Nghiên cứu so sánh một số phương pháp phát hiện tác nhân gây bệnh than bacillus anthracis

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----------***-----------

LUẬN VĂN CAO HỌC

Mã số chuyên ngành: 60420103
Đề tài:

một số
nhân gây bệnh than Bacillus anthracis
Học viên: Lƣu Anh Tú
Lớp: CHST _ K15
Hƣớng dẫn: PGS.TS Ngô Đình Bính

Hà Nội, 2013
1


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính là người thầy đã
hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp
đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn phòng tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi

hoàn thành khóa học và bản luận án này.
Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,
Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt
qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên
tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và
nghiên cứu.
Tác giả

2


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng
cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực.
Hà Nội, ngày tháng
Tác giả

3

năm 2013


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP

Acid Adenozin Triphosphate

B. anthracis/ Ba

Bacillus anthracis

bp

base pair

CA

Casamino Acid

dH2O

deion water

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EF

Edema Factor

FAO

Food Agricultural Organisation

h

giờ

kDa

Kilo Dalton

LB

Lauria Betani

LF

Lethal Factor

MPA

Meat Pepton Agar

MPB

Meat Pepton Broth

ORF

Open Reading Frame

PA

Protective Antigen

PCR

Polymerase Chains Reaction

SDS

Sodium Dodecylsulphate

TAE

Tris – Acetate EDTA

4


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn Bacillus anthracis gây bệnh than đã được sử dụng như là một vũ
khí sinh học nguy hiểm nhất trong lịch sử chiến tranh. Đặc biệt những năm gần
đây những chủng vi khuẩn gây bệnh than đã cải biến gen được sử dụng trong
khủng bố sinh học gây hoảng loạn trong cộng đồng dân cư trên thế giới. Vì vậy
việc phát hiện nhanh, chính xác vi khuẩn gây bệnh than là rất cần thiết và cấp
bách, giúp cho các bác sĩ và các nhà dịch tễ học có biện pháp ứng phó kịp thời,
hạn chế thương vong và lây lan của dịch bệnh. Các phương pháp truyền thống
dựa trên việc phân lập và xác định đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc
tính sinh lý, sinh hóa của các chủng đòi hỏi tốn thời gian và dễ xảy ra nhầm lẫn
dẫn đến tình trạng mất nhiều thời gian để phát hiện được người bệnh đang bị
nhiễm bệnh than. Ngoài ra, hiện nay ở Việt Nam chưa có biện pháp nào đánh giá
mức độ sản sinh kháng thể kháng bệnh than ở người cũng như ở động vật. Dựa
trên các kết quả nghiên cứu trước đây về việc phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh
than bằng kĩ thuật sinh học phân tử cũng như việc tách dòng và biểu hiện gen
mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA, chúng tôi đã thực hiện đề tài “
Bacillus anthracis”
dựa trên nguyên lý miễn dịch học. Các phương pháp mới này nhằm khắc phục
những hạn chế của những phương pháp trước đây đồng thời cung cấp thêm công
cụ trong việc đánh giá tình trạng nhiễm bệnh than.
2. Mục tiêu nghiên cứu
ệnh than Bacillus anthracis
.
3. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu biểu hiện gen pagA trong Escherichia coli BL21
2. Nghiên cứu sự đáp ứng miễn dịch của protein PA tái tổ hợp trên động vật thí
nghiệm.

5


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
3. Thu nhận huyết thanh thỏ thí nghiệm và kiểm tra khả năng đáp ứng miễn
dịch bằng phương pháp Western Blot.
4. Nghiên cứu chế tạo kit ELISA phát hiện vi khuẩn Ba và tác nhân gây bệnh
than.
5.

.

6. Xây dựng Kit ELISA phát hiện tác nhân gây bệnh than vi khuẩn Ba.
7. Thử nghiệm Kit ELISA với huyết thanh bệnh nhân.

6


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh than và các dạng bệnh than
Bệnh than thường xuất hiện ở các loài động vật hoang dã cũng như động
vật nuôi, đặc biệt là các loại gia súc ăn cỏ như trâu, bò, cừu, ngựa, dê… do
chúng hít phải hoặc nhiễm phải bào tử than trong đất. Ở người, nguy cơ mắc
bệnh than là do tiếp xúc với động vật ăn cỏ. Các loài khác như bò sát, lưỡng cư

cũng bị nhiễm bệnh than nhưng ở các mức độ khác nhau [24].
Bệnh than có thể nhiễm vào cơ thể vật chủ theo ba con đường: qua da,
qua đường tiêu hoá và đường hô hấp. Bệnh có thể biến chứng thành thể than
màng não nếu hít vào bào tử than. Tuỳ theo cách thức lây nhiễm mà người ta
chia bệnh than thành 4 thể than khác nhau: than da, than tiêu hoá, than hô hấp,
than màng não [32].
1.1.1. Bệnh than thể da
Đây là hình thức phổ biến nhất chiếm hơn 95 % và là loại bệnh có khả
năng điều trị. Bệnh thường gặp ở những nhóm đối tượng có nguy cơ lây nhiễm
cao, thường xuyên tiếp xúc với động vật và các sản phẩm từ gia súc đã bị nhiễm
VK than, thường là những người nông dân, bác sĩ thú y, người giết mổ gia súc,
người buôn bán gia súc hay thịt, … Từ các vết thương hở trên da, vi khuẩn hay
bào tử B. anthracis có thể xâm nhập vào (Hình 1.1).
Triệu chứng của bệnh: Sau 1 - 2 ngày đầu thấy xuất hiện các vết sẩn ngứa như
côn trùng đốt, dần dần xuất hiện các dấu hiệu hoại tử trong vùng tâm. Sau 2- 3 ngày
sẽ xuất hiện các mụn nhỏ hay nốt nhú tại vị trí nhiễm, xung quanh xuất
hiện các mụn nước. Vài ngày sau tại vùng trung tâm vết loét sẽ xuất hiện
các nốt đen, khô và bắt đầu bong vẩy.
Trong khoảng 1-2 tuần kể từ khi nhiễm bệnh sẽ xuất hiện các mủ và
các hiện tượng đau nhức, mệt mỏi, sốt, bạch cầu tăng, các hạch bạch huyết
tăng lên. Sau đó vùng thương tổn sẽ chuyển sang dạng tự phát. Nếu bệnh
nặng thêm vết loét sẽ lan rộng và ăn sâu làm nhiễm trùng máu dẫn đến

7


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
không thể chữa khỏi. Than da gây tử vong khoảng 20 % các trường hợp

không được điều trị [36].

