc điểm của CPE chitinase thô
5. Bước đầu thử nghiệm tác dụng chế phẩm chitinase thô trong phòng trừ nấm bệnh hại cây
trồng
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu nội dung 1 tại PTN Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp HCM
Nghiên cứu nội dung 2 tại Phòng Xét Nghiệm NK – Biotek, quận 7, Tp. HCM
Nghiên cứu nội dung 3,4,5 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại
học Cần Thơ
Đề tài được tiến hành trong thời gian từ tháng 4 năm 2011 đến tháng 9 năm 2011

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NS trong hệ sinh thái RNM

1.1.1. Giới thiệu về RNM
* Giới thiệu chung về RNM
Diện tích RNM trên thế giới khoảng 15.429.000 ha. Khu vực châu Á có diện tích RNM lớn nhất
là Ấn Độ-Thái Bình Dương với diện tích khoảng 6.9 triệu ha. Nước có diện tích RNM lớn nhất châu Á
là Bangladet với 600.000 ha. Việt Nam có 252.500 ha RNM phân bố ở cả 3 miền: bắc, trung, nam
RNM được hình thành nhờ phù sa do các con sông cùng với trầm tích biển do thủy triều mang
vào tạo thành các bãi lầy. RNM chịu tác động của cả biển lẫn lục địa nên tài nguyên sinh vật rất đa
dạng phong phú và chính sự tác động này đã làm cho sinh vật có những cơ chế tồn tại rất đặc biệt
RNM có những vai trò hết sức quan trọng: Hạn chế tác hại của song thần và bão lớn, bảo vệ đê
biển, làm chậm dòng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao của sóng khi triều
cường, bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, hạn chế xâm nhập mặn và bảo vệ


nước ngầm, làm sạch MT nước khi có lũ quét, sạt lở đất, cung cấp nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu
và lợi ích của con người
* Giới thiệu về RNM Cần Giờ - Tp HCM
RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn, nằm ở cửa ngõ đông nam
thành phố Hồ Chí Minh. Thuộc xã Long Hòa, huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh.
RNM có khí hậu nóng ẩm, lượng mưa thấp. Nhiệt độ trung bình 25,80C, biên độ dao động nhiệt
P

P

trong ngày 5-70C, thời điểm có nhiệt độ cao nhất: tháng 12, tháng 1. Độ mặn trung bình: 1,5 – 2,5 %,
P

P

tùy theo khu vực có thể lên đến 18%, độ mặn phụ thuộc vào thủy triều của biển đông và lưu lượng
nước sông Đồng Nai, sông Sài Gòn. Độ mặn lớn nhất khi triều cường, nhỏ nhất khi triều kém

Hệ sinh vật: thực vật trên 150 loài, động vật thủy sinh không xương sống trên 700 loài, cá trên
137 loài, động vật có xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài động vật có vú,
chim có khoảng 130 loài.
Vi sinh vật gồm nấm men, NS, vi khuẩn, xạ khuẩn… vi sinh vật có vai trò hết sức quan trọng
đối với hệ sinh thái RNM. Vi sinh vật phân bố rộng rãi và có mặt trong mọi cơ chất của RNM. Nhiều vi
sinh vật có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích
của con người. Tuy nhiên cho đến nay những nghiên cứu về vi sinh vật ở RNM còn rất ít, chưa tương
xứng với qui mô và tiềm năng của hệ vi sinh vật RNM
1.1.2. Đặc điểm sinh học NS ở RNM
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái
NS là nhóm có cấu tạo tế bào nhân chuẩn, cấu trúc tế bào tính từ ngoài vào trong gồm: thành tế
bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh và nhân phân hóa. Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài
nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng gọi là neocercosporin
Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên
cơ quan sinh sản, đó chính là cuống sinh BT. Từ cuống sinh BT sẽ hình thành BT là một tế bào sinh
sản, thường có dạng hình cầu. Mỗi loài nấm có hình dạng BT và màu sắc BT có khác nhau. Chính màu
sắc của BT đã tạo nên màu sắc của các KL và màu sắc đặc trưng của các chi và loài nấm.
Sợi nấm có đường kính trung bình 5-10µm, đôi khi rất lớn tới 25µm nhưng cũng có khi rất nhỏ
chỉ 1-2µm. Chiều dài sợi nấm có thể đạt vài chục centimet. Sợi nấm có thể có vách ngăn tạo thành
dạng đa bào, tuy nhiên do khả năng di chuyển của nhân mà từng tế bào có thể có một, hai nhiều nhân
hay chẳng có nhân nào. Sợi nấm cũng có thể không có vách ngăn, bên trong sợi nấm chứa nhiều nhân
được gọi là các tế bào đa nhân, gặp ở các lớp Trichomycetes, Oomycetes


Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên
cơ quan sinh sản là cuống sinh BT. Từ cuống sinh BT sẽ hình thành nên các BT. BT là một tế bào sinh
sản, thường có dạng hình cầu. Khi BT được phân tán từ cơ thể mẹ đến nguồn cơ chất thích hợp nó sẽ
nảy mầm, phát triển theo cả 3 chiều tạo thành hệ sợi nấm mới. Sau vài ngày, số lượng sợi nấm tăng lên
rất nhiều tạo thành một đám, ta có thể quan sát bằng mắt thường. Hệ sợi nấm phát triển đến giai này
được gọi là KL. Tùy theo loài mà KL có các hình dạng khác nhau nhưng thường có hình cầu. Sau một

thời gian, trên các sợi nấm khí sinh sẽ hình thành các BT có hình dạng và màu sắc khác nhau đặc trưng
cho từng loài
1.1.2.2. Đặc điểm sinh sản
NS có nhiều hình thức sinh sản, trong đó chủ yếu là hình thức sinh sản bằng BT. Sau đây là một
số hình thức sinh sản ở NS:
Sinh sản vô tính: Sinh sản vô tính theo kiểu đứt đoạn, sinh sản vô tính bằng BT áo, sinh sản vô
tính bằng BT kín, sinh sản vô tính bằng BT đính
Sinh sản hữu tính: sinh sản hữu tính bằng BT túi (Ascospore), sinh sản hữu tính bằng BT đảm
(Basidiospore), sinh sản hữu tính bằng BT noãn (Oospore), sinh sản hữu tính bằng BT tiếp hợp
(Zigospore).
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí – sinh hóa
- Sinh lí:
Các loài sinh vật nói chung và NS nói riêng có sự sinh trưởng, phát triển và đặc điểm phân bố
phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố MT. RNM là một hệ sinh thái chịu nhiều tác động của gió bão, chịu
ảnh hưởng của chất thải từ đất liền (chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp) lẫn chất thải từ MT
biển…Vấn đề ô nhiễm là điều không thể tránh khỏi nhất là ô nhiễm VSV gây bệnh. Điều kiện MT khắc
nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả năng thích nghi của NS ở RNM.
Nhiệt độ: NS thuộc nhóm VSV ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 200C – 500C, cá
P

P

P

P

biệt có một số ít loài có thể sống sót ở 00C và 600C.
P

P

P

P

pH: là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của NS, NS phát triển tốt ở MT hơi axit (pH
= 4 – 6). Tuy nhiên cũng có một số loài phát triển ở pH < 3 hay pH < 9 (Ingold, 1967). pH làm thay đổi
tính chất của màng tế bào và làm ảnh hưởng đến sự phân ly của các cấu tử thức ăn trong MT. Do đó, sự
hấp thu các loại thức ăn vào trong tế bào bị thay đổi. MT có pH quá cao hay quá thấp đều làm cho sự
sinh trưởng của NS yếu đi.


Ánh sáng: ánh sáng không cần cho quá trình sinh trưởng của hầu hết các loài NS, nhưng ánh
sáng lại ảnh hưởng đến sự hình thành BT của một số loài nấm
Khí oxi: nồng độ oxi rất cần cho hoạt động sống của NS vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc.
Nguồn C: cơ thể nấm không có diệp lục nên không có khả năng tự dưỡng và phải sống kí sinh,
hoại sinh hay cộng sinh. Chúng là những VSV dị dưỡng hóa năng hữu cơ. NS có khả năng đồng hóa
nhiều nguồn C khác nhau, ngoài những đường đơn dễ hấp thụ như glucose chúng cũng sử dụng trực
tiếp các đường như mantose, saccarose…
Nguồn N: N đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia thành phần cấu tạo của các protein và
đặc biệt là enzyme. NS có khả năng đồng hóa cả nguồn N hữu cơ lẫn vô cơ, các chủng NS khác nhau
có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn N.
Độ mặn: Đa số các NS ở RNM đều có khả năng chịu mặn cao. Chúng có thể sinh trưởng ở nồng
độ muối từ 2% - 20%. Thậm chí một số NS ở RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30%. Đây
là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM.

