Nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến đậu cove TL1 ở giai đoạn nảy mầm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
**********

TRẦN THỊ BÍCH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁP
SUẤT THẨM THẤU ĐẾN ĐẬU COVE
TL1 Ở GIAI ĐOẠN NẢY MẦM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Người hướng dẫn khoa học:
PGS, TS NGUYỄN VĂN MÃ

HÀ NỘI 5/2011


LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy hướng
dẫn Khoa học PGS.TS Nguyễn Văn Mã đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy cô giáo trong khoa
Sinh - KTNN, trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao Công
nghệ, các Phòng, Ban trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho
em trong thời gian nghiên cứu.
Trong quá trình thực hiện do thời gian có hạn và bước đầu làm quen với
phương pháp nghiên cứu khoa học nên không tránh khỏi những thiếu xót, rất
mong được sự đóng góp của thầy cô giáo và các bạn sinh viên.
Em xin chân thành cảm ơn

Xuân Hòa, ngày....tháng......năm
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Bích Hương

ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi khẳng định kết quả nghiên cứu trong khóa luận tốt nghiệp nay:
* Là kết quả của tôi được thực hiện tại trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
* Hoàn toàn không trùng lặp sao chép kết quả của người khác

Xuân hòa, ngày....tháng......năm
Sinh viên

Trần Thị Bích Hương

iii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
atm:
NC:

atmosphere
nước cất

NXB:

nhà xuất bản

Ptt:

áp suất thẩm thấu

iv


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài...................................................................................... 1
2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu............................................................. 2
3.Ý nghĩa lí luận và thực tiễn........................................................................ 3
NỘI DUNG ................................................................................................. 4
Chương 1: Cơ sở lí luận của vấn đề nghiên cứu ....................................... 4
1.1 Quá trình nảy mầm ở thực vật và sự nảy mầm ở đậu cove...................... 4
1.1.1 Quá trình nảy mầm ở thực vật ............................................................. 4
1.1.2 Sự nảy mầm ở đậu cove....................................................................... 5
1.2 Prolin và vai trò của prolin ..................................................................... 6
1.3 Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đối với thực vật
nói chung và cây đậu cove nói riêng............................................................. 8
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu.................................. 10
1 Đối tượng nghiên cứu................................................................................ 10
2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 10
2.1 Phương pháp xác định các áp suất thẩm thấu.......................................... 10
2.2 Bố trí thí nghiệm .................................................................................... 10
2.3 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu ....................................... 11
2.3.1 Xác định tỷ lệ nảy mầm....................................................................... 11

2.3.2 Xác định chỉ tiêu sinh trưởng của mầm................................................ 11
2.3.3 Xác định khối lượng tươi, khô của mầm.............................................. 11
2.3.4 Xác định hoạt độ các enzyme .............................................................. 11
2.3.5 Xác định hàm lượng axit amin prolin .................................................. 14
2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 14
Chương 3: Kết quả nghiên cứu.................................................................. 15
3.1 Khả năng nảy mầm của đậu cove dưới tác động của áp suất thẩm thấu .. 15

v


3.2 Sinh trưởng thân rễ mầm đậu cove ......................................................... 16
3.2.1 Thân mầm ........................................................................................... 16
3.2.2 Rễ mầm ............................................................................................... 18
3.3 Khối lượng tươi, khô .............................................................................. 19
3.3.1 Khối lượng tươi ................................................................................... 20
3.3.2 Khối lượng khô.................................................................................... 21
3.4 Hàm lượng prolin ................................................................................... 23
3.5 Hoạt độ các enzyme ............................................................................... 25
3.5.1 Hoạt độ enzim lipaza ........................................................................... 25
3.5.2 Hoạt độ enzim amilaza ........................................................................ 26
3.5.3 Hoạt độ enzim proteaza ....................................................................... 28
KẾT LUẬN................................................................................................. 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 31

