Nghiên cứu khả năng thấm hút của màng BC được tạo ra từ acetobacter

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
**************

NGUYỄN THỊ THƠM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
THẤM HÚT CỦA MÀNG BC TỪ
ACETOBACTER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học
ThS. Nguyễn Khắc Thanh

HÀ NỘI - 2011
Nguyễn Thị Thơm

i

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu khoa học này em đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của Th.S Nguyễn Khắc Thanh cùng các thầy
cô bộ môn vi sinh, Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ quý báu của thầy cô. Đồng
thơi em cũng xin chân thành cảm ơn Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 đã tạo điều kiện cho em tìm thông tin phục vụ cho nghiên cứu và hoàn
thành đề tài này

Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2011
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thơm

Nguyễn Thị Thơm

ii

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi, đề tài
nghiên cứu này không trùng với đề tài nghiên cứu nào khác
Đề tài của tôi có trích dẫn một số nội dung của một số tác giả khác để

bổ sung cho khóa luận của mình. Tôi xin phép và trân trọng cảm ơn.

Sinh viên

Nguyễn Thị Thơm

Nguyễn Thị Thơm

iii

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BC

: Bacterial cellulose

MC

: Microbial cellulose

S – BC

: Static Bacterial cellulose

CFU

: Colony Forming Unit

cs

: Cộng sự

Nguyễn Thị Thơm

iv

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU
Bảng 1.1: Phân loại các nhóm vi khuẩn Aceticd theo Pastuer (1950) .............6
Bảng 1.2: Đặc điểm sinh hóa của chủng Acetobacter xylinum
theo Pastuer (1950) ........................................................................................9
Bảng 2: Các bước xử lý màng BC ..................................................................22
Bảng 3.1: Lượng nước hút được của màng BC theo thời gian ........................28
Bảng 3.2: Lượng dịch nghệ hút được của màng BC theo thời gian.................29
Bảng 3.3: Lượng Berberin hút được của màng BC theo thời gian...................30

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Lượng nước hút được của màng BC theo thời gian .................... 28
Biểu đồ 3.2: Lượng dịch nghệ hút được của màng BC theo thời gian............. 29
Biểu đồ 3.3: Lượng Berberin hút được của màng BC theo thời gian .............. 30

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật ......................................... 10
Hình 1.2: Qúa trình tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum .... 13
Hình 3.1: Kết quả nhuộm Gram của Acetobacter xylinum BHN2 ............................... 25
Hình 3.2: Khuẩn lạc của Acetobacter xylinum BHN2
trên môi trường thạch đĩa ............................................................................... 26
Hình 3.3: Màng BC sinh ra từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 ....................... 26

Nguyễn Thị Thơm

v

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
Phần 1: MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài........................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài .....................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................2
4. Ý nghĩa của đề tài.......................................................................................2
Phần 2: NỘI DUNG

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1

Phân loại vi khuẩn Acetobacter ............................................................3
1.1.1 Các tiêu chí phân loại Acetobacter...............................................3
1.1.2 Lược sử phân loại Acetobacter ....................................................3
1.1.3 Vi khuẩn Acetobacter ..................................................................6

1.2

Vị trí và đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter xylinum ..........................8
1.2.1 Vị trí............................................................................................8
1.2.2 Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum .....................................8
1.2.3 Qúa trình tổng hợp cellulose của màng Bacterial cellulose ở vi
khuẩn Acetobacter xylinum..................................................................10

1.3

Ứng dụng của màng BC .......................................................................14
1.3.1 Ứng dụng trong một số lĩnh vực ..................................................14
1.3.2 Ứng dụng trong điều trị bỏng.......................................................14

1.4

Tình hình nghiên cứu khả năng hấp thụ các chất lên màng BC .............16

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu..................................................................18
2.1.1 Giống ..........................................................................................18
2.1.2 Hóa chất và thiết bị......................................................................18

2.1.3 Môi trường ..................................................................................18
2.2 Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................19