Hình 1.1. Bệnh than thể da
1.1.2. Bệnh than thể tiêu hoá
Nguyên nhân của bệnh than
tiêu hoá là do ăn phải thịt gia súc
đã bị nhiễm bào tử than mà không
được nấu chín, thậm chí cả khi
được nấu chín thì khả năng gây
bệnh vẫn cao. Người ta tìm thấy vi
khuẩn than trong dịch ruột của
bệnh nhân mắc bệnh than. Đầu tiên
vi khuẩn sẽ tấn công vào những vị
Hình 1.2. Manh tràng của bệnh nhân

trí thương tổn của màng nhày ruột

nhiễm than đường tiêu hóa

và dạ dày. Từ những vị trí này sẽ
xuất hiện những vết loét, lan rộng

và lan vào hệ bạch huyết. Bệnh than tiêu hoá thường ít gặp nhưng lại có tỉ lệ tử
vong khá cao. Bệnh thường có hai thể lâm sàng [8, 32, 36] (Hình 1.2):
Thể bụng: dấu hiệu đầu tiên và rất dễ nhận biết là có thương tổn xuất
huyết hoại tử ở manh tràng và các vùng lân cận. Triệu chứng ban đầu không đặc
biệt với những cảm giác buồn nôn, biếng ăn, sốt. Sau đó là các triệu chứng đau
bụng, tiêu chảy, sốc do nhiễm trùng và tử vong. Bệnh nhân có thể viêm phúc
mạc hoặc viêm lá lách do vi khuẩn tấn công vào khu hạch bạch huyết. Sau 2-5
ngày kể từ khi xuất hiện dấu hiệu của bệnh sẽ gây tử vong.

8


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Thể họng, miệng: tại vùng thương tổn thấy xuất huyết hoại tử ở vùng vòm
họng, cổ họng cứng, sưng amidan. Bệnh nhân sốt cao, khó nuốt, hạch vùng cổ
sưng to, nhiễm độc máu và đa số đều dẫn đến tử vong. Dạng than này có tỉ lệ tử
vong cao chiếm 50 % mặc dù có được điều trị.
1.1.3. Bệnh than hô hấp
Nguyên nhân gây than hô hấp là do hít phải bào tử than. Sau khi vào cơ
thể, các bào tử than sẽ phát triển thành thể hoạt động và di chuyển tới các phế
nang, hạch lympho phổi và trung thất gây xuất huyết hoại tử và phù thũng, làm
trung thất giãn rộng ra cả hai bên làm bệnh nhân có cảm giác đau vùng ức, sốt
cao. Các thương tổn xuất huyết và hoại tử lan đến màng phổi gây tràn máu màng
phổi. Khí quản cũng bị ảnh hưởng với các triệu chứng như ho khan, co thắt,
vùng phổi bị phù. Vi khuẩn sẽ theo đường máu lan đến phần dưới niêm mạc của
ống tiêu hoá và tạo nên các vết loét ở thành ruột làm bệnh nhân nôn ra máu, tiêu
hoá ta máu hoặc cả hai triệu chứng trên. Một số nang lympho của đường tiêu
hoá cũng bị phù và xung huyết, nếu bệnh nặng hơn có thể biến chứng sang thể
màng não gây xuất huyết. Đa số bệnh nhân đều tử vong trong khoảng 1 - 2 ngày
kể từ khi phát bệnh. Tỉ lệ tử vong của thể than này rất cao [61,76] (Hình 1.3).

Hình 1.3. Phổi (1) và trung thất (2) của khỉ nhiễm than
đường hô hấp

1.1.4. Bệnh than thể màng não

9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Bệnh thường do biến chứng từ ba thể than trên. Than màng não xuất hiện
khi vi khuẩn B. anthracis tấn công vào hệ
thống thần kinh trung ương theo đường
máu và các mạch bạch huyết. Triệu chứng
của bệnh thường là sốt cao, mệt mỏi, đau
cơ, đau đầu, buồn nôn, lên cơn mê sảng khi
phát bệnh và dẫn đến hôn mê. Đa số bệnh
thường dẫn đến tử vong sau 1-2 ngày kể từ
khi mắc bệnh. Thể than này có tỉ lệ tử vong
rất cao [32, 36] (Hình 1.4).

Hình 1.4. Não của khỉ nhiễm than
thể màng não

1.2. Tác nhân gây bệnh than
1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn than (Bacillus anthracis)
Vi khuẩn B. anthracis thuộc nhóm I, chi Bacillus. Nó tồn tại trong đất,
nước và không khí. Vi khuẩn B. anthracis là vi khuẩn gram dương, sinh bào tử
(trong điều kiện kị khí hay kị khí bắt buộc), không có lông roi nên không có khả
năng di động. Kích thước tế bào 3-5 μm, rộng 1-2 μm. Tế bào hình que, vuông
đầu, sắp xếp với nhau thành chuỗi dài như sợi rơm hoặc chỉ vài tế bào nối với
nhau [21, 32] (Hình 1.5).
Bào tử B. anthracis có hình elip, nằm ở trung tâm tế bào, nang bào tử không
phồng. Kích thước khoảng 1-1,5 µm. Bào tử được hình thành vào thời kì cuối của
pha sinh trưởng logarit [18] (Hình 1.5).

Khuẩn lạc B. anthracis có màu trắng sữa hoặc trắng xám tới xám, bề mặt
sần sùi, dính ướt, đường kính 3-5 mm [4].
Điều kiện thích hợp cho B. anthracis phát triển là ở điều kiện nhiệt độ 2832oC, pH = 7, thời gian nuôi cấy 3-5 ngày. Khi gặp điều kiện bất lợi, tế bào sinh
dưỡng sẽ hình thành nội bào tử.

