Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn acetobacter xylinum có khả năng tạo màng BC

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (927.3 KB, 47 trang )

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo trong tổ
phương pháp giảng dạy, các thầy cô trong khoa Sinh - KTNN, các thầy cô
giáo trong trường ĐHSP Hà Nội 2 và các bạn sinh viên. Đặc biệt em xin bày
tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới cô Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình giúp
đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận.
Do lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học. Hơn nữa
do thời gian và năng lực của bản thân còn hạn chế, mặc dù đã rất cố gắng
nhưng chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong nhận được
sự đóng góp ý kiến của các thầy, cô giáo và các bạn sinh viên để khóa luận
của em được hoàn thiện và có nhiều ứng dụng trong thực tế.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2012
Sinh viên

Phạm Thị Ngọc Mai

1

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật.
Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập
từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có tài liệu sao chép hay bịa đặt,
không trùng với kết quả đã công bố.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày tháng năm 2012
Sinh viên

Phạm Thị Ngọc Mai

2

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 3
2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 3
3. Nội dung của đề tài ....................................................................................... 3
4. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 3
5. Điểm mới ....................................................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. ............................................................ 4

1.1. Lược sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum................................... 4
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum............................................. 6
1.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon.................................................................... 9
1.4. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC ................................................ 10
1.4.1. Đặc điểm cấu trúc của màng BC........................................................... 10
1.4.2. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose ...................................................... 11
1.5. Các đặc điểm của quá trình lên men ........................................................ 12
1.5.1. Ảnh hưởng của oxy ............................................................................... 12
1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................ 12
1.5.3. Ảnh hưởng của các hợp chất chứa cacbon, nitơ, photpho .................... 13
1.5.4. Ảnh hưởng của nồng acid acetic và rượu etylic.................................... 13
1.6. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới và ở Việt Nam 13
1.6.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới...................... 13
1.6.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam ...................... 14
1.7. Tình hình nghiên cứu ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng................ 15
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16

2.1. Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất ............................................... 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 16

3

2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 16
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 16
2.1.4. Môi trường nghiên cứu ........................................................................ 17
2.1.4.1. Môi trường giữ giống (môi trường cơ bản) ...................................... 17
2.1.4.2. Môi trường nhân giống ...................................................................... 17
2.1.4.3. Môi trường lên men............................................................................ 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 18
2.2.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................. 18
2.2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc ............................................................. 18
2.2.1.2. Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum bằng
phương pháp nhuộm Gram................................................................. 18
2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng ................... 19
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hoá giống.............................................................. 19
2.2.1.5. Phương pháp lên men tạo màng ......................................................... 19
2.2.1.6. Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose ........................ 19
2.2.2. Phương pháp toán học ........................................................................... 20
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 21

3.1. Khảo sát sự tạo màng của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 .. 21
3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn
A.xylinum BHN2 và CH14 ...................................................................... 22
3.2.1. Xác định hàm lượng acid acetic tạo thành của các chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 .................................................... 22
3.2.2. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum trên kính

hiển vi quang học ................................................................................... 23
3.2.2.1. Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn A.xylinum ........................... 23
3.2.2.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa ............................................... 24
3.2.2.3. Hoạt tính catalase ............................................................................... 25

4

3.2.2.4. Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn A.xylinum trên môi trường
Blue bromphenol ................................................................................ 25
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình sinh
trưởng và phát triển của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 26
3.3.1. Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển của 2 chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 ..................................................... 26
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tạo màng
của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 ................ 29
3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ tới khả năng tạo màng
của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 ................. 32
3.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pepton tới khả năng tạo màng của 2
chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 ........................... 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 36

1. Kết luận ....................................................................................................... 36
2. Đề nghị ........................................................................................................ 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 37