Nguyễn Thị Thơm

vi

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

2.2.1 Phương pháp vi sinh ....................................................................19
2.2.2 Phương pháp hóa sinh .................................................................21
2.2.3 Phương pháp xử lý màng BC từ Acetobacter xylinum.................22
2.2.4 Phương pháp vật lý......................................................................23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát một số đặc tính của chủng Acetobacter xylinum........................25
3.1.1 Hình thái và tế bào học ..........................................................................25
3.1.2 Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa .........................................25
3.1.3 Sinh trưởng trên môi trường lỏng ................................................26
3.2 Khảo sát một số đặc tính của màng BC ....................................................27
3.2.1 Khả năng thấm hút của màng ......................................................27
3.2.2 Khả năng ngăn cản một số vi sinh vật của màng..........................30
Phần 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................33

Nguyễn Thị Thơm

vii

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Màng BC (Bacterial cellulose) là một sản phẩm tự nhiên được tổng hợp
từ một số loại vi khuẩn khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng. Hầu hết các
nghiên cứu đều chỉ ra rằng Acetobacter là loài vi khuẩn tổng hợp màng BC có
hiệu quả cao nhất [8].
BC có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học cao, khả
năng hấp thụ nước lớn, khẳ năng polyme hóa và trạng thái kết tinh lớn...Vì
vậy, BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong nhiều lĩnh vực công nghệ.
Như trong công nghệ thực phẩm BC để sản xuất thạch dừa, màng bảo quản
thực phẩm. Trong công nghiệp giấy, màng BC để sản xuất giấy chất lượng
cao, màng lọc nước công nghệ môi trường… Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng
BC dùng làm mặt nạ dưỡng da. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, BC bước đầu
nghiên cứu làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay thế ra tạm thời, mạch máu
nhân tạo…
Hiện nay ở Việt Nam những nghiên cứu sản xuất và sử dụng màng BC
mới chỉ được quan tâm vài năm gần đây và mới đạt được kết quả bước đầu
Màng BC có thể hoàn toàn sản xuất trong nước bằng phương pháp lên men
tĩnh của vi khuẩn Acetobacter trong môi trường lỏng. Hiện nay, việc nghiên
cứu và ứng dụng màng BC trị bỏng ở nước ta là một vấn đề mới mẻ, gần đây

có một số ít các nghiên cứu về tạo màng BC dùng trị bỏng [7].
Xuất phát từ thực tiễn về nhu cầu sử dụng màng BC dùng trị bỏng
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu khả năng thấm hút của
màng BC được tạo ra từ vi khuẩn Acetobacter ”.

Nguyễn Thị Thơm

1

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

2. Mục đích của đề tài
Màng BC ứng dụng trong trị bỏng có khả năng thấm hút dịch rỉ vết
thương nhưng vẫn giữ cho vết thương có độ ẩm nhất định để tạo điều kiện tái
sinh mô.
3. Nội dung nghiên cứu
_ Tạo màng BC từ chủng Acetobacter
_ Nghiên cứu khả năng thấm hút nước, dịch nghệ tươi và

Berberin của màng BC từ vi khuẩn Acetobacter.
_ Khảo sát khả năng ngăn cản một số vi sinh vật của màng BC.
4. Ý nghĩa của đề tài
Nghiên cứu được khả năng thấm hút tốt nhất của màng BC ứng dụng
trong trị bỏng.

