Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzym

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


LÊ KIM THANH

ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ
LÊN HOẠT TÍNH XÚC TÁC
CỦA ENZYME BROMELAIN TRONG QUẢ DỨA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08



Người hướng dẫn
TRẦN THANH TRÚC
NĂM 2007
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang ii
Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài :” Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên
hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain trong quả dứa” do Lê Kim Thanh thực
hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua.

Cán bộ hướng dẫn Cán bộ phản biện

Trần Thanh Trúc Nguyễn Thị Thu Thủy

Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2007
Chủ tịch hội đồng

Nguyễn Văn Mười

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang i
















LỜI CẢM TẠ





Em xin chân thành gửi lời cảm tạ và biết ơn sâu sắc đến:
Cô Trần Thanh Trúc đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận
lợi nhất cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp;
Và cô Nguyễn Thị Thu Thủy đã nhiệt tình truyền thụ những kiến
thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho em trong quá
trình thực hiện đề tài;
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô phòng thí nghiệm Công Nghệ
Enzyme, Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã
nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề
tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực
Phẩm đã tận tình giảng dạy và truyền thụ những tri thức quý báu cho
chúng em trong suốt thời gian học tập.
Em xin cảm ơn thầy cố vấn Nhan Minh Trí và tập thể các bạn lớp
Công Nghệ Thực Phẩm khóa 28 đã động viên và giúp đỡ em trong
suốt khóa học vừa qua.
Cần Thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2007
Sinh viên thực hiện
Lê Kim Thanh
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang i
TÓM TẮT
Trong công nghiệp chế biến thực phẩm từ quả dứa, sự biến đổi của các thành phần và
giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thường xảy ra trong quá trình tiền xử lý. Bên cạnh đó,
sự tương tác giữa các thành phần bên trong nguyên liệu cũng có thể dẫn đến những
biến đổi không mong muốn như trên. Một trong những nguyên nhân gây ra điều này
đáng được quan tâm là hệ enzyme trong quả dứa mà tiêu biểu là hệ enzyme

protease_bromelain quả. Đề tại này được đặt ra với mục đích là tìm ra quy luật hoạt
động của hệ enzyme bromelain quả từ dịch chiết quả dứa ở các điều kiện xử lý
pH = 4,6 – 9,5 và nhiệt độ từ 10 – 75
0
C.
Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ quả dứa được sử dụng cho nghiên cứu
enzyme bromelain tốt nhất từ ngày bảo quản thứ tư trở đi; và bảo quản dịch chiết chứa
enzyme tốt nhất là ở điều kiện lạnh đông.
Đồng thời, có sự tương tác giữa pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của hệ enzyme
bromelain quả trong dịch chiết. Hệ enzyme này thể hiện hoạt tính tối thích trong
khoảng nhiệt độ từ 10 – 20
0
C ở môi trường pH thấp, 30 – 40
0
C ở môi trường pH kiềm
(pH = 7,5 – 9,5) và 40 – 60
0
C ở môi trường pH trung tính (pH = 6,8 -7,1).

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang ii
MỤC LỤC
TÓM TẮT ........................................................................................................... trang i
MỤC LỤC................................................................................................................... ii
DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................. iv
DANH SÁCH BẢNG................................................................................................. iv
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................... 1
1.1 TỔNG QUAN........................................................................................................ 1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU................................................................................... 1
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................... 2
2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA................................................................................. 2
2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA........................................................... 3
2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa................................................................... 3
2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain ............................................................................. 4
2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính chung của enzyme bromelain.............................................. 5
i. Cấu tạo............................................................................................................. 5
ii. Hoạt tính enzyme bromelain............................................................................. 6
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain ................................ 7
i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ....................................................................... 7
ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH............................................................................... 8
2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME ............................................................. 9
2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản..................................................................... 9
2.3.2 Động học phản ứng enzyme.............................................................................. 10
2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN................................................................. 11
2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN........................... 12

