Xây dựng và lựa chọn phương thức đóng gói, bảo quản màng BC

Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung và ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân đã tận tình
chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu khóa luận này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo trong tổ bộ môn Vi
sinh, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình
giảng dạy, khuyến khích em trong thời gian học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành khóa luận này. Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã giúp
đỡ, động viên em.

ĐHSP Hà Nội 2, ngày 10/ 05/ 2011
Sinh viên

Đào Văn Kiên

i
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

LỜI CAM ĐOAN

Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận, tôi xin cam đoan:
Khóa luận “Xây dựng và lựa chọn phương thức đóng gói, bảo quản
màng BC tạo ra từ chủng Acetobacter xylinum BHN2” là công trình nghiên
cứu của cá nhân tôi, thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị
Kim Nhung và ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân. Các kết quả trình bày trong
khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ khóa luận
nào trước đây..

ĐHSP Hà Nội 2, ngày 10/ 05/ 201
Sinh viên

Đào Văn Kiên

ii
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài........................................................................................ 1

2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 1
3. Nội dung của đề tài..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa của đề tài....................................................................................... 2
NỘI DUNG ................................................................................................... 3
Chương 1. Tổng quan tài liệu ..................................................................... 3
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của A.xylinum.............................................. 3
1.1.1. Vị trí phân loại của A.xylinum............................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm phân loại của A.xylinum........................................................ 4
1.2. Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn A.xylinum ..................... 6
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng ............... 11
Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.......................................13
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 13
2.1.1. Vi sinh vật .......................................................................................... 13
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................. 13
2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 13
2.1.4. Môi trường ......................................................................................... 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 14
2.2.1. Phương pháp vi sinh ........................................................................... 14
2.2.2. Phương pháp vật lý............................................................................. 16
2.2.3. Phương pháp xử lý màng BC từ A.xylinum ........................................ 17
2.2.4. Phương pháp bảo quản màng BC từ A.xylinum................................... 18
2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lí kết quả ............................................... 20

Chương 3. Kết quả nghiên cứu.................................................................. 21
3.1. Nghiên cứu thu nhận màng BC từ chủng A.xylium BHN2 ..................... 21
iii
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

3.1.1. Lên men tạo màng .............................................................................. 21
3.1.2. Xử lý màng sau lên men ..................................................................... 22
3.2. Nghiên cứu phương thức đóng gói màng BC ....................................... 23
3.2.1. Đóng gói bằng phương pháp thủ công ................................................ 23
3.2.2. Đóng gói bằng máy hút chân không.................................................... 24
3.3. Lựa chọn chất phụ gia bảo quản màng BC khi đóng gói........................ 26
3.3.1. Khảo sát khả năng thấm hút của màng BC.......................................... 26
3.3.2. Khảo sát độ bền cơ học của màng BC sau bảo quản ........................... 30
3.4. Xây dựng quy trình đóng gói và bảo quản màng BC ở quy mô phòng thí
nghiệm ......................................................................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 35

iv
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC HÌNH
Trang

Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC ............................................................. 6
Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật ............................................................... 6
Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum ............................. 8
Hình 1.4. Con đường tổng hợp cellulose từ cơ chất glucose ........................... 9
Hình 2.5. Kết quả nhuộm Gram của Acetobacter ........................................ 16
Hình 2.6. Đo độ bền màng BC theo chiều dọc.............................................. 17
Hình 2.7. Đo độ bền màng BC theo chiều ngang.......................................... 17
Hình 2.8. Màng sau sấy ................................................................................ 19
Hình 2.9. Màng BC ngâm tẩm phụ gia ......................................................... 19
Hình 2.10. Bàng BC tẩm phụ gia đã đóng gói .............................................. 19
Hình 3.11. A.xylinum BHN2 trên môi trường thạch nghiêng......................... 21
Hình 3.12. Giống A.xylinum BHN2 cấp 1.................................................... 21
Hình 3.13. Màng BC chưa xử lý................................................................... 22
Hình 3.14. Màng BC trước xử lý .................................................................. 22
Hình 3.15. Màng BC sau xử lý ..................................................................... 22
Hình 3.16. Túi nilon thông thường ............................................................... 23
Hình 3.17. Đóng gói thủ công ...................................................................... 23
Hình 3.18. Màng BC đóng gói thủ công ...................................................... 24
Hình 3.19. Túi nilon hút chân không ............................................................ 25
Hình 3.20. Máy hút chân không AMERA - V100 ......................................... 25
Hình 3.21. Màng BC đóng gói bằng máy hút chân không ............................ 25
Hình 3.22. Chế phẩm màng BC tẩm Becberin clorid 0,1% đã đóng gói........ 33