Nguyễn Thị Thơm

2

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Phân loại vi khuẩn Acetobacter
1.1.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter
Để phân loại Acetobacter, người ta dựa vào những tiêu chuẩn sau:
- Địa điểm nơi phân lập: có liên quan đến điều kiện môi trường sống.
- Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách xắp xếp tế bào, màu sắc tế
bào khi nhuộm Gram, khả năng di động, có tiên mao hay không, vỏ nhầy…
- Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ giữa các yếu tố: nhiệt độ, độ pH của
môi trường, khả năng hình thành sắc tố, mối quan hệ với oxy, khả năng sử
dụng chất vô cơ và hữu cơ…
- Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, tính chất, màu sắc… của
khuẩn lạc trên môi trường thạch. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự
biến đổi của môi trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay
không mùi, màu sắc môi trường có biến đổi hay không…)
1.1.2. Lược sử phân loại Acetobacter
Việc nghiên cứu Acetobacter nói chung và A.xylinum nói riêng đã và
đang thu hút được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đi sâu nghiên cứu

tìm hiểu. Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobater được tiến hành từ thế
kỷ XIX. Trong đó có một số khóa phân loại đáng chú ý sau:
Khóa phân loại của Beijerinck năm 1899, ông đã tiến hành phân lập vi
khuẩn acetic thuần khiết và chia chúng thành 4 nhóm cơ bản.
Năm 1916, Janke đã tiếp theo công trình nghiên cứu của Beijerinck.
Ông đã phân loại dựa trên 2 dấu hiệu:
+ Một là: sử dụng muối amoni làm nguồn cung cấp nitơ trong quá
trình sinh trưởng và phát triển.

Nguyễn Thị Thơm

3

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

+ Hai là: không hoặc có khả năng di động trong quá trình phát triển.
- Năm 1926, Henneberg dựa vào nơi sống mà chia vi khuẩn acetic làm
4 nhóm sau:
+ Nhóm 1: vi khuẩn không sinh trưởng trên bia, vì hoa huplon độc với
chúng.
+ Nhóm 2: vi khuẩn sinh trưởng trên bia.
+ Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trên dịch rượu vang.
+ Nhóm 4: vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh.
- Năm 1934, các nhà khoa học Hoa Kỳ đã nghiên cứu thành phần dinh
dưỡng của vi khuẩn giấm thấy chúng có khả năng sử dụng các hợp chất tương

đối đơn giản làm nguồn nitơ và nguồn cacbon nên đã xếp chúng vào họ
Nitrobacteriaceae. Từ đó vi khuẩn acetic có tên gọi là Acetobacter.
- Năm 1936, Kenyver, Wanneil và Staniel nghiên cứu khả năng di
động vủa chúng thấy có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động nên xếp
chúng vào họ Pseudomonadaceae.
- Năm 1948, Vanghn tiến hành nghiên cứu khả năng di động của một
số

loài

Acetobacter

(Acetobacter

aceti,

Acetobacter

melanoginum,

Acetobacter zances, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans) nhờ
đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn acetic trong họ
Pseumodonadaceae.
- Năm 1949, Krassilnicov nghiên cứu trên xạ khuẩn và vi khuẩn cùng
một số tác giả người Mỹ trong các bài báo cáo của mình đều thống nhất xếp
vi khuẩn Acetobacter vào họ Pseumodonadaceae.
- Theo khóa phân loại mới của Bergey và nhiều tác giả khác thì vi
khuẩn Acetobacter và Glucobacter – các vi khuẩn acetic được xếp vào họ
Acetobacteriaceae.

Nguyễn Thị Thơm

4

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

- Năm 1914, dựa vào khả năng oxy hóa acid acetic, Bergey phân chia
các loài trong Acetobacter thành 2 nhóm:
+ Nhóm 1: có khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O.
Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (sinh trưởng trên môi
trường Hoyer) như: Acetobacter aceti.
Không sử dụng muối amoni là nguồn nitơ duy nhất.
Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa cellulose
như:

Acetobacter

rancens,

Acetobacter

pasteurianus,

Acetobacter

kneizigianus.
Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose như:
Acetobacter xylinum.
+ Nhóm 2: không có khả năng oxy hóa acid acetic.
+ Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose: sắc tố nâu tối đến đen nhạt
(Acetobacter melanogenus); sắc tố trắng hồng (Acetobacter recens).
+ Không tạo thành sắc tố: nhiệt độ thích hợp khoảng 30 - 35oC
(Acetobacter sobuxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 18 - 21oC
(Acetobacter oxydans).
Năm 1950, Frateur chính thức đưa ra một khóa phân loại mới dựa trên
các tiêu chuẩn cụ thể:
- Khả năng tạo catalaze.
- Khả năng tổng hợp các chất xeto từ rượu bậc cao như: glycerol,
manitol, sorbitol.
- Khả năng oxy hóa acd acetic thành CO2 và H2O.
- Khả năng oxy hóa glucose thành gluconic.
- Khả năng sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ và rượu etylic làm
nguồn cacbon ( sinh trưởng trên môi trường Hoyer )
- Tạo sắc tố nâu.

