Nghiên cứu một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase của một số chủng nấm mốc bằng phương pháp lên men rắn

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CBH

Cellobiohydrolase

CMC

Cacboxylmethylcellulose

HEC

Hydroxylethylcellulose

Bùi Thị Thủy

1


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CMCase

Cacboxylmethylcellulase

Cs

Cộng sự

C1

Exoglucanase

CX

Endoglucanase

Bùi Thị Thủy

2


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hiện nay ở những nước công nghiệp phát triển, việc nghiên cứu sản
xuất và ứng dụng các enzyme ngày càng phát triển. Theo thống kê gần đây,
hầu hết các enzyme đều có nguồn gốc từ vi sinh vật và đa số các chế phẩm

enzyme được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, y tế,
nghiên cứu khoa học và bảo vệ môi trường.
Enzyme cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose
bằng cách thủy phân liên kết 1,4 – β – glucoside trong cellulose. Cellulose
được tổng hợp chủ yếu nhờ vi sinh vật, trong đó nấm mốc có hoạt tính phân
giải mạnh hơn vi khuẩn như mốc Asperillus, Mucor…Cellulase là phức hệ
Enzyme quan trọng và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Hầu hết
sử dụng cellulase vào hai mục đích chính: một là dùng cellulase trực tiếp
trong phân giải phế thải của công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ
sung thức ăn gia súc và vào trong công nghệ môi trường; hai là thủy phân
cellulose tạo cơ chất lên men để thu sản phẩm cuối cùng khác nhau.
Đặc biệt trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng
suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở
mức cao nhất. Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm
enzyme bổ sung vào khẩu phần ăn của vật nuôi không những làm tăng khả
năng phân giải và hấp thụ thức ăn của vật nuôi dẫn đến tăng trưởng nhanh mà
còn đảm bảo chất lượng thịt. Mặt khác dưới tác động của enzyme bổ sung,
lượng thức ăn được phân giải và hấp thụ triệt để hơn nên giảm được lượng
phân thải ra do đó giảm bớt sự ô nhiễm môi trường [12].
Từ lâu, con người đã biết đến các chủng nấm mốc và ứng dụng của
chúng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp
dược phẩm, công nghiệp môi trường, nông nghiệp. Tuy nhiên cũng chưa có

Bùi Thị Thủy

3


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

nhiều nghiên cứu tập trung vào các chủng nấm mốc phân giải cellulose,
nguyên nhân có thể do trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật tỏ ra ưu thế
hơn so với nấm mốc về khả năng sinh cellulase. Nhưng nếu xét về khả năng
chống chịu pH, khả năng sử dụng nguồn carbon, nguồn nitơ,…thì nấm mốc tỏ
ra ưu thế hơn so với các nhóm vi sinh vật khác [4].
Hàng năm, hoạt động trong ngành nông nghiệp đã thải ra môi trường
hàng trăm ngàn tấn phế thải, hiện đã và đang là một trong những nguyên nhân
gây ô nhiễm môi trường, Nếu lượng phế phẩm này được xử lý làm thức gia
súc hoặc phân bón thì đó là một nguồn lợi lớn. Ở Việt Nam cũng đã có nhiều
nghiên cứu về cellulose ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi như: Chu Thị
Thanh Bình và Cs (2002) đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến thải
hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc [1], theo tác giả Nguyễn Lân Dũng
(1991) đã lên men xốp sắn bằng cách sử dụng Asperillus hennebergii,
Asperillus niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò,…và kết quả cho
nhiều triển vọng [3].
Nghiên cứu của tôi tập trung vào nghiên cứu một số yếu tố môi trường
ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase của các chủng nấm mốc, ứng dụng
trong việc xử lý phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh
cellulase của một số chủng nấm mốc được Phòng thí nghiệm Vi sinh, trường
ĐHSP Hà Nội 2 phân lập từ các phế phụ phẩm nông nghiệp.
3. Nội dung nghiên cứu
 Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose mạnh
 Nghiên

cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến khả năng

sinh cellulase của một số chủng nấm mốc.

Bùi Thị Thủy

4


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

4.Ý nghĩa khoa học của đề tài
 Ý nghĩa lí luận: nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm
sinh lí, sinh hóa chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose.


Ý nghĩa thực tiễn: các chủng được lựa chọn sẽ có triển vọng ứng dụng
trong việc xử lí phế phẩm nông nghiệp làm thúc ăn gia súc.