vi


PHẦN MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Đậu cove có tên khoa học là Phaseolus vulgaris (L.) thuộc họ Đậu
Leguminosae, Fabaceae. Đậu cove được trồng rộng rãi trên khắp thế giới, có
nguồn gốc từ Trung Mỹ và được trồng cách đây hơn 600 năm. Ở Châu Á, đậu
cove được sử dụng nhiều bởi nó có giá trị dinh dưỡng cao, là một trong những
loại rau giàu protein (khoảng 2,5% trong quả non), chất béo (khoảng 0,2%
quả non), chất đường bột (khoảng 7% quả non) [8]. Quả tươi giàu vitamin A
và C, có thể dùng ăn tươi, đóng hộp và đông lạnh. Ở một vài quốc gia Châu Á
như Ấn Độ, Miến Điện... sử dụng hạt khô của đậu cove trong các bữa ăn
kiêng. Đậu cove là một trong những loại rau màu thích nghi trong hệ thống
luân canh với lúa. Trong các loại đậu rau thì đậu cove quan trọng vào loại bậc
nhất vì được phân bố rộng khắp, sản lượng tương đối lớn và có tiềm năng như
là nguồn thu nhập với các nông hộ nhỏ. Bên cạnh việc đậu cove là nguồn
cung cấp vitamin và chất khoáng phong phú trong các loại thực phẩm hàng
ngày, chúng còn có tính chất cải tạo đất, góp phần tăng năng suất và chất
lượng các cây trồng khác.
Ngày nay, các nghiên cứu về khả năng chịu hạn của cây trồng nói chung,
đậu cove nói riêng ngày càng được mở rộng vì tính ứng dụng cao của cây
trồng họ Đậu. Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật các nhà khoa học có điều
kiện tìm hiểu về cơ chế sinh lý, sinh hóa chịu hạn của thực vật như sự ảnh
hưởng của điều kiện thiếu nước đến sự phát triển của hạt cây non, đến quá
trình quang hợp và hô hấp. Các cơ chế sinh hóa và sinh học phân tử cũng đã
được nghiên cứu như xác định vị trí của gen liên quan đến điều chỉnh áp suất
thẩm thấu, gen tổng hợp 1 số chất hình thành và tích lũy khi hạn hán như
prolin, nhóm amin bậc 4, một số đường…. Tuy vậy, để tìm hiểu rõ ảnh hưởng

1


của hạn hán và bản chất khả năng chịu hạn của đậu cove cần có những nghiên

cứu sâu hơn, đặc biệt là các nghiên cứu về sinh lý, sinh hóa của cây ở giai
đoạn nảy mầm trong điều kiện gây hạn… Áp suất thẩm thấu chính là nguyên
nhân gây sự chênh lệch giữa nồng độ muối khoáng trong và ngoài rễ cây làm
cho cây không thể hút được nước.
Để tăng năng suất đậu cove một trong những biện pháp là làm tăng khả
năng chống chịu của chúng với ngoại cảnh bằng cải tiến kĩ thuật, chọn tạo
giống mới hoặc lựa chọn nhiều nơi trồng có điều kiện ngoại cảnh thích hợp.
Vì vậy, cần tiến hành kĩ thuật nghiên cứu phản ứng của đậu cove trong các
điều kiện áp suất khác nhau để tìm được giới hạn chịu hạn của đậu cove và
điều kiện mà cây sinh trưởng tốt nhất từ đó tăng năng suất đậu cove.
Đã có một số tác giả nghiên cứu như Bùi Huy Thiện (1979), Nguyễn
Văn Mã, Chen T.H, Murata N (2002) , James A.Bunce [17], Finnegan [22]…
đã tìm hiểu ảnh hưởng của sự thiếu nước đến quang hợp, hô hấp, sinh trưởng
và đánh giá khả năng chịu hạn của thực vật.
Nghiên cứu về áp suất thẩm thấu và ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu lên
thực vật nói chung và đậu cove noi riêng là vô cùng cấp thiết nhưng lại chưa
được tiến hành một cách cụ thể. Xuất phát từ những lí do trên tôi lựa chọn và
tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến đậu cove
TL1 ở giai đoạn nảy mầm”
2. Mục tiêu và nhiệm nghiên cứu
2.1. Mục tiêu
Nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng mầm,
hàm lượng prolin và hoạt độ một số loại enzyme của hạt đậu cove nảy mầm .
2.2. Nhiệm vụ
Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng (tỉ lệ nảy mầm, chiều dài thân, rễ mầm,
khối lượng tươi, khô), hàm lượng prolin và hoạt độ một số loại enzim:

2

amilaza, lipaza và proteaza của mầm đậu cove được gieo trong dung dịch
đường có các áp suất thẩm thấu khác nhau.
3. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn.
Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung nguồn tài liệu về ảnh hưởng của
áp suất thẩm thấu đến sinh trưởng của đậu cove, giúp cho việc xác định nhanh
khả năng chống chịu của các giống đậu cove trên đất mặn.

3


NỘI DUNG
Chương 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Quá trình nảy mầm ở thực vật và sự nảy mầm ở đậu cove
1.1.1. Quá trình nảy mầm ở thực vật
Nảy mầm là giai đoạn đầu tiên của quá trình phát triển cá thể. Quá trình
nảy mầm diễn ra nhiều biến đổi sinh lí, sinh hóa trong hạt với tốc độ cao để
chuẩn bị cho sự hình thành một cây non mới.
Quá trình nảy mầm của hạt diễn ra bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau,
mỗi giai đoạn đều có những đặc điểm sinh lí, sinh hóa đặc trưng. Gồm các
pha:
- Pha trương hạt: khi bắt đầu nảy mầm hạt hút nước rất mạnh làm cho
hạt trương lên.
- Pha hình thành và hoạt hóa enzyme: trong hạt có một lượng enzyme
nhất định nhưng chủ yếu ở dạng liên kết. Do vậy không có hoạt tính, khi hoạt
hóa bởi nước, enzyme được giải phóng ở dạng tự do bắt đầu hoạt động mạnh.
- Tích lũy dinh dưỡng: ngay những phút ngâm nước đầu tiên cường độ
hấp thụ oxi của hạt tăng lên, đặc biệt là chu trình hexozmonophotphat tăng lên
nhiều lần, do vậy lượng ATP tích lũy nhiều.
- Động viên chất dinh dưỡng và xác định các chất hữu cơ đặc trưng cho

