Nghiên cứu một số yếu tố môi trường ảnh hưởng tới khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc m151 bằng phương pháp lên men rắn

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

ĐINH THỊ THU HƢƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG TỚI KHẢ NĂNG
SINH CELLULASE CỦA CHỦNG NẤM MỐC
M151 BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN RẮN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. Phƣơng Phú Công

Hà Nội, 2012
1


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phƣơng Phú Công đã hƣớng dẫn,
chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và tạo điều kiện để em thực hiện và hoàn thành tốt
luận văn tốt nghiệp này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Đinh Thị Kim
Nhung và các thầy cô trong tổ bộ môn Vi sinh vật học, cùng toàn thể thầy cô
trong khoa Sinh - KTNN, Ban giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, đã tạo điều
kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng em xin cảm ơn sự giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè
trong suốt quá trình làm đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày…tháng 5 năm 2012

Sinh viên
Đinh Thị Thu Hương

2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết
quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không
trùng với kết quả của các tác giả khác.

Hà Nội, ngày…tháng 5 năm 2012
Sinh viên
Đinh Thị Thu Hương

3


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1.

Lý do chọn đề tài....................................................................................... 1

2.

Mục đích nghiên cứu................................................................................. 2

3.

Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2

4.

Ý nghĩa khoa học của đề tài ...................................................................... 3

5.

Điểm mới của đề tài .................................................................................. 3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1.

Cellulose.................................................................................................... 4

1.2.

Cơ chế phân giải cellulose ........................................................................ 6

1.3.

Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose ................................................. 8

1.3.1. Nấm sợi ..................................................................................................... 8
1.3.2. Vi khuẩn .................................................................................................... 8
1.3.3. Xạ khuẩn ................................................................................................... 9
1.4.

Hệ thống cellulase ..................................................................................... 9

1.5.

Ứng dụng của cellulase ........................................................................... 10

1.6.

Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật ... 14

1.6.1. Giống vi sinh vật ..................................................................................... 14
1.6.2. Nguồn dinh dƣỡng .................................................................................. 14
1.6.3. Điều kiện nuôi cấy .................................................................................. 16
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 17
2.1.

Nguyên liệu và vi sinh vật ...................................................................... 17

2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................. 17

4


2.1.2. Môi trƣờng .............................................................................................. 17
2.1.3. Hóa chất – thiết bị ................................................................................... 19
2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 19

2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh................................................................................ 19
2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh ............................................................................. 20
2.2.2.1. Nuôi cấy chủng để thử hoạt tính ............................................................. 20

2.2.2.2. Xác định hoạt tính bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm........................... 20
2.2.2.3. Xác định hoạt tính enzyme bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi
trƣờng thạch (William, 1983) ................................................................. 20
2.2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng đến hoạt tính Cellulase . 21
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 22
3.1.

Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose........... 22

3.2.

Ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase
của chủng M151........................................................................................ 24

3.2.1. Ảnh hƣởng của nguồn cellulose tự nhiên ............................................... 24
3.2.2. Ảnh hƣởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả
năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M151 ....................................... 26
3.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase............................. 28
3.2.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy .......................................................... 29
3.2.5. Ảnh hƣởng của độ ẩm ............................................................................. 30
3.2.6. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase ........................ 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 36

5


DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lƣợng cellulose trong một số nguyên liệu

Bảng 3.1. Các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose (D-d) cm
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của các nguồn cơ chất khác nhau đến khả năng sinh
cellulose của chủng mốc M151
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm đến khả năng sinh
cellulase của chủng nẩm mốc M151
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng sinh cellulase
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase
HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc lập thể của cellulose
Hình 1.2. Cấu trúc của cellulose
Hình 3.1. Khả năng sinh cellulase của các chủng đƣợc nghiên cứu
Hình 3.2. Hình ảnh khuẩn lạc của chủng nấm mốc M151
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn cellulose tự nhiên đến khả năng sinh
cellulase của chủng M151