5

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A.xylinum

: Acetobacter xylinum

BC

: Bacterial cellulose

MT

: Môi trường

Cs

: Cộng sự

CS

: Cellulose synthase

PGM

: Phosphoglucomutase

PC

: Plant cellulose

GK

: Glucokinase

FK

: Fructokinase

6

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH

1. DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur
(1950)
Bảng 2.1. Thành phần các môi trường lên men
Bảng 3.1. Khả năng tạo màng BC trên các loại môi trường khác nhau của
chủng vi khuẩn A.xylinum
Bảng 3.2. Khảo sát khả năng tạo thành acid acetic của các chủng vi khuẩn
A.xylinum
Bảng 3.3. Xác định số lượng tế bào của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum
BHN2 và CH14
Bảng 3.4. Sự biến thiên hàm lượng acid acetic của 2 chủng vi khuẩn
A.xylinum qua thời gian nuôi cấy khác nhau
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới độ dày màng BC
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khối lượng tươi của màng BC
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khối lượng khô của màng BC
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nitơ tới độ dày của màng BC
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nitơ tới khối lượng của màng BC
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn pepton ở nồng độ khác nhau đến khối

lượng màng BC ở chủng CH14
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn pepton ở nồng độ khác nhau đến khối
lượng màng BC ở chủng BHN2

7

2. DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC
Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật
Hình 1.3. Sự hình thành những dải ribbon trong màng BC của A.xylinum
Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum
Hình 3.1. Chủng giống vi khuẩn A.xylinum
Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A.xylinum
Hình 3.3. Khuẩn lạc A.xylinum trên môi trường thạch đĩa
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng A.xylinum
Hình 3.5. Chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic của vi khuẩn A.xylinum
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn quá trình sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn
A.xylinum BHN2 và CH14
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự tạo thành acid acetic trong dung dịch lên men
của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14

8

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay công nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật
chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh
với những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công

nghiệp, y học... Khó có thể tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học
mà lại không liên quan tới vi sinh vật.
Vi khuẩn Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí
bắt buộc, hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Vi khuẩn
A.xylinum tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi
khuẩn này trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp
màng cellulose sinh học thuần khiết và được g ọi là màng sinh học Bacterial
cellulose (BC), đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose
[26], [28].
Cho đến nay , Acetobacter xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có
khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên . Loài vi khuẩn Gram âm
này sống hiếu khí bắt buộc , không sinh bào tử và là loài tiến bộ nhất trong vi
khuẩn tí a. Mỗi tế bào Acetobacter xylinum có thể chuyển hóa tới 108 phân tử
glucose vào phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng tổ ng hợp cellulose là
rất lớn [6].
Nét cấu trúc quan trọng trong cơ chế kết tinh khác hẳn với cellulose
(PC) ở thực vật ở chỗ chú ng không có sự kết hợp hemic ellulose, ligmin hay
những thành phần phụ khác , mà được cấu tạo từ các sợi mic rofibril tạo nên
những bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose với độ bền cơ học cao ,
độ tinh khiết cao, khả năng thấm hút nước lớn , đường kí nh sợi nhỏ , khả năng
polime hóa và trạng thái kết tinh lớn

. Ngoài ra , màng B C còn chứa nhiều

dưỡng chất , acid hữu cơ đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật

9

khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động

của tia UV…[18], [24].
Nhờ những đặc tí nh độ c đáo trên mà màng BC được coi là nguồn
polimer mới, là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện
nay. Nó đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa
sau của thế kỷ XIX và hiện đ ược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như: trong công nghiệp sản xuất giấy màng BC được dùng để sản xuất giấy
điện tử chất lượng cao; trong công nghệ môi trường đã sử dụng màng BC làm
màng phân tách để sử lý nước và

biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989;