cơ thể trong giai đoạn nảy mầm: các chất dự trữ trong hạt chủ yếu phụ thuộc 3
nhóm chất hữu cơ: gluxit, protein, lipit. Trong quá trình nảy mầm enzyme  amylaza tác động vào liên kết 1,4 – gluxit của phân tử tinh bột làm phân giải
tinh bột thành các dextrin tham gia vào quá trình hô hấp và ở dạng xaccarozo
tích lũy ở các tế bào phụ phôi. Protein được phân giải bởi enzyme proteza
thành các axit amin và amit. Phần lớn các axit amin tạo thành được chuyển
vào phụ phôi để tổng hợp các phân tử protein đặc trưng cho cơ thể.

4


- Sinh trưởng của phôi: khi hạt nảy mầm phôi bắt đấu sinh trưởng. Đầu
tiên rễ mầm nhô ra để cố định cây và hút nước, thức ăn hòa tan. Trụ dưới lá
mầm duỗi ra trước khi mầm cành bắt đầu sinh trưởng và tạo cành.
Sự sinh trưởng tiếp theo của mầm: gồm 2 kiểu sinh trưởng
- Sinh trưởng trên bề mặt đất (thường gặp ở cây 2 lá mầm): các lá mầm
được đẩy lên mặt đất nhờ trụ dưới lá mầm.
- Sinh trưởng dưới mặt đất (thường gặp ở cây 1 lá mầm): sự nảy mầm
của hạt bắt đầu từ sự sinh trưởng của bao rễ và sự nhú rễ cái. Sau đó, bao lá
mầm sinh trưởng đẩy chồi lên mặt đất. Tiếp theo là lá thứ nhất bên trong bao
lá mầm nhô ra ngoài. Cuối cùng đỉnh cành bắt đầu sinh trưởng.
1.1.2. Sự nảy mầm ở hạt đậu cove
Đậu cove thuộc cây 2 lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các đặc trưng
của cây hai lá mầm. Ở giai đoạn đầu của thời kì nảy mầm, trong hạt quá trình
sinh lí, sinh hóa diễn ra mạnh giống như quá trình nảy mầm của hạt nói
chung.
Sự nảy mầm của hạt đậu cove cũng bắt đầu bằng sự hấp thụ nước nhờ cơ
chế hút trương của hạt làm hạt trương lên, rễ mọc ra, thân vươn lên đội 2 lá
mầm lên khỏi mặt đất, lá mầm xòe ra, thân mầm tiếp tục phát triển thành thân
chính. Trong giai đoạn này, cây con sống chủ yếu vào nguồn chất dinh dưỡng
dự trữ ở trong 2 lá mầm, đến khi hết chất dinh dưỡng các lá mầm chuyển sang

màu vàng rồi rụng và đồng thời cũng là lúc mà bộ rễ phát triển đủ khả năng
hút nước và chất dinh dưỡng từ đất lên để nuôi cây.
Giai đoạn này dài hay ngắn tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh. Nếu gieo
vào vụ hè thì giai đoạn này ngắn hơn vụ đông. Thông thường thời gian này
khoảng 5 – 10 ngày sau khi gieo. Thời kì này chính là thời kì quyết định mật
độ cây con cũng như sức sinh trưởng của cây đậu cove sau này.

5


1.2. Prolin và vai trò prolin
Prolin hay pirolidin cacboxylic là một amoniaxit ưa nước có công thức
phân tử C5H9NO2. Trong phân tử prolin có chứa vòng pirolidin được tạo
thành do sự kết hợp của nhóm amin bậc 1 ở Cα với cacbon ở mạch bên.
Tỷ lệ prolin trong cây được điều khiển bởi enzyme P5CS (delta 1 –
pyrrolin – 5 – cacboxylat synthetaza) và enzyme phân giải PDH (prolin
dehydrogennaza) [8]. Prolin được tổng hợp từ glutamine. Quá trình này được
kích thích bởi axit Abxixic và stress về thiếu nước[14]. Hiện nay con đường
tổng hợp prolin đã được mô tả khá đầy đủ, nhưng sự phân giải prolin mới chỉ
được hiểu biết rất ít[15].
Prolin thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu, chúng có khối lượng
phân tử nhỏ. Ngoài ra còn có nhóm hợp chất các amon bậc 4 (glyxinebetain,
prolinbetain, beta – alaninbetain và choline – oxy – sulfat) và nhóm hợp chất
3 – dimethylsunfulfonio propionate (DMSP) cũng là nhóm có khả năng tạo áp
suất thẩm thấu cao [23]. Nhóm hợp chất amin bậc 4 và DMSP đều là dẫn xuất
của các tiền chất là axit amin. Các hợp chất trên cùng có chung tính chất
không tích điện ở pH trung tính (như các ion vô cơ) và có khả năng tan tốt
trong nước, không độc khi tập trung với nồng độ cao và làm ổn định cấu trúc
các đại phân tử protein, giúp thành tế bào chống lại ảnh hưởng làm biến tính
của sự tập trung muối cao và các chất hòa tan khác có hại cho tế bào… [23].