2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 13
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15
3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ......................................................................... 15
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang iii
3.1.1 Nguyên liệu...................................................................................................... 15
3.1.2 Hóa chất thí nghiệm ........................................................................................ 15
3.1.3 Thiết bị thí nghiệm .......................................................................................... 15
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 16
3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu .......................................... 16
3.2.2 Bố trí thí nghiệm............................................................................................... 17
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN................................................................... 20
4.1 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản dịch chiết từ dứa chứa bromelain quả đến đặc
tính enzyme ................................................................................................................ 20
4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân
của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein ........................................................ 22
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 26
5.1 Kết luận ............................................................................................................... 26
5.2 Đề nghị................................................................................................................ 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 27
PHỤ LỤC.................................................................................................................... v

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang iv
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến.................................................................................. 2
Hình 2: Quả dứa (Ananase Comosus).................................................................................... 3
Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain .....................................6
Hình 4: Cấu trúc phân tử proteases cysteine ......................................................................... 6
Hình 5: Hình vẽ minh họa sự tác động của pH
môi trường
lên hoạt tính enzyme........................... 8
Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly bromelain quả (thô) ............................................................ 16
Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1%........................................................................ 16
Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả theo thời
gian bảo quản....................................................................................................................... 21
Hình 9: Mẫu dung dịch chiết chứa enzyme bromelain quả sau 12 ngày bảo quản ................. 22
Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của
enzyme bromelain trong dịch quả dứa.................................................................................. 23
Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ
khác nhau............................................................................................................................. 24
Hình 12: Đồ thị biểu diễn hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau ở
pH thấp................................................................................................................................ 25
Hình 13. Đường chuẩn tyrosine............................................................................................ vii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein ................................................................. 12
Bảng 2: Kết quả theo dõi hoạt tính của enzyme bromelain trong dung dịch dứa tươi theo thời
gian bảo quản....................................................................................................................... 20
Bảng 3: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ môi trường xử lý lên
hoạt tính của enzyme bromelain quả .................................................................................... xii

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 1
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 TỔNG QUAN
Khoảng 20 năm gần đây, với hơn 400 đề tài nghiên cứu, giới khoa học Châu Âu đã đưa
ra một khuyến cáo rằng “với một quả dứa mỗi ngày, bạn sẽ không cần gặp bác sĩ”
(Harvey and Ross, 1985). Câu nói trên đã được khoa học thực tiễn xác minh là phù hợp
với dược tính đặc biệt của quả dứa. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy quả dứa loài
Ananas có khả năng dược lý cao là do trong thành phần của quả có hệ enzyme
bromelain, hay còn gọi là enzyme dứa.
Bromelain là tên gọi chung của một nhóm enzyme thực vật, được tìm thấy từ những
cây dứa loài Ananas, họ Bromeliaceae. Enzyme này đã mang đến cho giống dứa
Ananas sự nổi tiếng về khả năng dược lý trong việc chữa trị các bệnh về đường tiêu hóa
và giảm đau, giảm sưng do viêm nhiễm.
Về mặt thực phẩm, dứa là một loại cây ăn quả có nhiều giá trị dinh dưỡng và rất được
ưa chuộng. Về mặt khoa học, dứa là một nguồn thực vật chứa loại enzyme đặc biệt có
dược tính cao. Trong chế biến thực phẩm từ quả dứa, vấn đề đặt ra là cần quan tâm đến
sự biến đổi về thành phần, giá trị dinh dưỡng và hệ enzyme trong quả dứa. Với vai trò
không kém phần quan trọng, hệ enzyme trong quả dứa cũng cần được quan tâm đúng
mức. Tuy nhiên, để biết được sự biến đổi về hoạt tính của hệ enzyme bromelain quả,
cần phải biết quy luật chung về hoạt tính xúc tác của chúng.
Giống như các enzyme khác, hoạt tính xúc tác của enzyme “bromelain quả” cũng chịu
ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố, trong đó nhân tố pH và nhiệt độ, là hai nhân tố được quan
tâm nhiều nhất trong quá trình chế biến thực phẩm từ quả dứa. Từ vấn đề đặt ra trên,
việc nghiên cứu khảo sát các ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của hệ
enzyme bromelain trong quả dứa là cần thiết, nhằm tạo tiền đề và cơ sở cho việc nghiên
cứu lâu dài về hệ enzyme này.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Khảo sát tác động của việc xử lý pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme
bromelain quả trên cùng một loại cơ chất. Trên cơ sở đó, tìm hiểu được quy luật biến
thiên về hoạt tính của hệ enzyme này theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ chế biến
nhằm phục vụ cho công nghệ chế biến các sản phẩm từ dứa.