v
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Bảng
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur ...... 5
Bảng 3.2. Khảo sát sự xâm nhiễm của vi sinh vật đối với màng BC đóng
gói không tẩm chất phụ gia........................................................................... 23
Bảng 3.3. Khảo sát sự xâm nhiễm của vi sinh vật đối với màng BC đóng
gói không tẩm chất phụ gia............................................................................24
Bảng 3.4. Khả năng thấm hút nước của màng sau xử lý ............................... 27
Bảng 3.5. Khả năng thấm hút dung dịch nước muối sinh lý của màng BC ... 27
Bảng 3.6. Khả năng thấm hút thuốc trị bỏng B76 của màng ......................... 28
Bảng 3.7. Khả năng thấm hút Becberin clorid 0,1% của màng ..................... 29
Bảng 3.8. Khảo sát độ bền cơ học của của các mẫu màng BC tẩm chất phụ
gia ................................................................................................................ 30
Đồ thị
Đồ thị 3.1. Khả năng thấm hút các chất phụ gia của màng BC ..................... 29
Đồ thị 3.2. Độ bền cơ học của các mẫu màng BC tẩm chất phụ gia.............. 30

vi
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

TÓM TẮT CÔNG TRÌNH
A.xylinum khi được nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng trong điều kiện
nuôi cấy tĩnh sẽ hình thành một lớp màng, trong đó có bản chất là cellulose
liên kết với các tế bào vi khuẩn A.xylinum. Màng này được gọi là màng
Bacteria cellulose (màng BC). Cellulose trong màng vi khuẩn có một số đặc
tính quý như: độ dẻo dai, độ bền, chắc khỏe, độ đàn hồi. Nhờ những đặc tính
đó mà hiện nay màng BC được xem như là nguồn nguyên liệu mới có tiềm
năng và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thực
phẩm (làm thạch dừa), y học (làm màng thay thế da tạm thời trên bệnh nhân
bỏng), công nghệ mỹ phẩm (làm mặt nạ tẩy trang, làm sáng da)…Tuy nhiên
màng BC trong quá trình đến tay người sử dụng thường bị giảm chất lượng
hoặc bị nhiễm một số loại nấm mốc và vi khuẩn không mong muốn. Vì vậy,
tìm ra phương pháp đóng gói và bảo quản màng BC là một vấn đề cấp thiết
đang được nghiên cứu.
Trong công trình này chúng tôi tập trung nghiên cứu quá trình thu nhận
màng, các bước xử lý màng, ngâm tẩm phụ gia, phương thức đóng gói màng
BC từ đó bước đầu xây dựng quy trình đóng gói và bảo quản màng BC với
quy mô phòng thí nghiệm. Kết quả của công trình là tiền đề cho các nghiên
cứu tiếp theo xây dựng quy trình sản xuất màng BC trên quy mô công nghiệp,
nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn và giảm giá thành sản phẩm.