6


Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nguồn cellulose phối trộn đến khả năng sinh
cellulase của chủng M151
Hình 3.5. Khả năng sinh cellulase ở các tỷ lệ phối trộn cellulose tự nhiên
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase của chủng
M151
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của
chủng M151
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng sinh cellulase của chủng M151
Hình 3.9. Khả năng sinh cellulase của chủng M151 ở các mức độ ẩm.
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase của chủng

M151
Hình 3.11. Khả năng sinh cellulase của chủng M151 trên các nguồn nitơ

7


CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

CBH

Cellobiohydrolase

CMC

Cacboxyl methyl cellulose

HEC

Hydroxyethyl cellulose

CMCase

Cacboxyl methyl cellulase

Cs

Cộng sự

C1

Exoglucanase

Cx

Endoglucanase

8


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trên thế giới ngày nay, đặc biệt là ở những nƣớc công nghiệp phát
triển, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme ngày càng trở
nên mạnh mẽ. Theo thống kê gần đây, hầu hết enzyme công nghiệp đều có
nguồn gốc từ vi sinh vật. Qui mô sản xuất, mức độ và hiệu quả ứng dụng tùy
thuộc trình độ sản xuất công nghiệp ở mỗi nƣớc. Tuy nhiên, đa số các chế
phẩm enzyme hiện hữu đƣợc ứng dụng nhiều nhất trong các lĩnh vực công
nghiệp thực phẩm, y tế, nghiên cứu khoa học và bảo vệ môi trƣờng. Trong đó
nghiên cứu sản xuất và ứng dụng cellulase đang đƣợc quan tâm một cách đặc
biệt bởi cellulose là nguồn nguyên liệu dồi dào trên trái đất.
Cellulase là một phức hệ enzyme rất quan trọng và đƣợc ứng dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực. Trong hiện tại và tƣơng lai, ngƣời ta sử dụng
cellulase cho hai mục đích chính: Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế
thải của công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào thức ăn
gia súc và công nghệ môi truờng; thủy phân cellulose tạo cơ chất lên men để
thu các sản phẩm cuối cùng khác nhau.
Đặc biệt trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng
suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dƣỡng của thức ăn ở
mức cao nhất. Để giải quyết nhiệm vụ này, ngƣời ta có thể dùng chế phẩm
enzyme bổ sung vào khẩu phần ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các

enzyme có sẵn trong đƣờng tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dƣỡng của
thức ăn giúp cho vật nuôi tiêu hóa đƣợc tốt hơn [14].
Từ lâu, con ngƣời cũng đã biết đến các chủng nấm mốc và ứng dụng
của chúng trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp chế biến thực phẩm, công
nghiệp dƣợc phẩm, công nghệ môi trƣờng, nông nghiệp. Tuy nhiên cũng chƣa
có nhiều nghiên cứu tập trung vào các chủng nấm mốc phân giải cellulose,

9


nguyên nhân có thể do trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật ƣu thế hơn so
với nấm mốc về khả năng sinh celllulase. Nhƣng nếu xét về khả năng sử dụng
nguồn cacbon, nguồn nitơ, khả năng chống chịu pH…thì nấm mốc tỏ ra ƣu
thế hơn so với các nhóm vi sinh vật khác [4]. Hàng năm, hoạt động trong
ngành nông nghiệp đã thải ra môi trƣờng hàng trăm tấn phế thải, hiện đã và
đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trƣờng. Nếu lƣợng
phế phẩm này đƣợc xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón thì đó là một
nguồn lợi lớn. Trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về
cellulase ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi nhƣ: Chu Thị Thanh Bình và cs
(2002) đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giàu
cellulose làm thức ăn gia súc [1], theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên
men xốp sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger
sản phẩm dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò…và kết quả cho nhiều triển
vọng [5].
Đề tài của tôi tập trung vào nghiên cứu một số yếu tố môi trƣờng ảnh
hƣởng đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M151, ứng dụng
trong việc xử lý phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng
sinh cellulase của chủng nấm mốc M151 tuyển chọn đƣợc.