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 2
Ruộng dứa Dứa Queen
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA
Dứa là loại cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được đưa tới các đảo khu
vực Caribe nhờ những thổ dân Anhdieng Carib. Năm 1493, Christopher Columbus lần
đầu tiên đã nhìn thấy các loại cây của chi này tại Guadeloupe. Ông đã đem chúng về
Châu Âu và từ đây chúng được người Anh và Tây Ban Nha phát tán tới các đảo trên
Thái Bình Dương (Morrison, 1963). Năm 1813, các cánh đồng trồng dứa thương phẩm
được thành lập tại Hawaii, Philippines, Đông Nam Á, Florida và Cuba. Dứa đã trở
thành một trong 3 loại cây ăn quả phổ biến nhất trên thế giới, sau chuối và các loại quả
họ citrus (Anon, 1993).
Dứa có tên khoa học là Ananas comosus. Thuộc loài Ananas, họ Bromeliaceae. Một số
giống dứa trồng phổ biến nhất hiện nay là giống Queen và Cayenne, tên khoa học là
Ananas comosus (Linnaeus) merril (Brasil). Ngoài ra, còn có một số giống dứa ăn quả
phổ biến khác như Ananas sativus, Ananas bracteatur (Lindley) (Nam Mỹ).. (Collin et
al., 1931).


Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến
Hiện nay, trên thế giới cây dứa được trồng ở hầu hết các nước nhiệt đới như
Philippines, Thái Lan, Malaysia, Brazil, Mexico, Cuba, Nam Phi..và một số nước cận

nhiệt đới như đảo Hawaii, Đài Loan..
Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước hiện khoảng 40.000 ha
với sản lượng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều
ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An… miền Bắc có
Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Giang, Phú Thọ….miền Trung có Nghệ An, Quảng
Dứa Cayenne
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 3
Nam, Bình Định,… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc khoảng 10
tấn, phía Nam 15 tấn/ha.
Dứa là một loại quả nhiệt đới có giá trị dinh dưỡng và giá trị năng lượng cao. Dứa được
sử dụng trong chế biến thực phẩm và rất được ưa chuộng. Thành phần hóa học của quả
dứa bao gồm nước (81 – 87%), sacharose (4,59 – 12%), glucose, fructose, vitamine
nhóm B, vitamine C và các khoáng chất Fe, Na, K, P, Mg..
Ngoài ra trong quả dứa còn có một hệ các acid hữu cơ đa dạng, tạo nên vị chua, thơm
hấp dẫn cho quả như acid citric (28 – 66% tổng lượng acid trong quả) (Gortner, 1963),
acid ascorbic (từ 200 – 710 mg/l) (Singleton, 1955), acid malic (18 – 30% tổng lượng
acid trong quả (Chan et al.,1973), acid oxalic, acid formic..Hàm lượng acid trong quả
thay đổi theo độ chín của dứa và chúng được phản ánh bởi thông số pH. Khi trái chín
chuyển sang màu vàng, độ pH giảm xuống từ 3,9 – 3,7 (Teisson và Pineau, 1982).
2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA
2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa
Trong dịch chiết từ thân cây dứa và quả dứa có một hệ enzyme khá đa dạng và phức
tạp, chúng thay đổi trong suốt quá trình phát triển của cây và quả dứa. Giống như ở các
loại thực vật khác, hệ enzyme trong cây dứa cũng bao gồm nhiều nhóm enzyme với các
đặc tính khác nhau, trong đó, nhóm enzyme protease chiếm đa số. Protease trong dứa
gồm có cysteine protease, đây là nhóm enzyme chính với đại diện là enzyme
bromelain; ngoài ra còn có một lượng ít các enzyme peroxidase, amylase, cellulase,