vii
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

PHỤ LỤC

Hình 1. Màng BC thu được bằng lên men trong bình
tam giac

Hình 2. Màng BC đóng gói có tẩm B76

viii
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

Hình 3. Nước muối sinh lý NaCl
0,9% của công ty dược phẩm Văn
Lang

Hình 4. Thuốc trị bỏng B76 của Học viên
Quân y

Hình 5. Cây Vàng đắng dùng để
triết xuất Becberin clorid

ix

Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MC: Microbial cellulose
BC: Bacterial cellulose
PC: Plant cellulose
CFU: Colony Forming Unit
OD: Optical Density
CS: Cộng sự

x
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Ngày nay, công nghệ sinh học đã trở thành một trong những ngành
khoa học mũi nhọn, có tác động to lớn đến đời sống con người thế kỷ XXI.
Công nghệ sinh học cung cấp hàng loạt các sản phẩm cần cho dinh dưỡng và
điều trị bệnh của con người, động vật, thực vật. Vi sinh vật với hoạt tính
phong phú, đa dạng, hiệu quả đang đóng vai trò quyết định cho công nghệ
sinh học. Đó chính là công nghệ vi sinh mà tiền thân của nó là công nghệ lên
men đã trải qua các giai đoạn phát triển khá phức tạp và đạt nhiều thành tựu
trong việc ứng dụng các chủng vi sinh vật vào cuộc sống. Một trong những
chủng khá phổ biến và được ứng dụng nhiều nhất là vi khuẩn A.xylinum.
A.xylinum khi được nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng trong điều kiện
nuôi cấy tĩnh sẽ hình thành một lớp màng, trong đó có bản chất là cellulose
liên kết với các tế bào vi khuẩn A.xylinum. Màng này được gọi là màng
Bacteria cellulose (màng BC). Cellulose trong màng vi khuẩn có một số đặc
tính quý như: độ dẻo dai, độ bền, chắc khỏe, độ đàn hồi. Nhờ những đặc tính
đó mà hiện nay màng BC được xem như là nguồn nguyên liệu mới có tiềm
năng và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thực
phẩm (làm thạch dừa), y học (làm màng thay thế da tạm thời trên bệnh nhân
bỏng), công nghệ mỹ phẩm (làm mặt nạ tẩy trang, làm sáng da)…Tuy nhiên
màng BC trong quá trình đến tay người sử dụng thường bị giảm chất lượng
hoặc bị nhiễm một số loại nấm mốc và vi khuẩn không mong muốn.
Từ những thực tiễn trên và mong muốn tìm hiểu thêm về vi khuẩn
A.xylinum, quá trình tạo màng BC cũng như nhiều ứng dụng hữu ích của nó
tôi chọn đề tài: “Xây dựng và lựa chọn phương thức đóng gói, bảo quản
màng BC”.

1
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

2. Mục tiêu của đề tài
Xây dựng và lựa chọn phương thức đóng gói và bảo quản chế phẩm
màng BC.
3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Nghiên cứu thu nhận màng BC trên quy mô phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu phương thức đóng gói màng BC.
- Lựa chọn chất phụ gia bảo quản màng BC khi đóng gói.
- Xây dựng quy trình đóng gói và bảo quản màng BC ở quy mô phòng
thí nghiệm.
4. Ý nghĩa của đề tài
Bước đầu xây dựng và đề xuất các phương pháp đóng gói, bảo quản
màng BC ở quy mô phòng thí nghiệm định hướng trong làm màng trị bỏng.
Tạo cơ sở tiền đề cho các nghiên cứu đóng gói bảo quản màng BC trên
quy mô công nghiệp.

2
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của A.xylinum
1.1.1. Vị trí phân loại của A.xylinum
Tên gọi: A.xylinum là một tên gọi chính thức theo hệ thống danh pháp
quốc tế 1990.
Vi khuẩn nói chung, A.xylinum nói riêng đã và đang thu hút được sự
quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới từ trước tới nay. Ngay từ
thế kỷ XIX các nhà khoa học đã tiến hành phân lập và phân loại chúng. Tuy
nhiên cho đến nay việc phân loại vi khuẩn này vẫn còn nhiều tranh cãi.
Năm 1950, Frateur đã xếp A.xylinum vào nhóm Mezoxydans.
Năm 1957, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology” ông
đã xếp A.xylinum vào chi Acetobacter, thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes.
Đến năm 1974, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology”.
A.xylinum lại được coi như là một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi
Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc.
Cùng với thời gian loài vi khuẩn này lại được sắp xếp vào những vị trí
khác nhau. Theo “Applied and Envitromene microbiology” và “Bergey’s
manual of systematic bacteriology” thì họ Acetobacteraceae gồm hai chi vi
khuẩn acetic quan trọng là Acetobacter và Gluconobacter. Vi khuẩn
A.xylinum được xếp vào chi Acetobacter.
Tới nay, đã tồn tại nhiều quan điểm khác nhau trong việc phân loại vi
khuẩn acetic nói chung và A.xylinum nói riêng. Vấn đề này vẫn đang gây
nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những nghiên cứu tiếp theo.

