Lựa chọn phương pháp tối ưu để diệt vi khuẩn acetobacter có trên màng BC
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (670.82 KB, 31 trang )
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Trong tự nhiên có một số vi khuẩn (Acetobacter, Achromobacter,
Aerobacter, Agarobacterium, alcaligen…) có khả năng sản sinh ra màng
cellulose. Khi nuôi cấy vi khuẩn này trong môi trường chứa glucose, glyserol,
họăc một số nguồn cacbon hữu cơ khác nhau chúng có khả năng hình thành
trên bề mặt một lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và được gọi là màng
sinh học Bacterial Cellulose (BC).
Cho đến nay, Acetobacter xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có
khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên. Màng BC được tạo
thành từ vi khuẩn Acetobacter xylinum có cấu trúc và đặc tính cơ học giống
cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ
bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết
cao, độ polymer hóa lớn, độ thông thoáng tốt, có khả năng ngăn cản vi khuẩn
đi qua nên được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau như
sản xuất da nhân tạo sử dụng để ghép da, thay thế da trị bỏng, sản xuất mặt lạ
dưỡng da... Ngoài ra chúng còn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực
phẩm, điển hình là sản xuất thạch dừa, trong sản xuất giấy chất lượng cao, tơ
nhân tạo [11].
Ở Việt Nam cũng đã nghiên cứu sản xuất và sử dụng màng BC trong
điều trị bỏng trên đối tượng động vật, hy vọng trong tương lai không xa sẽ
được thử nghiệm và ứng dụng trên người. Để làm được như vậy thì việc khử
khuẩn trên màng cũng là một khâu quan trọng.
Từ lý do trên tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Lựa chọn phương
pháp tối ưu để diệt vi khuẩn Acetobacter xylinum có trên màng BC”.
GVHD: Phương Phú Công
1
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu phương pháp tối ưu diệt vi khuẩn Acetobacter xylinum có
trên màng BC sau lên men nhưng vẫn giữ được một số tính chất lý hóa đặc
biệt của màng.
3. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài.
- Tìm ra phương pháp tối ưu diệt vi khuẩn Acetobacter xylinum trên
màng BC sau lên men.
- Nghiên cứu góp phần tạo ra màng trị bỏng phục vụ đời sống, nhu
cầu của xã hội.
4. Nội dung cần tiến hành
- Hoạt hoá chủng A. xylinum được cung cấp từ phòng thí nghiệm.
- Nhân giống chủng A. xylinum, lên men và thu màng BC.
- Nghiên cứu một số tích chất vật lý của màng BC được tạo ra từ
chủng A. xylinum.
- Nghiên cứu các khả năng diệt khuẩn A. xylinum còn lại trên màng và
lựa chọn phương pháp tốt nhất.
- Nghiên cứu khả năng vô trùng của màng trong điều kiện bảo quản
phòng thí nghiệm.
GVHD: Phương Phú Công
2
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Vai trò của Acetobacter xylinum và màng BC
1.1.1.Vai trò của vi khuẩn Acetobacter xylinum
Trong lịch sử, con người đã biết cách làm giấm bằng kinh nghiệm thực
tiễn của mình xong chưa hiểu rõ cơ sở khoa học của quá trình tạo giấm, càng
không thể giải thích được vì sao rượu loãng lại có thể chuyển thành giấm.
Ngày nay, chúng ta khẳng định rằng tác nhân của quá trình tạo giấm chính là
vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn giấm, vi khuẩn acetic.
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc,
hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Vi khuẩn A.xylinum
tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi khuẩn này
trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng
cellulose sinh học thuần khiết và được gọi là màng sinh học Bacterial
Cellulose, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose.
1.1.2.Vai trò của màng BC
Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong
các lĩnh vực công nghệ khác nhau như sản xuất da nhân tạo sử dụng để ghép da,
thay thế da trị bỏng, sản xuất mặt lạ dưỡng da, dùng làm màng phân tách cho
quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,
dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi
trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, dùng màng BC
để sản xuất giấy điện tử, làm cơ chất cố định protein hay cho sắc kí... Đặc biệt
Brown đã dùng BC làm vải đặc biệt [11]. Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy
của màng BC là dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm như sản xuất màng trị
bỏng, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ...