Sự tích lũy các chất đó có ý nghĩa rất quan trọng, bởi vì chúng đóng vai trò
nòng cốt trong việc duy trì sức trương của tế bào và hấp thụ nước ngược
gradient nồng độ dưới tác động của stress.
Như vậy, vai trò của prolin chống chịu stress nước ở thực vật thể hiện:
prolin tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của nội bào và tham gia cấu trúc
bảo vệ màng và protein.

6


Khi nghiên cứu chức năng của prolin, Nanjo và cộng sự đã phát hiện:
những cây bị đột biến về hình dạng (có sự bất thường về biểu bì, tế bào mô
mềm và hệ mạch) có hàm lượng P5CS thấp, rất mẫn cảm với áp lực thẩm
thấu. Nhưng nhũng sự biến đổi kiểu hình đó có thể ức chế được bằng cách
tăng cường hàm lượng prolin ngoại bào [3].
Theo Wyn Jones (1977) những chất được coi là tác nhân cạnh tranh thẩm
thấu, trong đó đáng kể nhất là prolin, được xem như đóng vai trò chủ đạo
trong việc thích ứng thẩm thấu tế bào chất thực vật, nhằm phản ứng lại áp lực
thẩm thấu. Khi bị tác động bởi áp suất thẩm thấu thì sự tích lũy prolin có thể
tăng từ 10 – 100 lần [22].
Nhiều kết quả nghiên cứu khác cũng cho thấy sự tích lũy prolin là một
phản ứng thông thường của thức vật sống ở nơi có nồng độ muối cao (Stewort
và Lee 1974; Treichel 1975; Briens và Larther 1982) và trong mô lá, mô phân
sinh chồi của thực vật chịu áp lực nước (Barnet và Taylor 1996; Baggess
1976), trong vùng đỉnh của thực vật sống ở nơi có thế năng nước thấp (Voet
Berg và Shorp 1991) [27].
Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng prolin và axit Abxixic của những đối
tượng mẫn cảm và chống chịu điều kiện áp suất thẩm thấu Zheng Yi - Zhi và
Litian cũng khẳng định rằng: phản ứng với áp lực nước và nồng độ muối cao,
cây đậu cove tích lũy hàm lượng prolin cao, đó được xem như phản ứng thích

nghi với điều kiện khô hạn [33].
Theo những cách thức khác nhau, những nghiên cứu ứng dụng công
nghệ gen với tính chống chịu các điều kiện bất lợi về nước, đang tập trung
vào nhóm gen thuộc chu trình tổng hợp prolin. Các gen này mã hóa cho
enzyme P5CS và P5CR (gen tham gia vào quá trình tổng hợp prolin) đã được
Kishor chuyển thành công vào thuốc lá và nhận kết quả tốt, lượng prolin tăng
từ 8 - 10 lần so với cây đối chứng [23].

7


1.3. Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đối với
thực vật nói chung và cây đậu cove nói riêng
Trong vài năm gần đây, thời tiết diễn ra bất thường đã gây ra tác động
không nhỏ đối với trồng trọt, đặc biệt là hạn hán và sự xâm nhập của nước
biển làm diện tích đất nông nghiệp bị thu hẹp. Theo đánh giá của ngân hàng
thế giới năm 2007, Việt Nam sẽ là một trong 5 nước chịu ảnh hưởng nghiêm
trọng của biến đổi khí hậu do Trái Đất nóng lên. Nước biển dâng lên 1m sẽ có
2.983km2 đất bị ngập, diện tích đất mặn ngày càng tăng. Nghiên cứu ảnh
hưởng của áp suất thẩm thấu đối với thực vật để tìm ra loại cây trồng phù hợp
cho những vùng đất nhiễm mặn là một yêu cầu cấp thiết. Những nghiên cứu
có liên quan đến áp suất thẩm thấu đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế
giới với nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có cây đậu cove.
Trên thế giới, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học – kĩ thuật, đã có
nhiều công trình nghiên cứu về tính chịu nóng của thực vật như nghiên cứu
của các tác giả: Bate L.S. (1973)[15]; Bernet N.M., Naylor A.W(1996)[16],
Gerenet J và cộng sự(2005)[18], Xiao B., Yhuang, Ntang(2007)[31], Zhao SH
và cộng sự(2000)[32],…nghiên cứu về tình hình chịu hạn, chịu mặn và chịu
lạnh ở lúa,láu mì và thực vật nói chung.
Về đậu tương cũng có một số tác giả nghiên cứu như Whitsitt và cộng sự

