Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và trình tự gen trnh psba của loài sao mặt quỷ (hopea mollissima c y wu, 1957) ở việt nam

Trường ĐHSP HN 2

1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Các loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) đã tạo nên một họ thực vật độc
đáo và nổi tiếng của vùng nhiệt đới. Hiện nay, gỗ các loài cây họ Dầu đang
chiếm phần lớn trên thị trường gỗ thế giới nên rõ ràng chúng đang đóng một
vai trò quan trọng đối với nhiều nước, nhất là các nước châu Á đặc biệt là ở
các nước Đông Nam Á. Ngoài việc cung cấp gỗ, các loài cây họ Dầu còn đem
lại nhiều loại sản phẩm có giá trị khác phục vụ đời sống con người như tinh
dầu thơm, nhựa mủ, mỡ bơ, camphor, tannin …
Các chi lớn nhất trong họ Dầu là Shorea (khoảng 250 loài), Hopea (105
loài), Dipterocarpus (70 loài) và Vatical (65 loài) [11]. Ở Việt Nam, họ Dầu
có 6 chi (Anisoptera, Hopea, Parashorea, Vatica, Dipterocarpus, Shorea),
hầu hết là loài bản địa và đặc hữu. Do giá trị thương mại và nhu cầu của
người dân địa phương, các loài cây họ Dầu bị khai thác quá mức [4]. Ở Việt
Nam, các loài cây họ Dầu hiện chỉ còn gặp trong các khu bảo tồn đã được quy
hoạch vì trong những năm qua, do chiến tranh tàn phá, khai thác quá mức mà
diện tích rừng nói chung và rừng hỗn giao cây họ Dầu nói riêng đã bị suy
giảm nghiêm trọng. Theo viện Điều tra quy hoạch rừng (1995), ở thời điểm
năm 1959, diện tích các loài rừng có cây họ Dầu ở Đông Nam Bộ chiếm 49%
diện tích toàn vùng, đến năm 1968 giảm xuống 36%, năm 1982 giảm còn
18% và năm 1992 chỉ còn 8% [10]. Xét ở quy mô quốc gia, tài nguyên cây họ
Dầu nói chung và tài nguyên di truyền cuả từng loài cây họ Dầu nói riêng đã
bị suy kiệt mạnh. Hiện tại, trong số hơn 40 loài thuộc họ Dầu có ở Việt Nam
thì 33 loài đang bị đe doạ ở mức độ toàn cầu.
Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) là loài phân bố hẹp, chỉ
có ở Việt Nam và Trung Quốc, do gỗ chắc bền, có nhiều giá trị sử dụng nên

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

2

gỗ Sao mặt quỷ bị khai thác quá mức, hiện đang đứng trước nguy cơ bị đe doạ
tuyệt chủng cao, theo sách đỏ Việt Nam 2007, Táu Mặt Quỷ được xếp ở cấp
độ sẽ nguy cấp Vu A1c, d [2].
Để bổ sung thông tin về di truyền cho cở sở dữ liệu các loài thực vật
quý hiếm của Việt Nam và góp phần nâng cao chất lượng của công tác bảo
tồn loài, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái và
giải mã trình tự gen trnH-psbA của loài Sao Mặt Quỷ (Hopea mollissima
C.Y.Wu, 1957) thu tại Khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang.
2. Mụ đ

đề

:

Nghiên cứu các thông tin về phân bố, sinh thái, hiện trạng, trình tự gen
trnH-psbA và giá trị tài nguyên loài Sao mặt quỷ ở Việt Nam, nhằm cung cấp
cơ sở dữ liệu cho công tác phân loại, bảo tồn và các nghiên cứu có liên quan.
3.
3.1.

n

ọ
n

n
ọ

ết quả của đề tài sẽ góp phần bổ sung vào tài liệu về phân loại thực vật
ở Việt Nam, cung cấp thông tin về đặc điểm sinh học và trình tự gen trnHpsbA của loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam,
phân biệt với Sao hòn gai (Hopea chinensis Hand- azz) c ng như trong công
tác nghiên cứu các loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam.
3.2.

n

ti n:

Ứng dụng vào sản xuất lâm nghiệp, sinh thái và tài nguyên sinh vật.
4. Đ ểm mới c

đề tài:

Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về trình tự gen trnH-psbA của loài
Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam c ng như trên
thế giới.
Đã ôn bố 1 bài báo khoa học tại: “Hội nghị sinh viên nghiên cứu
khoa học các trường ĐHSP toàn quốc lần thứ VI”.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

3

Bố cục c a khóa luận gồm: 29 trang, 15 ảnh, 4 bảng được chia thành
các phần chính như sau:

ở đầu (3 trang), chương 1 (Tổng quan tài liệu: 3

trang), chương 2 (Đối tượng, phạm vi, thời gian và phương pháp nghiên cứu:
8 trang), chương 3 ( ết quả nghiên cứu: 14 trang), kết luận và kiến nghị (1
trang), tài liệu tham khảo (21 tài liệu), phụ lục.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về en (Vùn đệm) trnH-psbA
Vùng đệm trnH-psbA nằm trong hệ gen lục lạp. Vùng này có kích
thước xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất cao (100% với các loài

đã được nghiên cứu).

ức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài là

1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0.00% - 0.08% [14]. Trình tự
trnH-psbA c ng đã được công bố trên ngân hàng gen với nhiều loài khác nhau
thuộc thực vật Hạt trần, dương xỉ, rêu và rêu tản (liverwort).

Hình 1.1. Cấu trúc của hệ gen lục lạp và vị trí của gen trnH-psbA trên hệ
gen lục lạp [21].

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

5

1.2. Lƣợc sử nghiên cứu
1.2.1. Trên thế giới
Loài Sao mặt quỷ được tác giả người Trung Quốc Wu Cheng Yi công
bố (dựa vào mẫu vật thu được của P.Y. ao thu ngày 7 tháng 4 năm 1954,
trên núi Pingbian ở độ cao 800m, thuộc tỉnh Vân Nam, Trung Quốc) năm
1957 [20] với tên khoa học là Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957 và xếp trong
họ Dầu (Dipterocarpaceae). Sau này, có một số công trình nghiên cứu đề cập
đến đặc điểm sinh học của họ Dầu nói chung và chi Hopea, như: Ashton
(1982) [12]; Li Hsiwen-editor (1990) [15] cung cấp các thông tin về đặc điểm
hình thái, phân bố, sinh học và sinh thái loài Hopea mollissima C. Y. Wu,

1957 ở Trung Quốc (sau này Xi-wen Li, Jie Li & Peter S. Ashton (2007) [19]
c ng đề cập đến trong công trình Thực vật chí Trung Quốc được dịch ra tiếng
Anh); Ashton, P. (1998) [13] c ng đã đề cập đến loài Hopea mollissima C. Y.
Wu, 1957 trong danh lục đỏ thế giới,…
1.2.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, các công trình đề cập đến chi Hopea và loài Sao mặt quỷ
(Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) chủ yếu là các công trình phân loại hay giá
trị tài nguyên, như: Nguyễn Tiến Bân (1997) [1] giới thiệu họ Dầu
(Dipterocarpaceae) và chi Hopea; Phạm Hoàng Hộ (1999) [8] cung cấp các
thông tin để nhận biết loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) ở
Việt Nam; Nguyễn

im Đào (2003) [6] đã chỉnh lý về danh pháp, cung cấp

các thông tin về phân bố, sinh thái và giá trị tài nguyên loài Sao mặt quỷ
(Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam; Nguyễn Tiến Bân & nnk
(2007) [2] cung cấp các thông tin về hình thái, phân loại và đánh giá hiện
trạng bảo tồn loài này trong Sách đỏ Việt Nam,…
Như vậy có thể thấy rằng, công trình “Nghiên cứu một số đặ đ ểm
sinh học và

n

Khóa luận tốt nghiệp

en

nH-psbA c a loài

ặ

ỷ (Hopea

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

6

mollissima C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam” là công trình đầu tiên ở Việt Nam
nghiên cứu trình tự gen trnH-psbA của loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima
C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam c ng như trên thế giới.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

7

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, THỜI GIAN VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đố ƣợng nghiên cứu
Mẫu lá và vỏ cây loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957)
được thu tại khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang, Việt Nam.

