Nghiên cứu quy trình tẩy rửa và bảo quản màng BC tạo ra từ vi khuẩn acetobacter

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay, đối với các quốc gia trên thế giới công nghệ sinh học không
còn là một ngành mới mẻ mà nó đã trở thành một ngành kinh tế chủ đạo
trong sự phát triển khoa học kĩ thuật và công nghệ. Là một bộ phận của công
nghệ sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang ngày càng phát triển mạnh mẽ
và ngày càng có những ứng dụng thiết thực vào cuộc sống. Bằng việc ứng
dụng các quá trình lên men vi sinh vật đã tạo ra chế phẩm. Một trong các
chủng vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghệ lên men vi sinh
là vi khuẩn Acetobacter.
Vi khuẩn Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng
trong điều kiện nuôi cấy tĩnh tạo nên một lớp màng trên bề mặt dung dịch,
màng này có bản chất từ cellulose kết hợp với tế bào vi khuẩn Acetobacter
xylinum – gọi là màng BC.
Màng BC do vi khuẩn sản xuất ra có bản chất là cellulose cũng giống
như cellulose của thực vật nhưng có một số tính chất ưu việt hơn như: độ
dẻo dai, độ bền cơ học, khả năng polymer hóa cao… nên có rất nhiều ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm (sản xuất thạch dừa, màng để bảo
quản thực phẩm…); y học (sản xuất màng trị bỏng…); mỹ phẩm (sản xuất
màng làm mặt nạ…); bảo vệ môi trường (màng để bảo quản thực phẩm…);
công nghiệp (sản xuất giấy chất lượng cao…).
Màng BC mới chỉ được quan tâm gần đây và mới bước đầu thu được
kết quả. Việc tẩy rửa và bảo quản màng như thế nào để có những đặc tính
(pH, độ bền cơ học, độ dẻo dai, khả năng thấm hút, khả năng kháng khuẩn...)
phù hợp với ứng dụng trị bỏng trên thỏ đang là hướng nghiên cứu được
nhiều tác giả quan tâm.

-1-


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

Với mong muốn tìm hiểu rõ hơn, tìm ra được phương pháp tẩy rửa
màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum để đạt được những đặc tính cơ
bản và phương pháp bảo quản màng trong một thời gian nhất định không
làm thay đổi tính chất có được của màng thử nghiệm ứng dụng trị bỏng trên
thỏ, trên cơ sở kế thừa những kết quả của nhiều tác giả mà tôi quyết định
chọn đề tài: “Nghiên cứu quy trình tẩy rửa và bảo quản màng BC tạo ra từ
vi khuẩn Acetobacter”
2. Mục tiêu của đề tài
Lựa chọn phương pháp tẩy rửa màng từ vi khuẩn Acetobacter xylinum
BHN2 thích hợp ứng dụng trị bỏng trên thỏ.
Bước đầu khảo sát phương pháp bảo quản màng.
3. Nội dung tiến hành
- Tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Accetobacter xylinum BHN2
- Xử lý màng bằng 4 mô hình
- Khảo sát khả năng thấm hút nước, nghệ, thuốc kháng sinh của màng
sau khi xử lý.
- Bảo quản màng bằng túi hút chân không.
4. Ý nghĩa của đề tài
Đề xuất ra quy trình tẩy rửa màng và bảo quản màng BC ứng dụng trị
bỏng trên thỏ.

-2-

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Acetobacter

Acetobacter

:

-Đ

.

-

:h

-

:m

:n

,

-

)

Acetobacter

sâu nghiê

Acetobacter xylinum

.

Acetobater
:

c

.

2

:

.

-3-


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

:k

.

:
1: v
.
2: v

.
.

4: v

.

-

Acetobacter.
-

.
Acetobacter (Acetobacter aceti, Acetobacter melanoginum,
Acetobacter zances, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans

Pseumodonadaceae.
-

Acetobacter

.

Acetobacter

–

Acetobacteriaceae.

-4-

acetic


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

Acetobacter

:
2

2O.

) như: Acetobacter aceti.
.
như:

Acetobacter

rancens,

Acetobacter

pasteurianus,

Acetobacter

kneizigianus.
llulose như:
Acetobacter xylium.
2: k

.