GVHD: Phương Phú Công
3
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
Hình 1.1: Cấu tạo màng BC
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo màng
Các yếu tố như thành phần môi trường, nhiệt độ và chế độ thông khí,
sự thay đổi điều kiện nuôi cấy là những nhân tố quan trọng đối với quá trình
lên men tạo màng.
1.2.1. Ảnh hưởng của độ thông khí
Vi khuẩn Acetobacter xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Điều kiện
tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của
quá trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ
thông khí quyết định năng suất BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và
sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao
trong lên men chìm. Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng,
thoáng và lớp môi trường mỏng [12].
Wanatabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy cũng ảnh
hưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuẩn. Cellulose hình thành dưới
áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất
GVHD: Phương Phú Công
4
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
oxy cao. Do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp
màng BC [18].
1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
0
Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn Acetobacter xylinum từ 25-35 C. Ở
nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt
động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên
men sẽ giảm [13].
1.2.3. Ảnh hưởng của nguồn C, N, P và các nguyên tố vi lượng
Để quá trình oxi hóa xẩy ra nhanh trong dịch lên men cần cung cấp
nguồn các chất như: axit acetic, rượu etylic, dung dịch lên men cần được bổ
sung thêm các chất khoáng như: (NH4)2SO4; KH2PO4; MgSO4.7H2O;
CaHPO4… Ngoài ra, trong môi trường dinh dưỡng cần bổ sung thêm vitamin
và pepton, cao nấm men, cao thịt, nước chiết cà chua…
1.2.4. Độ pH
Vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có
pH thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm
acid hoá môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp
ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại [14].
1.3.Các phương pháp khử khuẩn [22]
Các phương pháp khử khuẩn gồm hai phương pháp chính đó là: khử
khuẩn bằng phương pháp vật lý và khử khuẩn bằng phương pháp hóa học.
1.3.1. Các phương pháp vật lý
* Khử khuẩn bằng hơi nóng (nhiệt ẩm)
Nguyên lý: Nhiệt ẩm ở dưới dạng hơi nóng được bão hòa dưới áp lực là
một tác nhân vật lý để tiêu diệt tất cả các dạng sống của vi sinh vật kể cả các loài
có nha bào. Nhiệt tạo ra hơi nóng phá hủy vi sinh vật nhưng quá trình này nhờ
cộng thêm hơi ẩm vì nếu chỉ có hơi nóng tự nó không đủ để tiêu diệt vi khuẩn.
GVHD: Phương Phú Công
5
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
Hơi nóng và nhiệt ẩm có được nhờ gia tăng nhiệt độ của nước. Người ta tạo ra
một áp lực lớn hơn áp lực khí quyển để gia tăng nhiệt độ của nước nhằm tạo ra
nhiệt nóng cao để phá hủy sức sống của vi sinh vật, đồng thời với hơi nóng, độ
ẩm sẽ làm biến dạng chất protein bên trong tế bào.
Với phương pháp này hầu hết các vi sinh vật bình thường đều bị giết trong
vài phút ở nhiệt độ 540C - 5500C. Một số loài vi sinh vật có nha bào chịu đựng
được ở nhiệt độ 1150C trong 34h. Tuy nhiên không có một loài vi sinh vật nào
sống sót ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút tiếp xúc.
* Khử khuẩn bằng nhiệt nóng (sấy khô)
Nguồn năng lượng đốt bằng than hay bằng điện, nhiệt độ trong buồng sấy
sẽ tăng dần đạt được 1800C. Thời gian hấp từ 15 – 45 phút, ở nhiệt độ này các
phân tử hữu cơ bị phân hủy thành cacbon do đó vô khuẩn được tuyệt đối.
* Khử khuẩn bằng phương pháp đun sôi:
Các loại nấm, vi khuẩn chịu nhiệt. Đặc biệt là các loài virut và nha bào vi
khuẩn có thể sống ở nước sôi 1000C trong vài giờ. Do đó không nên khử khuẩn
bằng phương pháp đun sôi ở áp suất của khí quyển.
