Tài liệu Báo cáo tốt nghiệp "Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase, invertase, protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao" pdf

TRƯỜNG
KHOA…………………….
Đề tài
Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa
enzyme pectinase, invertase, protease trên cơ
chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
1
Mục lục
MỞ ĐẦU 3
Đặt vấn đề 3
Chương 2 5
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
Giới thiệu chung về ca cao 5
Sơ lược về cây ca cao 5
CHƯƠNG 3 21
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
Chương 4 32
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt
hóa enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt
ca cao 32
Chương 5 70
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70
2
Chương 1
MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Xã hội càng phát triển thì nhu cầu của con người ngày càng tăng. Các sản phẩm cao cấp
cũng ngày càng được sử dụng nhiều hơn, trong đó các sản phẩm từ ca cao ngày càng phổ
biến hơn.
Từ ca cao, người ta có thể chế biến ra rất nhiều loại sản phẩm như: bánh, kẹo nhân

chocolate; nước uống hương vị chocolate…Không những thế, cacao khô và một số thành
phần chocolate chứa rất nhiều nhóm chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng trong việc
duy trì hệ thống tim mạch hoạt động tốt, ngăn ngừa bệnh tim…(Theo Phạm Hồng Đức
Phước, 2009).
Tuy nhiên, để tạo ra được những sản phẩm từ ca cao chất lượng cao thì cần quan tâm đến
nhiều vấn đề trong đó cần chú trọng đến quá trình lên men ca cao. Quá trình lên men có
vai trò rất quan trọng nhằm tạo ra các hợp chất hóa học tạo nên hương vị đặc trưng cho
sản phẩm chocolate. Trong quá trình lên men có sự tham gia hoạt động của các enzyme
làm tăng hiệu quả các phản ứng tạo được nhiều tiền chất đặc trưng cho chocolate, làm
tăng chất lượng sản phẩm. Các enzyme quan trọng trong quá trình lên men của ca cao như
pectinase, protease, invertase,…
Do đó, muốn xác định thời điểm thích hợp bổ sung enzyme để quá trình lên men được tối
ưu tôi thực hiện đề tài “Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase,
invertase, protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao”.
3
1.1. Mục đích đề tài
- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới khả năng hoạt hóa của enzyme
pectinase, invertase, protease (giới hạn là sử dụng chế phẩm enzyme của hãng Novozym).
- Xác định được thời điểm bổ sung enzyme vào để hiệu quả lên men đạt cao nhất.
4
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Giới thiệu chung về ca cao
Sơ lược về cây ca cao
Cây ca cao có tên khoa học là Theobroma cacao L., thuộc họ Sterculiaceae, là loài duy
nhất trong số 22 loài của chi Theobroma được trồng sản xuất. Ca cao có nguồn gốc từ lưu
vực sông Amazon nằm ở Nam, Trung Mỹ và cũng đã được trồng rộng rãi ở đây từ hơn
500 năm trước. Sinh thái tự nhiên của cây ca cao là ở tầng thấp trong những cánh rừng
mưa nhiệt đới; nơi có cường độ ánh sáng thấp, ẩm độ không khí cao, biên độ nhiệt giữa
ngày và đêm cũng như giữa các tháng trong năm đều hẹp (Theo Phạm Hồng Đức Phước,

2009).
Hiện nay, ca cao được chia làm 3 nhóm chính, bao gồm: Criollo, Forastero và Trinitario.
2.1.1. Thành phần hóa học của quả và hạt ca cao
Nước, chất béo (bơ ca cao), carbohydrates, nitrogen, acid hữu cơ, mối khoáng,…Các
thành phần này sẽ có hàm lượng khác nhau ở chất nhầy, vỏ hạt và thịt hạt.
- Chất nhầy (thịt quả) có hàm lượng nước và đường cao nhất, ngoài ra còn có acid
citric làm cho pH của thịt quả luôn ở 3,5.
- Vỏ hạt có hàm lượng carbohydrates cao
- Thịt hạt có hàm lượng bơ ca cao rất cao, vỏ hạt có một ít và chất nhầy không có.
5
Hình 2.1 : Thịt quả ca cao
Bảng 2.1 Các thành phần của hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi
Thành phần Chất nhầy Vỏ hạt Phôi nhũ
Nước
Chất béo
(Bơ Ca cao)
Carbohydrate
Cellulose
Tinh bột
Pentosans
Sucrose
Glucose + Fructose
Nitrogen
Protein
Theobromine
Enzyme
Polyphenols
84,5
_
_

_
2,7
0,7
10,0
0,6
_
_
_
9,4
3,8
13,8
46,0
_
_
_
18,0
_
_
0,8
35,0
31,3
3,2
4,5
4,9
_
1,1
8,4
2,4
0,8
5,2

6
Acid hữu cơ
Citric & acetic, oxalic
Muối khoáng
Tổng số
0,7
0,8
100,0
_
8,2
100,0
0,6
2,6
100,0
(Nguồn: F. Hardy. Trích từ Phạm Chí Thông, 1999)
Theo Dr. Emile Cros, 1999 thì trong lớp cơm nhầy chứa khoảng 82% – 87% là nước, 10%
– 15 % đường, acid citric 1% – 3 %, protein 0,6%, pH ban đầu của lớp cơm nhầy vào
khoảng 3,6. Các thành phần này là cơ chất thích hợp cho hoạt động của các enzyme
protease, invertase và pectinase.
Với các thành phần trên thì việc ứng dụng các enzyme (pectinase, protease, invertase) phù
hợp với cơ chất có trong thành phần của lớp thịt quả (lớp cơm nhầy) là hướng đi chính
của đề tài.
2.1.2. Sơ chế hạt ca cao
 Thu hoạch quả cacao
Trong thu hoạch cần phải hái trái chín, vì nếu chưa chín hạt
trong trái khó bóc ra, khó ủ, tỉ lệ hạt tím và xám cao, năng
xuất cacao thô giảm nhiều. Nhưng trái chín lâu trên cây thì
trái dễ bị sâu bệnh, côn trùng phá hoại và bản thân trái cacao
bị chín rục, thối rữa và hạt trong trái sẽ nảy mầm (Theo Phạm
Trí Thông, năm 1999).