3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose.
3.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh
cellulase của chủng M151.
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Ý nghĩa lí luận: nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm
sinh lí, sinh hóa chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose.

10


Ý nghĩa thực tiễn: mong rằng các chủng đƣợc lựa chọn sẽ có triển vọng
ứng dụng trong việc xử lý phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc.
5. Điểm mới của đề tài
Nghiên cứu một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng sinh
cellulase của chủng nấm mốc tuyển chọn đƣợc trên các tỷ lệ phối trộn phế
phụ phẩm nông nghiệp (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) lần lƣợt là 4:3:3, 4:4:2, 6:2:2,
6:3:1.

11


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1

. Cellulose
Cellulose là hợp chất cao phân tử đƣợc cấu tạo từ các liên kết mắt xích

β-D-glucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong

đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên
vách tế bào thực vật. Tổng lƣợng của chúng chiếm tới 50% tổng số
hydratcacbon trên trái đất.
Về cấu trúc hóa học, cellulose là một polymer mạch thẳng do các Dgluco-pyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4glucozid. Các đơn phân
glucose trong cellulose có cấu hình dạng ghế, quay 1 góc 1800 so với phân tử
trƣớc nó. Các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang [23].

Hình 1.1. Cấu trúc lập thể của cellulose
Về cấu trúc không gian, cellulose có cấu trúc dạng sợi song song dài
khoảng 5µm với đƣờng kính 3nm. Các sợi này liên kết với nhau bởi các liên
kết hydro và liên kết Vandervan tạo thành các bó sợi nhỏ có đƣờng kính 10-

12


40 nm gọi là vi sợi (microfibrin). Các sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên
cấu trúc mixen của cellulose, cellulose dạng mixen gồm có 2 vùng.
Vùng kết tinh (crystalline): có cấu trúc trật tự cao gồm các sợi chặt chẽ,
ngăn cản sự hấp thụ nƣớc ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm 3/4 cấu
trúc cellulose.
Vùng vô định hình (amorphous regions): có cấu trúc kém chặt chẽ nên
kém bền vững, do vùng có thể hấp thụ nƣớc và trƣơng lên.

Hình 1.2. Cấu trúc của cellulose
Cellulose tự nhiên không tan trong nƣớc, axit, hay kiềm loãng và nhiều
dung môi hữu cơ khác. Chỉ có axit hay kiềm nóng mới có tác dụng phân giải
cellulose. Trong tự nhiên có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
thủy phân đƣợc cellulose nhƣ: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc…
Cellulose đƣợc tổng hợp hàng năm với khối lƣợng lớn. Sinh khối thực
vật cả Trái Đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lƣợng

cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có
trong động vật và vi sinh vật nhƣng với số lƣợng rất nhỏ. Dƣới đây là bảng
thông kê cho thấy hàm lƣợng cellulose trong một số nguyên liệu

13


Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu
Nguyên liệu
Kiều mạch
Vỏ đậu tƣơng
Mía
Cây trƣởng thành
Bã sắn

Cellulose
42,8
51
34
42
56,6

Nguyên liệu
Thân ngô
Cỏ
Vỏ hạt
Bông
Rơm

Cellulose

36
28
60
91
44

Trong các phế liệu cellulose thƣờng có mặt ở các dạng sau:
Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, vỏ lạc, vỏ trấu, lõi ngô, cây ngô, cỏ …
Phế liệu công nghiệp thực phẩm: vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã sắn…
Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cƣa, gỗ vụn…
Các chất thải sinh hoạt: rác, giấy báo, bao bì…
1.2. Cơ chế phân giải cellulose
* Reese và các cộng sự lần đầu tiên đƣa ra cơ chế phân giải vào năm 1952
nhƣ sau:
Cellulose tự
nhiên

C1

Cellulose hoạt
động

Cx

Đƣờng hòa
tan

Cellobiase

Glucose

Theo tác giả này thì enzyme C1 tƣơng ứng với exoglucanase, Cx tƣơng
ứng với endoglucanase. Quá trình thủy phân cellulose tự nhiên đƣợc thực hiện
dƣới tác động của một phức hệ cellulase nhƣ sau.
Enzyme C1 là một enzyme không đặc hiệu. Dƣới tác dụng của enzyme
này các cellulose tự nhiên (rơm rạ, cỏ, bông…) bị trƣơng lên và biến dạng
thành chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn, chuẩn bị cho tác dụng của
enzyme tiếp theo. Để xác định hoạt tính của enzyme C1 ngƣời ta thƣờng sử
dụng các loại cellulose tự nhiên nhất là sợi bông thấm nƣớc.