* Khử khuẩn bằng tia cực tím
Tia phóng ra từ một loại đèn thủy ngân có bước sóng dài để hấp thu các
chất hữu cơ ngay cả với dụng cụ trong suốt.
* Khử khuẩn bằng siêu âm
Siêu âm tác dụng với tần số cao trên các dịch, các khí và không khí gần.
Trong môi trường lỏng, siêu âm tạo nên những gốc hóa học tự do H+ là gốc có tác
dụng oxi hóa khử mạnh, OH- là gốc có tác dụng oxi hóa và nó có thể trùng hợp tạo
nên như oxi già.
* Khử khuẩn bằng phóng xạ
Dùng tia phóng xạ (tia X) tác dụng chính là do các tia phóng xạ tách các
electron, biến các vật thể thành ion âm và dương. Áp dụng phương pháp này cho
GVHD: Phương Phú Công
6
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
thấy: mỗi loài vi khuẩn nhạy cảm mỗi tia khác nhau. Trên mỗi môi trường tia
phóng xạ lại tác dụng khác nhau. Độ nhạy cảm với tia cũng khác nhau tùy theo
loài vi khuẩn, nấm hay virut.
1.3.2. Các phương pháp hóa học
* Khí ethylene oxide (EO).
EO có khả năng diết chết tất cả các loài vi sinh vật kể cả nha bào khi tiếp
xúc trực tiếp trong một thời gian nhất định. Cơ chế chính là ức chế sự chuyển hóa
bình thường của protein và quá trình tái sinh protein. Muốn có tác dụng diệt
khuẩn, vật liệu phải tác dụng trực tiếp với khí EO. Trong thực hành khí EO đơn
thuần sẽ gây cháy nổ cho nên người ta trung hòa với một khí khác như
hydrocacbone hay CO2. Khử khuẩn bằng khí này tùy thuộc vào nồng độ, nhiệt độ,
độ ẩm và thời gian tiếp xúc với khí. Khí chứa trong một bình kim loại hỗn hợp
gồm 10 – 12% EO. Nồng độ EO khử khuẩn là: Cứ 1l trong buồng khử khuẩn
chứa khoảng 450 – 800 mg khí EO. EO có thể gây bỏng, khí đắt tiền, trang thiết bị
đặc biệt khí dễ nhiễm độc.
* Khử khuẩn bằng hoạt chất glutaraldehyd
Ngoài khí EO người ta có thể dùng hoạt chất glutaraldehyd để khử khuẩn,
diệt khuẩn những vật liệu, dụng cụ nhạy cảm với nhiệt độ. Cách thức áp dụng
tương tự như khử khuẩn bằng khí EO.
Thuận lợi: Dễ thấm, dễ xâm nhập, an toàn không gây kích ứng da, không
gây hư hỏng dụng cụ, diệt khuẩn ở nhiệt độ bình thường.
Khó khăn: Phương pháp phải hoạt hóa bằng cách pha trộn vào các dung
dịch đệm. Có mùi đặc biệt và có độc tính nên ảnh hưởng đến người sử dụng.
* Khử khuẩn bằng các loại cồn
- Etylic: Sau vài giây tiếp xúc có tác dụng diệt các loài vi khuẩn không có
nha bào, ức chế hoạt động của virut.
- Cồn propylic: Diệt khuẩn mạnh nhưng nhược điểm là kích thích mạnh.
GVHD: Phương Phú Công
7
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
* Diệt khuẩn bằng formol
Formol là chất khử khuẩn khá độc.
Trioxymethylene thường được khử khuẩn các dụng cụ không hấp được
như một số máy móc phẫu thuật, đồ nhựa, ống nội khí quản...
* Các chất khử khuẩn khác
- Hypochlorite là những muối natri có nồng độ khác nhau
- Dung dịch cồn : dung dịch 5% sát khuẩn mạnh nhưng gây kích ứng da
- Nước oxy già 3%: có tác dụng sát khuẩn, làm sạch vết thương bẩn.