- Sinh hóa [1]
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển NS tiết ra MT ngoài nhiều sản phẩm như các sắc tố,
các chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm, trong đó nhiều chất có HT sinh học có ý nghĩa quan trọng
đối với con người cũng như hệ sinh thái như các các enzyme, kích thích tố tăng trưởng, vitamin, kháng

sinh… MT sống khắc nghiệt ở RNM làm cho kiểu trao đổi chất của chúng khác biệt hơn so với các
nấm ở đất liền. Do đó, các sản phẩm trao đổi chất của chúng, trong đó đặc biệt là hệ enzyme cũng
mang tính chất khác lạ hơn
HT enzyme thủy phân ngoại bào
NS là nhóm VSV có tiềm năng lớn nhất sinh các enzyme thủy phân ngoại bào. Đa phần các
enzyme dùng trong công nghiệp có nguồn gốc từ NS.
Cellulase: là enzyme ngoại bào có khả năng cắt đứt liên kết 1–4 β - glucosid của phân tử
cellulose để tạo thành các đơn phân glucose. Cellulose là thành phần chủ yếu trong xác thực vật do đó
enzyme này có vai trò quan trọng trong việc phân giải những hợp chất hữu cơ tồn đọng trong MT.
Enzyme này được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như thức ăn gia súc, công nghiệp thực phẩm nhờ
khả năng phân giải cellulose. Những NS có khả năng phân giải cellulose là các nấm thuộc chi


Aspergillus (Asp.niger, Asp.flavus, Asp.oryzae…), Fusarium (F.oxysporum, F.solani), Penicillium,
Trichoderma…
Amylase: là enzyme thủy phân tinh bột và những chất có cấu trúc tương tự. Vì tinh bột
cũng là một trong những sản phẩm chủ yếu của thực vật nên vai trò của amylase cũng giữ một vị trí hết
sức quan trọng trong việc phân giải các sản phẩm với thành phần chủ yếu là tinh bột và góp phần trong
việc làm sạch MT. Những NS có khả năng phân giải mạnh tinh bột là Asp.candidus,
Asp.awamori….Cũng như cellulose, dựa vào đặc tính phân giả mạnh tinh bột mà amylase được ứng
dụng nhiều trong lĩnh vực sản xuất rượu, bia, bánh mì…
Protease: là enzyme thủy phân liên kết peptid trong các polypeptide tạo thành các chuỗi
polypeptide ngắn hơn, các đipeptide hay các axit amin. Trong tự nhiên enzyme này có tác dụng khoáng
hóa: phân giải các hợp chất hữu cơ có bản chất protein trong xác động thực vật và sinh vật nói chung
thành các hợp chất đơn giản và cuối cùng thành các phân tử vô cơ. Con người đã ứng dụng enzyme này
trong các lĩnh vực của đời sống như công nghiệp thịt, da, tơ tằm … nhằm tận dụng khả năng phân giải
protein của chúng cũng như tận dụng những sản phẩm từ quá trình phân giải đó. Những NS có khả
năng sinh protease mạnh là nhóm mốc vàng (Asp.flavus, Asp.oryzae, Asp.funginatus…) và nhóm mốc
đen (Asp.niger, Asp.awmori, Asp.usamii…)
Pectinase: là enzyme xúc tác quá trình phân giải pectin thành các hợp chất đơn giản như

galacturonic, galactose, methanol….được ứng dụng trong sản xuất nước quả, rượu vang, hoặc trong sản
xuất cà phê hòa tan, chế biến đay gai…Những NS có khả năng sinh pectinase cao được chú ý là
P.glaucum, Asp.awamori, P.citrinum…
Chitinase: Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucoszamine liên kết với
nhau bởi mối liên kết β - 1,4 – glucosid. Hàng năm trong tự nhiên có thể tạo 1010 – 1014 tấn chitin.
P

P

P

P

Chitinase bị VSV (chủ yếu là NS) phân giải liên kết β - 1, 4 – glucosid tạo ra các N-acetylglucoszamine. Hệ chitinase mạnh còn giúp các NS (Trichoderma spp., Glyocladium spp., Chaetomium
spp.) tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh (Fusarium oxysporium, Botritiscinerea,
Pyricularia oryzae… có thành tế bào là chitin) và các loài nấm B. bassiana, M. anisopliae, P.
fumosoroseus… chống các loài côn trùng có vỏ chitin. Các NS này được sử dụng làm tác nhân kiểm
soát sinh học chống các VSV gây bệnh và côn trùng trong nông – lâm nghiệp.


VSV nói chung và NS nói riêng thường không có khả năng tạo được tỉ lệ cân đối giữa các
enzyme, có loài tạo được nhiều enzyme này, loài khác lại tạo nhiều enzyme khác. Các loài nấm thường
có HT amylase và chitinase rất mạnh [6][7]
HT sinh các chất kháng sinh:
Chất kháng sinh là một trong số những sản phẩm trao đổi chất bậc hai do NS sản xuất ra. Hiện
có rất nhiều công trình nghiên cứu vai trò của chất kháng sinh đối với đời sống. Tuy nhiên, hiện có hai
giả thiết về vai trò của chất kháng sinh được nhiều nhà khoa học ủng hộ hơn cả. Giả thuyết thứ nhất
cho rằng việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo khả năng sống sót cao cho
chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là với các loài có BT. Người ta đã xác định được
một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sự nảy mầm của BT chính chủng sinh ra chất kháng sinh đó.