10


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1

/>
2
Hình 1.5. Tế bào (1) và bào tử (2) B. anthracis

1.2.2. Sự hình thành bào tử
Bào tử B. anthracis đã được tìm thấy ở rất nhiều nơi trên thế giới. Nó vùi
sâu trong lòng đất và có thể tồn tại ở đó khoảng 100 năm [17]. Bào tử được hình
thành khi gặp điều kiện bất lợi. Các nội bào tử nằm bên trong tế bào mẹ, khi tế
bào mẹ phân giải, các nội bào tử sẽ được giải phóng, chúng có thể tồn tại và phát
triển độc lập trong một thời gian dài. Các nội bào tử khá bền vững. Nhiệt độ và
độ ẩm dường như không có ảnh hưởng lớn đến sự tồn tại của bào tử than. Bào tử
có khả năng kháng lại và sống sót sau khi tồn tại lâu với điều kiện bất lợi như
khô hạn, dung môi; nhiệt độ, pH, áp suất; tia cực tím và phát xạ ion hóa [43].
Khi gặp điều kiện thuận lợi, các nội bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế
bào sinh dưỡng. Các tế bào sinh dưỡng lại tiếp tục phát triển nếu gặp điều kiện
thuận lợi và ngược lại, nếu gặp điều kiện bất lợi nó lại hình thành nên các nội
bào tử để bảo tồn sự sống.
Bào tử nghỉ của Ba có cấu trúc tương đối hoàn chỉnh. Bào tử hoàn chỉnh

được tạo bởi 2 vùng chính bao gồm 1 lõi và vỏ đen gồm các lớp khác nhau. Lớp
vỏ là 1 vùng điện tử trong suốt bao gồm tế bào chất và chất nguyên sinh bao
quanh bởi lớp màng tế bào trong và màng ngoài, cả 2 đều xuất phát từ 1 màng tế
bào gốc có tính phân cực độc lập nhau. Màng bên trong trở thành màng tế bào
chất của tế bào sinh dưỡng khi bào tử nảy mầm. Cấu trúc chính tạo nên sự sống
sót của bào tử là vỏ bào tử. Cấu trúc này là 1 lớp dày điện tử trong suốt nằm
giữa 2 lớp màng. Cấu trúc này bao gồm acid dipicolinic và polymer muropeptide
11


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
có cấu trúc tương tự thành tế bào sinh dưỡng [10]. Đây là nhân tố có vai trò lớn
trong khả năng kháng nhiệt của bào tử. Nó cũng duy trì trạng thái bào tử nghỉ
trong suốt quá trình xâm nhiễm của pepetide nhày của vỏ để hydrate hóa lõi.
Lớp vỏ chắn điện tử cứng, dày là một lớp vỏ protein phức tạp được tổng hợp
trong tế bào mẹ và tập hợp quanh lớp màng ngoài của tiền bào tử. Cấu trúc này
không cần thiết cho trạng thái ngủ của bào tử hay tính kháng nhiệt nhưng quan
trọng trong tính kháng của bào tử đối với sự tấn công của các enzyme như
lysozym.
1.2.3. Sự tƣơng tác của bào tử Bacillus anthracis và đại thực bào
Những nghiên cứu trước đây đã chứng minh việc nhiễm bệnh than được
thiết lập qua phổi. Nồng độ bào tử là 5.104-1.105 là cần thiết cho việc nhiễm vào
thỏ qua da, liều gây chết (LD50) của bào tử B. anthracis chủng Ame ở thỏ là
1,05.105 CFU.
Khi bào tử bị hít vào đến nhánh cuống phổi nhỏ và túi phổi, hầu hết chúng
bị thực bào nhanh và hiệu quả bởi đại thực bào phổi theo con đường bổ sung
(recruitment) của F-actin [15]. Việc nhận ra actin này cho thấy các thụ thể của
phần Fc của IgG (FcRs) [13] là trung gian trong quá trình thực bào. Bào tử B.

anthracis qua Rac1 và Cdc 42. Các đại thực bào mang bào tử dịch chuyển dọc
các kênh bạch huyết (lymphatic channels) tới các hạt bạch huyết; tới các hạt
bạch huyết ở trung thất (mediastinal) và từ đó đi vào máu. Do đó, sự nảy mầm
của bào tử dường như là cần thiết cho sự thiết lập bệnh than [24].
Các nghiên cứu gần đây sử dụng các kĩ thuật quan sát ở độ phóng đại cao
cho phép xác định các cấu trúc phân tử bên trong khoang tế bào, kết hợp với
những phân tích về tế bào được phân lập từ các động vật nhiễm bệnh đã có thể
giải thích về sự nảy mầm hiệu quả của bào tử B. anthracis bên trong đại thực
bào. Để thiết lập bệnh than cần sự xuất hiện nhanh của dạng tế bào sinh dưỡng.
Do đó, B. anthracis phải đánh bại được hệ thống miễn dịch của vật chủ, phã vỡ
các tế bào đặc hiệu bao gồm bạch cầu đơn nhân (monocyte) và đại thực bào.
Đây là các nhân tố đóng vai trò chủ yếu trong việc tiêu diệt vi khuẩn xâm nhiễm
sản sinh các nhân tố kháng khuẩn. Ví dụ, B. anthracis có thể nảy mầm trong đại
12


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
thực bào phổi. Các nhân tố liên quan tới sự nảy mầm bao gồm GerXB, GerXA
và GerXC mã hóa bởi operon gerX [15].
Tầm quan trọng của các điều kiện thuận lợi bên trong của quá trình nảy
mầm của bào tử trong việc thiết lập bệnh than đã được giải thích rõ. Ông đã sử
dụng lỗ màng bụng (peritoneal cavity) của chuột làm mô hình. Ông cho rằng các
nhân tố liên quan đến những bước đầu tiên của quá trình nhiễm trùng, trước khi
xuất hiện tế bào sinh dưỡng xác định tính kháng tự nhiên hay tính mẫn cảm với
bệnh than. Trong quá trình nảy mầm, 1 loạt các phản ứng phân hủy không
nghịch đảo sẽ dẫn tới phá hủy trạng thái nghỉ của bào tử [10]. L-Alanine, DLTyrosine và Adenosine là những chất cảm ứng nảy mầm hiệu quả và L-Alanine
dường như là chất cảm ứng nảy mầm chủ yếu trong huyết thanh [24].
Sự nảy mầm của bào tử B. anthracis trong đại thực bào kéo theo sự biểu