acid phosphatase.
(Nguồn: truy cập ngày:
13/11/2006)
- Enzyme peroxidase, tồn tại và có hoạt tính không đổi trong suốt quá trình phát
triển của quả. Tuy nhiên, trong quả chín lượng enzyme này giảm dần, chỉ còn
khoảng 1/3 so với ban đầu (Gortner và Singleton, 1965).
- Cysteine protease là nhóm enzyme proteolytic chủ yếu nhất được tìm thấy trong
dịch thân và quả dứa. Protease trong quả xuất hiện từ lúc bắt đầu ra hoa, tăng dần
về số lượng trong suốt thời kỳ phát triển của quả. Ở giai đoạn quả chín, lượng
enzyme này cũng có xu hướng giảm dần (Gortner và Singleton, 1965; Lodh et al.,
1972).
- Từ cây dứa loài Ananas, người ta đã tìm thấy được có tối thiểu 4 loại cysteine
protease khác nhau (Rowan et al., 1988). Protease hiện diện chủ yếu trong dịch từ
thân dứa là bromelain thân, ngoài ra còn có ananain (EC 3.4.22.31) và
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 4
comosain. Trong dịch quả dứa, cysteine protease chủ yếu là bromelain quả.
- Từ một số nghiên cứu khác, các nhà khoa học còn tìm thấy trong dịch từ thân và
quả của một loại dứa Bromelia pinguin (cùng họ Bromeliaceae) cũng chứa
enzyme protease tên là pinguinain (EC.3.4.99.18). Loại này chỉ có một số đặc
tính đặc biệt và hoạt tính hydrolase kém hơn so với bromelain (Toro-Goyco et al.,
1968).
- Từ quả xanh của giống Bromelia Hieronymi Mez, họ Bromeliaceae, các nhà khoa
học đã tìm thấy được một loại peptidase mới tên là Hieronymain I. Loại enzyme
này cũng đã được xác lập vào nhóm cysteine protease (Bruno M.A.; Pardo M.F.;
Caffini N.O.; López L.M.I, 2003).
Trong quá trình phát triển của cây và trái dứa, dịch chiết thân và trái còn chứa một số
các enzyme dehydrogenase, synthase, pectin methyl esterase, pectin galactoronase

nhưng với số lượng rất thấp.
2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain (bromeline)
Enzyme bromelain lần đầu tiên được biết đến vào khoảng thế kỷ XIX. Năm 1892, nhà
khoa học Chittenden là người đầu tiên đã tìm thấy sự hiện diện của một loại enzyme có
khả năng thủy phân protein trong dịch của cây và trái dứa, Ananas Comosus
(pineapple). Ông đã gọi nó là “bromeline”. Sau này, thuật ngữ “bromeline” hay
“bromelain” đã được dùng để gọi chung các enzyme thủy phân protein (protease), được
tìm thấy từ những cây giống cây dứa thuộc cùng họ Bromeliaceae.
(Nguồn: truy cập ngày: 15/12/2006)
Bromelain hiện diện ở tất cả các phần của cây dứa, loài
Ananas. Chúng chiếm trên 50% protein trong thân dứa và
quả dứa. Do đó enzyme bromelain còn được gọi là
“enzyme dứa”. Tùy theo nguồn gốc, bromelain được phân
làm 2 loại là bromelain thân (trích từ dịch thân dứa) và
bromelain quả (trích từ dịch quả dứa)
Trong công nghiệp, phần thân cây dứa được dùng làm
nguyên liệu chính để sản xuất ra enzyme bromelain thương
mại, vì đây là nguồn nguyên liệu dồi dào đặc biệt là sau
mùa thu hoạch trái.
Enzyme bromelain quả (EC 3.4.22.33)
- Tên gọi khác: bromelain quả, juice bromelain, bromelase, bromelain quả FA2.
Hình 2: Quả dứa
(Ananase Comosus)
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 5
- Hoạt tính: là một endopeptidase, xúc tác phản ứng thủy phân protein tại vị trí bất
kỳ trên mạch polypeptide.
- Cơ chất: thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng hợp tương tự như bromelain