Jonas và Fonah, 1998). Ngoài ra, màng BC còn được dùng làm chất mang đặc
biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989), làm các sợi truyền
quang, là môi trường cơ chất trong sin h học sử dụng cố đị nh protein thay cho
sắc ký . Trong công nghiệp thực phẩm sử dụng vi khuẩn A.xylinum nuôi trên
môi trường nước dừa tạo màng BC để sản xuất th ạch dừa. Trong lĩ nh vực mỹ
phẩm và dược phẩm , lợi dụng những đặc tính quý báu của màng BC như
thông thoáng , kháng khuẩn , tính tương đồng về cấu trúc với sợi collagen
trong da nên màng BC được coi là nguồn nguyên liệu quý giá dùng làm mặt
lạ dưỡng da, da nhân tạo, dùng trong điều trị bỏng và tổn thương da [9], [25].
Ở Việt Nam hiện nay, do nhu cầu màng trị bỏng lớn, nhưng hầu hết đều
phải nhập ngoại với giá thành cao. Trong khi đó màng BC có thể tự sản xuất
trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền. Nên nếu chế tạo
thành công màng BC từ vi khuẩn A.xylinum sẽ có ý nghĩa rất cao trong tình
hình điều trị bỏng ở nước ta hiện nay [27].
Do sự đa dạng về các mặt ứng dụng như trên và với mong muốn được
tìm hiểu thêm về vi khuẩn A.xylinum, quá trình tạo màng BC cũng như nhiều
ứng dụng hữu ích của nó, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu một số đặc
tính sinh học của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng
BC”.

10

2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn A.xylinum có khả năng
tạo màng BC.
3. Nội dung của đề tài
3.1. Khảo sát sự tạo màng của 2 chủng vi khuẩn vi khuẩn A.xylinum BHN2 và
CH14
3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn A.xylinum
BHN2 và CH14
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình sinh
trưởng và phát triển của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14
4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Lý luận
Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn A.xylinum
BHN2 và CH14 để tạo màng BC có chất lượng tốt trong thời gian ngắn.
4.2. Thực tiễn
Nghiên cứu góp phần tạo ra màng BC có chất lượng tốt với chi phí thấp
để ứng dụng tạo màng trị bỏng.
5. Điểm mới
Nồng độ pepton thích hợp cho khả năng tạo màng BC ở 2 chủng vi
khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 là 0,4‰.

11

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Lƣợc sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter
Từ lâu người ta đã biết acid acetic ở dạng giấm nhưng cho đến những
năm đầu thế kỷ XIX người ta mới điều chế được acid acetic và biết được rằng
giấm là sản phẩm lên men của 1 chủng vi khuẩn có tên là Acetobacter hay vi
khuẩn acetic.
Người đầu tiên nghiên cứu những màng mỏng của giấm là nhà bác học
Person vào năm 1822. Ông đã chứng minh được đó là một loại vi sinh vật có
tên là Mycoderma aceti.
Năm 1837, Kiitsing đã khẳng định rõ vai trò của vi sinh vật trong quá
trình lên men giấm. Cũng năm này Hansen đã tách được từ màng giấm loại vi
khuẩn thuần khiết đó là Mycoderma aceti [22].
Năm 1862-1868, Frateur đã chứng minh được sự đúng đắn trong nhận
xét của ông Kiitsing “Để thực hiện quá trình lên men nhất thiết phải có vi sinh
vật”. Ông đã khẳng định bản chất của vi sinh vật trong quá trình lên men
acetic là một tác nhân quan trọng. Trong quá trình này do phát hiện ra kính
hiển vi điện tử nghiên cứu màng xuất hiện trên bia và rượu vang. Ông kết luận
rằng màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn ông cũng gọi đó là
Mycoderma aceti [23].
Những nghiên cứu tiếp theo đều nhằm mục đích cái tiến quá trình lên
men acetic và tiến hành phân loại chúng.
Beijerinck, 1899 ông đã phân loại vi khuẩn dựa vào hai dấu hiệu:
Một là: Dựa vào khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện sự sinh
trưởng và phát triển của mình.
Hai là: Dựa vào giai đoạn di động có hay không trong quá trình phát
triển.