hiện của các gen mã hóa các nhân tố gây độc như nhân tố hoạt hóa độc tố (toxin
transactivator) AtxA, kháng nguyên bảo vệ PA, nhân tố gây chết LF, nhân tố
gây phù thũng EF. Dạng tế bào trưởng thành thoát khỏi đại thực bào phổi để
nhân nhanh trong máu với tính độc cao. Các tế bào có hoạt tính hình thành vỏ
nhày sau 30 phút nảy mầm ở invitro [9].
1.3. Các độc tố của vi khuẩn Bacillus anthracis
1.3.1. Độc tố than
Khái niệm độc tố than đề cập tới 3 protein riêng rẽ, chúng hoạt động trong
một tổ hợp nhị phân để giải phóng ra 2 loại độc tố riêng rẽ. Tiểu phần B (kháng
nguyên bảo vệ PA) là phương tiện vận chuyển 2 tiểu phần A (nhân tố gây phù
thũng EF và nhân tố gây chết LF) đi vào trong tế bào. Như vậy, độc tố than gồm
3 thành phần là PA, EF và LF:
1.3.1.1. Kháng nguyên bảo vệ PA
Protein độc tố PA hoàn chỉnh có trọng lượng phân tử là 83 kDa, bao gồm
735 acid amin (Mr 82,684); 394 phân tử nước và 2 nguyên tử canxi. Phân tử PA
hoàn chỉnh có 4 vùng chức năng, mỗi vùng có vai trò khác nhau trong quá trình
nhiễm bệnh [38].

13


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hoá bởi gen pagA nằm trên plasmid
pXO1. Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết LF
hay nhân tố gây phù thũng EF lại sản sinh độc tố gây chết (LeTx) hoặc gây phù
thũng (EdTx) cho tế bào vật chủ. Nếu thiếu kháng nguyên bảo vệ PA thì B.
anthracis không độc và không còn hoạt tính của độc than (90). Chính do các đặc
điểm này mà kháng nguyên bảo vệ PA được xem là một kênh dẫn truyền gián

tiếp cho các nhân tố EF và LF để chúng phát huy độc lực [37,38,36,47].
1.3.1.2. Nhân tố gây phù thũng (Edema Factor - EF)
EF được coi như một enzyme Adenylate Cyclase (ATP pyrophosphatelyase, EC 4.6.1.1) (Hình 1.6), có trọng lượng phân tử 89 kDa, chứa 767 gốc acid
amin. Nó có chức năng chuyển hóa ATP nội bào thành cAMP, quá trình này
được thực hiện khi EF kết hợp với Calmodulin (CaM - là một thụ quan canxi lớn
trong tế bào nhân chuẩn) [60,68]. EF kích thích tăng mức cAMP bên trong tế
bào. EF và AC phụ thuộc calmodulin có 3 trình tự được duy trì chặt chẽ, gồm 24
acid amin (303 - 339) mang vị trí gắn ATP [8]. Trình tự này có liên quan đến
quá trình xúc tác [26]. Đặc tính của vị trí gắn Calmodulin chưa được xác định,
tuy nhiên peptid (499 - 532) và đầu C từ gốc 150 còn lại đã được xác định. EF
có thể tương tác với màng kép lipid mà không phụ thuộc vào pH, không giống
như LF, EF còn liên kết với các lỗ màng sau khi được chuyển vào trong tế bào
chất.
Khi EF được kháng nguyên bảo vệ PA dẫn vào trong tế bào vật chủ độc tố
EF sẽ gây nên hiện tượng mất cân bằng enzyme và dẫn đến làm mất tính thấm
của tế bào vật chủ. Dịch tế bào bị dồn ứ và gây nên hiện tượng trương bào.
Màng tế bào căng ra, mọng nước, đây chính là nguyên nhân gây phù thũng ở tế
bào vật chủ [29].
Nhân tố gây phù thũng EF được tạo bởi ít nhất 3 vùng chức năng riêng
biệt. Khi loại bỏ 261 gốc đầu N của EF thì không ảnh hưởng đến hoạt tính xúc
tác. Vùng này cũng liên quan tới vị trí liên kết PA nhưng không xúc tác [29].
Hoạt tính xúc tác được xác định là do phần còn lại của phân tử và có thể được
tách thành dưới vùng liên kết cơ chất và dưới vùng liên kết calmodulin. Đột biến
14


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
điểm đã cho thấy tầm quan trọng của trình tự 303-339 đối với hoạt tính xúc tác.

Đặc biệt, Lys313 dường như đảm bảo cho sự liên kết chặt chẽ của cơ chất
nucleotide [26]. Ở AC của B. pertussis, histidine được xác định là có thể hoạt
động như những base trong sự tạo vòng. Trong số 9 gốc histidine ở AC của B.
pertussis, có 3 gốc được bảo tồn ở EF. His63 (có hình thái tương tự như His318 ở
EF) không cần thiết cho việc liên kết nucleotide nhưng lại có ảnh hưởng đến
động học của sự xúc tác. Dưới vùng cuối cùng có liên quan tới sự liên kết
Calmodulin. Peptide 499-532 có thể liên kết với Calmodulin theo cách phụ
thuộc Ca với ái lực kiểu dại [39]. Tuy nhiên, có nghiên cứu lại cho thấy 150 gốc
đầu C mới có liên quan tới sự liên kết Calmodulin. Vùng đầu N của EF hầu như
có sự tương đồng về cấu trúc với LF, trong khi đó dưới vùng đầu C lại khác
đáng kể về trình tự và chức năng. Phân tích cấu trúc bậc 2 của 541 gốc đầu C
của EF cho thấy cấu trúc bậc 2 chủ yếu là các chuỗi β [27].
Trong nghiên cứu gần đây, Shen và cộng sự đã chứng minh được rằng
vùng xúc tác của EF (EF3) (là phức hợp tạo bởi phần enzyme của EF với
CaM và adenosine 5’- , -methylene-triphosphat. Đây là vùng quan trọng
nhất, nó kết hợp với CaM để gây phù thũng cho tế bào vật chủ [44].