- Acid pesacetic dung dịch 2%
- Các aminonium hóa trị 3, phenol và các dẫn chất.
- Các kim loại nặng như thủy ngân .
1.4. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới và ở Việt
Nam
1.4.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới
Hiện nay, vi khuẩn Acetobacter xylinum và ứng dụng của nó đang
được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. tập chung theo hai
hướng cơ bản:
* Hướng 1 : chủ yếu là phân lập tuyển chọn, nghiên cứu các đặc tính
sinh học của Acetobacter xylinum từ đó xác định vị trí phân loại của chúng
trong sinh giới.
* Hướng 2 : nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm và ứng
dụng của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Đó là các nghiên cứu về khả năng
sinh tổng hợp cellulose của các chủng Acetobacter xylinum; ảnh hưởng của
môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp
cellulose.
Mở đầu là nghiên cứu của R.M.Brown [10]và cs, K.Zaa [20]. Gần đây
cơ chế sinh tổng hợp cellulose, các hệ enzyme tham gia vào con đường
GVHD: Phương Phú Công
8
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Acetobacter xylinum mới dần được sang tỏ
[9], [16], [17].
Từ sau nửa thế kỉ XIX đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu
về ứng dụng của màng BC trong lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt làm màng trị
bỏng, sử dụng màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng và đã thu được kết
quả tốt như Wan và Millon đã được đăng kí bản quyền về làm màng BC từ
Acetobacter xylinum dùng trị bỏng [19]. Về sau cũng có nhiều tác giả cũng
nghiên cứu về hướng này.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylium ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải
tiến. Có một số các nghiên cứu, công bố liên quan đến Acetobacter xylinum,
sự hình thành BC và ứng dụng màng BC. Các công trình mới chỉ bước đầu
nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo
màng trị bỏng [7]; sản xuất thạch dừa [5]. Gần đây nhất là nghiên cứu ứng
dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn của Nguyễn
Thúy Hương và Phạm Thành Hổ.
Năm 2006, PGS.TS Nguyễn Văn Thanh – Trưởng bộ môn Vi Sinh –
Ký Sinh Đại học Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng
sinh học dầu mù u bằng phương pháp lên men. Nó có khả năng thấm nước
cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học ,
có thể thay thế da tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát
khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu
tố gây kích ứng da.
Mới đây, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung cũng
đang bước đầu ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng trên thỏ [8].
GVHD: Phương Phú Công
9
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một
số màng trị bỏng như màng ối, trung bị da lợn, da ếch, màng chitossan, sử
dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng …
Không chỉ ở Việt Nam mà hầu hết các quốc gia trên thế giới, việc
điều trị bỏng bằng các thuốc trị bỏng có nguồn gốc từ tự nhiên đã được áp
dụng rất lâu và phổ biến. Các thuốc này có sẵn trong thiển nhiên và có nhiều
đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vết thương, côn trùng đốt…
GVHD: Phương Phú Công
10
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên Liệu
2.1.1. Vi sinh vật
Đối tượng nghiên cứu là các chủng Acetobacter xylinum được phòng
thí nghiệm Thực vật - Vi Sinh Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2 cung cấp.
2.1.2. Hoá chất
- Nguồn Cacbon: Rượu etylic, Glucose, Sacrose, Manitol, Lactose,
Fructose, Dihyroxyaceton, Axit acetic.
- Nguồn Nitơ: Cao nấm men, Pepton, (NH4)2SO4
- Các muối khoáng: KH4PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH, CuSO4.
- Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nấm men, cao ngô.
- Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol.
- Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol.
- Ngoài ra còn sử dụng : Các loại bia, nước dừa, các loại nước chiết
quả.
2.1.3 Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức).
Nồi hấp Tommy (Nhật).
Máy so màu UV – vis ( Nhật).
Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ).
Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh).
Máy li tâm Sorvall (Mỹ).
Micropipet Jinson (Pháp), các loại từ 20l – 10ml.