Có thể chất kháng sinh có vai trò kìm hãm sự nảy mầm của BT cho đến khi điều kiện MT ngoài hoàn
toàn thích hợp cho sự phát triển của chúng. Giả thiết thứ hai cho rằng việc tổng hợp các chất kháng
sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể
tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái
cục bộ đó.
Gần đây người ta phát hiện ra NS ở RNM là nguồn VSV có tiềm năng sinh các chất kháng
khuẩn và enzyme đặc biệt là chitinase có ý nghĩa lớn cho sự tồn tại của thực vật chịu mặn
Độc tố nấm:
Một sản phẩm trao đổi chất bậc hai của nấm đáng được quan tâm đó là độc tố nấm (mycotoxin).
Đây là một trong số những mối nguy hại lớn cho sức khỏe con người và động vật khi sử dụng thức ăn
có chứa một HL độc tố nhất định hoặc ăn phải nấm có khả năng sinh độc tố. Hiện có trên 300 loại độc
tố nấm đã được con người phát hiện. Trong số đó, nguy hiểm nhất là aflatoxin, đặc biệt là aflatoxin B1.
Phần lớn các NS ở RNM đều có khả năng sản sinh ra các sản phẩm giúp khống chế VSV có hại như
chất kháng sinh, độc tố giúp làm tăng khả năng đối kháng trong quá trình cạnh tranh của đời sống. Một
số NS còn có HT diệt côn trùng mạnh, có thể sử dụng để sản xuất các chế phẩm diệt côn trùng một
cách an toàn. Đây là một nguồn gen quý, rất có giá trị đối với sinh học và y học.
Kết luận: Với những đặc điểm đáng chú ý như trên, NS đang trở thành đối tượng rất được quan
tâm nghiên cứu nhằm khai thác triệt để những đặc tính sinh học quý phục vụ cho đời sống con người.
1.1.2.4. Đặc điểm phân loại nấm sợi


Hiện nay có hai phương pháp được sử dụng phổ biến là phương pháp phân loại truyền thống và
phương pháp phân loại hiện đại bằng sinh học phân tử.
*Phương pháp truyền thống:
Chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái. Dayal (1975) đã dựa vào 7 đặc tính để phân loại nấm sợi:
đặc điểm hình thái, ký chủ đặc thù, đặc điểm sinh lý, đặc điểm tế bào học, đặc điểm di truyền học, đặc
điểm kháng huyết thanh, đặc tính sinh hóa và phân loại số học.
Có nhiều khóa phân loại được sử dụng như: Saccardo P.A (1880 – 1886), Baron G.L (1968),
Hughes S.T (1953), Ellis M.B (1971), Ainsworth G.C (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1986), Barnett
H.L và cộng sự (1972), Nguyễn Lân Dũng (2000), Samson (2004)

* Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử
Đây là phương pháp kỹ thuật rất hiện đại và tương đối mới mẻ. Các thao tác cơ bản được sử
dụng là kĩ thuật thu nhận DNA, chạy PCR và giải trình tự axit nucleic.
Thu nhận DNA
Yêu cầu của kỹ thuật này là phải thu được các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị
phân hủy bởi tác nhân hóa học và cơ học. Ba bước cơ bản của kĩ thuật DNA :
Phá màng tế bào và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phóng các DNA,
đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform
(hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA. Thu nhận axit nucleic.
Làm kết tủa axit nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu nhận các axit nucleic dạng cô
đặc, dễ bảo quản.
Chạy PCR (Polymerase Chain Reaction)
Nguyên tắc
Khuếch đại một trình tự DNA lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1 (biến tính)
Trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao
hơn Tm của phân tử, thường là 940C – 950C trong vòng 30 giây – 1 phút.
P

P

P

P


Bước 2 (lai)
Nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động trong khoảng từ

400C – 700C và kéo dài trong vòng 30 giây – 1 phút.
P

P

P

P

Bước 3 (tổng hợp)
Nhiệt độ được tăng lên đến 720C là nhiệt độ mà DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian
P