thân.Tuy nhiên, bromelain quả hoạt động thủy phân tốt nhất trên cơ chất tổng hợp
Bz-Phe-Val-Arg+NHMec, không phản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như
bromelain thân.
(Nguồn: truy cập ngày:
13/11/2006)
Bromelain quả là một protease acid, có phân tử lượng khoảng từ 23 đến 31 kDa tùy
thuộc vào kỹ thuật phân tích của phòng thí nghiệm. Bromelain quả có điểm đẳng điện
pI = 4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân với pI = 9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et
al., 1985).
2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính của enzyme bromelain
i. Cấu tạo
- Mã số enzyme
 Bromelain thân: E.C.3.4.22.32
 Bromelain quả : E.C.3.4.22.33
(Nguồn: truy cập
ngày: 21/12/2006)
- Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain
- Tên khoa học và y học : sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease
- Tên thương mại : Bromanase (Kramer – Novis), Bromelain 2400 Maximum
Strength (Vitalize Corp)
Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch
chiết từ cây dứa, chủ yếu là các protease cysteine.
Enzyme bromelain là một protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có
chứa cysteine. Đây là một amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH
(sulfuhydryl). Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân
tử có tất cả 5 cầu nối disulfite.
Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amine thay đổi khác nhau. Bromelain
thân có khoảng 321 – 144 acid amin, còn bromelain quả thì có khoảng 283 – 161 acid
amin. Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 6
đầu carbonyl là glycine. Bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alanine.
Khi phân tích cấu trúc bậc một của bromelain, Murachi và Busan nhận thấy cách sắp
xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau
Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –
- Gly – Cys – Lys –
Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
ii. Hoạt tính enzyme bromelain
Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase,
amydase và esterase. Bromelain xúc tác phản ứng thủy
phân trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cả cơ chất tự
nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin,
BAA _ Benzoyl-L-Arginine amide, BAEE _Benzoyl-L-
Arginine Ethyl Esther, BAEM _ Benzoyl-L-Arginine
Methyl Esther…(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Nhóm sulfuhydryl trong phân tử của enzyme đóng vai trò
rất quan trọng trong các phản ứng của enzyme, là thành
phần trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác. Chúng có khả năng gắn với cơ chất để
tạo thành phức chất enzyme – cơ chất. Chúng tham gia vào nhiều biến đổi hóa học như
sự ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl hóa, tạo thành các mercaptide,
serine mercaptal, liên kết hydrogen và những phức hợp chuyển điện tích. (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia
xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và các amino
acid.

- Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain trong thân dứa cao hơn
bromelain trong quả xanh và quả chín.
R R
(- NH – CH – CO – NH – CH – CO - )
n

+ H - OH
Enzyme bromelain
n = k + i
R
( - NH – CH – COOH )
i

+


R
( H
2
N – CH – CO - )
k

Hình 4: Cấu trúc phân tử
proteases cysteine
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 7
- Đối với cơ chất tổng hợp như BAA, ở 5
0