Hình 1.6. Nhân tố gây phù thũng EF

1.3.1.3. Nhân tố gây chết (Lethal Factor - LF)
15


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Nhân tố gây chết LF là một protein gồm 776 acid amin, trọng lượng phân
từ 90 kDa. Nó được coi là một nhân tố quan trọng do vi khuẩn B. anthracis tiết
ra (Hình 1.7).

Hình 1.7. Nhân tố gây chết LF
LF chứa một loạt 4 trình tự lặp lại không hoàn toàn trong phần trung tâm,
sự mất đoạn trong vùng này làm protein bị bất hoạt hoặc không hoạt động [82].
Vùng xúc tác nằm ở đầu C phần HExxH zinc - metalloprotease đã xác định trình
tự (686-690) [22]. Sự đột biến ở những gốc có tính chất quyết định sẽ phá hủy
hoạt tính độc tố gây chết và gắn Zn2+ với LF, điều này cho thấy LF giống với
độc tố botulinum của Clostridium và độc tố uốn ván. Vì thế, LF được coi là một
metalloprotease kẽm [18]. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LF phân giải
các acid amin đầu N của protein kinase hoạt hóa quá trình phân bào (Mitogen
Activated Protein Kinases - MAPKs), Merk1 và Merk2. Sự đột biến ở vùng xúc
tác của LF sẽ làm mất độc tính của đại thực bào, tiêu hủy MAPKK phân giải và
ảnh hưởng đến sự phân bào [24].
Khi LF kết hợp với Zn2+ sẽ làm tăng quá trình sản xuất cytokin trong đại
thực bào và tế bào bạch huyết [11]. Đây chính là nguyên nhân gây phá hủy đại
thực bào và là thủ phạm chính dẫn đến hiện tượng sốc và tử vong. Sau khi được
16


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
vận chuyển vào trong tế bào, độc tố LF sẽ làm tăng tính thấm của các ion Na+ và
K+, sau đó là quá trình thuỷ phân ATP. Quá trình này ức chế sự tổng hợp các đại
phân tử liên quan đến đáp ứng miễn dịch [16]. LF phong tỏa hệ thống báo động
của cơ thể bằng cách gắn với một cấu trúc protein đặc biệt của tế bào, vùng
metallo-protease của LF sẽ nhằm tới các kênh dẫn truyền tín hiệu nội bào làm
cho những thông tin mà tế bào cần thông báo cho hệ miễn dịch về sự xuất hiện
của yếu tố lạ bị đình chỉ, từ đó các protease sẽ phá hủy cấu trúc nội bào gây chết
cho tế bào vật chủ.
1.3.2. Độc tố vỏ nhày (Capsule Toxin)

Độc tố vỏ nhày hay vỏ capsule có bản chất là acid poly- -D-glutamic, có trọng
lượng phân tử là 215 kDa ở trong tế bào và ở ngoài tế bào là 20-55 kDa. Nó được mã
hoá bởi các gen cap nằm trên plasmid pXO2 có trọng lượng phân tử là 95 kb [32,38,39].
Tất cả các dòng gây độc của B. anthracis đều tạo ra vỏ nhày. Vỏ nhày
giúp cho vi khuẩn B. anthracis tránh được sự bảo vệ của hệ thống miễn dịch vật
chủ và kích thích gây nhiễm trùng ở vật chủ. Vỏ nhày ức chế đại thực bào và
gây ra đáp ứng miễn dịch yếu. Ngoài ra vỏ nhày còn có tác dụng bảo vệ làm
tăng tính độc của vi khuẩn bệnh than. Thông thường, các khuẩn lạc xù xì sẽ độc
hơn các khuẩn lạc nhẵn.
Vỏ nhày không được hình thành khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường
dinh dưỡng thông thường. Nó chỉ hình thành trong môi trường thạch huyết ngựa
hoặc môi trường có bổ sung 0,7 % Na2CO3, ủ ở 37oC, trong điều kiện kị khí
[12]. Bản thân chuỗi poly- -D-glutamic không gây độc nhưng có chức năng bảo
vệ vi khuẩn chống lại thành phần diệt khuẩn của huyết thanh và bạch huyết,
chống lại hiện tượng thực bào trên bề mặt tế bào [12,24]. Vì vậy, vỏ nhày có vai
trò trong suốt quá trình xâm nhiễm và có vai trò nhất định trong giai đoạn cuối
của bệnh.
Polymer acid D-Glutamic được hình thành chủ yếu bởi các liên kết peptide
giữa γ carboxyl và các nhóm α-NH2. Kích thước của chuỗi polyglutamic dường
như khác nhau phụ thuộc vào điều kiện phát triển của B. anthracis, trong invitro
17


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
chúng từ 20-55 kDa, trong khi đó, ở invivo chúng có chứa hàng ngàn gốc với
trọng lượng phân tử là 215 kDa. Sự liên kết của capsule phụ thuộc vào các
cation hóa trị II (Mg2+, Ca2+) (chúng liên kết các nhóm acid của polymer) và sự
hidrat hóa [6].

Theo tài liệu tổng hợp của Koehler (2002), Quá trình tổng hợp capsule
được mô tả gồm 3 bước. Đầu tiên, khi có mặt acid L-glutamic, Mg2+ và
hydroxlamine, một enzyme hoạt hóa glutamyl xúc tác hoạt hóa sự hình thành
glutamyl hydroxamate phụ thuộc ATP. Khi không có mặt hydroxlamine, gốc γL-glutamyl được hình thành. Dạng iso D không phải là tiền chất cho phản ứng
enzyme. Tiếp theo bước hoạt hóa, γ-L-glutamyl được chuyển thành γ-Dglutamyl. Bước cuối cùng là chuyển acid glutamic đã được hoạt hóa vào một
chất nhận liên kết trong với màng (γ-D-glutamyl). Do đó, chuỗi polyglutamyl
được kéo dài nhờ bổ sung các gốc glutamyl mới vào nhóm amin của gốc
glutamyl của chất nhận [24].
1.4. Sự biểu hiện của các độc tố
Các độc tố được hình thành trong suốt quá trình nhân lên của tế bào dinh
dưỡng trong cơ thể vật chủ. Trong invivo, sự tổng hợp các độc tố được cảm ứng
bởi việc bổ sung carbonate và phụ thuộc nhiệt độ.
Sự biểu hiện các gen độc tố được điều hòa bởi carbonate và nhiệt độ ở
mức độ phiên mã [5,45]. Tương tự carbonate nhưng nhiệt độ làm tăng sự phiên
mã capB [32]. Sự phụ thuộc nhiệt độ của giai đoạn tổng hợp capsule có thể do
ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme.
Người ta đã xác định được hai nhân tố chính điều hòa sự dịch mã và biểu
hiện của gen là atxA và acpA.
Gen atxA mã hóa nhân tố hoạt hóa độc tố than nằm trên pXO1. Đây là
nhân tố điều hòa toàn bộ sự biểu hiện của gen độc tố của B. anthracis. Các
chủng B. anthracis đột biến mất atxA không sản sinh được EF, LF, và PA hoặc
sản sinh lượng ngoài giới hạn phát hiện và khả năng tổng hợp capsule giảm. Gen
atxA đã được phát hiện thuộc 2 nhóm độc lập [49]. Gen atxA là nhân tố điều hòa
dương cho sự hoạt hóa quá trình dịch mã của các gen độc tố. Sự hoạt hóa này
18