P

của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Giải trình tự axit nucleic
Các phương pháp xác định trình tự axit nucleic đều dựa trên 2 nguyên tắc:
Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert)
Dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều
phân đoạn có kích thước hơn kém nhau một nucleotid.
Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger)
Quá trình tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ enzyme DNA polymerase bên
cạnh nguồn nguyên liệu là các đơn phân nucleotic còn được bổ sung thêm các đơn phân
dideoxinucleotid. Kết quả là quá trình kéo dài chuỗi polynucleotide sẽ dừng lại khi có một
dideoxinucleotid tham gia vào chuỗi. Từ đó dẫn đến việc tổng hợp ra được một nhóm gồm nhiều đoạn
DNA có kích thước hơn kém nhau một nucleotide.
Sau đó, các phân đoạn DNA được điện di trên gel polyacrylamid. Dựa trên kết quả điện di người
ta có thể xác định được trình tự của đoạn DNA cần thiết. So sánh đối chiếu với trình tự gen trong ngân
hàng gen để xác định loài.

1.1.2.5. Vai trò của NS trong hệ sinh thái RNM
Với đặc điểm riêng của NS ở RNM, chúng đã mang lại nhiều vai trò mang tính quyết định đối
với hệ sinh thái RNM.
Trong điều kiện của RNM – nơi mà nguồn dinh dưỡng chủ yếu là các biopolymer của sinh khối
thực vật RNM và động vật biển thì các NS chính là tác nhân tham gia tích cực vào quá trình phân giải
các hợp chất hữu cơ phức tạp này, là mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và tham gia khép kín chu
trình sinh địa hóa của RNM. Cụ thể hơn, nhờ hệ thống các enzyme ngoại bào mạnh như amylase,
cellulase, protease,…chúng phân giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan, cung cấp chất


dinh dưỡng và năng lượng cho cả hệ sinh thái. Các chức năng trên có thể kể đến như việc NS ở RNM
phân hủy mùn bã hữu cơ thành nguồn thức ăn khoáng để nuôi dưỡng cây ngập mặn và tảo phù du, phân
hủy các phần rơi rụng của cây ngập mặn thành mùn bã hữu cơ tạo nguồn thức ăn cho các động vật tiêu
thụ cấp 1.
Bản thân NS ở RNM cũng trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài động vật nhỏ và ấu
trùng của một số loài (Odum, 1980; Alogi, 1989). NS ở RNM cũng là nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng
cho các VSV hóa dị dưỡng khác, từ đó làm giàu quần thể VSV [6].
NS ở RNM có vai trò lớn đối với việc làm sạch MT sống với việc phân giải các chất độc hại
trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng. Bên cạnh vai trò làm sạch MT sống
nói chung, NS ở RNM còn có vai trò làm sạch MT sinh vật với chức năng là tác nhân kiểm soát sinh
học hữu hiệu trong việc giữ cân bằng sinh thái.
NS ở RNM chỉ có mặt ở những lá đang phân hủy khi còn tiếp xúc trực tiếp được với oxi tự do.
Vì vậy, rất có thể vai trò của nấm trong quá trình phân hủy các sản phẩm rơi rụng của RNM chỉ tồn tại
khi các sản phẩm này còn trôi nổi trên mặt nước hoặc gần với lớp bùn đất bề mặt RNM [6], [7]. NS có
khả năng biến đổi cơ chất, điều chỉnh MT cho các cơ thể khác sử dụng [6]
Tuy nhiên, các hoạt động sống của NS ở RNM lại làm giảm lượng oxi trong đất, bùn RNM do
quá trình hô hấp, gây bệnh cho động thực vật hoặc thải vào MT một số chất độc như: ammoniac,
sunfuahidro… [6], [7].
Kết luận: NS ở RNM có vai trò vô cùng quan trọng đối với chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ
sinh thái RNM, có vai trò bảo vệ MT sinh thái nói chung và MT sinh thái RNM nói riêng, cũng như có

vai trò to lớn trong mối quan hệ sinh học giữa các loài sinh vật từ đó đóng góp vào việc giữ cân bằng
cho hệ sinh thái đặc biệt này.
1.2.

Chitin và chitinase

1.2.1. Nguồn chitin:
Chitin là một polysacharide tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau
cellulose). Trong tự nhiên, chitin có trong cả động vật và thực vật. Trong động vật, chitin là một thành
phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể,
giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao, các đơn phân của chitin là một thành phần chủ yếu
trong mô da, nó giúp cho sự tái tạo và làm liền các vết thương ở da. Trong thực vật, chitin có ở vách tế
bào nấm họ zygomycetes, trong sinh khối nấm mốc và trong một số loại tảo.


Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, HL chitin - chitosan chiếm khá cao từ
14 - 35% so với trọng lượng khô.Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin
- chitosan.
Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ
một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier
phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ
giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều
đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với cellulose.
Cấu trúc hoá học của chitin:
Chitin (C 8 H 13 O 5 N)n là một polymer mạch dài của N-acetylglucosamine, dẫn xuất của glucose,
R

R

R

R

R

R

trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm acetyl amin (-NHCOCH 3 ) (cấu trúc
R

R

I). Như vậy chitin là poly (N-acetyl-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose) liên kết với nhau bởi các
liên kết β-(1-4) glycoside. Trong đó các đơn phân của chitin cũng được đánh số như của glucose. Cấu
trúc của chitin là tập hợp các monosacharide (N-acetyl-β-D-glucosamine). Hơn nữa chitin tồn tại rất
hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn trong liên kết cộng hóa trị (covalent bond) với các protein,
CaCO 3 và các hợp chất hữu cơ khác.
R

R

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử chitin
Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu
hình: α, β, γ – chitin. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi đơn phân
(N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi đơn phân này bằng mũi tên sao cho phần


đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH 2 OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH 3 , thì các cấu trúc α, β, γ- chitin
R

R

R

R

được mô tả như sau:

Hình 1.2: Các cấu hình của chitin
α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết
hydro trong một lớp trong cùng một mạch, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp kề nhau giữa các
mạch nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và
năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên.
β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và hai song song một
ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có liên kết hydro. Dạng β - chitin cũng có thể chuyển sang
dạng α - chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Qua nghiên cứu về sự thủy
phân chitin bằng enzyme hay acid HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một
polymer được tạo thành từ các đơn vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4)
glucoside (H.F. Mark et al., 1965)
T
8
1

Ứng dụng của chitin:
Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung gian cho các chất quan trọng như
chitosan, glucosamin và các chất có giá trị khác. Chitosan là một dạng chitin đã bị khử acetyl, nhưng
không giống chitin, nó lại tan được trong dung dịch acid. Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành
công nghiệp, nông nghiệp, y dược và bảo vệ MT như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc
kem, vải, làm thuốc chữa bỏng, giảm đau, thuốc hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, chống đông tụ
máu, tăng sức đề kháng, chữa xương khớp, màng bao hoa quả, bảo vệ MT…Với khả năng ứng dụng

rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất các
sản phẩm này.
Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian là
chitin hoặc chitosan. Glucosamine được cơ thể dùng để sản xuất ra các proteoglycan. Glucosamin chủ
yếu được sử dụng trong y học chữa bệnh thoái hoá khớp.


1.2.2. Chitinase
1.2.2.1. Nguồn chitinase:
Chitinase từ thực vật:
Ở thực vật, chitinase hiện diện chủ yếu ở hạt, thân, củ, hoa. Thực vật kích thích sinh tổng hợp
chitinase như là một cơ chế phòng thủ trước các tác nhân gây bệnh. Chitinase của thực vật thường được
tìm thấy ở giai đoạn đầu của sự sinh trưởng của cây. Chitinase thực vật thường thuộc dạng
endochitinase, với trọng lượng phân tử nhỏ hơn chitinase từ côn trùng.
Chitinase từ côn trùng:
Chitinase trong côn trùng đóng một vai trò quan trọng như là một enzyme phân hủy lớp chitin
trong thời kì lột xác của chúng. Sau khi endochitinase cắt ngẫu nhiên các lớp biểu bì tạo thành các
chitinoligosacchride, exochitinase sẽ cắt tiếp để tạo thành N-acetyl-glucosamine. Các monomer sinh ra
T
7
1

sẽ được tái sử dụng tạo thành lại lớp biểu bì mới. Chitinase ở côn trùng có thể bị ức chế bởi
allosaminidin. Chitinase cũng có thể được tìm thấy trong động vật giáp xác như tôm sú. Chitinases ở
động vật giáp xác được tạo thành trước khi quá trình lột xác ở lớp da xảy ra.
Chitinase từ vi sinh vật:
Vi sinh vật là nguồn cung cấp chủ yếu chitinase trong sản xuất. Hiện nay chitinase được tìm
thấy trong các nhóm vi khuẩn như là Serratia, Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas,
Clostridium, Vibrio, Arthrobacter, Beneckea, Aeromonas, và Streptomyces. Ngoài ra, chitinase cũng
được tìm thấy trong các chủng nấm như Trichoderma, Penicillium, Lecanicillium, Neurospora, Mucor,