(1997) [30] đã cho thấy lượng nước mất trên 60% thì đậu tương vẫn có thể
phục hồi được. Những nghiên cứu của Matra N, Cushman J.C (1994) [24]…
đã nhận thấy rằng cDNA của đehydrin từ lá đậu tương mất nước bị phân lập,
đehydrin là một trong những LEA (late embryogenesis abundant protein) với
chức năng bảo vệ tế bào khi mất nước. Sheila A.Blackman và cộng sự (1992)
[28] đã nghiên cứu protein sốc nhiệt HSP (heat shock protein) trong phôi
mầm hạt đậu tương đang chín ở điều kiện bình thường và áp suất thẩm thấu
cao. Kết quả nghiên cứu đã khẳng định HSP đã tăng lên trong quá trình hình

8


thành hạt và giảm khi nảy mầm. HSP hỗ trợ bảo vệ tế bào vào thời điểm
oligosacarit chưa được tổng hợp để hỗ trợ tế bào thực hiện chức năng.
Fernando E.P. và cộng sự (2000)[17] đã nghiên cứu ảnh hưởng của muối trên
hạt đậu tương nảy mầm…
Ở Việt Nam, diện tích và năng suất đậu cove chưa cao do tập quán canh
tác, điều kiện tự nhiên, biện pháp kĩ thuật. So với bình quân của thế giới, năng
suất đậu cove khá ổn định ở Việt Nam.
Nghiên cứu tính chống chịu của cây trồng có ở Việt Nam được tiến hành
sâu rộng ở các đối tượng lúa, đậu tương, thuốc lá, nhãn… [1], [4], [8], [9]
trong đó đậu tương là cây trồng được chú trọng khá nhiều. Chẳng hạn như:
nghiên cứu đặc điểm di truyền và khả năng chịu hạn ở con lai F1 (Nguyễn
Huy Hoàng) [4], nghiên cứu mối quan hệ giữa tính chịu hạn với thành phần
điện di protein của đậu tương (Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải) [5], sự
biến đổi của hoạt độ enzyme protein, amilaza và hàm lượng prolin của đậu
tương khi gặp hạn ở thời kì ra hoa (Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn
Mã)… Các kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất và chọn tạo
được nhiều giống cây trồng mới có năng suất cao, phẩm chất tốt phù hợp với
điều kiện khí hậu và canh tác ở Việt Nam.

Tại trung tâm nghiên cứu và thực nghiệm đậu đỗ, viện Khoa học Kĩ
thuật Nông nghiệp Việt Nam, nhiều giống đậu tương nhập nội và giống địa
phương đã được đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng bằng một số biện
pháp: cho hạt nảy mầm trong dung dịch đường sacarozo, hoặc nhiệt độ cao
của trên 1000 giống nhập nội đã phân lập được 185 mẫu giống có khả năng
chịu hạn trồng vụ đông xuân, 68 mẫu chịu hạn tổng hợp, 65 mẫu giống chịu
nóng khá, 14 mẫu giống vừa chịu nóng vừa chịu hạn tốt và vừa có nhiều đặc
tính kinh tế quan trọng khác [4].

9


Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: giống đậu cove TL1 do viện Rau quả TW cung
cấp. Đậu cove TL1 có thời gian sinh trưởng ngắn (55 - 60 ngày), phù hợp
trồng thuần, đây là giống thân leo nên khi trồng cần làm giàn. Cây cao 1 - 2m,
sinh trưởng hữu hạn, trái sai, màu xanh mỡ, giòn ngọt, thích nghi rộng và
năng suất cao [34].
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Phương pháp xác định các áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu được xác định theo phản ứng của Schardakov và
Grodzinski (1982) và tính giá trị bằng phương trình Van - Hoff
Ptt = i.C.R.T
Trong đó: Ptt là áp suất thẩm thấu; C là nồng độ đường; R = 0,082; T là
nhiệt độ tuyệt đối (T = 273 + t); i = 1 +  (n-1).
Thí nghiệm thăm dò: chúng tôi tiến hành thử khả năng nảy mầm của đậu
cove ở các áp suất thẩm thấu khác nhau. Kết quả thử nghiệm cho thấy đậu
cove có thể nảy mầm ở môi trường có áp suất từ 1- 9 atm, khi áp suất thẩm

thấu > 10 atm thì đậu cove không có khả năng nảy mầm nữa. Trên cơ sở đó,
chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu sự sinh trưởng, hoạt độ một số
enzyme và prolin của đậu cove nảy mầm trong dung dịch đường ở các áp suất
1 atm, 3 atm, 5 atm, 7 atm, 9 atm.
2.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và
Chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Để xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, tiến hành thí nghiệm gieo hạt trong
dung dịch đường theo phương pháp xác định khả năng chịu hạn của Volcaca.