3
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

1.1.2. Đặc điểm phân loại của A.xylinum
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái - tế bào học
A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng
2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di
động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng
nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm
iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích lũy
4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá
giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [6].
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc,
hóa dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước
ép hoa quả, trong đất.
1.1.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc
trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Vi
khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng
sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC [16].
Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ
với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo
ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh
[10].
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
+ Đặc điểm sinh lý

Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 35oC, pH = 4 - 6. Nhiệt
độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn
4
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

ngay cả trong môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau
và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn
A.xylinum sinh trưởng và tạo màng. A.xylinum có khả năng chịu được pH
thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn
chế sự nhiễm khuẩn lạ.
+ Đặc điểm sinh hoá
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt
tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [15]…Theo quan
điểm này A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae,
bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng
khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây:
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum
theo Frateur [9]
STT
1
2
3

4
5
6
7

Đặc điểm

Hiện tượng

Oxy hoá ethanol thành
acid acetic
Hoạt tính catalase
Sinh trưởng trên môi
trường Hoyer
Chuyển hoá glycerol thành
đihydroxyaceton
Chuyển hoá glucose thành
acid
Kiểm tra khả năng sinh sắc
tố nâu
Kiểm tra khả năng tổng
hợp cellulose

Chuyển hoá môi trường chứa Bromphenol
Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng
Hiện tượng sủi bọt khí

+
+

Sinh khối không phát triển

_

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên men

+

Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc
trên môi trường chứa CaCO3

+

Không hình thành sắc tố nâu

_

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

5
Đào Văn Kiên

Kết
quả

K33B - SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

1.2. Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn A.xylinum
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polymer β - 1,4 glucopyranose mạch
thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau.

Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC

Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật

Chuỗi polymer β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với
với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc Van Der Waals tạo
thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng
lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể
xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng [14].
1.2.2. Một số tính chất của màng bacterial cellulose
Chung và Shyu đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ cứng, độ
dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối … lên tính chất của
BC. Các mảnh BC có độ cứng là 3,68 kg/cm2. Độ cứng của các miếng BC
6
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

giảm khi chúng được nhúng vào dung dịch đường và độ cứng tăng lên khi
được nhúng vào dung dịch muối [22].
Sản phẩm của cellulose vi khuẩn có một số tính chất như sau:
- Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao.
- Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp.
- Do khả năng S-BC hình thành sẵn màng, khi ứng dụng trong làm vải
không cần qua khâu dệt, làm giấy không cần qua khâu bột giấy.
- Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của
cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy.
- Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose
(kiểm soát được cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo
cellulose.
- Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà
không gắn lignin, có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì
vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong
tương lai.
1.2.3. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [8],[7].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc
tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A.xylinum: Glucokinase (GK),
Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase
(UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó

UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [9].

7
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum
 Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn

Giai đoạn polymer hoá:
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hoá
chuyển glucose thành glucose-6-phosphate. Enzyme phosphoglucomutase
tiếp tục chuyển hoá glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate thông
qua phản ứng isomer hoá. Glucose-1-phosphate nhờ enzyme UDP-glucose
pyrophospholyase chuyển hoá thành UDP-glucose. Cuối cùng, UDP-glucose
được tổng hợp nên sẽ được hoá thành cellulose và cellulose được tiết ra môi
trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase.
Enzyme này được hoạt hoá nhờ một nucleotide vòng là cyclic-di-GMP.