Beauveria, Lycoperdon, Aspergillus, Myrothecium, Conidiobolus, Metharhizium, Stachybotrys, và
Agaricus. Nguồn chitinase được tạo ra bởi vi sinh vật cho HL nhiều hơn so với động, thực vật, và nhìn
chung enzyme cảm ứng ngoại bào thuộc hai loại endochitinase và exochitinase. Vi sinh vật có khả năng
phân hủy chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Nhưng nguồn enzyme từ các chủng vi sinh vật khác
nhau có khả năng hòa tan trong dung dịch và kích thước rất khác nhau. Bên cạnh đó độ phức tạp và
thành phần dị hợp trong phân tử cũng rất đa dạng. Chitin bên trong tế bào vi sinh vật do có các cơ chế
bảo vệ riêng nên không bị phân hủy bởi chitinase của chính tế bào đó nhưng khi tiết ra MT bên lại có
tính chuyên biệt để chuyển hóa và thủy phân chitin (Cottrell MT et al.,1999; Keiko Shirai Matsumoto,
2006).
1.2.2.2. Cơ chế hoạt động:


Quá trình thủy phân chitin là sự kết hợp của một phức hệ enzyme bao gồm endo-chitinases
(EC 3.2.1.1.4), exo-chitinases (EC 3.2.1.14), chitobiase (EC 3.2.1.30) and β-N-acetyl hexosaminidases
(EC 3.2.1.52). Endochitinases cắt ngẫu nhiên bên trong chuỗi chitin tạo các đoạn oligo-N-acetyl
glucosamine ngắn như là chitotetraose, chitotriose, và diacetylchitobiose. Exochitinases phân hủy
chitin cho sản phẩm diacetylchitobiose không tạo ra các N-acetyl glucosamine hoặc oligomers. β-Nacetyl hexosaminidases cắt diacetylchitobiose cũng như chitotriose và chitotetraose tạo các đơn phân
N-acetyl glucosamine. (Sahai, A.S. and Manocha, M.S., 1993)

Hình 1. 3: Cơ chế hoạt động của các enzyme chitinase
1.2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase:
HT enzyme chitinase sinh ra ở mỗi loài khác nhau thì khác nhau. HT của chitinase cũng bị ảnh
hưởng bởi nhiệt độ, độ pH, các ion kim loại và cơ chất phản ứng. Với Trichoderma harzianum,
chitinase được hoạt hóa khi có sự hiện diện của các ion Mn2+, Fe2+, Ca2+ và Co2+. Trong khi Cu2+, Zn2+,
P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

Hg2+ và EDTA là những tác nhân gây kìm hãm mạnh lên hoạt động của enzyme ở chủng nấm này [63].
P

P

Chitinase từ Alternaria alternate đòi hỏi Ca2+ và K+ cho hoạt động của nó, enzyme này chịu nhiệt và
P

P

P

P

mất 20% HT khi cho phản ứng ở nhiệt độ 600C trong 60 phút [33]
P

P

1.2.2.4. Tính chất sinh hóa của chitinase
* Trọng lượng phân tử
Trọng lượng phân tử của chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn khoảng 30kDa đến 120kDa. Ở
tảo biển và thực vật bậc cao có trọng lượng phân tử khoảng 30kDa. Ở các loài thân mềm, chân đốt,
động vật có xương có trọng lượng phân tử khoảng 40- 90kDa
* Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis


Điểm đẳng điện pI của chitinase có giá trị từ 3- 10 ở thực vật bậc cao và tảo; ở côn trùng, giáp
xác, thân mềm và cá là 4,7- 9,3; ở VSV là 3,5- 8,8. Hằng số Michaelis là 0,10- 0,11 (g/l).
* Nhiệt độ hoạt động
Tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các chitinase có thể có những giá trị nhiệt độ tối thích khác
nhau. Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho chitinase ở VSV hoạt động là 40oC, một số loài sinh chitinase có
P

P

khả năng chịu nhiệt cao. Bendt và cộng sự (2001) phát hiện HT thủy phân chitin mạnh nhất của
chitinase từ Vibrio sp. từ 30- 45oC và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus licheniformis phân lập ở
P

P

suối nước nóng có khả năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 80oC. Penicillium chrysogenum có nhiệt độ tối
P

P

ưu là 400C [57]. De-hui Dai (2011) đã chiết tách được chitinase từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus sp. Hu1
P

P

có nhiệt độ hoạt động tối thích là 600C [32]
P

P

* Độ pH hoạt động
Chitinase hoạt động trong khoảng pH 4,0 – 8,5 (Bendt và cộng sự, 2001). pH tối ưu cho enzyme
chitinase ở thực vật bậc cao và tảo là 4 – 9; ở động vật là 4,8 – 7,5 và ở VSV là 3,5- 8,0. Chitinase của
nấm HT cao nhất ở pH= 5, trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8,0.
pH của chitinase còn phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng. Các nghiên cứu đa số sử dụng cơ
chất là glycol chitin và pH tối ưu khoảng 5,0