10


+ Chọn giống đều, khỏe, khử trùng khay, bình…. Giấy lọc được sấy ở
1300C trong vòng 1 giờ, hạt được khử trùng bằng dung dịch KMnO4 1% trong
5 phút.
+ Gieo trên khay có giấy thấm, chia thành 2 phần:
Phần 1 (P1): cho hạt nảy mầm trong nước cất (lô đối chứng); Phần 2
(P2): cho hạt nảy mầm trong dung dịch đường Sacarozo với áp suất thẩm thấu
1 atm, 3 atm, 5 atm, 7 atm, 9 atm, 11 atm.
Hạt nảy mầm trong dung dịch đường dễ bị nhiễm nấm nên cần bổ sung
thêm kháng sinh nistatin 1/2 viên trong 1/2l. Hàng ngày bổ sung nước cất
hoặc dung dịch đường ở các lô như nhau.
2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
2.3.1. Xác định tỷ lệ nảy mầm
Những hạt nảy mầm là những hạt có chiều dài rễ mầm đạt từ 3mm trở
a
b

lên [29], tỷ lệ nảy mầm theo công thức: P=  100%

Trong đó: P là tỉ lệ nảy mầm của hạt, a là số hạt nảy mầm trong lô thí
nghiệm, b là số hạt nảy mầm trong lô đối chứng.
2.3.2. Xác định chỉ tiêu sinh trưởng của mầm
Chiều dài thân mầm, rễ mầm (mm): sử dụng thước đo chia đơn vị đến
mm để đo chiều dài thân, rễ mầm vào các ngày 2, 4 và 6 sau khi hạt nảy mầm.
2.3.3. Xác định khối lượng tươi, khô của mầm
Cân khối lượng tươi của mầm bằng cân phân tích Sartorius.
Cân khối lượng khô của mầm: Rửa mầm bằng nước cất sau đó sấy trong
3 giờ ở nhiệt độ 1050 C.
2.3.4. Xác định hoạt độ các enzyme
* Xác định hoạt độ enzyme lipaza: Xác định hoạt độ enzyme lipaza
theo Nguyễn Văn Mùi [15].

11


+ Hóa chất: Đệm axetat pH = 4,7, cồn 96%, toluene, dung dịch NaOH
0,1N, thuốc chỉ thị màu tymolphtalein hoặc phonolphtalein 1
+ Tiến hành: Cân 5g hạt nghiền nhỏ thành dạng đổng thể chuyển vào
bình nón 100ml cho thêm 10ml nước cất lắc đều. Cho thêm 1ml dầu lạc làm
cơ chất và 5ml dung dịch đệm axetat pH = 4,7 với vài giọt toluen. Trộn đều
hỗn hợp và cho vào tủ ấm 30oC trong 20 - 24h. Bình kiểm tra phải đun sôi
dịch enzyme 3-5 phút để làm mất hoạt động của enzyme trước khi cho tiếp
xúc với cơ chất. Sau khi ngừng phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96% và
15-25ml ete, lắc đều, để lắng. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N và 0,5ml
chỉ thị màu tymolphtalein 1%.
Tính kết quả: X=

a  b . f .10
w

Trong đó: X là hoạt độ enzyme lipaza; a là số ml NaOH 0,1N dùng để
chuẩn độ bình thí nghiệm; b là số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình đối
chứng; f là hệ số chỉnh lí NaOH 0,1N; w là khối lượng hạt.
* Xác định hoạt độ enzyme α - amilaza
+ Hóa chất: Dung dịch NaCl 0,1%, dung dịch enzyme, tinh bột 1%, dung
dich iot 0,02.
+ Tiến hành: Chuẩn bị 10 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 10ml dung dịch
NaCl 0,1%. Thêm vào ống thứ nhất 1ml dung dịch enzyme lắc đều, lấy 1ml
chuyển sang ống thứ 2, lắc đều và chuyển sang ống 3, tiếp tục như vậy cho
đến ống 10, lấy 1ml ống 10 bỏ đi. Cho vào mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột
1% lắc đều giữ ở 30oC trong 30 phút. Sau đó lấy ra làm lạnh, cho vào mỗi ống
một giọt dung dịch I2 0,02N. Ghi ống có độ pha loãng lớn nhất mà có khả
năng phân giải tinh bột.
+ Kết quả: X = 2.2n

12


Trong đó: X là hoạt độ của enzyme amilaza trong 1ml dung dịch
enzyme; n là ống nghiệm thứ n.
* Xác định hoạt độ enzyme proteaza
+ Hóa chất: Dung dịch KH2PO4 0,1N, axit triloaxetic 10% (CCl3COOH),
dung dịch protein 5%, thuốc chỉ thị màu tymolphtalein 1%, dung dich lọc
foocmandehit, dung dịch NaOH 0,2N
+ Tiến hành: Lấy 2 bình nón, cho vào mỗi bình 2g hạt đã nảy mầm
nghiền nát và 10ml KH2PO4 0,1N. Lắc nhẹ để tạo môi trường pH thích hợp
với hoạt độ của proteaza có trong hạt đã nảy mầm. Thêm vào bình 1 (bình đối
chứng) 10ml axit triloaxetic để kìm hãm hoạt dộ của enzyme. Cho vào mỗi
bình 2ml dung dịch protein 5%. Đặt 2 bình trong tủ ấm 37oC, thời gian 1 giờ.