12

Năm 1926, Henneberg chia tất cả vi khuẩn acetic thành bốn nhóm theo

nơi sinh sống đặc trưng của nhóm [28].
Nhóm 1: Vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa húp lông độc với
chúng.
Nhóm 2: Vi khuẩn phát triển trên bia.
Nhóm 3: Vi khuẩn trong dung dịch rượu vang.
Nhóm 4: Vi khuẩn để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh.
Năm 1931, Janke hoàn thành khóa phân loại của mình. Năm 1934, theo
nghiên cứu của hội nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ các vi khuẩn acetic có khả năng
sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ nên đã được kết
hợp vào họ Nitro Bacteriaceae. Từ đó vi khuẩn giấm giữ tên Acetobacter [27].
Năm 1936, Kenyver và Wanniel cùng với Staniel đã cho rằng dựa vào
đặc tính của vi khuẩn acetic có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động của
chúng vào họ Pseudomonadaceae.
Năm 1948, Vanght công bố kết quả của mình ông quan sát được về sự
di động của nhiều loại Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum,
Acetobacter zancens, Acetobacter melanogenum, Acetobacter oxidans.
Vanght đã giải thích rằng các loại trên cùng một loại có đơn mao ở cực và đã
xác nhận vị trí của vi khuẩn acetic trong họ Pseudomonadaceae.
Ngày nay theo khóa phân loại Bergey và nhiều tác giả đã xếp vi khuẩn
Acetobacter và Gluconobacter vào họ Acetobacteriaceae.
Năm 1914, Bergey phân loại các loài trong giống Acetobacter thành 2
loại:
Loại 1: Oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O
Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer
dạng điển hình của vi khuẩn Acetobacter aceti).
Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất .

13

Trên bề mặt môi trường dịch thể tạo màng nhầy có chưa xenluloza
dạng điển hình là: Acetobacter xylinum.
Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa
xenluloza dạng điển hình là: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus,
Acetobacter kneizigianus.
Loại 2: Không oxi hóa acid acetic
Tạo thành sắc tố trên môi trường có đường glucoza
Sắc tố nâu tối tới đen nhạt: Acetobacter melanogenus
Sắc tố hồng: Acetobacter
Không tạo thành sắc tố
Nhiệt độ thích hợp nhất từ 30-350C: Acetobacter suboxydans
Nhiệt độ thích hợp nhất từ 18-210C: Acetobacter oxidans [15],[16]
Năm 1960, Shiwel và Carr nghiên cứu về đặc trưng môi trường nuôi
cấy và sinh hóa của vi khuẩn. Nhiệt độ phát triển thích hợp nhất nằm trong
giới hạn 30-350C. Hai ông đã đi đến kết luận không thể có sự phân loại đồng
nhất giữa các vi khuẩn Acetobacter [25], [26].
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.2.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Acetobacter xylinum
* Đặc điểm hình thái, tế bào học
A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng
2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di
động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng
nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm
iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ
4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá
giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [9].

14

Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc,
hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước
ép hoa quả, trong đất.
* Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc
trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Vi
khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng
sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC. Ngược lại, trong điều
kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều
nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái
khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [15], [23].
* Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH: 4 - 6. Nhiệt độ
và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
cả trong môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và
nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn
A.xylinum sinh trưởng và tạo màng.
A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm
acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
Đặc điểm sinh hoá
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính
catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [22]…Theo quan điểm
này A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác
trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1 dưới đây:

15

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum
theo Frateur (1950)
STT
1
2
3

Đặc điểm

Hiện tƣợng

Kết quả

Oxy hoá ethanol

Chuyển hoá môi trường chứa Bromphenol

thành acid acetic

Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng

Hoạt tính catalase

Hiện tượng sủi bọt khí

+

Sinh khối không phát triển

_

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên men

+

Sinh trưởng trên môi
trường Hoyer

+

Chuyển hoá
4

glycerol thành
dihydroxyaceton

5

6

7

Chuyển hoá glucose Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc
thành acid
Kiểm tra khả năng
sinh sắc tố nâu
Kiểm tra khả năng
tổng hợp cellulose