C và pH = 6,0 thì hoạt tính phân giải của
bromelain trong quả xanh cao hơn bromelain trong thân và quả chín (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
Hoạt tính của bromelain có thể được xác định theo các đơn vị: đơn vị Rorer, đơn vị
BTU (đơn vị bromelain tyrosine), đơn vị CDU (đơn vị thủy phân casein), đơn vị GDU
(đơn vị thủy phân gelatin), đơn vị MCU (đơn vị đông tụ sữa)…
Thông thường người ta đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain dựa trên đơn vị MCU
hoặc GDU. 1 GDU tương đương với 1,5 MCU
( Nguồn: truy cập ngày: 12/12/2006)
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain
Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, hoạt tính của enzyme bromelain cũng
chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố:
 Nhân tố môi trường gồm nhiệt độ, pH, ion kim loại..;
 Nhân tố bên trong gồm nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, một số nhóm chức
của enzyme và độ tinh khiết của enzyme.
Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động xúc tác của enzyme bromelain còn
phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như cơ chất, bản thân enzyme,
thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hóa..
Bromelain là một enzyme có nguồn gốc thực vật vì thế tính chất của enzyme này sẽ gắn
liền với một số tính chất của loại thực vật chứa chúng. Trong số các tác nhân ảnh
hưởng đến hoạt tính của enzyme thì tác nhân vật lý là được quan tâm nhiều nhất bởi
các ứng dụng của nó trong thực tiễn sản xuất, đặc biệt là sự ảnh hưởng bởi nhiệt độ và
pH của môi trường xử lý enzyme hay trong quá trình chế biến loại thực vật chứa chúng.
i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ
Nhiệt độ có những ảnh hưởng ở nhiều mức độ khác nhau lên hoạt tính của enzyme.
Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các
enzyme bị mất hoạt tính trên 70
0
C (Lê Ngọc Tú, 2004).
Enzyme bromelain có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 45 – 60

0
C. Nhiệt
độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử
enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí
không gian của nhóm – SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất.
Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt
tính của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999).
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 8
pH tối thích
Độ hoạt
động của
enzyme
pH
pH
tối thích
Bên cạnh đó, nhiệt độ của phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc
biệt là thời gian phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động
làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn
tại của enzyme..
Theo nhiều nghiên cứu cho thấy
- Ở dịch chiết quả, (pH = 3,5), khi tăng nhiệt độ lên đến 60
0
C thì bromelain vẫn còn
hoạt tính.
- Bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ hơn
 Ở 5
o

C, pH = 4 – 10, enzyme bromelain giữ hoạt tính tối đa trên casein trong
vòng 24 giờ;
 Ở 55
o
C, pH = 6,1 ,enzyme bromelain bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút.
- Quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH
Giá trị pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme.
Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường. Mỗi loại enzyme thường chỉ
hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích.
.






Hình 5: Hình vẽ minh họa sự tác động của pH môi trường lên hoạt tính enzyme
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Độ pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của
enzyme và của cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất. Nếu pH quá cao hoặc quá thấp sẽ
làm ảnh hưởng đến điện tích và khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, có thể làm
giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme, do đó hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm hoặc thậm chí mất hẳn.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 9
Bromelain có biên độ pH hoạt động khá rộng, chúng có khả năng hoạt động tốt trong