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40.
GVHD: Phương Phú Công
11
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ).
Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn…
2.1.4. Môi trường
2.1.4.1. Môi trường phân lập giống (MT1)
Glucose: 20 g
(NH4)2SO4: 3 g
KH2PO4: 2 g
MgSO4.7H2O: 2 g
CaCO3 : 10g
Agar: 20g
Pepton: 4g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
2.1.4.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)
Glucose: 20 g
(NH4)2SO4: 3 g
KH2PO4: 2 g
MgSO4.7H2O: 2 g
Pepton: 4g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
2.1.4.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng ( MT3)
Glucose: 20 g
(NH4)2SO4: 3 g
KH2PO4: 2 g
MgSO4.7H2O: 2 g
Pepton: 4g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước dừa: 500ml.
Nước máy: 500ml
GVHD: Phương Phú Công
12
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân biệt tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram
Vi khuẩn Acetobacter xylinum là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể
phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (kép).
Vai trò: Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều
loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi
khuẩn dựa vào khả năng tạo thành trong tế bào hợp chất bền vững của protein
đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt.
Tiến hành: Lấy chủng Acetobacter xylinum đem nhuộm tiêu bản theo
phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi
quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần [1], [2], [3].
2.2.2. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập được xác lập là vi khuẩn
Acetobacter xylinum được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4 – 5 ngày trong
tủ ấm ở 300C [2], [3]. Sau đó giữ trong tủ lạnh ở 40C dùng cho các nghiên cứu
tiếp theo. Cấy truyền giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần.
2.2.3. Phương pháp hoạt hóa giống
Giống trong ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem
sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh
vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa sử dụng môi trường tiêu
chẩn (MT1) không có thạch aga, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 8 phút.
Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch
nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [2], [3].
2.2.4. Phương pháp lên men tạo màng
Phương pháp lên men tạo màng sử dụng môi trường lên men tạo
màng (MT3) đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau đó bổ sung vào
môi trường lên men 5% giống hoạt hóa.
GVHD: Phương Phú Công
13
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
Nuôi ở điều kiện tĩnh trong 7 – 10 ngày.
2.2.5. Phương pháp xử lý vi khuẩn Acetobacter xylinum trên màng BC
bằng các thí nghiệm sau:
Phương pháp xử lý vi khuẩn trên màng phải đảm bảo các tiêu chí sau:
màng sau xử lý phải vô khuẩn, màng dai, pH trung tính, mùi dễ chịu; các
bước xử lý màng phải đơn giản, hiệu quả và ít tốn kém.
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Acetobacter
xylinum chịu tác động của nhiều yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, pH…Tôi đã
tiến hành lên men tạo màng BC trong môi trường lỏng (MT3), sau khi thu
màng chọn màng BC ổn định, mỏng 0,5 – 1mm, kích thước 10 × 15 cm, dai
để tiến hành khử khuẩn vi khuẩn Acetobacter xylinum có trên màng BC theo 5
phương pháp sau:
+ Phương pháp 1: hấp màng ở 1210C trong vòng 20 phút, ở 1100C
trong vòng 8 phút.
+Phương pháp 2: Sấy màng trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C trong vòng
10, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút.
+ Phương pháp 3: Chiếu tia cực tím trong khoảng thời gian là 10,15,
20, 25, 30 phút ở khoảng cách từ màng cho đến đèn cực tím là 40 cm.
+ Phương pháp 4: Ngâm cồn 960 trong vòng 6, 12, 24, 48 giờ.
+ Phương pháp 5: Sấy màng 600C trong 60 phút, sau đó chgieeus đèn
tím trong 10 phút.
Phương pháp đánh giá kết quả:
- Sau khi khử khuẩn trên màng theo 5 phương pháp trên, kiểm tra vi
khuẩn còn lại trên màng bằng cách:
+ Dùng kéo vô trùng cắt màng đã xử lý bằng 5 phương pháp ở trên
với diện tích 4cm2 sau đó đặt lên các hộp Petri có sẵn môi trường
dinh dưỡng (MT1).