Hình 2.1. Sơ đồ vị trí thu mẫu

2.2. Đị đ ểm nghiên cứu
Khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang, Việt Nam; Phòng tiêu
bản thực vật và phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, Viện Sinh
thái và Tài nguyên sinh vật.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

8

2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 7 năm 2011 đến tháng 12 năm 2012.
2.4. P ƣơn p áp n

ên ứu

2.4.1. P ƣơn p áp phân loại bằng hình thái học
Chúng tôi sử dụng mẫu tiêu bản thu tại khu bảo tồn thiên nhiên Khe
Rỗ, tỉnh Bắc Giang kết hợp với các mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng tiêu
bản thực vật - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (HN). Các mẫu tiêu bản
sử dụng trong nghiên cứu gồm các mẫu có số hiệu: 1171,3179, 5454 - phòng
tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
Các mẫu lá, cành, cuống, hoa được quan sát và soi dưới kính hiển vi
điện tử (với độ phóng đại 40X10, 4X10) tại phòng thực hành thực vật Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.

2.4.2. P ƣơn p áp đọc trình t gen
Để xác định trình tự gen trnH-psbA, chúng tôi sử dụng phương pháp giải
trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR theo nguyên lý của Sanger et al, 1977 [16],
thực hiện trên máy đọc trình tự ABI 3100.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

9

2.4.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Mẫu vỏ cây
Sao mặt quỷ

[17]
[21]

Tách chiết

Thiết kế mồi

ADN tổng số

Cặp mồi

PCR

Vùng gen trnHpsbA

Cặp mồi

Giải trình tự

Đọc kết quả trình tự gen

Phân tích số liệu, so sánh
với các loài thuôc chi Sao,
họ Dầu.

Hình 2.2. Sơ đồ các bước thí nghiệm
2.4.2.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số.
ADN là đại phân tử có kích thước lớn, nằm trong nhân tế bào do đó
muốn thu được ADN ta phải dùng cả tác nhân cơ học và tác nhân hóa học.
Phương pháp tách cơ bản gồm ba bước: Phá huỷ màng tế bào và màng nhân;

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

10

loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các prôtêin;

thu ADN bằng tủa cồn.
Tách chiết ADN tổng số
ADN tổng số được tách chiết theo CTAB của Xavier, 2000 [18] có cải
tiến cho phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam.
Quy trình tách được thực hiện theo các bước sau:
- Nghiền 00mg mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ thành bột mịn,
chuyển vào ống epp ml.
- Bổ sung 00l đệm rửa (Tris-HCL 100mM, EDTA 5mM, Sodium
metabisulfit 0,5, pH: 8.0, H2O…) vào ống epp ml, trộn đều tạo thành dịch
đồng nhất. Li tâm 000 v/p trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Bổ sung 600l đệm tách chiết (NaCl 1,5M , Tris-HCl 100mM, EDTA
20mM, CTAB 3, PVP 2%), đảo nhẹ tạo thành hỗn hợp đồng nhất ủ trong 60
phút ở 65oC (đảo đều sau mỗi 10 phút).
- Sau khi để nguội khoảng 5 phút, để loại bỏ các thành phần khác
không mong muốn như các poly-saccarit ta bổ sung thêm 00l chloroform:
isoamylacohol (:), đảo đều tạo thành dịch. Ly tâm 000 v/p trong 0 phút
ở o C, hút phần dịch nổi cho vào ống epp ,5ml mới (bước này thực hiện 2
lần).
- ADN được tủa bằng cách cho Isopropanol lạnh vào mẫu theo tỷ lệ
(Vmẫu: Visopropanol = :) đảo nhẹ để ở tủ -0oC trong ít nhất  giờ.
- ADN kết tủa được rửa sạch bằng 00l cồn 0. Ly tâm 000 v/p
trong 5 phút ở oC, loại cồn.
- Làm khô ADN. Hoà tan ADN trong 00l nước khử ion.
- Loại bỏ ARN bằng 2µl Rnase (10mg/ml), ủ ở 370C trong 1 giờ.
- Mẫu ADN được bảo quản ở - 200C.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung

Trường ĐHSP HN 2

11

- ADN tổng số sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose 1%.
2.4.2.3. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose
Điện di ADN trên gel Agarose là phương pháp được sử dụng trong cả
phân tích định tính và định lượng mẫu ADN. ADN là đại phân tử sinh học
mang điện tích âm, nên trong môi trường có điện trường các phân tử ADN có
kích thước khác nhau di chuyển từ cực âm sang cực dương với tốc độ khác
nhau.
Gel Agarose là loại gel thông dụng và phổ biến nhất, thao tác đơn giản,
thường được sử dụng để phân tích những đoạn có kích thước khoảng 0,50kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang [7].
- Cách pha Agarose :
Cho 0,g agarose và 0ml đệm TAE 1X hoà tan bằng cách đun hỗn
hợp trong lò vi sóng khoảng  phút.
Khi gel nguội đạt khoảng 600C, bổ sung vào dung dịch gel l EB (10
mg/ml), lắc đều, đổ hỗn hợp gel - EB vào giá thể đã cắm sẵn các lược tạo
giếng phù hợp với số lượng mẫu.
Để gel khô, khi gel đã khô, rút lược ra.
Dùng pipet hút 7µl mẫu. Mẫu được mix đều với 1µl màu nhuộm điện
di (brommophenol blue + glycerol) (loading dye) trên giấy parafin trước khi
đưa vào các giếng trên bản gel. Việc cho màu nhuộm điện di vào giúp ta nhận
biết mẫu và làm mẫu nặng hơn tránh bị nổi khi cho vào bể điện di.
Đưa bản gel vào bể điện di và chạy trong khoảng 0 phút ở 100v, 30A.
Soi gel đưới đèn UV. Các phân tử ADN bắt màu với EB trong gel agarose sẽ
hiện sẽ hiện lên với các vạch màu đỏ cam dưới đèn UV.
Nồng độ ADN được xác định dựa vào độ sáng của băng ADN so với độ
sáng của băng ADN chuẩn. Độ gọn của băng ADN sẽ cho biết độ nguyên vẹn

của ADN đã tách chiết được.
Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

12

2.4.2.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR)
do

ary

ullis phát minh ra năm 1985. Phương pháp PCR dựa vào đặc tính

của enzym ADN polymerase có khả năng xúc tác tổng hợp mạch ADN mới
trên mạch khuôn, với sự có mặt của mồi (mồi xuôi và mồi ngược).
- Cách tiến hành:
Nhân bản vùng gen trnH-psbA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi trnHpsbA.
+ Mồi xuôi trn-H:
5’- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC
+Mồi ngược psbA:
5’-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C
Chu trình phản ứng PCR được chạy trong tổng thể tích 50µl gồm 32µl H2O, 5
µl đệm, 5 µl dNTP, 3 µl mồi xuôi F (30 pM), 3 µl mồi ngược R (30 pM), 1 µl
ADN tổng số, 1 µl enzyme Taq-polymerase.
Chương trình chạy PCR được tiến hành theo chu kỳ nhiệt: 2 phút ở

960C, 30 chu kỳ (30 giây 960C, 25 giây 560C, 40 giây 72 0C) và sau đó là 1
chu kỳ ở 72 0C trong 5 phút.
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agrarose 1% và tinh sạch
bằng Qiaquick gel extranction kit (Qiagen, Đức).

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

13

Phản ứng PCR được thực hiện với chu kỳ nhiệt như sau:

30 chu kỳ
960C

960C

720C

2phút

30 giây

560C

40 giây

720C

5 phút

25 giây

40C
∞

Hình 2.3. Chu trình phản ứng PCR
2.4.2.5. Phương pháp đọc trình tự nucleotide
Phương pháp giải trình tự hiện nay được dùng phổ biến là phương pháp
Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain - determination
method) là một phương pháp xác định trình tự ADN được Frederick Sanger
phát triển vào năm 1977 [16].
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy là dựa vào hoạt động của
enzyme ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN. Enzym ADN
polymerase xúc tác quá trình gắn các nucleotit vào mạch đơn ADN đang tổng
hợp ở vị trí 3’có chứa nhóm-OH tự do, khi gặp nucleotit không có nhóm -OH
ở vị trí 3’ thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp là sử
dụng các loại dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp ADN một
cách ngẫu nhiên. Trong phản ứng sử dụng mồi tổng hợp là đoạn ADN mạch
đơn có kích thước khoảng 20 nucleotit.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản
ứng giải trình tự trực tiếp với mồi psbA, sử dụng Bigdye terminator cycler và
đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