5. Điểm mới của đề tài
 Nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả sinh cellulase mạnh
từ phế phụ phẩm nông nghiệp.
 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase của
chủng M4V, M151 và M251 từ lên men rắn thu cellulase ứng dụng cho
chăn nuôi.

Bùi Thị Thủy

5

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cellulose
Cellulose là polimer được cấu thành từ các đơn phân glucose được liên
kết bởi β-1,4 glycoside, là vật liệu chủ yếu của vách tế bào thực vật và là
nguồn carbohydrate phong phú nhất trong tự nhiên. Mức độ polimer hóa
thường từ 100 đến 20.000. Các chuỗi cellulose gần nhau được liên kết với
nhau tạo thành các tấm cellulose qua liên kết hydrogen và liên kết Vander
Waal tạo thành cấu trúc tinh thể, phân tử dạng sợi, bền vững [20].

Hình 1.1. Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose
Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ được sắp xếp thành đơn vị lớn
hơn gọi là sợi cơ bản, sau đó được bó thành sợi lớn hơn gọi là vi sợi và được
cấu trúc thành những sợi cellulose. Sợi cellulose bền vững bởi các liên kết nội
phân tử cũng như liên kết hydrogen nội phân tử. Sự xắp xếp các chuỗi riêng lẻ
bên trong những sợi cơ bản đã được tìm hiểu từ sự phân tích tán xạ tia X.
Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm những cấu trúc cố định trong
những vị trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với những vị trí khác.Chúng có khả
năng ngăn ngừa sự xâm nhập không chỉ enzyme mà thậm chí những phân tử
nhỏ như nước.Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, những sai sót trong cấu
trúc tinh thể đã dẫn đến hình thành một nhóm sợi cellulose có cấu trúc vô
định hình. Sợi cellulose còn có những cấu trúc bất quy tắc khác như: những
chỗ xoắn trong vi sợi, những lỗ trống trên bề mặt, những lỗ, hốc nhỏ và một
số mạch nhỏ. Tổng diện tích tiếp xúc của sợi cellulose lớn hơn bề mặt tinh thể

Bùi Thị Thủy

6


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

trong cấu trúc cùng kích thước. Sự không đồng nhất trong cấu trúc làm cho
sợi bị hydrate bởi nước khi nhúng vào môi trường lỏng và cho phép sự xâm
nhập bởi các phân tử lớn bao gồm các enzyme thủy phân cellulose [20].
Phân tử cellulose rất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho
sự phân cắt liên kết β-1,4 glycoside tại 250C. Trong khi, quá trình phân hủy
sinh học thường nhanh hơn và cung cấp dòng carbon cho khí quyển [21].

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của cellulose
Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn.Sinh khối thực
vật cả Trái Đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lượng
cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có
trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng rất nhỏ. Dưới đây là bảng
thông kê cho thấy hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu [25].
Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu
Nguyên liệu

Cellulose

Nguyên liệu

Cellulose

42,8

Thân ngô

36

Vỏ đậu tương

51

Cỏ

28

Mía

34

Vỏ hạt

60

Cây trưởng thành

42

Bông

91

56,6

Rơm

44

Kiều mạch

Bã sắn

Bùi Thị Thủy

7


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Trong các phế liệu, cellulose thường có mặt ở các dạng sau:
Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, vỏ lạc, vỏ trấu, lõi ngô, cây ngô, cỏ …
Phế liệu công nghiệp thực phẩm: vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, …
Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn…
Các chất thải sinh hoạt: rác, giấy báo, bao bì…
1.2. Các chủng sinh vật phân giải cellulose
Sinh tổng hợp cellulose là quá trình phức tạp chịu sự điều khiển của bộ
máy di truyền, sự hoạt hóa của các chất cảm ứng, và sự kiểm soát của các chất
trao đổi và các sản phẩm cuối cùng.
1.2.1. Nấm mốc

Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose nhưng chỉ có một vài
visinh vật có khả năng phân hủy hiệu quả cellulose tinh thể [19]. Các sinh vật
phânhủy cellulose hiếu khí như vi khuẩn và nấm, sử dụng cellulose thông qua
sản xuấtsố lượng lớn cellulase ngoại bào trong dịch nuôi cấy, mặc dù thỉnh
thoảng cũng có sự hiện diện trên bề mặt tế bào. Hầu hết các loài nấm đều có
khả năng sử dụng cellulose như là nguồn cơ chất cho sự phát triển.Nhiều loài
nấm nguyên thủy, như lớp nấm Chytridomycetes kị khí, có khả năng thủy giải
cellulose trong vùng ruột của động vật nhai lại.Khả năng thủy giải cellulose
cũng được tìm thấy ở nhiềuloài nấm kị khí khác [20].
Với xấp xỉ 700 loài nấm Zygomycetes, nhưng chỉ một vài loài thuộc
giốngMucor cho thấy có hoạt tính thủy giải cellulose.Trái lại, ngành nấm
Ascomycetes, Basidiomycetes và Deuteromycetes, mỗi ngành có hơn 15,000
loài, thủy giải mạnh cellulose. Nhiều giống nấm thu hút nhiều sự nghiên cứu
cho hoạt tính thủy giải cellulose và gỗ như:Chaetomium và Helotium
(Ascomycetes); Coriolus, Phanerochaetes, Poria, Schizophyllum và Serpula
(Basidiomycete); và Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum,

Bùi Thị Thủy

8


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium và Trichoderma (Deuteromycetes)
[20].
Nấm mốc thuộc giống Trichoderma và Aspergillus là hai loài sản xuất
được số lượng lớn cellulase và đã có nhiều sản phẩm thương mại dùng trong

công nghiệp.Trichoderma sản xuất ra lượng lớn endo-ß-glucanase và exo-ßglucanase nhưng với mức độ thấp ß-glucosidase, trong khi đó giống
Aspergillus sản xuất số lượng lớn endo-ß-glucanase và ß-glucosidase nhưng
với số lượng thấp exo-ß- glucanase [19].
Phức hợp cellulase của Trichoderma reesei có thể chuyển đổi hoàn toàn
cellulose tự nhiên cũng như các dẫn xuất của cellulose thành glucose. Sự phát
triển của các loại nấm cũng như sự sản xuất của các loại enzyme cellulase phụ
thuộc nhiều vào thành phần môi trường, nước, pH, nhiệt độ và ánh sáng, và
không khí và môi trường xung quanh [22].
Chủng Aspergillus fumigatus cho thấy khả năng sử dụng cellulose tinh
thểnhư là nguồn carbon duy nhất.Chúng tạo ra nhiều loại cellulase ngoại bào,
trongđó có 6 vạch có hoạt tính endoglucanase khi điện di trên gel
polyacrylamide. Hoạt tính CMCase tối ưu tại 65°C và pH 2, cho thấy đây là
loài vi sinh vật sản xuất endoglucanase ưa nhiệt và acid [16].
1.2.2. Vi khuẩn
Trong số các loài vi khuẩn, khả năng thủy giải cellulose được tìm thấy
ở hai bộ: Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí. Dựa vào các đặc
điểm sinh lí, vi khuẩn thủy giải cellulose có thể thấy bao gồm những nhóm
sinh lí sau [20]:
 Vi khuẩn kị khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, và
Caldicellulosiruptor)
 Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas và Thermobifida)


Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga, và Sporocytophaga)

Bùi Thị Thủy

9

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.3. Cơ chế thủy phân cellulose
Theo nghiên cứu của các tác giả thì hệ cellulose gồm 3 enzyme chủ
yếu:
 Exoglucananse: enzyme này thủy phân liên kết β - 1,4 - glucoside từ đầu
không khử của chuỗi cellulose tạo thành cellobiose, không thủy phân
cellulose dạng kết tinh và dạng hòa tan mà chỉ thay đổi tính chất vật lý của
chúng. Vai trò chính của enzyme này là giúp cho endoglucanase tác động lên
cellulose kết tinh.
 Endoglucanase: enzyme này thủy phân liên kết β - 1,4 - glucoside một cách
ngẫu nhiên bên trong chuỗi cellulose để giải phóng cellodextrin, cellobiose và
glucose; nó tác động mạnh đến cellulose vô định hình nhưng tác động yếu đến
cellulose kết tinh.
 β- glucosidase: enzyme này thủy phân cellobiose và các cello – oligosaccarit
mạch ngắn tạo thành glucose; β-glucosidase không tấn công cellulose hoặc
các cellodextrin khác [13].