Sau đó thêm vào bình 2 10ml axit triloaxetic 10% để kìm hãm hoạt độ của
enzyme, kết thúc quá trình thủy phân protein. Dùng ống đong đo dung dịch
mẫu (V), lọc dung dịch trong từng bình, đo lại dung tích dịch lọc, chuyển
sang các bình thí nghiệm (bình 2) và bình đối chứng (bình 1). Thêm vào mỗi
bình chứa dịch lọc 10ml foocmandehit và 5 giọt tymolphtalein để làm chất chỉ
thị màu. Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N đến khi xuất hiện màu mực
xanh cửu long là được.



+ Tính kết quả: X= V 2

 V 1.2,82.V . f

g.V

3

Trong đó: X là hàm lượng nitoamin trong mấu nghiên cứu (mg); V1 là
số ml NaOH 0,2N chuẩn độ ở bình đối chứng; V2 là số ml NaOH 0,2N chuẩn
độ ở bình thí nghiệm; V3 là số ml dung dịch lọc đem chuẩn độ V là số ml
dung dịch mẫu, g: khối lượng mẫu đem phân tích, f: hệ số điều chỉnh nồng độ
NaOH 0,2N.

13


2.3.5. Xác định hàm lượng axit amin prolin
Xác định theo phương pháp của Bates và cộng sự [15].
Lấy mỗi mẫu 0,5g nghiền nhỏ. Thêm 10ml dung dịch sulfosalysitic,

quay li tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, lọc lấy dung dịch. Lấy
2ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml axit axetic và 2ml dung dịch
nynhidrin, ủ trong nước nóng 100oC trong 1 giờ, sau đó ủ đá 5 phút. Lấy 2ml
dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml axit axetic và 2ml dung dịch nynhidrin, ủ
trong nước nóng 100oC trong 1 giờ, sau đó ủ đá 5 phút. Sau đó bổ sung vào
bình phản ứng 4ml toluene, lắc đều, lấy phần dung dịch màu hồng ở trên đem
đo mật độ quang học ở bước sóng 520nm trên máy so màu.
Nồng độ axit amin prolin được tính theo công thức:
Y= 1,4083 × X + 0,014

A=

Y.V
P

Trong đó: Y là nồng độ prolin được tính bằng (mg/l); X là giá trị mật độ
quang học OD được đo ở bước sóng 520nm; A là hàm lượng prolin; V là thể
tích dịch chiết; P là khối lượng mẫu.
2.3.6. Phương pháp xử lí số liệu

X
X 

;

n

n  30);

m=


n



2



 X X


; m% =

n 1



2

(nếu n < 30);

m  100
; md =
X



2



 X X

n



2

(nếu

m  m 
2

2

1

2

Trong đó: X là giá trị trung bình số học; m% là độ chính xác của thí
nghiệm; n là số lần nhắc lại; md là sai số của hiệu các trung bình số học; δ là
độ lệch chuẩn; m là sai số trung bình số học.

14


Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Khả năng nảy mầm của đậu cove dưới tác động của áp suất
thẩm thấu
Nảy mầm là chu trình sinh lí quan trọng trong chu kì sinh trưởng và phát
triển của thực vật nói chung và của đậu cove nói riêng, đảm bảo duy trì sự
sống, tạo cơ sở ban đầu cho một cơ thể mới.
Khi gieo hạt trong dung dịch đường sacarozo có áp suất thẩm thấu cao,
những hạt nảy mầm được là do chúng có khả năng hút nước lớn hơn sức hút
của môi trường.
Tỷ lệ nảy mầm của hạt ở 4 ngày đầu được thể hiện qua bảng 1, hình 1.
Bảng 1. Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu cove TL1
Đơn vị: hạt/mẫu
Mẫu
NC
1atm

3atm

5atm

7atm

9atm

Số hạt nảy mầm
Tỉ lệ (%)
Số hạt nảy mầm
Tỉ lệ (%)
Số hạt nảy mầm

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

9,33  2,52 21,67  2,08 30,00  0,00 30,00  0,00
6,67  1,53 19,67  2,52 30,00  0,00 30,00  0,00
71,49

90,77

100

100

3,00  1,00 15,67  3,51 30,00  0,00 30,00  0,00
32.15

72,31

100

100

1,67  0,58 10,67  1,53 28,67  1,53 29,00  1,00

Tỉ lệ (%)

18

49,23

Số hạt nảy mầm

1,33  0,58

6,67  1,53

Tỉ lệ (%)

14,26

30,78

60

73,33

Số hạt nảy mầm

0,33  0,58

1,33  0,58

5,67  2,52

17,33  1,53

Tỉ lệ (%)

3,54

6,13

18,90

57,77

15

95,57

96,67

18,00  1,00 22,00  1,00


Khi áp suất thẩm thấu tăng từ 1atm đến 9atm thì tỷ lệ nảy mầm của hạt
đậu giảm và luôn ít hơn so với gieo hạt ở nước cất.
Hạt chỉ nảy mầm mạnh từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 3, sang ngày thứ 4
số hạt nảy mầm mới rất ít, các hạt chưa nảy mầm có lớp dịch nhầy bao quanh
và bắt đầu có dấu hiệu bị hỏng.
Hạt nảy mầm tới áp suất thẩm thấu 9atm.