GVHD: Phương Phú Công
14
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
+ Sau 5 ngày kiểm tra khuẩn lạc xuất hiện bề mặt hộp petri.
- Kiểm tra độ dày mỏng của màng BC trước và sau khi xử lý bằng
cách cân khối lượng màng; kiểm tra màu sắc của màng, độ dai
bằng cảm quan, dùng quỳ tím kiểm tra pH trên màng.
GVHD: Phương Phú Công
15
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn trên kính hiển vi quang học
Để quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, tôi tiến hành làm tiêu bản và
nhuộm Gram. Lấy mẫu vi khuẩn trong ống thạch nghiêng làm tiêu bản và tiến
hành nhuộm Gram. Đưa lên tiêu bản lên kính hiển vi quang học (độ phóng đại
1000 lần) và quan sát.
Nhận thấy tế bào của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 đều
đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động, bắt màu hồng
fucshin, các tế bào này được bao bọc bởi một lớp màng nhầy tạo thành váng
dày.
Hình 3.1 : Tế bào của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 (độ
phóng đại 1000 lần)
GVHD: Phương Phú Công
16
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng [1] [21] vi khuẩn Acetobacter xylinum
có bao nhầy cấu tạo bởi cellulose. Thành phần cấu tạo chủ yếu của bao nhầy
là các poysaccarit (chủ yếu là glucose), ngoài ra còn có các polypeptit,
protein. Bao nhầy có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn
bám vào giá thể.
Theo tác giả Sokolnicki và cs [15] độ dai chắc của màng cellulose do vi
khuẩn sinh ra có liên quan đến hình dạng của tế bào vi khuẩn. Nếu độ dài
(chiều dài của tế bào) càng cao thì tính bền vững của màng cellulose do vi
khuẩn đó tổng hợp càng lớn. Kết quả này cùng phù hợp với nghiên cứu của
tác giả Nguyễn Thúy Hương (2006) khi nghiên cứu về mối liên hệ giữa hình
dáng kích thước tế bào vi khuẩn và độ chịu lực của màng BC cũng cho rằng
những dòng có tế bào dài thì màng BC mà chúng tạo ra có khả năng giữ nước
tốt hơn và có độ dai chắc hơn, còn những dòng Acetobacter xylinum có hình
dạng tròn dài thì màng BC của chúng khả năng chịu lực thấp hơn [6].
Như vậy, từ kết quả quan sát hình thái, kích thước tế bào chủng
Acetobacter xylinum BHN2 sinh tổng hợp màng BC phù hợp với mục đích
nghiên cứu của đề tài.
3.2. Lên men tạo màng trong môi trường lỏng
Vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi cấy trong môi trường lỏng (MT3)
hình thành một lớp màng trên bề mặt nuôi cấy.
Vi khuẩn Acetobacter xylinum là những loài hiếu khí, khi sống trong
môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp
thụ đường glucose, kết hợp đường với một acid béo để tạo thành tiền chất
nằm ở màng tế bào. Tiền chất này tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên
màng tế bào cùng với một enzyme có thể polyme hoá glucose thành cellulose
và trên môi trường dịch thể chúng sẽ phát triển thành lớp màng độ dày, mỏng
GVHD: Phương Phú Công
17
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
khác nhau tuỳ thuộc vào từng loài. Màng BC là tập hợp các tế bào vi khuẩn
liên kết với cellulose.
Hình 3.2 : Màng BC hình thành trên môi trường lỏng
Kết quả quan sát cho thấy màng BC từ chủng Acetobacter xylinum
BHN2 có màu trắng sáng, bề mặt màng nhẵn, có độ dai cao và chúng tôi cho
rằng màng BC do chủng Acetobacter xylinum BHN2 đáp ứng yêu cầu tạo
màng BC ứng dụng trong trị bỏng.