(Acetobacter melanogenus

(Acetobacter recens).
30 - 35oC

+

18 - 21oC

(Acetobacter sobuxydans
(Acetobacter oxydans).

:
-

e.

- K

: glycerol,

manitol, sorbitol.
-

i

2O.

2

-

.

-

h
)

-

.

-5-

Khóa luận tốt nghiệp
-

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh
.
Acetobacter

:
1.1:

Acetobacter theo Fasteur (1950)

Stt
Acetobacter suboxydans.
1

Suboxydans

Acetobacter

2

melanogennum

H2O.

Acetobacter aceti
2

Meroxydans

Acetobacter xylium
Acetobacter meroxydan

trên

Acetobacter ascendans
3

Oxydans

Acetobacter ransens
Acetobacter lovaniens

4

Peroxydans

cao

Acetobacter peroxydans
Acetobacter paradoxum

1.1.3. Vi khuẩn Acetobacter.
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae,
phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Có thể phân lập được các giống vi
khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực, thực phẩm, giấm, rượu, bia,
hoa quả… Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và
mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa đáng kể.

* Đặc điểm hình thái của Acetobacter
Vi khuẩn Acetobacter bắt màu Gram âm (Gr

-

). Thông thường

Acetobacter có dạng hình que, kích thước thay đổi tùy theo loài (0,3 - 0,6 ×

-6-


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

1 - 8 µm), có thể di động (có tiêm mao hoặc chu mao), hoặc không di động
(không có tiêm mao), hiếu khí bắt buộc, chịu được độ acid cao, tế bào đứng
riêng rẽ hoặc kết thành từng chuỗi, có khả năng tạo thành váng trên môi
trường lỏng. Tùy điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi
trường nuôi cấy…), các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra hình thái khác
biệt (kéo dài hoặc phình to ra).
Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter có hình
dạng tròn, đều, đường kính trung bình khoảng 1 - 2 mm. Trên môi trường
lỏng, vi khuẩn Acetobacter tập trung phát triển trên bề mặt môi trường, tạo
thành lớp màng mỏng, trong suốt, có độ dày khác nhau.
Khả năng tạo váng thay đổi tùy theo loài:
Acetobacter xylinum tạo thành váng hemicellulose khá dày và chắc.
Acetobacter orleanse váng mỏng nhưng chắc.
Acetobacter pasteurianum váng khô và nhăn nheo.

Acetobacter suboxydans váng mỏng dễ tan dã.
Acetobacter curvum sinh ra acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo
váng không chắc chắn [1].
* Đặc điểm sinh trƣởng.
Vi khuẩn phát triển trong phạm vi nhiệt độ 12 - 35ºC, pH = 3,0 - 6,5;
hiếu khí tuyệt đối.
Vi khuẩn Acetobacter có khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau
để sinh trưởng và phát triển. Đa số các loài Acetobacter có khả năng đồng
hóa muối amôn, có khả năng phân giải pepton.
Acetobacter đòi hỏi phải có một số vitamin nhất định như acid
pantothenic và các chất khoáng như K, Mg, Ca, Fe, S, P… ở dạng muối vô
cơ và hợp chất hữu cơ. Do có bia, dịch thủy phân nấm men, nước mạch nha,
nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng tốt cho sự phát triển của vi khuẩn

-7-


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

Acetobacter. Tính chất đặc trưng của của Acetobacter là oxy hóa rượu thành
acid acetic. Ngoài khả năng lên men tạo acid acetic, một số loài Acetobacter
còn tổng hợp được vitamin B1, B2, oxy hóa propanol thành acid propionic,
oxy hóa sorbit thành đường sorbose dùng trong công nghiệp sản xuất
vitamin C, oxy hóa glycerin thành dioxyaceton, oxy hóa glucose thành acid
gluconic [18].
1.2 Vị trí và đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter xylium
1.2.1 Vị trí
Acetobacter xylinum là tên gọi chính thức theo hệ thống danh pháp

quốc tế 1990.
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Acetobacter
xylinum

thuộc

giống

Acetobacter,

họ

Pseudomonadaceae,

bộ

Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn còn nhiều
tranh cãi, có một số tác giả coi Acetobacter xylinum như một loài phụ của
Acetobacter acetic [16].
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylium
* Đặc điểm hình thái
Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di
động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm,
nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều
kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi.
Khuẩn lạc của Acetobacter xylinum có kích thước (đường kính khuẩn
lạc đạt 1 – 2 mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi
lên, dày hơn và sẫm hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn [17].
* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
+ Đặc điểm sinh lý:

-8-


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

Vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH = 4
- 6. Nhiệt độ và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái
hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu.
Acetobacter xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ
sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ
[5].
+ Đặc điểm sinh hoá [1]
Năm 1950, Fasteur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính
catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer… Theo quan điểm này
Acetobacter xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae,
bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng
khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Acetobacter
xylinum theo Frateur (1950)
STT

Đặc điểm

Hiện tƣợng

Kết quả

1

Oxy hoá ethanol
thành acid acetic

Chuyển hoá môi trường chứa
Bromphenol Blue 0,04% từ màu
xanh sang màu vàng

+

2

Hoạt tính catalase

Hiện tượng sủi bọt khí

+

3

Sinh trưởng trên
môi trường Hoyer

Sinh khối không phát triển

_

4

Chuyển hoá
glycerol thành
dihydroxyaceton

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau
lên men

+

5

Chuyểnhoá
glucose thành acid

Vòng sáng xuất hiện xung quanh
khuẩn lạc trên môi trường chứa
CaCO3

+

-9-


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

6

Kiểm tra khả năng
sinh sắc tố nâu

Không hình thành sắc tố nâu

_

7

Kiểm tra khả năng
tổng hợp cellulose

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

1.2.3. Sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylium
* Cấu trúc cellulose
Các kỹ thuật hiện đại đã xác định được cấu trúc của cellulose vi
khuẩn. Kỹ thuật nhiễu xạ tia X phân biệt các dạng cấu trúc và kích thước của
cellulose vi khuẩn. Các kỹ thuật phổ Rama, phân tích phổ hồng ngoại phổ
cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose vi
khuẩn. Cellulose vi khuẩn có đường kính bằng 1/100 đường kính của
cellulose thực vật (hình 1.1) [16].

Cellulose thực vật

Bacterial cellulose

Hình 1.1: Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật

Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mịn và độ của cellulose vi khuẩn
gần bằng với độ chịu lực của nhôm. Khi đem so sánh đường kính của
cellulose vi khuẩn và cellulose nhân tạo cho thấy: kích thước của cellulose vi
khuẩn còn nhỏ hơn kích thước của sợi tổng hợp hóa học có đường kính nhỏ

- 10 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

nhất BC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên
kết ß - 1,4 glucan [12].
Các sợi mới sinh ra của BC kết hợp lại với nhau để hình thành nên các
sợi sơ cấp (subfibril) có chiều dài khoảng 1,5 nm, là những sợi mảnh nhất có
nguồn gốc tự nhiên. Các sợi sơ cấp kết hợp thành vi sợi (microfibril). Các
sợi nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng thành dải (ribbon).
Cấu trúc của BC phụ chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện
nuôi cấy chính, vi khuẩn tổng hợp những màng celluose trên bề mặt nuôi
cấy, tại danh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxi. Các màng
BC được gọi là S - BC trên môi trường nuôi cấy tĩnh (S - BC: static BC).
Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ lỗ được xếp dọc trên bề mặt
của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống sâu hơn
trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên
các mặt phẳng song song như không có tổ chức, có vai trò chống đỡ cho
quần thể tế bào Acetobacter xylinum.
* Tính chất của cellulose
Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ
cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối… lên tính

chất của BC.
Sản phẩm của của cellulose vi khuẩn có một số tính chất như sau:
- Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao.
- Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể chỉnh độ xốp.
- Do khả năng S - BC hình thành sẵn màng, khi ứng dụng trong làm
vải không cần qua khâu dệt, làm giấy không cần qua khâu bột giấy.
- Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của
cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy.

