Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất trồng khu vực xuân hòa

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
*********

NGUYỄN THỊ PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG
PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG ĐẤT TRỒNG
KHU VỰC XUÂN HÒA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. DƢƠNG MINH LAM
PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2012


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung và
TS. Dương Minh Lam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và
hoàn thành đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Khắc Thanh và các cán bộ phòng thí
nghiệm Vi sinh học, Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
đã nhiệt tình giúp đỡ tôi.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2, Ban chủ
nhiệm khoa Sinh – KTNN, Bộ môn Vi sinh vật học đã tạo điều kiện cho tôi
được học tập và hoàn thành đề tài này.

Tôi xin cảm ơn thầy cô và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình làm đề tài.
Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những người thân
yêu của tôi đã động viên giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.
.
Hà Nội, tháng 5 năm 2012

Sinh viên
Nguyễn Thị Phương


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả
nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận là trung thực và không
trùng với kết quả của các tác giả khác.

Tác giả
Nguyễn Thị Phƣơng


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

Trang

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu......................................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
4. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài........................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn ............................................................................... 5
1.1.1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên ................................................. 5
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ............................................................ 6
1.1.3. Cấu tạo xạ khuẩn ..................................................................................... 7
1.1.4. Vai trò của xạ khuẩn ............................................................................... 9
1.2. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại ........................................ 10
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy .............................................. 10
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại ....................................................................... 11
1.2.3. Đặc điểm sinh lý , sinh hóa ................................................................... 12
1.2.4. Phân loại số ........................................................................................... 12
1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của xạ khuẩn ........................................................... 13
1.3.1. Nhu cầu cacbon ..................................................................................... 14


1.3.2. Nhu cầu nitơ .......................................................................................... 14
1.3.3. Nhu cầu vitamin và chất khoáng ........................................................... 15
1.4. Cellulose và Cellulase .............................................................................. 15
1.4.1. Cellulose ............................................................................................... 15
1.4.2. Hệ thống cellulase ................................................................................. 19
1.4.3. Cơ chế phân giải cellulose .................................................................... 20
1.4.4. Ứng dụng của cellulase ......................................................................... 22
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu. ............................................................................................. 27
2.1.1. Vi sinh vật ............................................................................................. 27

2.1.2. Hóa chất – Thiết bị. .............................................................................. 27
2.2. Môi trường ............................................................................................... 27
2.2.1. Môi trường phân lập xạ khuẩn .............................................................. 27
2.2.2. Môi trường bảo quản và giữ giống ( pH: 7,2) ...................................... 28
2.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme ........................................................ 28
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 28
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu ............................................................................ 28
2.3.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất ......................................... 29
2.3.3. Phương pháp bảo quản chủng giống ..................................................... 28
2.3.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ................................ 30
2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn ...................... 31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập xạ khuẩn từ đất trồng ................................................................. 34
3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập được................... 36
3.3. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn ........ 37
3.4. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa ..................................................................... 39
3.4.1. Khả năng chịu muối .............................................................................. 38


3.4.2. Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon .................................................. 39
3.4.3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ........................................................ 41
3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi
cấy đến khả năng sinh cellulase của các chủng xạ khuẩn ............................... 43
3.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon............................................................... 43
3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ.................................................................... 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận .................................................................................................... 47
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 47
PHỤ LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

VSV:

: Vi sinh vật

HSCC

: Hệ sợi cơ chất

HSKS

: Hệ sợi khí sinh

AND

: Deoxyribonucleic Acid

ARN

: Ribonucleic Acid

ADP

: Diaminopimelic Acid

C1

: Enzyme endoglucanase

Cx

: Enzyme exoglucanase

CMC

: Cacboxyl methyl cellulose

CBH

: Celobiohydrolase

SSA

: Vùng bề mặt đặc hiệu của cellulose

CFU

: Colony Forming Unit


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.

Các thành phần chính của lingocellulose và các enzyme phân
giải

Bảng 1.2.

Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông
nghiệp phổ biến.

Bảng 3.1.

Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng

Bảng 3.2.

Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu

Bảng 3.3.

Khả năng chịu muối của 4 chủng T5, T7, T9, T13.

Bảng 3.4.

Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 4 chủng xạ khuẩn T5, T7,
T9, T13

Bảng 3.5.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 4 chủng xạ khuẩn T5, T7,
T9, T13

Bảng 3.6.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon tự nhiên đến hoạt tính cellulase
của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu

Bảng 3.7.

Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính
cellulase của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.

Cấu trúc lập thể của phân tử cellulose

Hình 1.2.

Cấu trúc cellulose

Hình 1.3.

Tác dụng của từng enzyme trong hệ thống cellulase

Hình 1.4.

Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973

Hình 3.1.

Một số chủng xạ khuẩn phân giải cellulose phân lập được

Hình 3.2.

Một số hình ảnh xạ khuẩn

Hình 3.3.

Hình ảnh hệ sợi và cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn
nghiên cứu

Hình 3.4.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng T5

Hình 3.5.

Môi trường chứa nguồn cacbon tự nhiên

Hình 3.6.

Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn trên môi chứa nguồn
cacbon tự nhiên

Hình 3.7.

Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính cellulase của các chủng
xạ khuẩn nghiên cứu


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong quá trình sống của thế giới sinh vật luôn xảy ra các phản ứng hóa

sinh chuyển hóa vật chất. Các phản ứng này gắn chặt với sự có mặt của
enzyme, một chất xúc tác sinh học. Dưới tác dụng của enzyme các phản ứng
hóa sinh trong cơ thể xảy ra rất nhanh không cần các điều kiện nhiệt độ, áp
suất cao, nồng độ axit hay kiềm đặc.
Tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật có chứa nhiều loại enzyme. Vì
vậy, có thể dùng những tế bào hoặc các mô của chúng làm nguồn sản xuất
enzyme. Trước kia người ta sản xuất enzyme từ động vật và thực vật với
lượng khá lớn (hàng chục vạn tấn/năm), ví dụ: amylase từ hạt nảy mầm,
protease từ nhựa đu đủ, dạ dày, tụy tạng…Tuy nhiên, trong cơ thể động vật và
thực vật quá trình sinh tổng hợp enzyme gắn liền với sự trao đổi chất của tế
bào, số lượng enzyme cần tổng hợp gắn liền với yêu cầu sống của cơ thể, hơn
nữa các bộ phận cơ thể có số lượng enzyme không đồng nhất. Vì vậy, chỉ có
một số bộ phận có thể dùng để sản xuất enzyme được. Muốn thu được
enzyme cần phải phá bỏ các tổ chức để chiết rút. Như vậy việc dùng động vật,
thực vật làm nguyên liệu sản xuất enzyme là rất hạn chế và không kinh tế,
không thể đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao về enzyme.
Tế bào vi sinh vật có chứa rất nhiều enzyme. Trong quá trình nuôi cấy, vi
sinh vật không những tạo thành bên trong tế bào các enzyme nội bào mà một
số vi sinh vật còn tiết vào môi trường các enzyme ngoại bào để phân hủy cơ
chất giúp tế bào dễ đồng hóa. Vi sinh vật là nguồn sản xuất enzyme tương đối
lí tưởng, nó có nhiều ưu việt so với các nguồn động vật và thực vật.
Cho đến nay, nền công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzyme đã có
những bước tiến khổng lồ với tiến độ phát triển khá mạnh mẽ. Số lượng
enzyme sản xuất ngày càng tăng, các phương pháp tách chiết và tinh sạch
1


ngày càng được hoàn thiện và hợp lý hóa, lĩnh vực ứng dụng chế phẩm
enzyme ngày càng được mở rộng. Sản lượng hàng năm tới vài trăm ngàn tấn
chế phẩm và được sử dụng trong hơn 30 ngành khác nhau: Công nghiệp thực