14


Enzyme Cx thủy phân cellulose hoạt động thành các đƣờng hòa tan
cellodextrin và cellobiose. Để xác định hoạt tính của enzyme Cx ngƣời ta
thƣờng sử dụng CMC hay HEC (hydroxyethyl cellulose) làm cơ chất.
Cellobiase thủy phân cellobiose để tạo ra glucose.
* Erichson và cs 1973 lại có quan điểm khác thể hiện trên một sơ đồ phức tạp
hơn nhiều về quá trình thủy phân cellulose.

Cellulose tự nhiên
Exoglucanase
Cellulose vô định hình không có cấu trúc
lớp (dạng hoạt động)
Endoglucanase
Exoglucanase
Disaccharide (cellobiose)
β-glucosidase
Glucose

Hình 1.2. Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973
Đầu tiên endoglucanase tấn công vào các vùng vô định hình trên bề mặt
cellulose, cắt đứt các liên kết β-1,4glucozid để tạo ra các đầu mạch tự do.
Tiếp đó, dƣới tác dụng của exoglucanase từ phía cực kín (phía không có tính
khử), cellulose bị cắt thành các cellodextrin, sau đó cùng với sự hiệp trợ của
exoglucanase phân cắt các cellulose tạo ra cellobiose và glucose. Cuối
cùng β-1,4-glucosidase thủy phân một phần cellodextrin và cellobiose
thành glucose.

15


1.3. Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose
1.3.1. Nấm sợi
Theo Carle-Urioste và cs cơ chế cảm ứng của cellulose đến sinh tổng
hợp cellulase ở nấm sợi T.reesei dựa trên sự có mặt một lƣợng nhỏ cellulase
sẵn có trong nấm.
Các kết quả của Hrmova và cs cho thấy rằng các disaccarit trong tự
nhiên cấu tạo bởi glucose và xylose, có vai trò quan trọng trong điều hòa sinh
tổng hợp cellulase của nấm sợi Aspergillus niger. Chất cảm ứng tốt nhất là 2O-beta-D-glucopyranosyl D-Xylose (Glcbeta 1-2Xyl), Sophorose và 2-Obeta-D- glucopyranosyl D-Xylose (Xylbeta 1-2Xyl) hoặc các đồng phân của
chúng cũng là những chất cảm ứng tốt. Loewenberg và cs khi nghiên cứu
cellulase của nấm sợi Trichoderma cũng có kết luận rằng: chỉ một lƣợng nhỏ
sophorose cũng gây lên sự tổng hợp cellulase. Bổ sung nhiều lần với một
lƣợng nhỏ sophorose sẽ tốt hơn là một lần với lƣợng lớn.
Các chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose thƣờng thuộc các
chi:

Aspergillus,

Alternaria,

Chaetomium,

Coprinus,

Myrothecium,

Penicillium, Rhizopus, Trichoderma…
1.3.2. Vi khuẩn
Vi khuẩn cũng có khả năng phân giải cellulose nhƣng không mạnh
bằng nấm sợi do lƣợng enzyme tiết ra môi trƣờng ít hơn và thành phần
enzyme cũng không đầy đủ. Khác với các loại cellulase từ nấm mốc, phần lớn
các cellulase từ vi khuẩn đều là các enzyme gắn kết với tế bào sinh chúng chứ
không phải là enzyme ngoại bào. Quá trình phân giải của các enzyme này sẽ
làm bào mòn bề mặt cả sợi cellulose.
Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose thƣờng thuộc các
chi sau: Angiococus, Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, Cellvibrio,
Cellulomonas,…