trên môi trường chứa CaCO3

+

Không hình thành sắc tố nâu

_

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

* Đặc điểm về sinh trƣởng
Vi khuẩn acetic phát triển tốt trên môi trường nước bia, các môi trường
có chứa cao nấm men, glucose, rượu etylic hay mannitol,… trong điều kiện
hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25-300C, pH: 5,4 - 6,8 [15],[16].
Tính chất đặc trưng nhất của vi khuẩn acetic là khả năng oxy hóa rượu
etylic thành acid acetic ở pH: 4,5. Ngoài ra, chúng còn thực hiện quá trình oxy
hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của
chúng) để tạo thành các hợp chất xeto hay các acid hữu cơ tương ứng.
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với nguồn cacbon, nguồn
nitơ và chất sinh trưởng rất đa dạng, chúng có thể đồng hóa nhiều loại thức ăn
cacbon khác nhau như: các loại đường (monosaccaride, disaccaride,

16

polysaccaride) rượu etylic, acid hữu cơ, nhưng không sử dụng được tinh bột và
lactose.

Một số vi khuẩn acetic có khả năng tổng hợp polysaccharide phân tử lớn
như cellulose, tinh bột, dextran,..người ta ứng dụng đặc tính này trong sản xuất
công nghiệp. Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose giống như bông:
A.xylinum, A.aceti…Trong điều kiện có nhiều dextran, saccazoza, một số loài
tổng hợp dextran giống Leuconostoc mensteroides. Một số vi khuẩn acetic còn
tổng hợp được dextran khi môi trường thiếu dextran và cellulose [13].
1.3. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.
Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật
dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất
có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ
bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng n ày khi khử
trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở
1100 trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp
hấp gián đoạn (phương pháp Tyndall). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác
người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường
dùng 0,5-0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các loại
đường ở dạng đồng phân D [2].
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch,...) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [2], [3].

17

1.4. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose

1.4.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polymer-β-1,4 glucopyranose mạch
thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau.
Chuỗi polymer-β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn.

Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật
Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải
lớn của tế bào khác bằng liên kết hydro hoặc Vandervan tạo thành dạng sệt
(gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể
vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính
vì thế mà màng BC được mở rộng [21].

18

Hình 1.3. Sự hình thành những dải ribbon trong màng BC của A.xylinum
1.4.2. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose

Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum

19

Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều
hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại
enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [12], [13].

Theo tác giả Alina Krystyna Vicz và cs cho rằng có 4 enzyme tham gia
xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A.xylinum: Glucokinase (GK),
Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - và Hromatka (1949-1953) cho
rằng: tế bào vi khuẩn có khả năng sản sinh phosphate uridylyltransferase
(UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó
UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [14], [17].
1.5. Các điều kiện của quá trình lên men
Khi nghiên cứu cơ chế quá trình lên men, Ebner acid acetic. Do đó tác
động quan trọng nhất đối với quá trình lên men là: thành phần dinh dưỡng và
điều kiện môi trường nuôi cấy. Khi các thành phần này thay đổi sẽ kéo theo
thay đổi các thông số: tốc độ sinh trưởng (h-1), sinh khối tế bào, nồng độ acid
tạo thành [18], [19].
1.5.1. Ảnh hưởng của oxi
Theo cơ chế của quá trình lên men để oxi hóa 1 mol rượu cần 1 mol O2.
Thực tế càng thoáng khí thì năng suất càng cao. Ở phương pháp chậm do bề
mặt tiếp xúc giữa tế bào và không khí bị hạn chế bởi sự bao phủ bề mặt dịch
lên men của lớp váng giấm, độ dày của lớp dung dịch. Vì vậy quá trình lên
men kéo dài 3-5 tuần. Nồng độ giấm thu được 3-7% acid acetic. Trong khi đó,
phương pháp tuần hoàn nhờ tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn quá trình rút xuống từ
5-7 giờ. Ở phương pháp chìm thời gian chỉ còn 3-4 ngày, hệ số chuyển hóa
đạt 98%. Nồng độ giấm đạt 7-14% acid acetic [2], [3].
1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Vi khuẩn acetic thuộc vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ hoạt động thích hợp là
từ 25-300C, nhiệt độ quá thấp làm chậm quá trình lên men, nhiệt độ cao sẽ làm