8
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

Một số chủng vi khuẩn A.xylinum có khả năng sử dụng đường fructose
hiệu quả hơn. Hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành
fructose-1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hoá thành
fructose-bi-phosphate nhờ enzyme fructose-1-phosphatekinase. Enzyme
phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hoá fructose-6phosphate thành glucose-6-phosphate. Glucose-6-phosphate lại tham gia vào
quá trình chuyển hoá tương tự như trên để tạo ra cellulose [21].
Giai đoạn kết tinh:
Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan. Trong đó
các chuỗi glucan kết hợp tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van
Der Waals. Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó
chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16
chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi,sau
đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi. [19]

Hình 1.4. Con đường tổng hợp cellulose từ cơ chất glucose [22]
 Ý nghĩa của quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A.xylinum

9
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

Phần lớn tế bào trong môi trường tĩnh, A.xylinum không di động do
chúng nằm bên trong lớp màng cellulose. Điều này làm cản trở nghiên cứu về
quá trình chuyển hoá, vận chuyển chất dinh dưỡng và oxy đến tế bào.
Lớp màng cellulose do vi khuẩn A.xylinum tạo ra bao xung quanh môi
trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này ngăn cản sự
cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khí khác, tạo điều kiện thuận lợi cho quá
trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn A.xylinum. Màng cellulose có khả năng
giữ nước nên giúp cho vi khuẩn phân huỷ các chất dinh dưỡng để sử dụng và
giúp tế bào chống lại ảnh hưởng của tia UV (tia tử ngoại). Nhờ tính dẻo dai và
tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được
những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm ẩm độ, thay
đổi pH, xuất hiện các độc chất. Các vi khuẩn A.xylinum có thể tăng trưởng và
phát triển bên trong lớp vỏ bao. Thực nghiệm chỉ ra rằng cellulose bao quanh
tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào
A.xylinum được bao bọc bởi BC sống sót sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím. Khi
tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của tế bào giảm chỉ còn khoảng 3%.
Mạng lưới BC là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn A.xylinum luôn ở bề
mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí . Chính mạng lưới này làm
cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thâu
nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi
trường lỏng không có mạng lưới cellulose [20]. Trong môi trường tự nhiên, đa
số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ
bao quanh tế bào và màng BC là một điển hình.
Một vài nghiên cứu còn cho thấy, cellulose được tổng hợp bởi
A.xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể sử dụng khi vi sinh vật này bị
thiếu dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo
10
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

glucanase hay endo glucanase. Các enzyme exo glucanase hay endo
glucanase phân huỷ cellulose được phát hiện trong dịch nuôi cấy ở một vài
chủng A.xylinum sản xuất cellulose [21].
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng màng bacterial cellulose trong điều
trị bỏng
1.3.1. Trên thế giới
Trên thế giới màng BC được dùng trong ngành dược phẩm và mỹ
phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs, Cienchanska, Legeza và cs, Wan và Millon,
Czaja và cs, sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu
được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền
về làm màng BC từ A.xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad,
Czaja và cs đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ
nữ [8].
1.3.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải
tiến. Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số
màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chatoyant, sử dụng
các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng. Từ năm 2000
nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cs đã có một số công
trình nghiên cứu về màng BC từ A.xylinum và bước đầu nghiên cứu về các
đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong trị
bỏng ở Việt Nam [20].

Năm 2006, Bộ môn Vi Sinh - Ký Sinh Đại học Y Dược Tp.HCM đã chế
tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp
lên men. Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học
nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời. Với các hoạt
chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên.
11
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

Mới đây có nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung và cs,
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cũng đang bước đầu ứng dụng màng BC
trong điều trị bỏng trên thỏ [13].
Trong công trình nghiên cứu này, chúng tôi không sử dụng dầu mù u
mà thay thế vào đó chúng tôi sử dụng các loại thuốc trị bỏng khác như:
Becberin florid 0,1%, thuốc bột trị bỏng B76, nước muối sinh lý. Đặc biệt,
chúng tôi đã xây dựng và lựa chọn được phương thức đóng gói, bảo quản
màng BC tạo ra từ chủng A.xylinum, tìm ra vật liệu đóng gói và chất bảo quản
phù hợp, vừa hợp giá thành, bảo quản được màng BC trong một khoảng thời
gian dài và nâng cao được tác dụng điều trị bỏng của màng.