2.4.3. P ƣơn p áp p ân

14

số liệu

- Sử dụng chương trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng
đã được các tác giả công bố trên ngân hàng gen (Genbank).
- Các trình tự ADN được so sánh, phân tích với các loài thuộc chi
Hopea và các loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) (Bảng 2.1) sử dụng các
phần mềm Clustalx.8.1.msw, phần mềm

ega 5 được dùng để phân tích tiến

hóa phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp
Maximum Parsimony (MP).
Bảng 2.1. Danh sách các trình tự sử dụng trong nghiên cứu

Tên khoa học

Mã hiệu Genbank

Hopea parviflora

JX502816.1

Hopea racophloea

JX502817.1

Pteleopsis anisoptera

EU338170.1

Shorea robusta

JX856942.1

Giá trị bootstrap (bootstrap value) dùng để đánh giá độ tin cậy của cây
phát sinh chủng loại được tính với 1000 lần lấy mẫu thử (resampling).

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

15

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đặ đ ểm loài Sao mặt quỷ ở Việt Nam
3.1.1. Đặ đ ểm hình thái
Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) là loài cây gỗ lớn

thường xanh , cao tới 40m, đường kính 40-80 hay hơn. Gốc có bạnh khá lớn.
Vỏ mầu nâu nhạt khi non, khi già nâu xẫm và bong thành các mảnh, để lại các
vết sẹo hình tròn đồng tâm. Cành non mảnh có lông dài hình sao. Lá đơn hình
trứng thuôn hay hình mác kích thước cỡ 13-18(-22) x 3,5-4,5(-8) cm (lá trung
bình) hoặc dài 22 cm, rộng 8 cm (lá lớn); chóp nhọn, mép nguyên, gốc nhọn
đến gần tròn; cả hai mặt lá đều có lông hình sao, mặt dưới rậm hơn, nhất là
trên các gân (khi già lông ít dần); gân bên 8-14 đôi, nổi rõ ở mặt dưới; gân
mạng nhiều và rõ. Cuống lá dài 1 cm, có nhiều vết nứt ngang.
Cụm hoa: Dạng cụm hoa chùy, mọc ở nách lá gần đỉnh cành hay cành
không mang lá. Hoa nhỏ, thơm, hoa lưỡng tính, nhỏ, mẫu 5; đài hợp ở gốc,
mặt ngoài có lông; cánh hoa rời, màu hồng; nhị 10; bộ nhụy gồm 3 lá noãn
hợp thành bầu thượng, không có lông.
Q ả: Quả hạch khô, hình cầu, đường kính 8-9 mm; đỉnh có 2 cánh phát
triển và 3 cánh nhỏ (do đài tạo thành); cánh quả phát triển có hình mác ngược,
cỡ 9-10 x 2,5-3,5 cm, có 10-14 đôi gân rõ .
Tuy nhiên trong thực tế, việc nhận dạng ra loài cây này c ng gặp nhiều
khó khăn bởi Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) và Sao hòn gai
(Hopea chinensis Hand - Mazz) là hai loài có rất nhiều đặc điểm giống nhau.
Qua quá trình tiến hành nghiên cứu, chúng tôi đã tìm ra được một số đặc điểm
riêng biệt của Sao mặt quỷ. Đây là những đặc điểm giúp chúng ta dễ dàng
phân biệt được hai loài này trong tự nhiên và c ng là những thông tin quan
trọng cho các nhà phân loại.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

16

Để giúp cho việc phân loại rõ ràng chúng tôi đưa ra bảng 3.1 chỉ ra
những đặc điểm sai khác cơ bản và dễ nhận biết nhất giữa hai loài này.
Bảng 3.1: Những đặc điểm sai khác cơ bản giữa
Sao mặt quỷ và Sao hòn gai

STT

Sao mặt quỷ
Thân

1

2

(hình 3.1, 3.2)

Lá

Mặt trên

(quan

(hình 3.3)

sát

Mặt dưới

dưới

(hình 3.4)

kính

Sao hòn gai

- Vỏ già mầu nâu sẫm.

- Vỏ già mầu nâu nhạt.

- Vỏ bong tạo các sẹo

- Vỏ bong tạo các sẹo

trên thân hình tròn đồng trên thân hình tròn
tâm rất rõ.

không thật đồng tâm.