Nguyễn Thị Thơm

5

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

- Tổng hợp cellulose.
Trên cơ sở đó, Fasteur chia vi khuẩn acetic thành các nhóm theo bảng
sau:
Bảng 1.1: Phân loại các nhóm vi khuẩn aceticd theo Pasteur (1950)
Stt

Tên nhóm

Vi khuẩn đại diện

Đặc điểm cơ bản

Acetobacter suboxydans. Không có khả năng oxy hóa
1

Suboxydans

Acetobacter

acid acetic thành CO2 và

melanogennum

H2O.

Acetobacter aceti
2

Meroxydans

Acetobacter xylinum
Acetobacter meroxydan

3

4

Oxydans

Peroxydans

Có đầy đủ các đặc điểm
trên

Acetobacter ascendans

Không có khả năng tạo các

Acetobacter ransens

hợp chất xeto từ rượu bậc

Acetobacter lovaniens

cao

Acetobacter peroxydans
Acetobacter paradoxum

Không

có

hoạt

tính

catalase, không oxy hóa
glucose thành acid gluconic

1.1.3. Vi khuẩn Acetobacter.
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố
rộng rãi trong tự nhiên. Có thể phân lập được các giống vi khuẩn này từ
không khí, đất, nước, lương thực, thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa quả…Có
khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó
có nhiều loài có ý nghĩa đáng kể.
* Đặc điểm hình thái của Acetobacter
Vi khuẩn Acetobacter bắt màu Gram âm (Gr

-

). Thông thường

Acetobacter có dạng hình que, kích thước thay đổi tùy theo loài (0,3 - 0,6 × 1

Nguyễn Thị Thơm

6

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

- 8 µm), có thể di động (có tiêm mao hoặc chu mao), hoặc không di động
(không có tiêm mao), hiếu khí bắt buộc, chịu được độ acid cao, tế bào đứng
riêng rẽ hoặc kết thành từng chuỗi, có khả năng tạo thành váng trên môi
trường lỏng. Tùy điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi
trường nuôi cấy…), các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra hình thái khác
biệt (kéo dài hoặc phình to ra).
Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter có hình dạng
tròn, đều, đường kính trung bình khoảng 1 - 2 mm. Trên môi trường lỏng, vi
khuẩn Acetobacter tập trung phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành lớp
màng mỏng, trong suốt, có độ dày khác nhau.
Khả năng tạo váng thay đổi tùy theo loài:
Acetobacter xylinum tạo thành váng hemicellulose khá dày và chắc.
Acetobacter orleanse váng mỏng nhưng chắc.
Acetobacter pasteurianum váng khô và nhăn nheo.
Acetobacter suboxydans váng mỏng dễ tan dã.
Acetobacter curvum sinh ra acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo váng
không chắc chắn [2].
* Đặc điểm sinh trưởng.
Vi khuẩn phát triển trong phạm vi nhiệt độ 12 - 35ºC, pH = 3,0 - 6,5;
hiếu khí tuyệt đối.
Vi khuẩn Acetobacter có khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau
để sinh trưởng và phát triển. Đa số các loài Acetobacter có khả năng đồng
hóa muối amôn, có khả năng phân gỉai pepton.