Hình 1.3. Quá trình phân giải cellulose
Đầu tiên endoglucanase tấn công vào các vùng vô định hình trên bề mặt
cellulose, cắt đứt các liên kết β – 1,4 – glucozid để tạo ra các đầu mạch tự do.
Tiếp đó, dưới tác dụng của exoglucanase từ phía cực kín (phía không có tính

Bùi Thị Thủy

10

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

khử), cellulose bị cắt thành các cellodextrin, sau đó cùng với sự hiệp trợ của
exoglucanase phân cắt các cellulose tạo ra cellobiose và glucose. Cuối cùng
β-1,4-glucosidase thủy phân một phần cellodextrin và cellobiose thành
glucose.
Tính chất và cấu trúc cũng như những thay đổi của cơ chất trong quá
trình thủy phân đều tác động đến vận tốc phân cắt của enzyme.Hiệu ứng này
đã được nghiên cứu trên quan điểm cơ chế phản ứng. Các kết quả quan trọng
thu được như sau:
 Chỉ số kết tinh của cellulose kết tinh cục bộ tăng trong quá trình phản ứng và
sự giảm đáng kể của vận tốc phản ứng phần lớn là do sự biến đổi cấu trúc của
cơ chất cellulose.
 Vùng bề mặt đặc hiệu (SSA) của cellulose kết tinh cục bộ giảm đáng kể trong
quá trình thủy phân, trong khi đó SSA của cellulose tái sinh thay đổi không
đáng kể.
 Trị số độ polyme hóa của cellulose có độ kết tinh cao gần như không thay đổi
còn của cellulose tái sinh vô định hình thì thay đổi rõ rệt.


Tổng hợp các yếu tố cấu trúc, sự hấp phụ của cellulose, sự kìm hãm của sản
phẩm và sự vô hoạt của cellulose, tất cả đều có ảnh hưởng quan trọng đến vận
tốc thủy phân cellulose [9].
1.4. Hệ thống cellulose
Phân tích sinh hóa của hệ thống cellulase từ vi khuẩn kị khí, hiếu khí và
từnấm đã cho những kiến thức tổng quan về hệ thống enzyme này. Hệ thống
cellulase được phân loại dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc
của chúng.

Ba loại hoạt tính enzyme cellulase cơ bản:

 Endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, phân cắt tại vị trí vô
định hình bên trong phân tử cellulose tạo ra các chuỗi oligosaccharide.

Bùi Thị Thủy

11


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

 Exoglucanase bao gồm 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (cellodextrinase) và
1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase). Exoglucanase phân cắt
từ đầu khử hoặc không khử của chuỗi cellulose tạo ra sản phẩm chính glucose
hay cellobiose. Exoglucanase hoạt động chủ yếu trên vùng cellulose tinh thể.
 β-glucosidase hoặc β-glucoside glucohydrolase. Thủy phân cellodextrin hòa
tan và cellobiose thành glucose [19].
Cellulase là một cấu trúc nhiều đơn vị bao gồm vị trí liên kết và thủy
phâncarbonhydrate (CBD). Chức năng chủ yếu của CBD gắn kết vùng xúc tác
vào cellulose tinh thể.Sự gắn kết đưa vùng xúc tác lại gần vùng cellulose tinh
thể cho sự thủy giải hiệu quả.Sự gắn kết cellulase thông qua CBD bền vững,
cũng cho thấy khả năng xúc tác cắt đứt các tương tác không cộng hóa trị giữa
các chuỗi cellulose của vùng cellulose tinh thể.Một vài CBD khác ưu tiên gắn
kết với vùng cellulose vô định hình. Mô hình thủy phân cellulose được đề
nghị lần đầu bởi Reese và các cộng sự, các CBD có vai trò làm “tróc” những
đoạn cellulose từ bề mặt, gia tăng sự thủy giải cellulose.
Hệ thống cellulase hoạt động phối hợp để nâng cao hiệu quả thủy phân

cellulose.Vi sinh vật đã thích ứng theo nhiều cách khác nhau để gia tăng hiệu
quả thủy phân cellulose cũng như hemicellulose và lignin trong tự nhiên.
1.5. Ứng dụng của cellulose
* Công nghiệp thực phẩm
 Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc.
 Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật.Trong quá trình sản
xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích ly dịch
quả từ thịt nghiền,ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase,
hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của
nước quả có thịt sẽ tốt hơn.

Bùi Thị Thủy

12


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

 Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà
rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lý cả chè, các loại
tảo biển…[27].
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase
trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện
tốt cho tác động của protease và đường hóa. Các chế phẩm enzyme amylase,
protease và glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các
diacetyl, do đó giảm lượng diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần
thiết để ủ bia [15].
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, khi sử dụng chế phẩm

A.niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase
cho thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế
phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất
bóc vỏ khá cao. Trong quá trình trích ly dịch quả, cellulose và pectin cản trở
sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm
Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [10].
Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng
chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vở thành tế
bào. Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực
vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Những
ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt.
Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ
cao.

*Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme
trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Ở công

Bùi Thị Thủy

13


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình
của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng
cho quá trình nghiền cơ học. Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với

endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng
khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước
khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết.Endoglucanase và hemicellulase đã
được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy [15].
*Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là
thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một
số enzyme phá hủy thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan
trọng, giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột
với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1,5% [15].
*Trong công nghệ xử lý rác thái và sản xuất phân bón vi sinh
Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng
công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả.
Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do
các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải. Đặng
Minh Hằng (1999) phân lập được 2 chủng nấm có khả năng phân giải
cellulose mạnh và đã tối ưu hóa được điều kiện nuôi cấy 2 chủng nấm đó
nhằm nâng cao khả năng tổng hợp cellulase, 192 chủng xạ khuẩn có khả năng
phân giải cellulose đã được phân lập và thuần khiết từ các mẫu đất rác, rơm
mục, gỗ mục trong đó số chủng có khả năng phân giải cellulose rất mạnh
chiếm 42% [8].
Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà
máy giấy thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc

Bùi Thị Thủy

14

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

cao).Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các
polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là
cellulose. Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các
xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu
quả cao [17].
* Ứng dụng của cellulase trong chăn nuôi
Trong chăn nuôi, để nâng cao năng suất vật nuôi thì nâng cao hiệu suất
sử dụng các chất dinh dưỡng có trong thức ăn tới mức cao nhất được coi là
giải pháp tốt nhất. Để giải quyết vấn đề này, người ta có thể dùng chế phẩm
enzyme bổ sung vào khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng
với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng
của thức ăn, giúp cho vật nuôi tiêu hóa tốt hơn.
Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng rẽ chế phẩm
enzyme này mà thường bổ sung cùng với các enzyme khác như: amylase,
protease, xylanase...tạo ra một dạng chế phẩm enzyme hỗn hợp (multienzym).
Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ
chất, vật nuôi sẽ hấp thụ các nguồn thức ăn tốt hơn.
Sử dụng enzyme trong chăn nuôi, người ta thấy lợn con theo ổ tăng
trọng 20% và giảm thức ăn 6 – 14%. Thí nghiệm trên lợn 1 – 3 tuần tuổi thì
lợn tăng trọng 8 – 40%, tăng khả năng sử dụng thức ăn từ 10 – 18% [2].
Người ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu bò. Quá
trình tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ của trâu bò được gắn liền với hoạt động
enzyme của các vi sinh vật sống nhờ ở đây. Vì vậy, bổ sung vào thức ăn
những chế phẩm enzyme để nâng cao khả năng tiêu hóa là điều rất cần thiết.
Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase… đều thu được

kết quả tốt. Kết quả tăng trọng cuả trâu bò có thể đạt tới 12 – 17%, có khi còn

Bùi Thị Thủy

15


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

cao hơn [14], [15].Trên thế giới người ta đã sử dụng thức ăn gia súc có chứa
các enzyme tiêu hóa từ đầu những năm 1990. Hiện nay, hàng năm người ta
sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme,
chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất.
Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức
ăn chăn nuôi như: GS.Nguyễn Lân Dũng, 1991 đã lên men xốp sắn với
Aspergillus henebergii, Aspergillus niger dùng làm thức ăn cho lợn, gà, bò…,
kết quả thấy có nhiều triển vọng [3]. Chu Thị Thanh Bình và cs, 2002 đã ứng
dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giầu cellulose làm
thức ăn gia súc…[1].Gần đây, đã có nghiên cứu về sự ảnh hưởng của enzyme
thương mại: phytase hoặc tổ hợp các enzyme (amylase, protease, cellulase,
xylanase…) đến khả năng tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn
con cai sữa. Kết quả cho thấy khi trong thức ăn có bổ sung chế phẩm phytase
hoặc tổ hợp các enzyme thì tăng trọng hơn so với đối chứng là 13,3% và 32%.
Nếu sử dụng phối hợp cả hai chế phẩm này thì tăng trọng hơn so với đối
chứng là 50%
Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ
ràng làm tăng hiệu quả tiêu hóa cho vật nuôi và giảm chi phí. Tuy nhiên, hiện
nay ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập khẩu với giá thành cao

nên việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề rất cần thiết.
1.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật
1.6.1. Giống vi sinh vật
Các vi sinh vật khác nhau thì có khả năng sinh enzyme khác nhau, ngay
cả những chủng cùng giống, cùng loài cũng có thể rất khác nhau về lượng
enzyme do chúng sản sinh ra. Vì vậy trong công tác nghiên cứu cần phải tiến
hành tìm kiếm các chủng, giống có hoạt lực sinh enzyme cao bằng cách phân