phẩm, thuộc da, dệt, phim ảnh, y học (chữa bệnh và phân tích hóa sinh ), bảo
vệ môi trường…Ở nước ta, nghành công nghiệp enzyme đã được hình thành
và hy vọng rằng trong tương lai không xa sẽ được phát triển cùng với trào lưu
chung của công nghiệp và hiện đại hóa đất nước.
Cellulose là thành phần chủ yếu tạo nên bộ khung xương tế bào thực vật.
Trung bình mỗi năm ước tính có khoảng 30 tỉ tấn chất hữu cơ được cây xanh
tổng hợp trên trái đất trong đó có 30% là thành tế bào thực vật, thành phần
chủ yếu của thành là cellulose. Hàng năm trái đất phải nhận về một lượng
chất thải khổng lồ (chất thải công nghiệp, chất thải sinh hoạt, chất thải thực
vật như lá, cành…). Thành phần chủ yếu của các loại chất thải này là
cellulose. Để phân giải lượng lớn cellulose này khu hệ vi sinh vật đất đóng vai
trò rất quan trọng đặc biệt là các chủng vi sinh vật có hệ enzyme cellulase có
tác dụng phân giải cellulose.
Từ những lí do trên cùng với việc tận dụng khả năng phân giải cellulose
của các chủng xạ khuẩn trong đất tôi đã lựa chọn và nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose trong đất trồng khu vực Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc”.
2. Mục tiêu
2.1.

Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải

cellulose trong đất trồng khu vực Xuân Hòa.
2.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn có hoạt tính
enzyme cellulase mạnh nhất.

2


3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose trong đất trồng khu vực Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc.
3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy : HSKS, HSCC,
sắc tố tan, cuống sinh bào tử.
3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lí, sinh hóa: khả năng chịu muối, khả
năng sử dụng các nguồn cacbon, khả năng sinh enzyme ngoại bào.
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy
đến hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn được chọn.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
Góp phần đem lại cho con người những hiểu biết về đời sống tự nhiên
của VSV nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Tạo cơ sở cho các phương thức
canh tác (cày sới, cải tạo đất, bón phân, luân canh, xen canh…) theo hướng
lợi dụng VSV phân giải cellulose, tăng cường phân giải các hợp chất hữu cơ
làm giàu dinh dưỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng.
Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao, ứng
dụng các chủng này vào đời sống (chăn nuôi, bảo vệ môi trường…)
Việc nghiên cứu các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy góp phần
tìm ra môi trường thích hợp nhất cho xạ khuẩn phát triển và ứng dụng trong
xử lí rác thải.

3


CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn
1.1.1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân
bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng,
bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển
được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức
độ canh tác và thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000
mầm xạ khuẩn, chiếm 9 – 45% tổng số vi sinh vật [20].
Tuy nhiên tùy vùng đất khác nhau trên thế giới mà có sự biến đổi lớn về
số lượng xạ khuẩn trong đất, số lượng xạ khuẩn ở nam bán cầu bao giờ cũng
cao hơn bắc bán cầu. Ngoài ra số lượng xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào
mức độ canh tác, độ phì nhiêu của đất, mức độ che phủ của thực vật…Đất
giàu dinh dưỡng hữu cơ, khoáng thì có nhiều xạ khuẩn hơn so với đất nghèo
dinh dưỡng. Trong 1g đất canh tác có thể phân lập được 5.000.000 CFU/g xạ
khuẩn. Đất vùng xa mạc khô nóng, nghèo dinh dưỡng có số lượng xạ khuẩn ít
hơn, dao động trong khoảng 10.000 – 100.000 CFU/g.
Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường,
chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6.8 –
7,5. Đồng thời số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong
năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần phải chú ý tới các điều kiện như
thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy mẫu, độ ẩm, nhiệt độ...

4


1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử). Hệ thống sợi xạ
khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 –
1,0µm đến 2,0 – 3,0µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [4].