Acetobacter đòi hỏi phải có một số vitamin nhất định như acid
pantothenic và các chất khoáng như K, Mg, Ca, Fe, S, P… ở dạng muối vô cơ
và hợp chất hữu cơ. Do có bia, dịch thủy phân nấm men, nước mạch nha,
nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng tốt cho sự phát triển của vi khuẩn

Nguyễn Thị Thơm

7

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Acetobacter. Tính chất đặc trưng của của Acetobacter là oxy hóa rượu thành
acid acetic. Ngoài khả năng lên men tạo acid acetic, một số loài Acetobacter
còn tổng hợp được vitamin B1, B2, oxy hóa propanol thành acid propionic,
oxy hóa sorbit thành đường sorbose dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin
C, oxy hóa glycerin thành dioxyaceton, oxy hóa glucose thành acid gluconic
[19].
1.2. Vị trí và đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.2.1. Vị trí
Acetobacter xylinum là tên gọi chính thức theo hệ thống danh pháp
quốc tế 1990.
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Acetobacter
xylinum

thuộc

giống

Acetobacter,

họ

Pseudomonadaceae,

bộ

Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Việc phân loại vi khuẩn còn nhiều
tranh cãi, có một số tác giả coi Acetobacter xylinum như một loài phụ của
Acetobacter acetid [17].
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum
* Đặc điểm hình thái
Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di
động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm,
nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều
kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi.
Khuẩn lạc của Acetobacter xylinum có kích thước (đường kính khuẩn
lạc đạt 1 – 2mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên,
dày hơn và sẫm hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn [21].
* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
+ Đặc điểm sinh lý:
Vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, môi

Nguyễn Thị Thơm

8

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

trường pH = 4 - 6. Nhiệt độ và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào
sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu.
Acetobacter xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ
sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ
[9].
+ Đặc điểm sinh hoá
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính
catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer… Theo quan điểm này
A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác
trong cùng một chi được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Acetobacter
xylinum theo Pasteur (1950)
STT
1
2
3
4

5
6

7

Đặc điểm

Hiện tượng

Chuyển hoá môi trường chứa
Oxy hoá ethanol
Bromphenol Blue 0,04% từ màu
thành acid acetic
xanh sang màu vàng
Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí
Sinh trưởng trên
Sinh khối không phát triển
môi trường Hoyer
Chuyển hoá
Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau
glycerol
thành
lên men
dihydroxyaceton
Vòng sáng xuất hiện xung quanh
Chuyểnhoá
khuẩn lạc trên môi trường chứa
glucose thành acid
CaCO3
Kiểm tra khả năng
Không hình thành sắc tố nâu
sinh sắc tố nâu
Kiểm tra khả năng

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam
tổng hợp cellulose

Nguyễn Thị Thơm

9

Kết quả
+
+
_
+

+
_
+

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.3. Sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum
* Cấu trúc cellulose
Các kỹ thuật hiện đại đã xác định được cấu trúc của cellulose vi khuẩn.
Kỹ thuật nhiễu xạ tia X phân biệt các dạng cấu trúc và kích thước của
cellulose vi khuẩn. Các kỹ thuật phổ Rama, phân tích phổ hồng ngoại phổ
cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose vi

khuẩn. Cellulose vi khuẩn có đường kính bằng 1/100 đường kính của
cellulose thực vật (hình 1.1)

Cellulose thực vật

Bacterial cellulose

Hình 1.1: Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mịn và độ của cellulose vi khuẩn
gần bằng với độ chịu lực của nhôm. Khi đem so sánh đường kính của
cellulose vi khuẩn và cellulose nhân tạo cho thấy: kích thước của cellulose vi
khuẩn còn nhỏ hơn kích thước của sợi tổng hợp hóa học có đường kính nhỏ
nhất BC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên
kết ß - 1,4 glucan [12],[15].
Các sợi mới sinh ra của BC kết hợp lại với nhau để hình thành nên các
sợi sơ cấp (subfibril) có chiều dài khoảng 1,5 nm, là những sợi mảnh nhất có

Nguyễn Thị Thơm

10

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

nguồn gốc tự nhiên. Các sợi sơ cấp kết hợp thành vi sợi (microfibril). Các sợi
nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng thành dải (ribbon).