Bùi Thị Thủy

16


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

lập từ các điều kiện tự nhiên và lựa chọn các điều kiện nuôi cấy tối thích với
các cơ chất cảm ứng cũng như cần nâng cao hoạt lực bằng cách đột biến [6].
1.6.2. Nguồn dinh dưỡng
Các yếu tố trong thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt
động sống và sự tạo thành enzyme của vi sinh vật. Trong môi trường nuôi cấy
vi sinh vật cần phải đảm bảo có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỷ lệ
các chất dinh dưỡng hợp lí, phù hợp với nhu cầu của từng vi sinh vật cụ thể.
* Ảnh hƣởng của nguồn carbon
Thành phần và hàm lượng carbon có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp
enzyme.
Đối với nấm sợi A. fumigatus và các loại nấm mốc ưa nhiệt, nguồn
carbon thích hợp nhất là rơm nghiền và bột giấy lọc.Môi trường cám và bã củ
cải đường là môi trường thích hợp nhất đối với T.reesei [7].

Trichoderma lignorum và Tr. koningi nuôi trên môi trường có nguồn
carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme là cao nhất.Kết quả cũng tương tự
như vậy khi nuôi Myrothecium verrucaria trên môi trường có giấy lọc và lõi
ngô, bã củ cải. Đối với Stachybotrit atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng
hợp cellulase là tinh bột (1%) [11].
* Ảnh hƣởng của nguồn nitơ
Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu
trúc cũng như các enzyme. Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi
sinh vật có thể là nitơ vô cơ hoặc hữu cơ. Việc lựa chọn nguồn nitơ là rất cần
để đảm bảo được hiệu suất tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế.
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh
cellulase là muối nitrat. Đối với các giống của bộ nấm bông
(Hyphomycetales) nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4. Nói chung các muối
amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá

Bùi Thị Thủy

17


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

trình tổng hợp, vì trong môi trường các muối này làm cho môi trường axit
hóa. Điều này không những ức chế quá trình tổng hợp enzyme mà còn làm
mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành.Natri nitrat làm cho môi trường kiềm
hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase.
Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp
cellulase.Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lí của từng chủng giống. Cao

ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật,
nhưng với cao ngô khả năng sinh tổng hợp C1- cellulase và Cx- cellulase cao
hơn so với nấm men.
Nước chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành Cx – enzyme, còn
cao ngô kích thích C1-enzyme và Cx-enzyme. Tác dụng kích thích của hợp
chất này là do sự có mặt của các axit amin, các nguyên tố khoáng và các nhân
tố sinh trưởng khác.
Ngoài nitơ và carbon thì các nguyên tố khoáng (Fe, Mn, Zn, Bo, Mo,
Cu…) có ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Các
nguyên tố Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme ở nhiều chủng
[13].
1.6.3. Điều kiện nuôi cấy
* Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong số các yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình
sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác nhau.Nhiệt độ tối thích cho sự
sinh trưởng của đa số các loài nấm mốc trên môi trường rắn là 250C – 400C.
Nhiệt độ trên 400C hoặc dưới 250C nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi
kéo dài, giảm khả năng tổng hợp enzyme. Nâng cao nhiệt độ trong giai đoạn
mốc sinh trưởng và hô hấp mạnh sẽ ảnh hưởng đến sự tạo thành các enzyme
khác nhau.

Bùi Thị Thủy

18


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Việc tạo thành α-amylase ở mốc A.oryzae không kìm hãm ở nhiệt độ
400C – 450C trong khoảng thời gian 10 – 12 giờ. Nhưng đối với nhiệt độ quá
300C sẽ làm giảm hoạt tính protease đi 2 lần hoặc hơn nữa [11].
* Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme.Thời
gian nuôi cấy quá dài hoặc quá ngắn đều làm giảm sinh tổng hợp enzyme của
các chủng nấm mốc. Thời gian thích hợp để tổng hợp cellulase của
Aspergillus niger là từ 36h – 48h.
* Ảnh hƣởng của độ ẩm
Mỗi loài vi sinh vật cần một ngưỡng độ ẩm. Khi độ ẩm thấp chúng phát
triển chậm.Khi giảm Aw (hoạt tính của nước) dẫn đến sự thủy phân bào tương
và làm giảm hoạt tính của các enzyme. Ví dụ Staphylococcus aureus giảm tốc
độ sinh trưởng đến 10% khi Aw=0,9 [5].
Khi nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp lên men rắn thì độ ẩm môi
trường có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh tổng hợp enzyme của các chủng nuôi
cấy. Nếu độ ẩm môi trường nuôi cấy quá thấp (< 50%) hoặc quá cao (> 80%),
nấm mốc không phát triển được hoặc phát triển rất chậm, do đó hàm lượng
enzyme sinh ra theo đó mà giảm dần.

CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Bùi Thị Thủy

19


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Mẫu phân lập
Sử dụng một số chủng vi sinh vật phân hủy cellulose được phân lập từ
lá cây mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm rạ mục được lấy ở một số nơi như:
huyện Yên Lạc, Xuân Hòa (Vĩnh Phúc), huyện Mỹ Đức, huyện Mê Linh (Hà
Nội).
2.1.2.Thiết bị, dụng cụ, hóa chất cần cho nghiên cứu
 Thiết bị: Bốc cấy, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp, cân điện tử, máy ảnh và các thiết bị
khác trong phòng thí nghiệm vi sinh khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP HN2.


Hóa chất: H2O, NaNO3, FeSO4, sacarose, CMC (cacboxyl methyl cellulose),
thuốc thử Liugon 1%...
2.2.Môi trƣờng

 Môi trường bảo quản và giữ giống: môi trường Crapek – Dox cơ sở:
Saccarose
NaNO3
MgSO4.7H2O
KCl
NaCl

Bùi Thị Thủy

30 g/l
10 g/l
0,5 g/l
0,5 g/l
1%

FeSO4
Thạch Agar
H2O
KH2PO4
pH

20

1 – 2 hạt
20g/l
1 lít
2g/l
5–6


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

 Môi trường nuôi cấy: Môi trường Czapek - Dox cơ sở thay sacaroza bằng lõi
ngô (vỏ trấu, vỏ lạc…).

KH2PO4
NaNO3
MgSO4.7H2O
KCl
NaCl

2g/l

10 g/l
0,5 g/l
0,5 g/l
1%

FeSO4
Thạch Agar
H2O
pH

1 – 2 hạt
20g/l
1 lít
5–6

 Môi trường thử hoạt tính: Môi trường Czapek - Dox cơ sở thay sacaroza bằng
CMC (carboxylmethyl cellulose).
KH2PO4
NaNO3
MgSO4.7H2O
KCl
NaCl

2g/l
10 g/l
0,5 g/l
0,5 g/l
1%

FeSO4

Thạch Agar
H2O
pH

1 – 2 hạt
20g/l
1 lít
5–6

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp vi sinh
2.3.1.1.Thu thập mẫu
Lấy các cành, lá cây mục, rơm rạ mục, đất mùn và rác thải ở những nơi
khô ráo, mỗi loại mẫu lấy khoảng 20g mỗi lần, tiến hành lấy ở các vùng khác
nhau.
2.3.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản
Đầu tiên ta phải làm là khử trùng thiết bị và dụng cụ thí nghiệm bằng
tia UV. Tiến hành cân đo môi trường, cụ thể là môi trường Crapek - Dox cơ sở
để làm môi trường phân lập, môi trường được hấp thanh trùng ở 1210C trong
45 phút sau đó phân phối khoảng 25ml môi trường vào hộp lồng đã vô trùng.
Để có môi trường thạch nghiêng giữ giống thì ta rót khoảng 3-4 ml môi

Bùi Thị Thủy

21


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

trường (chưa thanh trùng) vào ống nghiệm, đậy nút bông rồi đem thanh trùng.
Sau đó đặt nghiêng ống nghiệm chứa môi trường khi còn đang nóng.
2.3.1.3. Hoạt hóa các vi sinh vật
Sử dụng 10g mỗi mẫu đã được tán nhỏ cho vào bình tam giác có chứa
100ml nước, lắc đều. Dùng pipet hút lấy 0,5ml dung dịch các mẫu đó nhỏ vào
hộp lồng đầu tiên, lấy que chang chang đều rồi vẫn dùng que chang đó ta
chang tiếp vào khoảng 7 – 8 hộp lồng tiếp theo (không cần nhỏ thêm dung
dịch mẫu).
Làm tương tự đối với các mẫu còn lại. Kiểm tra các hộp lồng mỗi ngày
nếu có khuẩn lạc mọc lên thì cấy chủng đó sang môi trường thạch nghiêng,
đánh dấu và nuôi trong tủ ấm từ 3-4 ngày và bảo quản trong tủ lạnh ở 00C –
400C để giữ giống dùng cho việc nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền định kỳ và
liên tục 2 tháng/lần.
2.3.2. Phương pháp hóa sinh
2.3.2.1. Nuôi cấy chủng nấm để thử hoạt tính
Các chủng nấm tuyển chọn được nuôi cấy trải dày trên môi trường giữ
giống trong đĩa petri, nuôi trong tủ ấm từ 3 đến 5 ngày.
2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzim bằng phương pháp cấy chấm điểm
Định tính celluase bằng phương pháp cấy chấm điểm. Dùng que cấy
lấy một ít chủng nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng. Sau đó cấy chấm
một điểm vào môi trường thạch đĩa chứa 1% cơ chất CMC, nuôi trong tủ ấm
3 đến 4 ngày. Hiện hình vòng phân giải bằng dung dịch thuốc thử liugon đỏ
1%. Hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số (D – d) cm.
D : là đường kính vòng phân giải, d là đường kính khuẩn lạc.