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng
phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước của bào tử. Trường hợp
không có HSKS khuẩn lạc thường có dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có
màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và
điều kiện ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và điều kiện
nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…Đường kính mỗi
khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 – 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính
1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ (vì thế mà gọi là xạ
khuẩn). Một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng
nhất định. Nguyên nhân của những vòng tròn đồng tâm là do xạ khuẩn sinh ra
chất ức chế sinh trưởng. Khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi,
qua được vùng cơ chất ức chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp
theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trưởng sát với nó khiến khuẩn ty
phát triển yếu đi. Cứ như thế tạo thành các vòng tròn đồng tâm [5].
Khuẩn lạc có ba lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng
sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS,
độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ… có thể được tích lũy trong sinh khối tế
bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường.

5


* Khuẩn ty
Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một
loại phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ
khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử gọi là HSKS (khuẩn ty khí sinh – aerial
mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản. Một loại cắm sâu vào môi
trường gọi là HSCC (khuẩn ty cơ chất – substrate mycelyum) với chức năng

chủ yếu là dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố
này thường có màu sắc khác với màu sắc của HSKS. Đây cũng là đặc điểm
phân loại xạ khuẩn quan trọng.
Một số xạ khuẩn không có HSKS mà chỉ có HSCC, loại sợi này cho bề
mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khỏi môi trường khi cấy chuyền. Loại chỉ
có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc ra khỏi môi trường.
Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc
thành dạng màng, hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi
trường hay thành dạng bọt kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy
lắc hoặc nồi lên men khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi bông
hoặc cặn xốp. Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành những
quả cầu nhỏ chứa đầy môi trường, kích thước từ 0,1mm đến 2- 3mm [3].
1.1.3. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ
cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng
sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng sợi, dày 10 – 20 nm có tác dụng
duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp
ngoài cùng dày khoảng 60 – 120A0, khi già có thể đạt tới 150 – 200A0, lớp
giữa rắn chắc dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50 A0. Các lớp này chủ
yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – acetylglucozamin

6


liên kết với N – acetylmuramic bởi các liên kết 1,4 – β glucozid. Khi sử lý
bằng lyzozyme, các liên kết 1,4 – β glucozid bị cắt đứt, thành tế bào bị phá
hủy tạo thành thể sinh chất ( protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá hủy khi sử
lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hòa tan lipid khác.
Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipid (thành HSKS

có nhiều lipid hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không
chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao
đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [9].
Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào được chia thành 4 nhóm
chính [9], [4]:
Nhóm I : Thành tế bào có L-Axit diaminopimelic (L- ADP) và glixin
Nhóm II : Thành tế bào có meso- ADP và glixin
Nhóm III : Thành tế bào có meso- ADP
Nhóm IV : Thành tế bào có meso- ADP, đường arbinose, galactose.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm được cấu tạo
chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipid và protein. Chúng có vai trò đặc biệt
quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ
khuẩn.
Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế
bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và
các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm
sudan III và các hạt polysaccharid bắt màu với dung dịch lugol).
Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở
chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong AND, thường lớn hơn 55%, trong khi
đó ở vi khuẩn tỉ lệ này là 25 – 45% [6].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền
trong nhiễm sắc thề còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có

7


thể tự nhân lên và được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế
bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số
hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh,
chuyển genes, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển

chọn.
1.1.4. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ
phì nhiêu cho đất. Chúng đảm nhận nhiều chức năng khác nhau trong việc
làm màu mỡ cho đất bằng cách tham gia tích cực vào các quá trình chuyển
hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững như cellulose,
mùn, kitin, keratin, lignin…[15]
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có
tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6]. Trong đó có trên 15% có nguồn gốc từ các
xạ khuẩn hiếm như Actinomadura, Micromonospora, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium…Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn
hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học, thú
y học, bảo vệ thực vật như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixin,
tetraxicline… Bên cạnh đó trong quá trình trao đổi chất xạ khuẩn có thể sản
sinh ra nhiều chất hữu cơ. Trong đó điển hình là các enzyme ngoại bào
(cellulase, protease…), vitamin nhóm B (B1, B2,…, B12), một số axit hữu cơ
(acid lactate, acid acetate…)[15].
Ngày nay xạ khuẩn còn được ứng dụng rộng rãi trong nghành công nghiệp
lên men, chế tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này vào đời
sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào như
protease, amylase, cellulase, kitinase…Một số khác còn có khả năng tạo thành
chất kích thích sinh trưởng cho thực vật.