16


1.3.3. Xạ khuẩn
Các chi xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh nhƣ:
Streptomyces,

Thermoactinomyces,

Micromonospora,

Nocacdia,

Streptosporagium,…
1.4. Hệ thống cellulase
Hệ thống enzyme thủy phân cellulose gồm có 3 loại enzym chủ yếu:
endoglucanase(1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase,EC.3.2.1.4), exoglucanase
(1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91), β-glucosidase (EC.3.2.1.21)
Endoglucanase

EC.3.2.1.4:

hay

là

1,4-(1,3:1,4)-β-D-glucan-4-

glucannohydrolase hoặc Carboxymethylcellulase (viết tắt là CMCase). Đôi
khi ngƣời ta có thể gọi enzyme này bằng tên khác là endo-1,4-β-D-glucanase;
β-1,4-glucanase; cellulase A,…Enzyme này thƣờng thủy phân các liên kết
1,4-β-D-glucosid trong mạch cellulose một cách tùy tiện và giải phóng
cellulodextrin, cellobiose, ngoài ra còn cắt đứt các liên kết β-D-glucan của các
loại ngũ cốc. CMCase phân giải mạnh mẽ các cellulose hòa tan nhất là dạng
cellulose vô định hình nhƣng hoạt động rất yếu ở vùng kết tinh.
Exoglucanase EC.3.2.1.91: hay là 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase,
(viết tắt là CBH) các tên khác nhƣ exo-cellobiohydrolase, exoglucanase,
cellulase Cl, exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase. Enzyme này xúc tác tách
liên tiếp các phân tử cellobiose từ đầu khử và đầu không khử của chuỗi
cellulose. Ngày nay nó đƣợc coi là enzyme chủ đạo phân giải cellulose, bởi
nó có khả năng phân cắt cellulose ở cả vùng kết tinh. Hoạt tính enzyme này

rất mạnh khi tác động lên vùng vô định hình. Bởi vậy, khi kết hợp
endoglucanase với exoglucanase hoạt tính phân giải cellulose tăng rõ rệt.
β-glucosidase EC.3.2.1.21: Tên thƣờng gọi là β-D-glucosidase, tên hệ
thống là β-D-glucosid glucohydrolase. Đây là loại enzyme đặc hiệu, có khả
năng thủy phân cellobiose hay các cellooligosacarit hòa tan trong nƣớc giải

17


phóng glucose. Enzyme này có hoạt tính cực đại trên cellobiose và có hoạt
tính giảm dần theo chiều dài của chuỗi cellulodextrin [25].
1.5. Ứng dụng của cellulase
*Với công nghiệp thực phẩm: Chế phẩm cellulase thƣờng dùng để
Tăng chất lƣợng thực phẩm và thức ăn gia súc.
Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật. Trong quá trình
sản xuất các loại nƣớc quả và nƣớc uống không cồn dựa trên việc trích ly dịch
quả từ thịt nghiền, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme
cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng
thể của nƣớc quả có thịt sẽ tốt hơn.
Một số nƣớc đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả nhƣ bắp cải,
hành, cà rốt, khoai tây, táo và lƣơng thực nhƣ gạo. Ngƣời ta còn xử lý cả chè,
các loại tảo biển…[24].
Trong sản xuất bia, dƣới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase
trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện
tốt cho tác động của protease và đƣờng hóa. Các chế phẩm enzyme amylase,
protease và glucanase đã đƣợc sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các
diacetyl, do đó giảm lƣợng diacetyl đƣợc tạo thành, rút ngắn thời gian cần
thiết để ủ bia [16].
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, khi sử dụng chế phẩm
A.niger có tên thƣơng mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase

cho thấy số lƣợng cà phê đƣợc bóc vỏ tăng, hạt cà phê đƣợc bóc vỏ bằng chế
phẩm không còn nhớt nhƣ hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất
bóc vỏ khá cao. Trong quá trình trích ly dịch quả, cellulose và pectin cản trở
sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm
Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [12].