Bùi Thị Thủy

22

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

2.3.2.3. Xác định hoạt tính enzim bằng phương pháp khuếch tán trên môi
trường thạch (William, 1983)
Sử dụng khoan nút chai khoan 1 lỗ trên môi trường chứa CMC 1%.
Nhỏ vào mỗi lỗ khoan 1ml dung dịch enzyme đã chuẩn bị sẵn, để tủ lạnh 6h8h cho enzyme khuếch tán vào môi trường thạch sau đó cho vào tủ ấm 300C
trong 24h. Nhỏ thuốc thử Liugon 1% sẽ xuất hiện vòng phân giải. Hoạt tính
enzyme được xác định bằng hiệu số (D – d) cm.
2.3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính cellulase
* Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của cellulase
Cho dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các
mức nhiệt độ khác nhau từ 250C đến 400C trong 36h. Hoạt tính cellulase của
các dịch được xác định theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
* Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Cho dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các
mức thời gian khác nhau từ 12h đến 48h. Sau khoảng thời gian 12h, 24h, 36h,
48h, xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên môi
trường thạch.
* Xác định ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên
Nguồn carbon lần lượt được sử dụng là vỏ trấu, lõi ngô, vỏ lạc, nuôi
cấy chủng trong thời gian 36h, sau đó lấy dịch, xác định hoạt tính cellulase
trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
* Xác định ảnh hưởng của các nguồn nitơ
Nuôi cấy các chủng tuyển chọn trên môi trường Czapek - Dox thích
hợp với nguồn nitơ được sử dụng lần lượt là: NaNO3, NH4Cl, (NH4)2SO4,
pepton trong thời gian là 36h. Sau đó lấy dịch enzyme, xác định hoạt tính
cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.

Bùi Thị Thủy

23


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Thí nghiệm được tiến hành nhiều lần lặp lại, sau đó sử dụng phương
pháp trung bình cộng để tìm giá trị trung bình của các kết quả để tìm kết quả
của các lần thí nghiệm nhắc lại. Kết quả trung bình cộng thu được có độ chính
xác cao hơn. Do đây là các thí nghiệm đơn nên không cần phương sai.

Bùi Thị Thủy

24


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose
Từ các chủng gốc ở phòng thí nghiệm Vi sinh trường ĐHSP Hà Nội 2,
tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm, hình thái và hoạt tính cellulase. Đặc điểm

của các chủng được trình bày ở bảng sau:
Đặc điểm của chủng
ST

Thời

Chủng

Màu của

mốc

khuẩn lạc

1

M1-51

Đen

2 ngày

1.7

Lá

2

M1-53

Nâu trắng

3 ngày

1.0

cây

3

M1-61

Đen

2 ngày

0.6

mục

4

M1-62

Tím đen

3 ngày

0.5

5

M1-7

Xanh rêu

2 ngày

0.6

6

M2 -1

Xám

3 ngày

1.2

Gỗ

7

M2-3

Xám đậm

3 ngày

0.5

cây

8

M2-4

Xanh

3 ngày

0.3

mục

9

M2-51

Nâu đậm

1 ngày

1.9

10

M2 -52

Nâu

2 ngày

1.2

11

M3-4

Xanh Đen

1 ngày

0.5

12

M3-6

Trắng vàng

2 ngày

0.8

13

M3-7

Nâu

3 ngày

0.5

Rơm

14

M4-1

Vàng

3 ngày

1.4

dạ

15

M4-2

Trắng xanh

2 ngày

0.5

Mẫu

Đất
mùn

T

Bùi Thị Thủy

gian xuất
hiện

25

Hoạt tính cellulase
D-d (cm)