3.3. Các phương pháp khử khuẩn trên màng BC
3.3.1. Phương pháp 1: Hấp màng ở 1210C trong 20 phút và 1100C trong 8
phút
Màng BC đặt trong hộp nhựa chịu nhiệt đem hấp trong nồi hấp
Tommy để khử khuẩn trên màng. Sau khi xử lý màng tôi thu được kết quả
như sau:
GVHD: Phương Phú Công
18
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
Bảng 3.1: Màng BC sau xử lý bằng phương pháp 1
Phương pháp xử lý
Kết quả
Số khuẩn lạc mọc trên
Đặc điểm của màng
petri
Hấp màng ở 1210C trong
0
20 phút
Màu trắng đục
Mùi dễ chịu
Kém dai
pH = 4-5
Hấp màng ở 1100C trong
0
8 phút
Màu trắng đục
Mùi dễ chịu
Kém dai
pH = 4-5
Màng sau khi hấp 1210C trong 20 phút và 1100C trong 8 phút đều vô
khuẩn do vi khuẩn Acetobacter xylinum là vi khuẩn ưa ấm (nhiệt độ tối thích
là 25 – 350C), khi hấp màng ở nhiệt độ cao, áp suất lớn vi khuẩn trên màng
đều bị tiêu diệt. Qua kết quả thực nghiệm ở bảng 1, màng vẫn giữ được độ
dai, màng trắng, thầm hút tốt, tuy nhiên màng hơi mỏng, pH màng vẫn còn
axit.
Hình 3.3 : Màng sau khử khuẩn khi hấp ở 1210C trong 20 phút
và 1100C trong 8 phút
GVHD: Phương Phú Công
19
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
3.3.2. Phuơng pháp 2: Sấy màng ở 600C trong vòng 10, 20, 40, 60, 70 phút
Tôi đã tiến hành khử khuẩn khô màng ở 600C trong vòng 10, 20, 40,
60, 70 phút cho kết quả như sau:
Bảng 3.2 : Màng sau khi xử lý theo phương pháp 2
Sấy 10 phút
23
Màu trắng đục
Mùi dễ chịu
Dai
pH= 3-4
Sấy 20 phút
20
Màu trắng đục
Mùi dễ chịu
Dai
pH= 3-4
Sấy 40 phút
0
Màu trắng đục
Mùi dễ chịu
Dai
pH= 3-4
Sấy 60 phút
0
Màu trắng đục
Mùi dễ chịu
Dai
pH= 3-4
Sấy 70 phút
0
Màu trắng đục
Mùi dễ chịu
Kém dai
pH= 3-4
GVHD: Phương Phú Công
20
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
Vi khuẩn Acetobacyter xylinum sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ
25 – 350C. Khi sấy màng ở 600C , nhiệt độ cao sẽ làm biến đổi protein của
nguyên sinh chất, phá hủy màng tế bào, mọi hoạt động sống của vi sinh vật
đều bị ức chế. Ở thời gian 10 phút và 20 phút vi khuẩn trên màng vẫn còn
sống, sấy trong 40, 60 phút vi khuẩn trên màng đã bị khử, màng vô khuẩn,
màng dai, thầm hút tốt, màng trắng, mùi dễ chịu, ở 70 phút màng bị khô,
mỏng. Phương pháp này đơn giản, xử lý được nhiều màng cùng lúc, nhưng
pH màng còn axit. Như vậy màng sấy ở 600C là tốt nhất, màng dai, vô khuẩn,
độ ẩm thích hợp thuận lợi cho việc đóng gói và bảo quản..
Hình 3.4: Màng sau xử lý khi sấy 600C trong 60 phút và 40 phút
3.3.3. Phương pháp 3: Chiếu tia cực tím trong thời gian là 10,15, 20, 25, 30
phút ở khoảng cách từ màng cho đến đèn cực tím là 40 cm
Qua thực nghiệm tôi thu được kết quả như sau:
Bảng 3.3: Màng sau khi xử lý với thí nghiệm 3
Phương pháp xử lý
Kết quả
Số khuẩn lạc mọc
Đặc tính của màng
trên petri
Chiếu đèn tím trong 15
0
phút
GVHD: Phương Phú Công
Máu trắng đục
Mùi dễ chịu
21
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
Dai
pH=3-4
Chiếu đèn tím trong 20
0
Máu trắng đục
phút
Mùi dễ chịu
Dai
pH=3-4
Chiếu đèn tím trong 25
0
Máu trắng đục
phút
Mùi dễ chịu
Dai
pH=3-4
Theo bảng 4, khi chiếu đền cực tím lên màng ở thời gian là 10, 15, 20,
25, 30 phút thì khối lượng, độ dai, độ dày, màu sắc của màng không thay đổi,
vi khuẩn trên màng đều bị khử do tia uv gây ra những quá trình quang oxy
hóa trong nguyên sinh chất của tế bào, đặc biệt là tác động lên axit nucleic.