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

phải thực hiện trong môi trường có nồng độ CO2/bicacbonat cao. Ngoài ra atxA
còn thực hiện một vai trò khác là điều chỉnh sự biểu hiện của các gen độc tố khi
nó xâm nhiễm vào tế bào vật chủ để gây độc [11,17,24].
Để hiểu rõ vai trò của nhân tố điều hòa atxA, người ta tiến hành gây đột
biến để tạo một thể đột biến atxA. Khi nuôi cấy trong môi trường giàu dinh
dưỡng, thể đột biến atxA và chủng gốc có sự phát triển như nhau. Nhưng trên
môi trường nghèo dinh dưỡng như môi trường tổng hợp XO hoặc các môi
trường tương tự khác thì thể đột biến không gây độc của chủng Sterne (pXO1+
pXO2-) rất khó phát triển. Thể đột biến này tạo ra những đám khuẩn lạc nhỏ hơn
so với chủng gốc. Như vậy gen atxA có liên quan trực tiếp đến sự tổng hợp vỏ
capsule có nghĩa là nó liên quan đến gen mã hóa vỏ capsule. Đồng thời, sự có mặt
của atxA còn có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành bào tử. Thể đột biến atxA của
chủng Sterne tạo nhiều bào tử hơn khi phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng,
còn chủng Sterne ban đầu mang đột biến atxA nhưng đã loại bỏ các gen độc tố thì
không có đặc tính trên. Điều đó thể hiện sự liên quan chặt chẽ của atxA và các gen
độc tố [17].
Gen acpA mã hóa nhân tố điều hòa hoạt động trans đặc hiệu đối với sự
biểu hiện của các gen sinh tổng hợp capsule. acpA do Vietri và cộng sự (1995)
phát hiện khi gây đột biến gen nhảy của chủng B. anthracis (pXO1-, pXO2+).
Dạng đột biến chèn đoạn Tn 917 tạo khuẩn lạc xù xì khi nuôi cấy trong điều
kiện thích hợp cho sinh tổng hợp capsule. Chủng đột biến này bị mất đoạn 8,2
kb nằm ngoài vùng gen cap ở pXO2. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy gen acpA
cần thiết cho sự phiên mã của capB, gen đầu tiên trong operon cap ở các chủng
pXO1-, pXO2+ [50].
Các nghiên cứu tiếp theo đã cho thấy sự tương đồng về cấu trúc và chức
năng giữa 2 nhân tố điều hòa này. Gen atxA và acpA mã hóa các protein có kích
thước lần lượt là 56 và 55 kDa và trình tự acid amin có 28 % đồng nhất và 51 %
tương đồng. So sánh trình tự AtxA cà AcpA với các protein khác trong ngân
hàng dữ liệu thì không thấy có sự tương đồng. Tuy nhiên, các nhân tố điều hòa
của B. anthracis giống nhau tới 47-52 % so với protein điều hòa của

19


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Streptococus pyrogene, Mga (Nhân tố hoạt hóa nhiều gen), protein này liên kết
đặc hiệu với trình tự DNA đích của các gen độc nhất định ở Streptococus
pyrogene. Tuy nhiên trình tự acid amin phỏng đoán của AtxA và AcpA không
cho thấy khả năng liên kết DNA và sự tương tác đặc hiệu trình tự giữa các nhân
tố điều hòa và các vùng promoter của gen đích chưa được giải thích [24].
Xem xét các nhân tố điều hòa kiểm soát dương sự biểu hiện của các gen
độc cảm ứng bởi CO2/bicarbonat, Uchida và cộng sự (1997) đã kiểm tra sự
tương đồng chức năng của atxA và acpA [96]. acpA được tách dòng từ plasmid
nhiều bản copy ở chủng pXO1+, pXO2- không hoạt hóa sự biểu hiện của gen độc
tố. Tác nhân điều hòa AtxA mã hóa ở pXO1 kiểm soát gen độc ở cả 2 plasmid,
trong khi AcpA mã hóa ở pXO2 chỉ kiểm soát sự biểu hiện của capsule. Các
chủng mang cả 2 plasmid tổng hợp nhiều capsule hơn các chủng chỉ mang
pXO2 (35) và sự biểu hiện capsule tăng được cho là do AtxA. Ở những chủng
pXO1-, pXO2+, mức độ mRNA của acpA tăng trong quá trình nuôi cấy có
CO2/bicarbonat hơn là nuôi cấy ngoài không khí [50]. Điều này cho thấy mức
AcpA hạn chế sự biểu hiện của cap. Ngược lại, mRNA atxA và mức protein
trong các tế bào pXO1+, pXO2- không bị ảnh hưởng bởi tín hiệu
CO2/bicarbonat.
Cùng với hai nhân tố điều hòa acpA và atxA, người ta cũng tìm thấy một
gen pagR kích thước 300 bp, nó cùng được dịch mã xuôi chiều với gen pagA.
Gen pagR mã hóa cho một protein có trình tự acid amin giống với các tác nhân
điều hòa dịch mã trong các sinh vật khác. PagR là nhân tố ức chế sự biểu hiện
của operon pagA, gen này được phiên mã đồng thời với gen pagA. Sự phiên mã
từ promoter pagA sẽ tạo ra các bản sao đơn cistron chỉ có chứa pagA và 1 bản

sao 2 cistron mã hóa cho cả pagA và pagR. Sự biểu hiện của pagR với pagA phụ
thuộc atxA và được tăng cường bởi CO2. PagR thường ức chế sự biểu hiện của
atxA, thể đột biến pagR sản sinh số lượng atxA mRNA gấp hai lần so với chủng
gốc. Do đó, người ta cho rằng ảnh hưởng của pagR đến sự biểu hiện của pagA
xảy ra thông qua AtxA là do mức độ AtxA không hạn chế sự biểu hiện của
pagA, pagR [19,24].
20