18


Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng
chất lƣợng agar-agar hơn so với phƣơng pháp dùng acid để phá vở thành tế
bào. Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực
vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Những
ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt.
Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu đƣợc chế phẩm có cellulase
hoạt độ cao.
*Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme
trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Ở công
đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình
của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lƣợng
cho quá trình nghiền cơ học. Trƣớc khi nghiền hóa học, gỗ đƣợc xử lý với
endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng
khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần đƣợc tẩy mực trƣớc
khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã
đƣợc dùng để tẩy trắng mực in trên giấy [16].
*Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đƣờng hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là
thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một

số enzyme phá hủy thành tế bào nhƣ cellulase, hemicellulase có vai trò quan
trọng, giúp tăng lƣợng đƣờng tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột
với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rƣợu tăng lên 1,5% [16].
*Trong công nghệ xử lý rác thái và sản xuất phân bón vi sinh
Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng
công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trƣờng rất có hiệu quả.

19


Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do
các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải. Đặng
Minh Hằng (1999) phân lập đƣợc 2 chủng nấm có khả năng phân giải
cellulose mạnh và đã tối ƣu hóa đƣợc điều kiện nuôi cấy 2 chủng nấm đó
nhằm nâng cao khả năng tổng hợp cellulase, 192 chủng xạ khuẩn có khả năng
phân giải cellulose đã đƣợc phân lập và thuần khiết từ các mẫu đất rác, rơm
mục, gỗ mục trong đó số chủng có khả năng phân giải cellulose rất mạnh
chiếm 42% [11].
Phức hệ cellulase đƣợc sử dụng để xử lý nguồn nƣớc thải do các nhà
máy giấy thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao).
Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide
quan trọng quyết định tới chất lƣợng, số lƣợng giấy là cellulose. Vì vậy, nƣớc
thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xƣởng mộc khi bổ sung
các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao [17].
* Ứng dụng của cellulase trong chăn nuôi
Trong chăn nuôi, để nâng cao năng suất vật nuôi thì nâng cao hiệu suất
sử dụng các chất dinh dƣỡng có trong thức ăn tới mức cao nhất đƣợc coi là
giải pháp tốt nhất. Để giải quyết vấn đề này, ngƣời ta có thể dùng chế phẩm
enzyme bổ sung vào khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng
với các enzyme có sẵn trong đƣờng tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dƣỡng

của thức ăn, giúp cho vật nuôi tiêu hóa tốt hơn.
Cellulase là một trong số các enzyme thƣờng đƣợc bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi gia súc. Tuy nhiên, ngƣời ta không bổ sung riêng rẽ chế phẩm
enzyme này mà thƣờng bổ sung cùng với các enzyme khác nhƣ: amylase,
protease, xylanase...tạo ra một dạng chế phẩm enzyme hỗn hợp (multienzym).
Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải đƣợc nhiều loại cơ
chất, vật nuôi sẽ hấp thụ các nguồn thức ăn tốt hơn.

20


Sử dụng enzyme trong chăn nuôi, ngƣời ta thấy lợn con theo ổ tăng
trọng 20% và giảm thức ăn 6 – 14%. Thí nghiệm trên lợn 1 – 3 tuần tuổi thì
lợn tăng trọng 8 – 40%, tăng khả năng sử dụng thức ăn từ 10 – 18% [3].
Ngƣời ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu bò. Quá
trình tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ của trâu bò đƣợc gắn liền với hoạt động
enzyme của các vi sinh vật sống nhờ ở đây. Vì vậy, bổ sung vào thức ăn
những chế phẩm enzyme để nâng cao khả năng tiêu hóa là điều rất cần thiết.
Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase… đều thu đƣợc
kết quả tốt. Kết quả tăng trọng cuả trâu bò có thể đạt tới 12 – 17%, có khi còn
cao hơn [15], [16]. Trên thế giới ngƣời ta đã sử dụng thức ăn gia súc có chứa
các enzyme tiêu hóa từ đầu những năm 1990. Hiện nay, hàng năm ngƣời ta
sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme,
chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc đƣợc sản xuất.
Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức
ăn chăn nuôi nhƣ: GS.Nguyễn Lân Dũng, 1991 đã lên men xốp sắn với
Aspergillus henebergii, Aspergillus niger dùng làm thức ăn cho lợn, gà, bò…,
kết quả thấy có nhiều triển vọng [5]. Chu Thị Thanh Bình và cs, 2002 đã ứng
dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giầu cellulose làm
thức ăn gia súc…[1]. Gần đây, đã có nghiên cứu về sự ảnh hƣởng của enzyme