Có lông hình sao

Không có lông

Có nhiều lông hình sao

Không có lông

hiển

vi)
3

Cuống lá
(hình 3.1, 3.2)

Khóa luận tốt nghiệp

Có nhiều vết nứt ngang

Không có vết nứt
ngang

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

17

Hình 3.1. Thân cây và cuống lá Sao mặt quỷ

Hình 3.2. Thân cây và cuống lá Sao hòn gai (Ba Mùn-Quảng Ninh)

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

18

Hình 3.3. Lá (mặt trên) Sao mặt quỷ và Sao hòn gai

Hình 3.4. Lá (mặt dưới) Sao mặt quỷ và Sao hòn gai.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

19

Hình 3.5. Lông hình sao và lá Sao mặt quỷ.

Hình 3.6. Quả và cành Sao mặt quỷ
(mẫu tiêu bản 3179 thu ở Ba Rền - Quảng Bình, ngày thu 14/8/2000)

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

20

3.1.2. Đặ đ ểm sinh học - sinh thái
a đất ẩm, có tầng đất thịt dầy nhưng thoát nước; mọc trong các rừng
nhiệt đới, kín ẩm, thường xanh ở độ cao 100-1100 m, nhưng tập trung nhất ở
400-800 m, tạo thành các quần thể rừng ưu thế hoặc gần thuần loại; thường
mọc cùng với Táu muối (Vatica diospyroides Simingt), Chắp trơn
(Beilschmiedia laevis Allen), Lim (Erythrophleum fordii Oliv.), Vàng tâm
[Manglietia dandyi (Gagnep) Dandy].

ùa hoa tháng 6-9, mùa quả tháng 3-4

(năm sau). Tái sinh dưới tán cây mẹ rất tốt, nhưng nếu thiếu sáng lâu thì cây
mạ sẽ bị chết hàng loạt [2,5,3].
3.1.3. P ân bố,

ện trạng và giá trị tài nguyên

a. Phân bố
Ở Việt Nam, trước kia chỉ tìm thấy ở Lào Cai, Yên Bái, Ninh Bình,
Thanh Hóa, Nghệ An, Hà T nh [2,3].
Hiện nay, ngoài những khu vực trên chúng tôi đã tìm thấy ở khu bảo tồn
thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang, Việt Nam.
Trên thế giới, mới tìm thấy ở Trung Quốc (Hải Nam) [2,6,9,5].
b. Hiện trạn

á

ị

n

ên

Gỗ bền và nặng, màu xám vàng, ít bị mối mọt, nhưng dễ bị nứt; được
dùng trong xây dựng, đóng tầu, làm tà vẹt,...
Theo các nghiên cứu, ước lượng và tính toán số lượng quần thể của loài
Sao mặt quỷ sẽ bị suy giảm ít nhất là 20% trong 10 năm tới, mặt khác với
mức độ khai thác ngày càng nhiều nơi cư trú ngày càng bị thu hẹp do đó Sao
mặt quỷ được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (2007) ở phân hạng sẽ nguy cấp VU
A1c, d.
Hiện nay, Sao mặt quỷ đã được bảo vệ ở Vườn quốc gia Pù Mát (Nghệ
An), V Quang (Hà T nh) và Bến En (Thanh Hóa) [2].

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

21

3.2. Trình t gen trnH-psbA c a loài Sao mặt quỷ
Sau quá trình tiến hành tách chiết ADN, chạy PCR, đọc trình tự gen và
phân tích trình tự gen trnH-psbA của loài Sao mặt quỷ thu được tại khu bảo
tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang chúng tôi đã thu được các kết quả
sau:
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
ADN tổng số của 2 mẫu vỏ cây Sao mặt quỷ (Hopea mollissima
C.Y.Wu, 1957) thu tại khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang, Việt
Nam được tách chiết theo phương pháp CTAB (Xavier, 2000) đã hiệu chỉnh

cho phù hợp với điều kiện mẫu và khí hậu Việt Nam. Kết quả tách chiết ADN
tổng số sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (được trình bày
ở hình 3.7).

Hình 3.7. Hình ảnh ADN tổng số của Sao mặt quỷ
(giếng 1-2: Sao mặt quỷ thu tại khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ,
tỉnh Bắc Giang.)