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Sự dịch mã các gen độc tố và gen mã hóa vỏ capsule tăng lên khi tế bào
phát triển trong môi trường có nồng độ CO2/bicacbonat cao và ngược lại, nếu
nồng độ này thấp sẽ ức chế quá trình dịch mã [18].
Hai nhân tố là CO2/bicacbonat và nhiệt độ cũng đóng vai trò quan trọng
trong sự biểu hiện của 3 gen độc tố. Sự tổng hợp độc tố thu được nhiều nhất khi
ủ canh trường có nồng độ CO2 >> 5 % hoặc bổ sung bicacbonat vào môi trường
đã được đậy kín. Sự tổng hợp độc tố khi ủ canh trường ở nhiệt độ 37 oC cũng
nhiều hơn khi ủ ở 28oC [18,25].
Như vậy, quá trình dịch mã và biểu hiện của gen độc tố và gen mã hoá vỏ
capsule trong vi khuẩn B. anthracis được điều khiển bởi 3 nhân tố điều hòa là
acpA, atxA và pagR. Đồng thời 2 yếu tố CO2/bicacbonat và nhiệt độ cũng chi
phối sự biểu hiện của các gen độc tố [7,32,38].

Hình 1.8. Điều khiển các gen độc tố trong vi khuẩn B. anthracis
1.5. Kháng nguyên bảo vệ PA
1.5.1. Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA
Kháng nguyên bảo vệ PA là thành phần quan trọng trong quá trình gây
độc của vi khuẩn B. anthracis. Phân tử PA hoàn chỉnh có trọng lượng 83 kDa,

gồm 735 acid amin, kích thước không gian 3 chiều là 100x50x30A o. Kháng
21


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
nguyên bảo vệ PA do gen pagA mã hóa, gen này nằm trên plasmid pXO1
(185 kb) [7,32,38].
Mặc dù bản thân PA không gây độc nhưng nó lại có khả năng dẫn
truyền các độc tố vào bên trong tế bào vật chủ. PA83 có khả năng kết hợp
thụ thể trên bề mặt tế bào. Dưới tác dụng của protease nội bào họ furin,
PA83 sẽ bị phân tách thành 2 phần là PA20 và PA63, để lộ ra vị trí liên kết
với LE và EF. Đây là bước rất nguy hiểm trong quá trình gây độc của PA.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy nếu trên phân tử PA83 không chứa vị trí
phân cắt này thì không có khả năng gây độc. Sau đó, 7 mảnh PA63 sẽ liên
kết với nhau để tạo thành vòng heptam có 7 nhánh. Khi vòng heptam tổ
hợp với nhân tố LF sẽ gây chết và tổ hợp với nhân tố EF sẽ gây phù thũng
cho tế bào vật chủ. Vì vậy, kháng nguyên bảo vệ PA được coi là tác nhân
gián tiếp gây ra hiệu quả độc tố của nhân tố gây chết và phù thũng [32,38].
Bên cạnh đó, PA còn có vai trò chính trong miễn dịch bệnh than.
Người ta đã nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch của nhiều kháng
nguyên vi khuẩn B. anthracis như vỏ capsule, S-layer hay các protein khác,
kết quả đã cho thấy chỉ có các protein hình thành độc tố than mới có khả
năng kích thích miễn dịch sinh kháng thể. Trong đó, PA kích thích miễn
dịch sinh kháng thể nhờ khả năng trung hoà độc tố than [9]. Kháng thể
kháng PA sẽ phá huỷ protein PA ở vị trí liên kết với thụ thể trên tế bào vật
chủ hoặc phá huỷ vị trí phân cắt trên vùng I của PA83. Chính nhờ vai trò
dẫn truyền quan trọng của PA cũng như khả năng kích thích cơ thể sản sinh
kháng thể chống bệnh than nên PA đã trở thành tâm điểm chú ý của nhiều

nghiên cứu chẩn đoán, phòng ngừa bệnh than cũng như các nghiên cứu sản
suất vaccine sử dụng nguyên liệu là protein kháng nguyên bảo vệ tái tổ
hợp.
1.5.2. Cấu trúc và đặc tính kháng nguyên bảo vệ PA
Phân tử PA hoàn chỉnh gồm 735 acid amin (Mr82,684). Nó có trình tự
tương đồng với một họ các độc tố nhị nguyên ADP – ribosyltransferase như:
tiểu phần B của Clostridium botulinum C2 (33 %), Clostridium difficile cdt (35
22


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
%), độc tố iota-1b của Clostridium perfingens (34 %), Clostridium spiroforme
Sb (33 %) và protein VIP1 của Bacillus cereus (27 %). Nhưng trình tự tương
đồng giữa PA và họ độc tố nhị nguyên ADP-ribosyltransferase không bao gồm
vùng IV, điều này chỉ ra sự khác biệt giữa các thụ thể của các độc tố.
Kháng nguyên bảo vệ PA được tạo thành bởi các cấu trúc β đối song song. Kích
thước phân tử PA dạng duỗi thẳng là 100 x ~ 50 x 30 Ao. Phân tử PA83 hoàn
chỉnh gồm 4 phần chức năng [35]:
Vùng 1 (1-249): Cấu trúc xoắn , vùng này chứa 2 ion Ca2+ và một vị trí
hoạt hoá phân giải của các protease. Sau khi PA được hoạt hoá bởi protease nội
bào, nó sẽ giải phóng ra mảnh PA20 có chứa đầu N và mảnh PA63 chứa đầu C.
Mảnh PA20 sau khi giải phóng sẽ bị phân giải trong môi trường, 7 mảnh PA63
sẽ liên kết lại với nhau tạo nên vòng heptam có 7 nhánh (PA63)7, cấu trúc này
tan trong nước và xâm nhiễm vào trong tế bào vật chủ [38] (Hình 1.9). Ngoài ra
vùng đầu C này còn chứa các acid amin cần thiết cho liên kết của PA với EF,
LF.
Vùng II (250-487): là một lõi