- 11 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

- Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose
trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose.
- Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà
không gắn ligin, có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì
vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn nguyên liệu mới có nhiều ưu thế
trong tương lai [14].
* Quá trình tổng hợp cellulose của màng bacteria cellulose ở vi khuẩn
Acetobacter xylium.
- Vi khuẩn Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường dịch
lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh tạo nên một lớp màng trên bề mặt dung
dịch, màng này có bản chất từ cellulose kết hợp với tế bào vi khuẩn
Acetobacter xylinum – gọi là màng BC.
- Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước
được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa

nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [7].
- Các enzym tham gia quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn bao
gồm:
1PFK: fructose-1-phosphate kinase

CS: cellulose synthase

PGI: phosphoglucoisomerase

Fru-bi-P: fructose-1,6- bi-phosphate

PGM: phosphoglucomutase

UDPGlc: uridine diphosphoglucose

PTS: hệ thống phosphotransferase

FK: fructokinase

UGP: UDP-glucose

Glc-1-P: glucose-1- phosphate

pyrophosphophorylase

GK: glucokinase

Fru-6-P: fructose-6-phosphate

FBP: fructose-1,6-biphosphate

PGA: phosphogluconic acid

phosphatase

Glc-6-P: glucose-6-phosphate

G6PDH: glucose-6- phosphate
dehydrogenase

- 12 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

- Quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm nhiều phản ứng liên
tiếp nhau, được thực hiện bởi sự tham gia của một hệ các enzym [15].

Hình 1.2: Sơ đồ con đƣờng tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter
xylinum
Giai đoạn polymer hóa
Đầu tiên enzym glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa
chuyển glucose thành glucose-6- phosphate. Enzym phosphoglucomutase
tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate thông
qua phản ứng isomer hóa. Glucose-1-phosphate nhờ enzym UDP-glucose
pyrophospholyase chuyển hóa thành UDP-glucose. Cuối cùng, UDP-glucose
được tổng hợp nên sẽ được polymer hóa thành cellulose và cellulose được
tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là

- 13 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

cellulosesynthase. Enzym này được hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng là
cyclic-di-GMP.
Một số chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng sử dụng
đường fructose hiệu quả hơn. Hệ thống enzym phosphotransferase sẽ chuyển
fructose thành fructose-1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được
chuyển

hóa

thành

fructose-bi-phosphate

nhờ

enzym

fructose-1-

phosphatekinase. Enzym phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp
chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate. Glucose-6phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra
cellulose [17].

Giai đoạn kết tinh
Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết 1,4-glucan. Trong
đó, các chuỗi glucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực
liên kết yếu Van đec van. Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời
gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các
sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau
tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành
các bó sợi [14].
1.3. Ứng dụng của màng BC
1.3.1 Ứng dụng của màng BC trong một số lĩnh vực
Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh,
độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu,
khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường,
bề dày của vi sợi dưới 100 nm, bị phân hủy sinh học. có tính tương thích
sinh học, tính trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng. Màng BC có
các ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực như:

- 14 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

Thực phẩm: BC được dùng làm món tráng miệng (thạch dừa, kem ít
calori, đồ ăn nhanh, kẹo), chất nhũ hóa trong nước ép trái cây và những thức
uống khác, màng bao thực phẩm… [13]
Y học: điều trị tổn thương da trong ghép mô, cơ quan nội tạng, tác
nhân vận chuyển thuốc (qua đường miệng và da), da nhân tạo.
Mỹ phẩm: kem dưỡng da, chất làm nền cho móng nhân tạo, chất tăng