8


1.2. Các phƣơng pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại
Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lí sinh
học… nên việc định tên một số loại xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh
chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số, nghiên cứu

chủng loại phát sinh… Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình
thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lý- sinh hóa, miễn dịch học và sinh học
phân tử.
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những đặc điểm
quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định
loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng
trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian
nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình
thái và tính chất nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình
dạng và bề mặt bào tử.
Dựa vào đặc điểm hình thái người ta chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính:
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và
phân hóa thành HSKS và HSCC.
Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hướng
vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tương tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân
đốt hệ sợi.
Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào
có hình chữ V, T thường không có hệ sợi.
Dự vào nghiên cứu các xạ khuẩn trên các môi trường khác nhau người ta
chia hình dạng chuỗi bào tử thành 6 kiểu:
+ Kiểu S (Spira): chuỗi bào tử xoắn

9


+ Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng
móc câu hay xoắn không hoàn toàn.
+ Kiểu SRF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng.

+ Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa.
+ Kiểu RA- RF (Rectinaculum Apertum- Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử
có móc hay xoắn không hoàn toàn.
+ Kiểu RF ( Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng lượn sóng.
Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là
những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên như ta đã biết
xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp
xếp lại trong phân tử AND. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau
về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì
vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ
tiêu bổ sung như các đặc điểm sinh lý- sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học
phân tử.
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại
Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20
năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và hiệu quả thông qua việc định
tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật.
Type thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần
peptid và đường trong thành tế bào hay các polysaccarid gắn vào thành tế bào
Type Peptidoglican (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu
trúc của mạch tetrapeptid của PG cầu nối peptid và các liên kết giữa các mắt
xích của PG.
Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và Cornebacter. Đây là đặc điểm
phân loại cơ bản cho các chi đó.

10


Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch
thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu Iso và Entiso metyl hóa ở

nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10- metylloctade canoit (axit
tubereulostearinoic) là đặc điểm phân loại đến chi [11].
Photpholipid có 5 typ photpholipid (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần
đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.
Trong phân loại xạ khuẩn thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng
nhất. Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó,
người ta không thể nào không xác định thành tế bào.
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm
sinh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu
cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ
hệ thống enzyme. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu
muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh
trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất
kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn.
Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý, sinh hóa
cùng các đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân
loại. Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những
nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng
phải thay đổi [15].
1.2.4. Phân loại số
Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý –
sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số. Phương pháp
này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo
một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý – sinh hóa .

11


Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ vào

hệ số giống nhau (hệ số S – Similarity).
Công thức của Jacard ( Sj ):
Sj(AB) = NS * 100 / (NS + Nd)
Trong đó

Sj(AB): Mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%)
NS : Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng so
sánh.
Nd : Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính ở
chủng này và âm tính ở chủng kia).

Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu rễ
cây) của các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất được
xếp vào một nhóm.
1.3. Nhu cầu dinh dƣỡng của xạ khuẩn
Theo Nguyễn Thành Đạt trong quá trình tiến hóa của các VSV có quan
hệ mật thiết đối với các yếu tố của điều kiện sống. VSV cần ở tự nhiên hay
môi trường nuôi cấy nhân tạo chất dinh dưỡng để xây dựng nên các hợp chất
của tế bào và những hợp chất dùng để trao đổi năng lượng [3].
Nhu cầu dinh dưỡng của các VSV rất khác nhau. Ngay trong cùng một
loài VSV nhu cầu này cũng không có có sự thống nhất. Giống như các loài
VSV khác nhu cầu dinh dưỡng ở các loài xạ khuẩn cũng khác nhau. Trong
công nghiệp tùy thuộc vào mục đích mà người ta sử dụng các nguồn dinh
dưỡng thích hợp nhằm thu được năng suất cao nhất. Ví dụ nuôi cấy thu
enzyme cellulase người ta quan tâm đến nguồn cabon. Nhưng nếu mục đích
sản xuất là làm thế nào để thu được một lượng lớn chất kháng sinh nào đó thì
người ta lại quan tâm đến nguồn nitơ.