Cấu trúc của BC phụ chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện nuôi
cấy chính, vi khuẩn tổng hợp những màng celluose trên bề mặt nuôi cấy, tại
danh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxi. Các màng BC được
gọi là S - BC trên môi trường nuôi cấy tĩnh (S - BC: static BC). Các sợi
cellulose sơ cấp liê tục được đẩy ra từ lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào
vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi
trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt
phẳng song song như không có tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế
bào Acetobacter xylinum.
* Tính chất của cellulose
Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ
cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối… lên tính
chất của BC.
Sản phẩm của của cellulose vi khuẩn có một số tính chất như sau:
- Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao.
- Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể chỉnh độ xốp.
- Do khả năng S - BC hình thành sẵn màng, khi ứng dụng trong làm
vải không cần qua khâu dệt, làm giấy không cần qua khâu bột giấy.
- Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của
cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy.
- Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose
trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose [14].
- Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà
không gắn ligin, có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì

Nguyễn Thị Thơm

11

K33C - Sinh

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn nguyên liệu mới có nhiều ưu thế
[15].
* Quá trình tổng hợp cellulose của màng bacteria cellulose ở vi
khuẩn Acetobacter xylinum.
- Vi khuẩn Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng
trong điều kiện nuôi cấy tĩnh tạo nên một lớp màng trên bề mặt dung dịch,
màng này có bản chất từ cellulose kết hợp với tế bào vi khuẩn Acetobacter
xylinum gọi là màng BC.
- Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà.
- Các enzym tham gia quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn bao
gồm:
1PFK: fructose - 1 - phosphate
kinase

CS: cellulose synthase

PGI: phosphoglucoisomerase

Fru - bi - P: fructose - 1,6 - bi phosphate
UDPGlc: uridine diphosphoglucose

PGM: phosphoglucomutase

PTS: hệ thống phosphotransferase

FK: fructokinase

UGP: UDP - glucose
pyrophosphophorylase

Glc - 1 - P: glucose - 1 - phosphate
GK: glucokinase

Fru - 6 - P: fructose - 6 - phosphate
PGA: phosphogluconic acid

FBP: fructose - 1,6 - biphosphate
phosphatase

Glc - 6 - P: glucose - 6 - phosphate

G6PDH: glucose - 6 - phosphate
dehydrogenase

Nguyễn Thị Thơm

12

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

- Quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm nhiều phản ứng liên
tiếp nhau, được thực hiện bởi sự tham gia của một hệ các enzym [16].

Hình 1.2: Quá trình tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylium
Giai đoạn polymer hóa
Đầu tiên enzym glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa
chuyển glucose thànhglucose - 6 - phosphate. Enzym phosphoglucomutase
tiếp tục chuyển hóa glucose - 6 - phosphate thành glucose - 1 - phosphate
thông qua phản ứng isomer hóa. Glucose - 1 - phosphate nhờ enzym UDP glucose pyrophospholyase chuyển hóa thành UDP - glucose. Cuối cùng, UDP
- glucose được tổng hợp nên sẽ được polymer hóa thành cellulose và cellulose
được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là

Nguyễn Thị Thơm

13

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

cellulosesynthase. Enzym này được hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng là
cyclic - di - GMP.
Một số chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng sử dụng
đường fructose hiệu quả hơn. Hệ thống enzym phosphotransferase sẽ chuyển
fructose thành fructose - 1 - phosphate. Sau đó fructose - 1 - phosphate sẽ