độ dày và bền cho nước làm bóng móng tay… [7]
Bảo vệ môi trường: làm chất hấp thu cho các vật liệu loại bỏ chất độc
hại (làm sạch nước thải), thu hồi dầu và khoáng sản.
Công nghiệp: vật liệu làm quần áo và giày dép, màng dung chuyển
đổi âm thanh, làm các loại giấy đặc biệt như giấy dùng trong lưu trữ tài liệu,
giấy có thời gian sử dụng lâu dài, trong vẽ, in, chất dính và chất xơ trên trang
vẽ như giấy làm phủ bề mặt láng trong công nghiệp in.
1.3.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng.
Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng
ngày. Ngoài tổn thương da, bỏng còn gây rối loạn nội tạng, để di chứng nặng
đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh [11].
Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc
biệt quan trọng. Đối với vết thương nông, điều trị tại chỗ vết bỏng có tác
dụng làm giảm đau ngăn chặn các chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho
quá trình tái tạo phục hồi. Đối với trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ có
tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm khuẩn
tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịch
trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức
hoại tử, tạo điều kiện tốt cho hình thành mô hạt và biểu mô hóa thành sẹo,
chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật. Màng BC tổng hợp từ
Acetobacter xylinum có những đặc tính làm màng sinh học trị bỏng, màng
băng vết thương, điều trị tổn thương da. Trong ghép mô, cơ quan nội tạng.

- 15 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng
Đối tượng nghiên cứu là chủng vi khuẩn Acetobacter xylium BHN2
được cung cấp từ phòng thí nghiệm vi sinh - Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2.
2.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)
Nồi hấp Tommy (Nhật)
Cân (Precisa XT 320 M – Thụy Sĩ)
Máy li tâm Sorvall ( Mỹ)
Máy đo màu UV - vis (Nhật)
Máy lắc Orbital Shakergallenkump
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)
Tủ lạnh
Máy hút chân không Ammera R V100
Buồng cấy vô trùng, kính hiển vi quang học, hộp nồng, ống nghiệm,
bình tam giác,lamen, đèn cồn… và một số dụng cụ hóa sinh thông dụng
khác.
2.3. Hóa chất - môi trƣờng
2.3.1 Hóa chất
- Nguồn Cacbon: Glucose, Acid acetic.
- Nguồn Nitơ:, Pepton, (NH4)2SO4.
- Các muối khoáng: KH4PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH.
- Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nấm men.
- Thuốc thử: dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol.
- Thuốc nhuộm: tím gentian, Fucshin, Lugol.

- 16 -

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

- Ngoài ra còn sử dụng : các loại bia, nước dừa, các loại nước chiết
quả.
2.3.2. Môi trường
* Môi trường phân lập giống (MT1)
Glucose: 20 g
KH2PO4: 2 g
CaCO3 : 10g
(NH4)2SO4: 3 g
MgSO4.7H2O: 2 g
Agar: 20g
Pepton: 4g
Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
* Môi trường nhân giống (MT2)
Glucose: 20 g
KH2PO4: 2 g
(NH4)2SO4: 3 g
MgSO4.7H2O: 2 g
Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước dừa: 1000 ml.
* Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng
Glucose: 20 g.
KH2PO4: 2 g.
(NH4)2SO4: 3 g.
MgSO4.7H2O: 2 g.
Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).

Nước dừa: 1000 ml.

- 17 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp vi sinh
* Phương pháp đếm khuẩn lạc [3]
Phương pháp đến khuẩn lạc là phương pháp cho phép xác định số
lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống có khả
năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc... Đây là
phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào trong mẫu, độ nhậy cao,
định lượng vi sinh vật ở nồng độ thấp, nhưng khả năng sai số lớn cần phải
lặp lại nhiều lần trên một độ pha loãng.
Lấy 1 ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng
theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha
loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 300C trong 5 ngày đếm
số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế
bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.

N

Ai .

1000 1
.

Vi 10 n

(1)

Trong đó
N : Tổng số CFU trong 1 ml mẫu ban đầu.
Ai: Số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giảm CaCO3 trên đĩa
phân lập có độ pha loãng 10 - n.
Vi : Thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập.
10 - n : Là độ pha loãng của mẫu phân lập.
* Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram [3]
Vai trò: Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều
loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi
khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của
protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iot.

- 18 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum đem nhuộm tiêu
bản theo Phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính
hiển vi quang học Olympus CH - 2 với độ phóng đại 1000 lần.
* Bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng [3] [4]
Các khuẩn lạc sau khi phân lập và xác định sơ bộ là vi khuẩn axetic
cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 3 ngày
ở tủ ấm 28 - 30oC. Sau đó giữ trong tủ lạnh 4oC cho nghiên cứu tiếp theo.

Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần.
* Phương pháp hoạt hóa giống
Giống trong ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem
sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh
vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa sử dụng môi trường tiêu
chẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 8 phút. Sau đó
đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghêng vào
và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ.
* Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1210C
trong 8 phút để tránh phân rã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn tím trong 15
phút. Bổ sung vào môi trường 5% giống hoạt hóa.
Nuôi ở điều kiện tĩnh trong 7 – 10 ngày.
2.4.2. Phương pháp vật lý
* Khảo sát khả năng thấm hút của màng

.
Sau khi xử lý màng BC chúng tôi tiến hành sấy khô ở 400C trong vòng
24h rồi cân khối lượng của màng, rồi kiểm tra khả năng thấm hút nước,
nghệ, kháng sinh (Berberin).

- 19 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

+ Đối với nước: sau khi sấy khô, cân màng chúng tôi đem màng
ngâm vào nước trong (2h, 6h, 12h) rồi lại đem cân khối lượng của màng

trong thời gian trên.
+ Đối với nghệ: sau khi sấy khô, cân màng chúng tôi đem màng ngâm
vào nước trong (2h, 6h, 12h) rồi lại đem cân khối lượng của màng trong thời
gian trên.
+ Đối với thuốc kháng sinh: sau khi sấy khô, cân màng chúng tôi đem
màng ngâm vào dung dịch thuốc kháng sinh (thuốc kháng sinh hòa tan trong
nước) trong (2h, 6h, 12h) rồi lại đem cân khối lượng của màng trong thời
gian trên.
M = m2 – m1
M: khối lượng nước, nước nghệ hoặc dung dịch thuốc kháng sinh hút
vào.
m2: khối lượng màng sau khi ngâm nước, nước nghệ, dung dịch thuốc
kháng sinh.
m1: khối lượng màng trước khi ngâm nước, nước nghệ, dung dịch
thuốc kháng sinh.
* Khảo sát khả năng ngăn cản vi khuẩn của màng [9]
Khảo sát khả năng ngăn cản vi khuẩn của màng BC và so sánh với vải
gạc vô trùng đang lưu hành trên thị trường. Đặt các hộp lồng có chứa môi
trường dinh dưỡng và được
), gạc vô trùng ở ngoài không khí

d

nghiệm trong 24 giờ. Đưa vào tủ ấm 370C và quan sát trong những ngày tiếp
theo.
2.4.3. Kiểm tra độ pH
Kiểm tra bằng cách so màu bằng giấy chỉ thị.

- 20 -

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

Dùng giấy chỉ thị đặt một đầu lên màng sau khi xử lý, khi đó giấy chỉ
thị sẽ hình thành màu. Ta so màu của giấy chỉ thị với bảng màu để đọc độ
pH.
2.4.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả [6] [10]
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
thí nghiệm.

X

1
n

n

Xi
i 1

+ M: giá trị trung bình.
+ Xi: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm, từ 1đến n.
+ n: số lần thí nghiệm.
2.4.5. Phương pháp xử lý màng
Màng sau khi lên men còn nhiều phần dư của môi trường bám lên chủ
yếu là đường và một lượng lớn acid được tạo ra. Để làm sạch khuẩn, màng
có cảm quan: màu, mùi, độ dai, bền, pH vừa phải phù hợp với ứng dụng trị
bỏng thử nghiệm trên thỏ thì cần phải tẩy rửa màng. Tôi thực hiện nghiên

cứu một số mô hình tẩy rửa màng như sau:
Mô hình 1
+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần.
+ Đun sôi với nước trong 30 phút.
Mô hình 2
+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần.
+ Đun sôi với nước trong 30 phút.
+ Trung hòa với NaOH 0,1N ở nhiệt độ phòng trong 12h.
+ Rửa lại bằng nước 3 lần.
Mô hình 3
+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần.