khoảng pH = 3 – 10. Tuy nhiên, khoảng pH tối thích của enzyme bromelain lại là pH =
5 – 8. (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Trong phân tử enzyme bromelain, trung tâm hoạt động là cysteine, chứa nhóm hóa học
hoạt động mạnh là – SH . Khả năng xúc tác của nhóm cysteine là nhờ liên kết đồng hóa
trị được tạo thành thioester giữa nhóm acyl của cơ chất và nhóm sulfuhydryl của gốc
cysteine.
Trong môi trường pH sinh lý (pH = 6 – 8), phần lớn các nhóm – SH ở trạng thái không
ion hóa và sự tạo thành liên kết hydro với cơ chất là do sự tham gia proton của nhóm
– SH . Chính nhóm proton – SH sẽ làm tăng mật độ điện tích xung quanh nguyên tử
lưu huỳnh (Lê Ngọc Tú, 2004).
Bên cạnh đó pH còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác, mức độ ảnh hưởng của pH môi
trường lên enzyme tùy thuộc vào nhiệt độ, loại cơ chất, thời gian phản ứng, độ tinh
khiết của enzyme, bản chất của dung dịch đệm và sự hiện diện của chất tăng hoạt.
2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME
Enzyme là một chất xúc tác sinh học đặc hiệu, có vai trò xúc tác các phản ứng sinh hóa
diễn ra trong cơ thể sống. Về cấu tạo, enzyme có bản chất là protein, trong phân tử
enzyme có một hoặc vài bộ phận mang tính chất đặc hiệu, chỉ có bộ phận này mới tham
gia xúc tác phản ứng. Bộ phận này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trong
trung tâm hoạt động, có những nhóm chức hóa học có chức năng trực tiếp trong quá
trình xúc tác phản ứng. Tất cả các phần còn lại của enzyme đóng vai trò như một cái
khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác của enzyme.
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản
Tất cả các phản ứng sinh hóa đều có thể diễn ra với sự có mặt hay không có mặt
enzyme. Thông thường, các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất
tham gia phản ứng phải tiếp xúc với nhau ở vị trí tham gia phản ứng và chúng phải ở
trạng thái hoạt động. Muốn hoạt hóa các phân tử này cần cung cấp cho chúng một mức
năng lượng nào đó đủ để đạt đến trạng thái hoạt hóa. Năng lượng đó gọi là năng lượng
hoạt hóa. Khi có sự tham gia của enzyme, năng lượng cản trở được hạ thấp, nhờ vậy sự
tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất diễn ra dễ dàng hơn. Tức là đối với phản ứng có

enzyme, chỉ cần một mức năng lượng nhỏ cung cấp cho hệ thống thì phản ứng đã xảy
ra nhanh chóng.
Vai trò xúc tác của enzyme trong phản ứng hóa học là khi có sự tham gia của các
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 10
enzyme, cơ chất được hoạt hóa mạnh, làm thay đổi tính chất và cấu trúc của cơ chất, từ
đó sinh ra các sản phẩm mới của phản ứng (Lê Ngọc Tú, 2003).
2.3.2 Động học phản ứng enzyme
Năm 1913, hai nhà khoa học Lenom Michealis và Maud Menten đã đưa ra mô hình
động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh
mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme. Theo mô hình này,
enzyme (E) kết hợp với cơ chất (S) tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (E – S). Phức
hợp này sẽ được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme.
Enzyme được giải phóng sẽ thực hiện phản ứng mới.
Theo Michealis – Menten, cơ chế xúc tác tổng quát của phản ứng có enzyme được trình
bày theo sơ đồ:


Trong đó: K
1
, K
-1
, K
2
, K
-2
là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng.
K

-1
có giá trị nhỏ nhất.
Phản ứng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm là quan trọng nhất

K
2
tỉ lệ với nồng độ ES: v = K
2
.[ES] (v: vận tốc phản ứng)
Khi nồng độ ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Theo thuyết Mischaelis và Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác của enzyme xảy ra qua
ba giai đoạn:
 Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm hoạt
động của enzyme bằng các liên kết hóa học, tạo thành phức hệ enzyme cơ chất
(E-S). Ở giai đoạn này, các liên kết được hình thành thường là những liên kết
yếu nên phức hệ E – S thường không bền. Phản ứng tạo phức hệ này thường xảy
ra rất nhanh và cần có một ít năng lượng. Giữa E và S có năm loại liên kết tham
gia, mỗi loại có đặc tính riêng và năng lượng liên kết khác nhau, gồm liên kết
phối trí, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kỵ nước lực Vander-Waals và liên
kết do dịch chuyển điện tử.
 Giai đoạn hai: khi tạo thành phức hệ E – S, dưới tác dụng của enzyme, cơ chất
sẽ bị thay đổi về cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên kết bên
trong phân tử, dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia
ES E + P
K
2