được chuyển hóa thành fructose - bi - phosphate nhờ enzym fructose - 1 phosphatekinase. Enzym phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp
chuyển hóa fructose - 6 - phosphate thành glucose - 6 - phosphate. Glucose - 6
- phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra
cellulose [21].
Giai đoạn kết tinh
Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết 1,4 - glucan. Trongđó,
các chuỗi glucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết
yếu Van đec van. Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn,
sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản
gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các
vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi [15].
1.3. Ứng dụng của màng BC
1.3.1. Ứng dụng của màng BC trong một số lĩnh vực
Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ
bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả
năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề
dày của vi sợi dưới 100 nm, bị phân hủy sinh học. có tính tương thích sinh
học, tính trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng. Màng BC có các
ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực như:

Nguyễn Thị Thơm

14

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Thực phẩm: BC được dùng làm món tráng miệng (thạch dừa, kem ít
calori, đồ ăn nhanh, kẹo), chất nhũ hóa trong nước ép trái cây và những thức
uống khác, màng bao thực phẩm… [13].
Y học: điều trị tổn thương da trong ghép mô, cơ quan nội tạng, tác
nhân vận chuyển thuốc (qua đường miệng và da), da nhân tạo.
Mỹ phẩm: kem dưỡng da, chất làm nền cho móng nhân tạo, chất tăng
độ dày và bền cho nước làm bóng móng tay… [10].
Bảo vệ môi trường: làm chất hấp thu cho các vật liệu loại bỏ chất độc
hại (làm sạch nước thải), thu hồi dầu và khoáng sản [18].
Công nghiệp: vật liệu làm quần áo và giày dép, màng dung chuyển đổi
âm thanh, làm các loại giấy đặc biệt như giấy dùng trong lưu trữ tài liệu, giấy
có thời gian sử dụng lâu dài, trong vẽ, in, chất dính và chất xơ trên trang vẽ
như giấy làm phủ bề mặt láng trong công nghiệp in [20].
1.3.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng.
Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày.
Ngoài tổn thương da, bỏng còn gây rối loạn nội tạng, để di chứng nặng đến
khẳ năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh.
Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc
biệt quan trọng. Đối với vết thương nông, điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng
làm giảm đau ngăn chặn các chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho quá
trình tái tạo phục hồi. Đối với trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ có tác
dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm khuẩn tại
chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịch trong
cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức hoại tử,
tạo điều kiện tốt cho hinh thành mô hạt và biểu mô hóa thành sẹo,chuẩn bị tốt
nền ghép da trong phẫu thuật. Màng BC tổng hợp từ Acetobacter xylinum có

Nguyễn Thị Thơm

15

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

những đặc tính làm màng sinh học trị bỏng, màng băng vết thương, điều trị
tổn thương da. Trong ghép mô, cơ quan nội tạng.
1.4. Tình hình nghiên cứu khả năng hấp thụ các chất lên màng BC
Tác giả Nguyễn Văn Thanh và cs đã có một số công trình nghiên cứu
về màng BC từ Acetobacter xylinum và bước đầu nghiên cứu về các đặc tính
màng BC thu được là cơ sở chế tạo màng sinh học có ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực [12].
BC có nhiều ưu thế làm vật liệu chất mang trong kỹ thuật cố định tế
bào.
- Cố định tế bào vi khuẩn Lactococcus lastic trên màng BC để ứng
dụng lên men thu nhận bacteriocin và ứng dụng màng BC hấp thụ bacteriocin
để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu [26].
- Cố định nấm men trên chất màng BC và ứng dụng vào quá trình lên
men sản xuất rượu vang [24].
- Cố định vi khuẩn Oenococcus oeni bằng phức chất mang alginate –
bacterial cellulose ứng dụng lên men malolastic [25].
Đặc biệt, trong y học màng BC cũng được sử dụng như là một chất
mang các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên sử dụng trong điều trị bỏng. Điều
trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc tự nhiên đã được áp dụng từ rất lâu và
phổ biến ở tất cả các nước. Các thuốc này có sẵn trong thiên nhiên và có
nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vết thương vết loét…