12

1.3.1. Nhu cầu cacbon
Cacbon chiếm 50% vật chất khô của vi sinh vật, là yếu tố quan trọng
trong tất cả các hợp chất hữu cơ có mặt trong tế bào. Các hợp chất cacbon là
nguyên liệu cho các hoạt động sống [6].
Trong tự nhiên có 2 dạng hợp chất cacbon cơ bản là cacbon vô cơ và
cabon hữu cơ, mỗi sinh vật khác nhau sử dụng các nguồn cacbon khác nhau.
Dựa vào nguồn dinh dưỡng cacbon mà người ta chia vi sinh vật thành 2 nhóm
chính:
Dị dưỡng cacbon.
Tự dưỡng cacbon.
Xạ khuẩn là vi sinh vật dị dưỡng cacbon, xạ khuẩn có khả năng phân giải
các hợp chất hidratcacbon khác nhau từ dạng đơn giản (acetat, lactat, các loại
đường đơn) đến các dạng phức tạp (oligosaccharid, polisaccharid). Các hợp
chất hữu cơ này ngoài việc cung cấp nguồn cacbon còn cung cấp nguồn năng
lượng cho các hoạt động sống.
Phần lớn xạ khuẩn có đời sống dị dưỡng hiếu khí, quá trình oxi hóa thu
năng lượng xảy ra kèm theo việc liên kết với oxi không khí. Xạ khuẩn có khả
năng phát triển được trong những môi trường chứa nguồn cacbon duy nhất.
1.3.2. Nhu cầu nitơ
Nitơ có ý nghĩa quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật. Trong đó
nguồn nitơ dễ hấp thu nhất là nguồn NO3- và NH4+. Chúng thâm nhập vào tế
bào dễ dàng ở đó chúng tạo nên các nhóm imin và amin. Các muối amon hữu
cơ thích hợp đối với dinh dưỡng VSV hơn là các muối amon vô cơ. Các muối
NO3- không có độ chua sinh lí nên sau khi sử dụng dạng này dễ còn lại các
ion K+, Na+, Mg+ các ion này đều làm kiềm hóa môi trường [6].
Nguồn nitơ khó hấp thu hơn cả là nguồn nitơ khí trời. Một số loài VSV có
thể sử dụng nguồn này nhờ khả năng cố định nitơ (chuyển hóa N →NH 3).

13

Phần lớn các loài xạ khuẩn đều có đời sống dị dưỡng nitơ. Chỉ một số loài
thuộc chi Frankraceae có khả năng cố định nitơ nhờ sống cộng sinh với rễ cây
họ đậu.
1.3.3. Nhu cầu vitamin và chất khoáng
Vitamin và chất khoáng đóng vai trò không nhỏ trong quá trình sống của
VSV. Trong tế bào VSV ngoài nước, các chất hữu cơ còn có một lượng lớn
các vitamin và chất khoáng lượng chất này trong tế bào thay đổi theo tùy loài.
Tùy giai đoạn, điều kiện sinh trưởng mỗi yếu tố đều có tác động nhất định đối
với sự phát triển của tế bào VSV mà các nhân tố khác không thể thay thế
được.
Nguyên tố khoáng được chia làm 2 loại:
Nguyên tố đa lượng: P, K, Ca, Mg, Fe, Na, Cl...
Nguyên tố vi lượng: Mn, Cu, Co, B...
1.4. Cellulose và Cellulase
1.4.1.Cellulose
Thành phần chất khô chủ yếu của thực vật là hemicellulose và lignin.
Các thành phần này thường có tỉ lệ không giống nhau ở các loại cây khác
nhau. Chúng phối hợp tạo nên cấu trúc và quyết định tính chất hoá học cà cơ
lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật. Các hợp phần này thường đi liền
với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno – cellulose .
Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật. Tổng lượng của
chúng chiếm tới 50% tổng số hydratcacbon trên trái đất. Về cấu trúc hoá học
của cellulose là một polyme mạch thẳng do các D - glucopyranose liên kết với
nhau bằng liên kết β -1,4glucozid. Các đơn phân glucose trong cellulose có
cấu hình dạng ghế, quay một góc 180° so với phân tử trước nó. Các nhóm
hydroxyl này đều nằm trên một mặt phẳng nằm ngang.