- 21 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

+ Đun sôi với NaOH 0,5% trong 30 phút.
+ Rửa lại bằng nước 3 lần.
Mô hình 4
+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần.
+ Đun sôi với NaOH 0,5% trong 30 phút.
+ Trung hòa với acid citrid 5% ngâm với NaOH 0,5N trong 12h.
+ Ngâm với NaOH 0,5N trong 12h.
+ Trung hòa với acid citrid 5%.
2.4.6. Phương pháp bảo quản màng
Sử dụng máy hút chân không để bảo quản màng sau khi đã xử lý.
Màng sau khi được xử lý chúng tôi đem sấy khô ở 40 0 và bảo quản

màng bằng túi hút chân không bằng cách sử dụng máy hút chân không hút
hết không khí bên trong túi đựng màng.

- 22 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm của chủng Acetobacter xylinum BHN2
3.1.1. Hình thái và kích thước tế bào
Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần,
chúng tôi nhận thấy chủng Acetobacter xylinum BHN2 có dạng hình que, là
vi khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ 1,5 - 2,5µm. Tế bào xếp dạng
đơn, đôi, hoặc chuỗi ngắn.

Hình 3.1 Kết quả nhuộm Gram của Acetobacter xylinum BHN2
3.1.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Vi sinh vật khi phát triển trên môi trường đặc sẽ hình thành các khuẩn
lạc đặc trưng, khuẩn lạc của Acetobacter xylinum BHN2 có dạng tròn, trắng,
đục, đa số bề mặt khuẩn lạc trơn bóng và cấu trúc khuẩn lạc đồng nhất. Sau
4 ngày nuôi cấy, kích thước trung bình của khuẩn lạc 1 - 2 mm (hình 3.3).

- 23 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

Hình 3.2 Khuẩn lạc của Acetobacter xylinum BHN2
trên môi trƣờng thạch đĩa
Quan sát sự sinh trưởng của các chủng dọc theo vết cấy trên môi
trường thạch nghiêng đều có dạng dày và mép thẳng.
3.1.3. Tạo màng BC trên môi trường dịch lỏng
Vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi cấy trong môi trường lỏng hình
thành một lớp màng trên môi trường nuôi cấy (hình 3.4).

Hình 3.3 Màng BC do vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2

- 24 -


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tuyết - K33C - Sinh

Vi khuẩn Acetobacter xylinum là những loài hiếu khí, khi sống trong
môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp
thụ đường glucose, kết hợp đường với một acid béo để tạo thành tiền chất
nằm ở màng tế bào. Tiền chất này tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên
màng tế bào cùng với một enzym có thể polymer hóa glucose thành cellulose
và trên môi trường dịch thể chúng sẽ phát triển thành lớp màng độ dày,
mỏng khác nhau tùy thuộc vào từng loài. Màng là tập hợp các tế bào vi
khuẩn liên kết với cellulose.
Kết quả quan sát cho thấy màng BC từ chủng Acetobacter xylinum
BHN2 có màu trắng sáng, bề mặt màng nhẵn, có độ dai cao.
Như vậy, kết quả hình thái và kích tế bào, khuẩn lạc, khả năng tạo

màng BC, đặc điểm của màng tạo ra từ chủng Acetobacter xylium BHN2 đáp
ứng yêu cầu tạo màng ứng dụng trong trị bỏng. Vì vậy, chúng tôi sử dụng
chủng vi khuẩn này lên men tạo màng phục vụ nghiên cứu.
3.2. Xử lý màng BC
- Khả năng thấm hút của màng BC vô cùng quan trọng trong trị bỏng
vì nó ảnh hưởng đến khả năng hút dịch rỉ của vết thương do bỏng gây ra, khả
năng tái tạo mô, ngăn cản khuẩn, lành sẹo…
+ Màng có khả năng hút nước tốt khi đắp lên vết thương sẽ hút dịch
rỉ, làm giảm độ ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho tái tạo mô.
+ Màng có khả năng thấm hút nghệ tốt khi đắp lên vết thương sẽ hút
dịch rỉ, làm mát và nhanh lành sẹo.
+ Màng có khả năng thấm hút thuốc kháng sinh tốt khi đắp lên vết
thương có khả năng hút dịch rỉ, ngăn cản vi khuẩn xâm nhập, vết thương
nhanh lành.

- 25 -