thƣơng mại: phytase hoặc tổ hợp các enzyme (amylase, protease, cellulase,
xylanase…) đến khả năng tăng trƣởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn
con cai sữa. Kết quả cho thấy khi trong thức ăn có bổ sung chế phẩm phytase
hoặc tổ hợp các enzyme thì tăng trọng hơn so với đối chứng là 13,3% và 32%.
Nếu sử dụng phối hợp cả hai chế phẩm này thì tăng trọng hơn so với đối
chứng là 50%
Nhƣ vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ
ràng làm tăng hiệu quả tiêu hóa cho vật nuôi và giảm chi phí. Tuy nhiên, hiện

21


nay ở Việt Nam chế phẩm enzyme thƣờng phải nhập khẩu với giá thành cao
nên việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề rất cần thiết.
1.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật
1.6.1. Giống vi sinh vật
Các vi sinh vật khác nhau thì có khả năng sinh enzyme khác nhau, ngay
cả những chủng cùng giống, cùng loài cũng có thể rất khác nhau về lƣợng
enzyme do chúng sản sinh ra. Vì vậy trong công tác nghiên cứu cần phải tiến
hành tìm kiếm các chủng, giống có hoạt lực sinh enzyme cao bằng cách phân
lập từ các điều kiện tự nhiên và lựa chọn các điều kiện nuôi cấy tối thích với
các cơ chất cảm ứng cũng nhƣ cần nâng cao hoạt lực bằng cách đột biến [8].
1.6.2. Nguồn dinh dưỡng
Các yếu tố trong thành phần môi trƣờng có ảnh hƣởng rất lớn đến hoạt
động sống và sự tạo thành enzyme của vi sinh vật. Trong môi trƣờng nuôi cấy
vi sinh vật cần phải đảm bảo có đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng và tỷ lệ
các chất dinh dƣỡng hợp lí, phù hợp với nhu cầu của từng vi sinh vật cụ thể.
* Ảnh hƣởng của nguồn cacbon
Thành phần và hàm lƣợng cacbon có ảnh hƣởng lớn đến sinh tổng
hợp enzyme

Đối với nấm sợi A.fumigatus và các loại nấm mốc ƣa nhiệt, nguồn
cacbon thích hợp nhất là rơm nghiền và bột giấy lọc. Môi trƣờng cám và bã
củ cải đƣờng là môi trƣờng thích hợp nhất đối với T.reesei [10].
Trichoderma lignorum và Tr.koningi nuôi trên môi trƣờng có nguồn
cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme là cao nhất. Kết quả cũng tƣơng tự
nhƣ vậy khi nuôi Myrothecium verrucaria trên môi trƣờng có giấy lọc và lõi
ngô, bã củ cải. Đối với Stachybotrit atra nguồn cacbon tốt nhất để sinh tổng
hợp cellulase là tinh bột (1%) [13].

22


* Ảnh hƣởng của nguồn nitơ
Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu
trúc cũng nhƣ các enzyme. Nguồn nitơ bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy vi
sinh vật có thể là nitơ vô cơ hoặc hữu cơ. Việc lựa chọn nguồn nitơ là rất cần
để đảm bảo đƣợc hiệu suất tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế.
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh
cellulase là muối nitrat. Đối với các giống của bộ nấm bông(Hyphomycetales)
nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4. Nói chung các muối amon ít có tác
dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp,
vì trong môi trƣờng các muối này làm cho môi trƣờng axit hóa. Điều này
không những ức chế quá trình tổng hợp enzyme mà còn làm mất hoạt tính
enzyme sau khi tạo thành. Natri nitrat làm cho môi trƣờng kiềm hóa, tạo điều
kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase.
Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp
cellulase. Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lí của từng chủng giống. Cao
ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật,
nhƣng với cao ngô khả năng sinh tổng hợp C1- cellulase và Cx- cellulase cao
hơn so với nấm men.