Tỉ lệ nảy mầm
Số hạt
35

30
25
20
15
10
5
0
NC

Ngày 1
Ngày 2
Ngày 3
Ngày 4
Ptt
1

3

5

7

9

Hình 1. Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu cove TL1
3.2. Sinh trưởng thân, rễ mầm
3.2.1. Thân mầm
Tiến hành đo chiều dài thân mầm vào các ngày 2, 4 và ngày 6 sau khi hạt
nảy mầm. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 2, hình 2.

16


Bảng 2. Chiều dài thân mầm
Đơn vị: mm
Ptt

Ngày 2

Ngày 4

Ngày 6

NC

45,76  0,97e

64,48  0,74f

109,47  0,85g

1atm

37,89  0,44d

98,51  0,59g

130,13  0,76h

3atm

26,99  0,65c

67,52  0,89f

98,62  0,69g

5atm

22,45  1,1b

39,64  0,46d

48,58  0,88e

7atm

17,75  0,76b

34,87  0,83c

42,41  0,55c

9atm

12,32  0,5a

22,45  0,49b

35,66  0,64d

(Ghi chú: a, b, c, d, e, f, g, h thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ
tin cậy  = 0,05).
Thân mầm
mm
140
120
100
Ngày 2

80

Ngày 4

60

Ngày 6

40
20
Ptt

0
NC

1atm

3atm

5atm

7atm

9atm

Hình 2. Chiều dài thân mầm đậu cove
Kết quả bảng 2 cho thấy: trong cùng một ngày, khi áp suất tăng lên sự
sinh trưởng của thân mầm có xu hướng giảm xuống. Áp suất càng cao thì sinh

17


trưởng của rễ càng chậm. Ở áp suất thẩm thấu cao làm kìm hãm quá trình hút
nước của hạt làm giảm khả năng sinh trưởng của thân mầm.
Như vậy, trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao sự sinh trưởng của
thân mầm gặp nhiều khó khăn nên sự gia tăng chiều dài của thân mầm bị hạn
chế và sự kìm hãm này tỉ lệ thuận với sự gia tăng áp suất thẩm thấu.
3.2.2. Rễ mầm
Tiến hành đo chiều dài rễ mầm vào các ngày 2, 4 và ngày 6 sau khi hạt
nảy mầm. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3, hình 3.
Bảng 3. chiều dài rễ mầm
Đơn vị:mm
Ptt

Ngày 2

Ngày 4

Ngày 6

NC

86,84  0,72b

97,46  1,10c

109,47  0,55d

1atm

114,22  0,71d

126,22  0,41e

130,13  0,51a

3atm

92,52  0,46c

115,32  0,54d

121,62  0,64e

5atm

73,36  0,63b

98,22  0,39c

102,58  1,20d

7atm

49,70  0,53a

59,17  0,95b

73,41  0,88b

9atm

26,28  1.09a

31,59  0,74a

38,66  0,81a

(Ghi chú: a, b, c, d, e thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy
 =0,05).

18


Rễ mầm
mm
140
120
100
Ngày 2

80

Ngày 4

60

Ngày 6

40
20
Ptt

0
NC

1atm

3atm

5atm

7atm

9atm

Hình 3. chiều dài rễ mầm đậu cove
Kết quả bảng 3 cho thấy: chiều dài rễ mầm tăng nhanh khi áp suất thẩm
thấu thấp.
Trong điều kiện áp suất thẩm thấu thì chiều dài rễ mầm tăng dần theo

thời gian. Ở áp suất thẩm thấu càng thấp thì chiều dài rễ mầm tăng càng
nhanh theo thời gian.
Như vậy, áp suất thẩm thấu cao đã kìm hãm sự sinh trưởng của rễ mầm.
Sự sinh trưởng của rễ mầm tạo điều kiện tốt tăng cường khả năng hút nước
của mầm chống chịu với điều kiện ngoại cảnh khắc nghiệt.
3.3. Khối lượng tươi, khô
Trong quá trình nảy mầm của hạt, nước giữ vai trò đặc biệt quan trọng,
là tác nhân hoạt hóa enzym thủy phân và cũng là môi trường tham gia vào quá
trình phân giải chất trung gian phục vụ cho việc tổng hợp mới chất hữu cơ,
cung cấp năng lượng kiến tạo tế bào và mô.

19