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

22

Kết quả điện di cho thấy đã xuất hiện 2 vạch ADN rõ ràng, sắc nét,
không có hiện tượng vạch bị phân tán thành dải dài, điều đó chứng tỏ mẫu
ADN tổng số thu được ở cả 2 mẫu đều đạt chất lượng tốt, ít bị đứt gãy.
3.2.2. Kết quả nhân bản gen trnH-psbA bằng PCR
Mẫu ADN tổng số sau khi thu được được dùng làm khuôn để nhân bản
đoạn gen trnH-psbA, sử dụng mồi xuôi - trnH ( 5’- CGC GCA TGG TGG
ATT CAC AAT CC) và mồi ngược psbA (5’-GTT ATG CAT GAA CGT
AAT GCT C). Phản ứng PCR được chạy trong tổng thể tích 50µl, 30 chu kỳ.
Kết quả PCR sau đó đươc được di kiểm tra trên gel Agarose 1% (Hình 3.8).
Gen trnH-psbA là vùng gen lục lạp đã được chứng minh là marker phân tử
phù hợp cho các nghiên cứu barcoding. Trong nghiên cứu này, với cặp mồi
trnH (5’- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC), psbA (5’-GTT ATG
CAT GAA CGT AAT GCT C), 1 đoạn gen trnH-psbA dài 300bp sẽ được

khuyếch đại. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy đã
xuất hiện 1 đoạn ADN có kích thước đúng như dự kiến, vạch rõ ràng, sắc nét,
chứng tỏ sản phẩm PCR là đặc hiệu.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

23

Hình 3.8. Kết quả thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen trnH-psbA
(M: marker; giếng 1-2: Sao mặt quỷ thu tại khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ,
tỉnh Bắc Giang.)
3.2.3. Kết quả giải trình t gen trnH-psbA
Để kiểm tra sản phẩm PCR có khuếch đại đúng gen trnH-psbA hay
không, sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng kít tinh sạch DNA
extraction kit (QIAgen) và gửi đọc trình tự trên máy ABI 3100.
Kết quả giải trình tự gen trnH-psbA cho hình ảnh (các peaks) tương đối
rõ ràng (hình 3.9), không bị nhiễu nền, chứng tỏ mẫu đã được tinh sạch tốt.

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

24

Hình 3.9. Sơ đồ các peaks của trình tự gen trnH-psbA của loài Sao mặt quỷ
So sánh trình tự gen trnH-psbA trên Blast-NCBI đã chứng tỏ đoạn gen
thu được chính là gen trnH-psbA của loài Sao mặt quỷ.
3.2.4. So sánh trình t nucleotide mẫu nghiên cứu với một số loài khác
thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae).
Hopea mollissima là loài có phân bố hẹp, hiện mới chỉ tìm thấy ở Việt
Nam và tỉnh Hải Nam Trung Quốc. Những nghiên cứu ở cấp độ phân tử cho
các loài họ Dầu ở Việt Nam gần như là chưa có, do vậy chúng tôi đã không
tìm được trình tự gen trnH-psbA cho loài họ Dầu nào ở Việt Nam trên ngân
hàng gen để so sánh.
Với mục tiêu bước đầu nghiên cứu và làm quen với phương pháp phân
tích mối quan hệ di truyền của các loài gần g i trên cơ sở so sánh trình tự gen
bằng phần mềm chuyên dụng

ega 5.01, chúng tôi đã lựa chọn 3 loài họ Dầu

có nguồn gốc từ Ấn Độ bao gồm (Hopea parviflora, Hopea racophloea,
Shorea robusta và 1 loài ngoài nhóm là Pteleopsis anisoptera (thuộc họ
Combretaceae)) (dữ liệu lấy từ ngân hàng gen) (bảng 2.1).

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung


Trường ĐHSP HN 2

25

ết quả so sánh trình tự nucleotide gen trnH-psbA của 4 loài lấy từ ngân
hàng gen và 1 loài Hopea mollissima của Việt Nam được trình bày ở hình
3.10.

Hình 3.10. So sánh trình tự vùng trnH-psbA của Sao mặt qủy với một số
loài trong chi Sao và một số loài trong họ Dầu

Khóa luận tốt nghiệp

Tạ Thị Nhung