20

ức chế hoạt động của vi khuẩn, khi nhiệt độ tăng đến một mức nào đó thì quá
trình sinh sản của vi khuẩn sẽ bị đình chỉ làm giảm hiệu suất của quá trình lên

men [9], [14].
1.5.3. Ảnh hưởng của các hợp chất chứa cacbon, nito, photpho
Để đảm bảo hoạt động sống bình thường của vi khuẩn, môi trường thức
ăn ngoài rượu, nước còn phải cung cấp thêm muối khoáng, nguồn cacbon,
nguồn nitơ dễ hấp thụ như: CaHPO4, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, KHPO4,
MgSO4.7H2O... tùy nhu cầu cụ thể của từng loại. Ngoài ra môi trường cung
cấp thêm vitamin và các chất kích thích sinh trưởng như : pepton, cao nấm
men, cao thịt,...
1.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic và rượu etylic
Acid acetic có tác dụng ức chế hoạt động của vi khuẩn, khi nồng độ
acid 8% vi khuẩn hoạt động kém, khi nồng độ acid từ 12-14% thì hoàn toàn
đình chỉ hoạt động. Vì vậy, nồng độ acid acetic cần dùng hoạt hóa vào khoảng
2-2,5% (Nodes) và 2% (Ebner, 1985). Nồng độ rượu cao nhất để oxy hóa 56%. Khi không có rượu etylic trong môi trường vi khuẩn sẽ chuyển hóa acid
acetic thành CO2 và H2O [7], [8], [9].
1.6.Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới và ở Việt Nam
1.6.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới
Vi khuẩn A.xylinum và màng BC của chúng đã thu hút được sự chú ý
của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực
công nghệ: trong công nghệ môi trường, các nhà khoa học đã dùng màng phân
tách để xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng,
dùng màng như một chất đặc biệt để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền
quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực
phẩm. Đặc biệt trong công nghiệp dệt đã sử dụng chúng để sản xuất vải đặc

21

biệt có giá trị kinh tế cao. Trong công nghiệp giấy, màng BC được sử dụng để
sản xuất giấy điện tử có chất lượng cao [1], [4].
Ứng dụng nổi bật nhất của màng BC là trong lĩnh vực y học. Trong y

học, nó được sử dụng để chế tạo vật liệu composite đắp lên vết thương hở,
điều trị bỏng, thay thế da tạm thời, làm mặt nạ dưỡng da, làm mạch máu điều
trị các bệnh tim mạch. Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được
ứng dụng trong phẫu thuật và nha khoa. Năm 2005, Henrik Backdahl và cộng
sự đã ghép thành công sợi cellulose trên động mạch cảnh của lợn, thấy chúng
sinh sản chỉ sau 2 tuần cấy ghép. Họ đã đi đến kết luận có sự tương đồng về
cấu trúc giữa màng BC với collagen [5], [8].
1.6.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về A.xylinum và màng BC là khá mới
mẻ. Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc
tính về cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng; sản xuất thạch dừa;
những điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển và tạo màng của
A.xylinum. Có thể kể đến một số nghiên cứu điển hình như: năm 1998, tác giả
Đinh Thị Kim Nhung đã nghiên cứu về tối ưu hóa thành phần môi trường dinh
dưỡng cho A.xylinum. Năm 2003, tác giả Nguyễn Thúy Hương và Phạm
Thành Hổ (Bộ môn công nghệ sinh học, Trường ĐH Bách Khoa TPHCM) đã
nghiên cứu về chọn lọc các dòng A.xylinum cho sản xuất cellulose. Công trình
nghiên cứu do Nguyễn Thúy Hương, Phạm Thành Hổ, 2007, sử dụng
cellulose vi khuẩn làm tác nhân kết dính tạo các dạng ép từ phế phẩm phụ
nông nghiệp. Gần đây nhất nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị
Nguyệt đã nghiên cứu ứng dụng màng BC sản xuất từ vi khuẩn A.xylinum làm
mặt nạ dưỡng da [6], [8], [9].