Nƣớc chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành Cx – enzyme, còn
cao ngô kích thích C1-enzyme và Cx-enzyme. Tác dụng kích thích của hợp
chất này là do sự có mặt của các axit amin, các nguyên tố khoáng và các nhân
tố sinh trƣởng khác.
Ngoài nitơ và cacbon thì các nguyên tố khoáng (Fe, Mn, Zn, Bo, Mo,
Cu…) có ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Các
nguyên tố Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme ở nhiều
chủng [13].

23


1.6.3. Điều kiện nuôi cấy
* Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong số các yếu tố có ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình
sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác nhau. Nhiệt độ tối thích cho sự
sinh trƣởng của đa số các loài nấm mốc trên môi trƣờng rắn là 250C – 400C.
Nhiệt độ trên 400C hoặc dƣới 250C nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi
kéo dài, giảm khả năng tổng hợp enzyme. Nâng cao nhiệt độ trong giai đoạn
mốc sinh trƣởng và hô hấp mạnh sẽ ảnh hƣởng đến sự tạo thành các enzyme
khác nhau.
Việc tạo thành α-amylase ở mốc A.oryzae không kìm hãm ở nhiệt độ
400C – 450C trong khoảng thời gian 10 – 12 giờ. Nhƣng đối với nhiệt độ quá
300C sẽ làm giảm hoạt tính protease đi 2 lần hoặc hơn nữa [13].
* Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hƣởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme. Thời
gian nuôi cấy quá dài hoặc quá ngắn đều làm giảm sinh tổng hợp enzyme của
các chủng nấm mốc. Thời gian thích hợp để tổng hợp cellulase của
Aspergillus niger là từ 36h – 48h
* Ảnh hƣởng của độ ẩm

Mỗi loài vi sinh vật cần một ngƣỡng độ ẩm. Khi độ ẩm thấp chúng phát
triển chậm. Khi giảm Aw (hoạt tính của nƣớc) dẫn đến sự thủy phân bào
tƣơng và làm giảm hoạt tính của các enzyme. Ví dụ Staphylococcus aureus
giảm tốc độ sinh trƣởng đến 10% khi Aw=0,9 [6].
Khi nuôi cấy vi sinh vật bằng phƣơng pháp lên men rắn thì độ ẩm môi
trƣờng có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh tổng hợp enzyme của các chủng nuôi
cấy. Nếu độ ẩm môi trƣờng nuôi cấy quá thấp (< 50%) hoặc quá cao (> 80%),
nấm mốc không phát triển đƣợc hoặc phát triển rất chậm, do đó hàm lƣợng
enzyme sinh ra theo đó mà giảm xuống.

24


CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật
Sử dụng một số chủng vi sinh vật phân hủy cellulose đƣợc phân lập từ
lá cây mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm rạ mục đƣợc lấy ở một số nơi nhƣ:
huyện Tam Dƣơng (Vĩnh Phúc), huyện Mỹ Đức, huyện Mê Linh (Hà Nội).
2.1.1. Nguyên liệu
Lõi ngô, vỏ trấu, vỏ lạc đƣợc sấy khô và nghiền nhỏ.
Cacboxylmethyl cellulose (CMC).
2.1.2. Môi trƣờng
2.1.2.1. Môi trường bảo quản và giữ giống
Nồng độ

Hóa chất
Đƣờng saccarose

30 g/l

NaNO3

10 g/l

MgSO4.7H2O

0,5 g/l

KCl

0,5 g/l

NaCl

1%
1 – 2 hạt

FeSO4 (dạng vết)
Thạch agar

20 g/l

H2O

1 lit

KH2PO4

2 g/l

25