14

Bảng 1.1. Các thành phần chính của lingo – cellulose và các enzyme
phân giải ( Fengel và Wegener, 1989; Eaton và Hale, 1993 )
% sinh
khối
Đơn phân
tử

Cellulose

Hemicellulose

Lignin

40 – 50
Danhydroglucopyrano
se

25 – 40
Xylose
Mannose
Hexoses
Và các Pentose
β – 0 – liên kết mạch
thẳng với các mạch
nhánh thay thế
Endoxylanase
( E. C. 3.2.1.8)
và hydrolases khác

20 – 35
Coniferyl alcohol
ρ – counmaryl alcohol
Synapyl alcohol

Cấu trúc
đa phân tử

β – 0 – 4 liên kết
mạch thẳng

Các
enzyme có
hoạt tính
phân giải

Endoglucanlase
( E.C.3.2.1.4 )
Cellobiohydrolase
( E. C.3.2.1.91)
β – Glucosidase

Khử hydro trùng hợp thành
chất không kết tinh
Lignin peroxidase
( E. C. 1.11. 1. 7)
Mn phụ thuộc vào
peroxidase
(E.C.1.11.1.7)

Laccase (E. C. 1.10.3.2)

Hình 1.1. Cấu trúc lập thể của phân tử cellulose
Mức độ trùng hợp cellulose tự nhiên có thể đạt tới 10.000 đến 14.000 gốc
đường. Nhờ có phương pháp phân tích bằng tia rơnghen, người ta đã biết
trong tế bào thực vật cellulose có cấu tạo dạng sợi. Đơn vị nhỏ nhất hay dạng
sợi sơ cấp là chuỗi thẳng, bao gồm các gốc D-glucopyranose, đường kính ≈
3nm. Các sợi sơ cấp này liên kết với nhau bởi mối liên kết hydro hoặc lực
15


Vandervan hợp thành vi sợi, đường kính ≈ 10nm ÷ 40nm. Những vi sợi này
hợp thành những vi sợi lớn vững chắc có thể quan sát được dưới kính hiển vi
quang học. Mỗi sợi vi cấp lại được bao bọc bởi lớp lignin và hemicellullose.
Chính nhờ sự liên kiết chặt chẽ giữa cellulose, hemicellulose và lignin đã làm
cho cellulose vững chắc và khó phân giải hơn .

Hình 1.2. Cấu trúc cellulose
Cấu trúc của cellulose không đồng nhất và thường có 2 vùng:
Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự cao bền vững với tác động bên ngoài.
Vùng vô định hình do cấu trúc không chặt chẽ nên kém bền vững hơn.
Vùng vô định của cellulose có thể hấp thụ nước và trương lên. Trong
khi đó các mạng lưới liên kết hydro ở vùng kết tinh ngăn cản sự trương này,
nên enzyme chỉ tác động lên bề mặt các sợi [2].
Mặc dù với những phương pháp hiện có chưa đủ để xác định chính xác
cấu tạo của cellulose nhưng có thể thấy có rất nhiều kiểu gián đoạn và kết
thúc chuỗi, các bề mặt di dạng và các vùng xoắn hoặc phân nhánh dọc theo
các vi sợi. Trong quá trình sinh tổng hợp cellulose rõ ràng là không có sự
khống chế chặt chẽ nào để mọi sợi có chiều dài như nhau. Các sợi riêng biệt
có thể nằm trong nhiều vùng kết tinh, dẫn đến xảy ra nhiều chuỗi kết thúc bất

ngờ ngay trong vùng có độ kết tinh cao.

16