Dưới tác động của bức xạ này các phản ứng hóa học trong tế bào bị phá vỡ, vi
khuẩn Acetobacter xylinum bị tiêu diệt, màng vô khuẩn. Xử lý vi khuẩn trên
màng theo phương pháp này đơn giản, trong thời gian ngắn, nhưng không xử
lý nhiều màng cùng một lúc, màng còn axit.
a.
GVHD: Phương Phú Công
b.
22
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
c.
d.
Hình 3.5 : Màng sau khi khử khuẩn bằng đèn tím
a. màng sau khi khử khuẩn bằng đèn tím trong 10 phút
b. màng sau khi khử khuẩn bằng đèn tím trong 15 phút
c. màng sau khi khử khuẩn bằng đèn tím trong 20 phút
d. màng sau khi khử khuẩn bằng đèn tím trong 25 phút
3.3.4. Phương pháp 4: Ngâm cồn 960 trong vòng 6, 12, 24, 48 giờ.
Tôi tiến hành ngâm màng trong cồn 960 trong thời gian là 6, 12, 24,
48giờ. Kết quả được dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.4: Màng sau khi xử lý theo phương pháp 5
Phương pháp xử lý
Ngâm cồn trong 48h
Kết quả
0
Màu trắng đục
Mùi hắc
Dai
pH = 3-4
Qua bảng 5 tôi nhận thấy, màng sau khi ngâm cồn 960 trong các
khoảng thời gian khác nhau nhưng khối lượng màng, độ dai màu sắc của
màng trước và sau khi xử lý thay đổi hầu như không đáng kể, vẫn giữ được
đặc tính của màng.
Màng BC ngâm cồn 960 sau 6h, 12h, 24h đem kiểm tra vi khuẩn
Acetobacter xylinum trên màng, thấy trên hộp lồng vẫn xuất hiện khuẩn lạc
của vi khuẩn chứng tỏ rằng vi khuẩn trên màng vẫn chưa chết, màng chưa vô
khuẩn. Màng ngâm cồn 960 sau 48h, quan sát sát trên hộp lồng không thấy
xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn, màng đã vô khuẩn. Như vậy, màng ngâm cồn
GVHD: Phương Phú Công
23
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
K33C Khoa sinh - KTNN
sau 48h là hiệu quả nhất. Phương pháp này cũng khá tốn kém, thời gian khử
khuẩn dài, pH màng vẫn còn axit.
Hình 3.6: Màng sau khi khử khuẩn bằng cồn 960 trong 24h, 48h
3.3.5. Phương pháp 5: Sấy màng ở 600C trong 60 phút sau đó chiếu đèn
tím trong 10 phút
Màng sau khi sấy 600C trong 60 phút (thí nghiệm 2) thì màng vẫn dai,
sau 5 ngày màng vô khuẩn. Tuy nhiên, để đảm bảo màng vô khuẩn trong thời
gian dài trong quá trình bảo quản màng tôi tiến hành chiếu đèn tím lên màng
trong 10 phút (thí nghiệm 3) và thu được kết quả sau:
Bảng 3.5: Màng sau khi xử lý theo phương pháp 5
Đặc tính của màng
GVHD: Phương Phú Công
24
SV: Phí Thị Nụ
Khóa luận tốt nghiệp
GVHD: Phương Phú Công
K33C Khoa sinh - KTNN
25
SV: Phí Thị Nụ