1.2.2.5. Phân loại chitinase
* Dựa vào cấu trúc phân tử
Chitinase thuộc hai họ Glycohydrolase 18, Glycohydrolase 19.
Họ Glycohydrolase 18
Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc eukaryote, prokaryote
và virus. Họ này bao gồm chủ yếu enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như
chitodextrinase, chitobiase và N- acetyl glucosaminidase.
Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohhydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn

tròn, chúng hoạt động thông qua cơ chế kiểm soát mà các đoạn β polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm
là β anomer.
Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas
hydrophyla, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanoclaum album, Serratia marcescens…


Họ Glycohydrolase 19
Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn
Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae,… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng
xoắn.
* Dựa vào trình tự amino acid
Căn cứ vào trình tự amino acid, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và
vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhóm:
Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu amino giàu cystein nối với tâm xúc
tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein
có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc
tác.
Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein
ở đầu amino và peptide nhận biết ở đầu carboxyl, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I.
Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn.
Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II.
Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây 2 lá mầm, 41%- 47% trình tự amino
acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có giàu đoạn cystein nhưng
kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.
Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu
cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hoá ở thực vật bậc cao.
Ngoài ra, theo cơ chế xúc tác của chitinase ta có các loại chitinase sau: endochitinase, chitin-1,4β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosamine (exochitinase) và chitobiase.

1.2.2.6. Ứng dụng của chitinase
* Ứng dụng sản xuất chitosan

Chitosan và các dẫn xuất của chúng đều có tính kháng nấm, kháng khuẩn, như ức chế hoạt động
của một số loại vi khuẩn như E.Coli, diệt được một số loại nấm hại dâu tây, cà rốt, đậu và có tác dụng
tốt trong bảo quản các loại rau quả có vỏ cứng bên ngoài, làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả,
có khả năng tự phân huỷ sinh học cao, có khả năng tạo phức với một số kim loại chuyển tiếp như:


Cu(II), Ni(II), Co(II)... Do vậy chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: Trong lĩnh vực xử
lí nước thải và bảo vê MT, dược học và y học, nông nghiệp, công nghiệp, công nghệ sinh học
* Ứng dụng trong sản xuất Glucosamin
Glucosamine đặc hiệu trong điều trị thoái hóa khớp là do nó có 3 tác dụng: kích thích sản xuất
sụn, giảm đau khớp và chống viêm trong đó tác dụng kích thích sản xuất sụn đóng vai trò quan trọng
nhất. Glucosamine là thành phần chính của proteoglycan - 1 trong 3 thành phần (proteoglycan,
collagen, tế bào sụn) cùng với nước cấu tạo nên sụn khớp. Proteoglycan như sợi dây thừng xâu chuỗi
với collagen, có vai trò giữ nước để làm trơn và nuôi dưỡng collagen
* Ứng dụng trong việc phân lập tế bào trần
Sử dụng enzyme chitinase để phá hủy vách tể bào của vi sinh vật tạo tế bào trần. Nghiên cứu về
ảnh hưởng của một số nhân tố đến sự tạo tế bào trần từ nấm Trichoderma reesi đã cho thấy vai trò của
chitinase trong việc tạo tế bào trần [42], ứng dụng chitinase từ Enterobacter sp. NRG4 nuôi trên MT
bán rắn để phân lập tế bào trần từ nấm và nấm men, thành tế bào nấm men Rhaffia Rhodozyme đã được
phân giải thành công bằng hỗn hợp enzyme trong đó có chitinase từ Baccilus circulans [26]

* Ứng dụng sản xuất chitooligosaccharid, Nacetyl-D-Glucosamine
Chitooligosaccharid đã được Murao (1992) và Stoyachenko (1994) sản xuất bằng enzyme
chitinase do vi khuẩn Vibrio Alginolyticus và Streptomyces kurssanovii tổng hợp [52],[63].
Chitooligosaccharides và Nacetyl-D-lucosamine cũng được Ghanem (2011) sản xuất từ Aeromonas sp
và các loại vi khuẩn sinh chitinase [32]
* Sản xuất protein đơn bào
Vyas (1991) đã sử dụng enzyme chitinase từ Myrhothecium verrucaria trong việc sản xuất
protein đơn bào [67]. Owhashi (2000) và Guevara (2006) cũng đã ứng dụng chitinase của Alternaria
alternata được phân lập từ đất bị ô nhiễm cá để sản xuất protein đơn bào phục vụ cho nông nghiệp

[56]
* Trừ muỗi
Mendosa ES, Vartak PH, Rao JU (1996) dùng enzyme chitinase từ Myrhothecium verrucaria để
trừ côn trùng gây hai trong đó có muỗi Aedas aegypti. Gkargkas đã nghiên cứu về N-acetyl-[beta]-dT
5
1