rỗng chứa vòng xoắn lớn và linh hoạt

giữa 2 chuỗi 2β2 và 2β3. Vòng xoắn này (302-325) liên quan đến sự hình thành
lỗ màng. Ngoài ra, vùng II còn liên quan đến sự hình thành vòng heptam. Ở pH
thấp, heptam sẽ biến đổi và chuyển từ dạng tiền lỗ thành lỗ, sắp xếp lại 7 vòng
xoắn sẽ sắp xếp lại để tạo thành một lõi gồm 14 chuỗi

bắc cầu qua màng.

Vòng này có điểm cắt cho chymotrysin (Phe313- Phe314), hai gốc này còn có liên
quan tới sự vận chuyển EF và LF vào trong tế bào chất [82]. Vòng heptam tạo
thành nên kênh chọn lọc trong màng nhân tạo cũng như màng tế bào [31].
Vùng III (488-594): là vùng nhỏ nhất trong 4 vùng, có cấu trúc

kiểu

gấp nếp. Vùng này chứa một lõi kị nước (282-328) gồm 101 acid amin của 5
trình tự nhắc lại nối đuôi nhau và dường như được tạo ra thông qua quá trình sao
chép. Vùng này bao gồm 4 tấm

bện chặt hỗn độn và 4 vòng xoắn ốc nhỏ và 1

khe tương tự như ở ferredoxins và vùng A của độ tố gây hội chứng shock độc 1
(toxic-shock-sydrome toxin 1) [38]. Vùng này liên quan đến sự tương tác giữa
23


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

các protein với nhau. Có nghiên cứu còn cho rằng cho rằng vùng III có nhiều
chức năng khác như tham gia vào quá trình oligomerization tạo thành heptam
(PA63), liên kết với thụ thể và liên kết với enzyme thuỷ phân [33].
Vùng IV (595-735): đây là vùng liên kết với thụ thể và chứa vị trí epitop
quyết định kháng nguyên của PA. Vùng này đã được chứng minh là có khả năng
gây đáp ứng miễn dịch. Nó gồm hai vùng là vòng xoắn lớn (704-723) và vòng
xoắn nhỏ (679-693), trong đó chỉ có vòng xoắn nhỏ là có trình tự liên kết với thụ
thể. Ngoài ra còn có các gốc ở cuối đầu C tham gia hỗ trợ cho việc liên kết. Nếu
loại bỏ 2 phần là đầu C và vòng xoắn nhỏ sẽ làm giảm tính độc bằng cách ức chế
sự liên kết của PA với thụ thể. Kháng thể đơn dòng kháng vùng này có thể phã
vỡ sự liên kết thụ thể của PA [28,32]

Vïng 1
Vïng 3
VÞ trÝ ho¹t hãa ph©n
c¾t PA63 vµ PA20

Vïng 4

Vïng 2

VÞ trÝ liªn kÕt thô thÓ

Hình 1.9. Cấu trúc PA83

Hình 1.10. Cấu trúc vòng heptam (PA63)7 và tiền lỗ màng (prepore)

24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.5.3.

/>
Đặc điểm gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA
Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hóa bởi gen cấu trúc pagA nằm trên
plasmid pXO1. Gen pagA có khung đọc mở (ORF) dài 2319 codon, trong đó
đoạn kích thước 2205 bp mã hoá cho 735 acid amin của protein hoàn chỉnh
PA83. Trước vùng mã hoá protein này có 29 codon mã hoá chuỗi peptid tín hiệu
có đặc tính tương tự ở những protein khác do B. anthracis tiết ra. Chúng đều tích
điện âm, có đầu cuối N gồm 5 acid amin (Met-Lys-Lys-Arg-Lys), vùng kị nước
trung tâm (6-21), gốc alanine [51].
Thành phần base của gen pagA có tỉ lệ A+T cao, chiếm đến 69%, trong đó
A=39 %, T=30 %, G=17 %, C=14 %. Thành phần base này khác với những gen mã
hoá protein ở những vi khuẩn khác. Gen cấu trúc của protein hoàn chỉnh PA83 bắt
đầu từ vị trí nt 1891, đứng trước vị trí này là hai codon mở đầu ATG (mã hoá cho
acid amin methionin) nằm ở vị trí nt 1834 và nt 1804. Gen mã hoá PA83 không có
codon mã hoá cystein [51].
Theo nghiên cứu của Price và cộng sự năm 1999, khi nghiên cứu 26
chủng B. anthracis khác nhau thì thấy xuất hiện 5 đột biến điểm, trong đó, có 2
đột biến làm biến đổi acid amin và 3 đột biến cùng nghĩa. Theo lý thuyết, tỉ lệ
đột biến làm biến đổi acid amin so với đột biến cùng nghĩa là 1: 5. Tuy nhiên ở
đây, tỉ lệ này lớn hơn. Những đột biến làm biến đổi acid amin nằm ở vùng có
tính kháng nguyên cao, nằm ngang phần giao nhau của vùng III và vùng IV ảnh
hưởng tới vùng liên kết với LF [39].
Các dữ liệu về trình tự PA đã được công bố như trình tự promoter PA có
thể được sử dụng để phát hiện bởi các vector dò promoter (promoter-probing
vectors). Trình tự này có thể gây đột biến để tăng sản lượng protein tái tổ
hợp PA trong tế bào biểu hiện E. coli hoặc B. subtilis. Sự đột biến đặc thù

trên PA cũng được thực hiện nhằm: tăng khả năng sinh đáp ứng miễn dịch,
bất hoạt các protein phản ứng chéo trong vaccine nghiên cứu và kiểm tra vai
trò các vùng chức năng của PA khi liên kết với màng tế bào vật chủ để đưa
các nhân tố EF và LF vào trong tế bào vật chủ. Ngoài ra, trình tự nucleotide
25