Một số sản phẩm thuốc có nguồn gốc tự nhiên được dùng kết hợp tẩm với
màng BC dùng trong điều trị bỏng có thể kể đến là: dầu mù u, dịch nghệ tươi,
berberin… có tác dụng tốt đến sự tái tạo tế bào da, chống nhiễm khuẩn, làm
da chóng lành và ít để lại sẹo.
Dầu mù u: chiết xuất từ hạt cây mù u (Calophyllum inophyllum) có tác
dụng tái sinh mô tốt, làm mau lành vết thương, có tính kháng khuẩn, kháng
viêm, chống oxi hóa tốt đã được chứng minh trong dân gian và trên lâm sàng,

Nguyễn Thị Thơm

16

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

được ứng dụng nhiều trong điều trị bỏng. Cụ thể đối với nghiên cứu chế tạo
màng sinh học trị bỏng tẩm dầu mù u của PGS.TS Nguyễn Văn Thanh,
Trưởng bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh ĐH Y Dược TP.HCM.
Nghệ: từ lâu nghệ (Curcuma longa L) đã được biết đến là một thảo
dược có tác động tốt trong việc hàn gắn các vết thương, vết loét, làm liền sẹo.
Bộ phân sử dụng chính của cây nghệ là phần thân rễ chứa thành phần
polyphenol là curcuminoid có tác dụng chống oxy hóa và kháng viêm mạnh.
Tinh dầu nghệ chiếm khoảng 5 - 15 % có tác dụng kháng nấm, vi khuẩn, kí
sinh trùng. Trong điều trị bỏng, sử dụng tinh dầu nghệ kết hợp thấm lên màng
BC ở giai đoạn sớm có tác dụng loại bỏ hoại tử bỏng, trong giai đoạn muộn
có tác dụng tăng sinh tái tạo biểu mô, chống sẹo lồi [1].

Berberin: chất này được chiết xuất chủ yếu từ các thảo dược rất sẵn có
ở nước ta, chủ yếu là cây vàng đắng. Ngoài ra, còn tìm thấy ở một số cây họ
hoàng (hoàng liên, thỏ hoàng liên, hoàng bá… ). Berberin có tác dụng chống
lại vi khuẩn, siêu vi, nấm sinh vật đơn bào, virut, giun sán và chlamydia…
[23]. Vì vậy, berberin là một chất thích hợp cho việc tẩm, thấm hút lên màng
BC làm tăng thêm khả năng kháng khuẩn, chữa lành vết thương do bỏng gây
ra.
Các sản phẩm thuốc có nguồn gốc tự nhiên có nhiều đặc tính tốt phù
hợp cho điều trị bỏng nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu thấm hút dịch nghệ,
berberin,… lên màng BC phục vụ trong điều trị bỏng.

Nguyễn Thị Thơm

17

K33C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Giống
Chúng tôi tiến hành tuyển chọn và nghiên cứu khả năng hình thành
màng BC của các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2. (nhận được từ
phòng Vi sinh – Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2).
2.1.2. Hóa chất và thiết bị

* Hóa chất
Các hóa chất thông dụng: glucose (C6H12O6), pepton, acid acetic, rượu
etylic, NaOH, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4, KHPO4, CaCO3, agar agar, phenolphtalein, thuốc nhuộm tím gentian, dung dịch fucsin, dung dịch
lugol, berberin... được cung cấp từ phòng Vi sinh - Trường Đại học sư phạm
Hà Nội 2. Các hóa chất đều được tinh sạch ở mức phân tích.
Nước dừa nguyên chất.
* Thiết bị
Tại phòng Vi sinh, khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học sư phạm Hà
Nội 2.
Bao gồm: tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp, máy lắc, máy li tâm, micropipet, cân,
kính hiển vi, tủ lạnh, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, la men,
đèn cồn… và nhiều dụng cụ hóa sinh học khác.
2.1.3. Môi trường
* Môi trường giữ giống
Glucose: 20g
MgSO4.7H2O: 2g
(NH4)SO4: 2g
Thạch agar: 20g

Nguyễn Thị Thơm

18

K33C - Sinh