E + S ES E + P
K
1

K
-1
K
2

K
-2
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 11
phản ứng. Sau đó xảy ra sự thay đổi mật độ điện tích của phức hợp E – S làm
biến dạng các liên kết giữa chúng, kết quả là cơ chất được hoạt hóa, dẽ dàng
tham gia phản ứng.
 Giai đoạn ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm của quá trình phản ứng được
tạo thành, enzyme tách ra và trở về trạng tháng ban đầu, chuẩn bị kết hợp với
phân tử cơ chất khác. Quá trình phản ứng hoàn thành.
(citied by P. R. Mathewson, 1998)
2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN
Để xác định hoạt tính xúc tác của một loại enzyme, điều quan trọng nhất là lựa chọn cơ
chất và phương pháp đo hoạt tính phù hợp. Khả năng xúc tác của enzyme phụ thuộc rất
nhiều vào loại cơ chất. Đối tượng nghiên cứu ở đây là bromelain quả, cơ chất được
chọn là casein sữa (hoặc có thể là dạng muối caseinate).
Casein là protein chủ yếu có trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa. Casein là
một trong những protein có tính acid vì trong phân tử của chúng có chứa nhiều gốc acid
glutamic và acid aspartic. Các casein đều có điểm đẳng điện pI= 4,6. Casein không có
cấu trúc bậc ba và bốn nên không bị biến tính theo định nghĩa mà bị biến đổi phần lớn
do bị thủy phân bằng enzyme hoặc do xử lý nhiệt, khi đó các liên kết peptide bị cắt đứt
và hình thành những nitro phi protein (các mạch peptide ngắn, acid amine tự do, muối

amonium..). Các muối caseinate thì bền với nhiệt và tan trong nước tốt hơn. Casein
trong sữa gồm bốn dạng chính: α (s1) và α (s2)-casein, β-casein, κ-casein.
(Lê Văn Việt Mẫn, 2004)
 α (s1)-casein: phân tử lượng khoảng 23000 Da, có 199 gốc acid amine. Do sự
phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân tử
loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước.
 α (s2)-casein: phân tử lượng khoảng 25000 Da, có 207 gốc acid amine, có tính
ưa nước cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm
phosphoryl và gốc cation nhất.
 β-casein: phân tử lượng khoảng 24000 Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưa
béo cao nhất. Dưới 40C, β-casein hoàn toàn bị khử trùng hợp do có nhiều tương
tác ưa béo bị phá hủy.
 κ-casein: phân tử lượng khoảng 19000 Da, có 169 gốc acid amine. Loại này chỉ
chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực. Đầu amino của phân tử
protein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 12
Casein trong sữa có nguồn gốc từ những chủng bò khác nhau thì có thể có cấu trúc bậc
một khác nhau. Tuy nhiên cấu trúc bậc một của cùng một loại casein chỉ khác nhau bởi
vài gốc acid amine trong phân tử protein của chúng (Lê Ngọc Tú, 2003).
Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein
Acid amine Tỉ lệ (%)
Glutamic Acid
Proline
Leucine
Lysine
Valine
Aspartic Acid

Serine
Tyrosine
Isoleucine
Phenylalanine
Threonine
Arginine
Histidine
Alanine
Methionine
Glycine
Tryptophan
Cystine
20,2 %
10,2 %
8,3 %
7,4 %
6,5 %
6,4 %
5,7 %
5,7 %
5,5 %
4,5 %
4,4 %
3,7 %
2,8 %
2,7 %
2,5 %
2,4 %
1,1 %
0,3 %

Nguồn: truy cập ngày: 16/12/2006

2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN
Shoshi et al. (1975) đã nghiên cứu về sự biến đổi về thành phần hóa học của bromelain
thân I-1 và bromelain quả A dưới sự tác động của 2-hydroxy-5-5-nitrobenzyl Bromide,
tetra nitromethane và H
2
O
2
. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dưới tác động của các hợp
chất trên, enzyme bromelain bị biến đổi mạnh về cấu trúc, thành phần các acid amine
trong phân tử, trong khoảng pH và nhiệt độ nhất định.
(Nguồn: truy cập
ngày: 15/03/2007)