12
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vi sinh vật
Chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 được nhận từ phòng thí nghiệm Vi
sinh, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng những dụng
cụ thiết bị như: Nồi hấp khử trùng (Tomy, Nhật Bản); tủ sấy (Haraeus, Đức);
tủ ấm vi sinh (Haraeus, Đức); box cấy vô trùng; cân điện tử (Precica XT 320
M, Thuỵ Sỹ); micropipep (Gilson, Pháp); tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu
(Tawasi, Nhật); kính hiển vi quang học (olympus CX41 , Nhật); máy đóng gói
hút chân không chuyên dụng AMERA V100; hộp lồng; ống nghiệm; pipet, bàn
trang thuỷ tinh; bình tam giác; lam kính; la men; đèn cồn; … và nhiều dụng
cụ hoá sinh thông dụng khác (tại phòng thí nghiệm Vi Sinh, khoa Sinh KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2).
2.1.3. Hoá chất
Nguồn cung cấp cacbon: Ethanol, glucose, glycerol, saccarose, manitol,
lactose, acid acetic.
Nguồn nitơ:
+ Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4
+ Nguồn nitơ hữu cơ: pepton, cao thịt
Một số hoá chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH
Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch
lugol.
Agar, nước dừa nguyên chất.

Các hoá chất trên được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường
ĐHSP Hà Nội 2.

13
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

Kháng sinh trị bỏng B76 của học viện Quân y, becberin clorid 0,1%
được cung cấp từ Viện bỏng Quốc gia, dung dịch nước muối sinh lý của công
ty dược phẩm Văn Lang.
2.1.4. Môi trường [14]
2.1.4.1. Môi trường giữ giống
Glucose: 20 g
Cao nấm men: 5g
MgSO4.7H2O: 2g
Nước máy : 1000ml
2.1.4.2. Môi trường nhân giống
Glucose: 20 g
KH2PO4: 2 g
pH: 5,0 - 6,0

(NH4)2SO4 : 2g
Thạch agar: 20g
KH2PO4: 3g

NH4)2SO4: 2g
MgSO4.7H2O: 2g
Acid acetic: 2%
Nước dừa: 1000 ml

2.1.4.3. Môi trường lên men
Glucose: 20 g
MgSO4.7H2O: 2g
Nước dừa : 1000ml

(NH4)2SO4 : 3g
KH2PO4: 2g

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng [3] [5].
Các chủng giống sau khi phân lập, được sơ bộ xác định là A.xylinum
được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm ở 30oC. Sau đó
giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4oC dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền và
giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 2 tháng một lần .
2.2.1.2. Phương pháp hoạt hoá giống
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử
dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật
cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu
chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121oC trong 20 phút. Sau

14
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

ĐHSP Hà Nội 2

đó đem xử lý trong đèn cực tím 15 phút, cấy chuyển giống từ ống thạch
nghiêng vào và nuôi lắc 130 vòng/phút trong 24 giờ.
2.2.1.3. Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110oC
trong 20 phút để tránh caramen đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong
15 phút. Bổ sung vào môi trường 10% giống hoạt hoá.
Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh và theo dõi sự hình thành màng BC. Qua
nhiều lần khảo sát, chúng tôi nhận thấy sau 4 ngày có thể thu được màng BC
đạt yêu cầu.
2.2.1.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào
trên tiêu bản nhuộm kép
Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính,
cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng
phương pháp nhuộm gram:
1. Tím gentian: 2 phút.
2. Rửa nước.
3. Dung dịch Lugol: 2 phút.
4. Rửa nước.
5. Cồn 950: 20 giây.
6. Rửa nước.
7. Dung dịch Fucshin: 2 phút.
8. Rửa nước.
9. Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn.

15
Đào Văn Kiên

K33B - SP Sinh