22

1.7. Tình hình nghiên cứu ứng dụng màng bacterial cellulose trong điều
trị bỏng
Trong điều trị bỏng, để giảm đau cho bệnh nhân, hạn chế mất dịch, máu
qua vết thương, hạn chế nhiễm khuẩn vết bỏng, kích thích biểu mô hoá ở

bỏng nông hay kích thích tạo mô hạt ở bỏng sâu người ta thường sử dụng các
loại vật liệu che phủ tạm thời. Việc sử dụng các vật liệu che phủ tạm thời có
nguồn gốc từ da dị loại để che phủ vết thương phần mềm, vết bỏng đã được
sử dụng từ rất lâu. Tuy nhiên, việc sử dụng những loại da này cũng mới chỉ
dừng lại ở cách sử dụng đơn giản, đó là da tươi. Mặc dù da dị loại tươi có
những ưu điểm, đặc biệt là khả năng bám dính tốt, nhưng nó cũng có những
nhược điểm nhất định. Hơn nữa, việc sử dụng lại ở thế bị động, bảo quản và
xử lý phức tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng. Vật liệu từ da đồng
loại là lý tưởng nhất cho việc che phủ vết thương, vết bỏng nhưng trong nhiều
trường hợp rất khan hiếm; không đủ đáp ứng được. Chính vì vậy vật liệu che
phủ tạm thời từ các loại màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan
trọng trong điều trị bỏng. Một trong các loại màng sinh học đã và đang được
quan tâm ngày nay là màng cellulose vi khuẩn [10], [11].
Trên thế giới, tác giả Wan (Canada) đã có những nghiên cứu về màng
BC từ A.xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad, Czaia và cộng sự
đã dùng màng BC làm da nhân tạo, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [20].
Năm 2006, Bộ môn Vi Sinh - Ký Sinh Đại học Y Dược Tp.HCM đã
chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương
pháp lên men. Màng có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt
hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời.
Năm 2010, nhóm nghiên cứu đề tài B.2010 - 18 - 69TĐ của Đinh Thị
Kim Nhung cũng đang nghiên cứu thu nhận màng BC từ chủng vi khuẩn
Acetobacter, ứng dụng trị bỏng.

23

CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và thiết bị hóa chất

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 được phân lập từ màng của
các nguồn nguyên liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên
men theo phương pháp cổ truyền. Chủng giống nhận từ phòng Vi sinh - Khoa
Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Hóa chất
- Nguồn đường: glucose, saccarose, fructose, sorbitol (Nhật Quang Pharma
Co, Ltd).
- Nguồn nitơ:
+ Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4
+ Nguồn nitơ hữu cơ: pepton
- Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O.
- Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fuchsin, dung dịch
lugol
- Nước dừa, agar, …
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm tôi đã sử dụng những dụng cụ
thiết bị như:
Nồi hấp khử trùng
Kính hiển vi quang học (olympus CX41, Nhật)
Tủ sấy (Haraeus, Đức)
Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức)
Cân điện tử (Precisa XT 320 M, Thụy Sỹ) Micropipet (Gilson, Pháp)

24

Tủ lạnh (Tawashi, Nhật)
Hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh
Bình tam giác, lam kính, la men, đèn cồn.

2.1.4. Môi trường nghiên cứu
2.1.4.1. Môi trường giữ giống (môi trường cơ bản):
Glucose: 20g/l

(NH4)2SO4: 3g/l

Pepton:5g/l

KH2PO4: 2g/l

MgSO4.7H2O: 2g/l

Nước máy: 1000 ml

Agar: 20g/l
2.1.4.2. Môi trường nhân giống:
Glucose: 20g/l

KH2PO4: 2g/l

Pepton: 5g/l

MgSO4.7H2O: 2g/l

(NH4)2SO4:3g/l

Nước máy: 1000 ml

2.1.4.3. Môi trường lên men
Bảng 2.1. Thành phần các môi trƣờng lên men