Quả sau khi thu hoạch được trữ khoảng 1 tuần như vậy sẽ
đem lại hiệu quả lên men cao hơn (Sưu tầm và biên dịch Cao
Xuân Lộc, năm 2007). Hình 2.2: Quy trình sơ chế
ca cao
7
Thu hoạch
Trữ trái
Đập vỏ, lấy hạt
Lên men
Bảo quản
Phơi, sấy cacao
Hình 2.3: Trữ trái ca cao trong lồng
làm bằng tre
Hình 2.4: Trữ trái ca cao trên nền nhà
 Lên men
Theo Phạm Trí Thông, năm 1999 có 4 phương pháp ủ hạt cacao.
 Ủ thành đống:
 Ủ thùng
 Ủ thúng/ cần xé
 Ủ trên khay.
Hình 2.5: Ủ thúng Hình 2.6: Ủ thùng
• Mục đích của quá trình lên men
Ca cao sau khi thu hoạch cần thiết phải lên men. Trong quá trình lên men các tiền
chất để tạo hương chocolate được hình thành. Do đó ca cao chất lượng chỉ đạt được sau
8
khi lên men đúng kỹ thuật. Lên men cũng làm giảm vị đắng và chát và hình thành màu
nâu đặc trưng của chocolate (khuyennongvn.gov.vn).
• Yêu cầu của quá trình lên men
Nhiệt độ trong quá trình lên men cần phải đạt từ 45 – 50
0

C để tiêu diệt sức sống
của hạt (tránh hạt nảy mầm), nhiệt độ này sẽ thuận lợi cho các phản ứng sinh hóa trong tế
bào xảy ra nhanh hơn.
Thời gian lên men từ 5 – 7 ngày đối với gống Forastero, Trinitario tùy điều kiện
thời tiết của từng vùng. Nếu lên men ngắn quá thì quá trình sinh hóa chưa xảy ra hoàn
thiện, nếu lên men quá dài thì sự phân hủy đối với một số chất hữu cơ trong hạt xảy ra
mãnh liệt và tạo ra các sản phẩm gây mùi khó chịu như: phân hủy protein thành NH
3
, ôxy
hóa các acid béo không no thành các aldehyt có mùi át mùi đặc trưng của ca cao, các phản
ứng tạo ester với các mùi không mong muốn…(Theo Bernard W.Minific, C. C., F.R.I.C,
năm 1980)
Mức độ thông khí thích hợp: thông thường quá trình lên men yếm khí xảy ra đối
với hạt cacao bình thường (không được lưu quả) là 32 – 48 giờ, và đối với hạt đã làm
giảm hàm lượng nước (lưu quả 9 ngày) thì sau 24 – 32 giờ và tiếp theo sau đó là quá trình
lên men hiếu khí (là giai đoạn cần không khí) tạo acid acetic. Như vậy, thời gian đảo cần
thiết đối với hạt bình thường (không được lưu quả) là 2 ngày 1 lần đối với hạt từ quả được
lưu 9 ngày là một ngày sau 48 giờ. (Theo Smilja, L., 2007)
Loại thùng ủ: Thùng ủ phải đảm bảo không có mùi vị lạ (mùi cao su, mùi xốp, ,
…), không bị acid ăn mòn, chất liệu thùng ủ không bị tác động bởi acid và cồn. Thùng ủ
còn phải có tác dụng dễ thoát dịch nhớt, giữ được nhiệt độ.
Khối lượng và độ cao khối hạt: Khối lượng hạt để đạt được kết quả lên men tốt là
từ 50 kg hạt tươi trở lên, độ cao khối hạt trong ủ lên men ở khối lượng vừa và nhỏ là
không quá 40 cm. Với khối lượng và độ vao này thì quá trình sinh hóa trong hạt sẽ xảy ra
9
một cách triệt để và theo xu hướng tốt (Theo Sterling S. Thompson, K. B. M., Alex
S.lopez, năm 2001)
• Cơ chế của quá trình lên men
- Sự lên men của lớp cơm nhầy ca cao Lớp cơm nhầy chứa một trữ lượng
đường cao (khoảng 15 % - 20 %) và do sự có mặt của acid citric tạo nên độ pH của lớp

cơm nhầy ban đầu là 3,5 là môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm men.
- Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, các nấm men như: Candida,
Debaryomyces, Hansenula, Saccharomyces… đã phát triển và chuyển hóa đường trong
chất cơm nhầy thành rượu ethylic và CO
2
theo phản ứng: (Theo Phạm Trí Thông, 1999)
C
6
H
12
O
6
2C
2
H
5
OH + 2CO
2
Sự chuyển hóa này xảy ra trong điều kiện khị khí, điều kiện này cho phép sự phát
triển của các vi khuẩn acid lactic _ Lactobacillus, chủ yếu là L.Plantarum, L.Collinoides
và L.Fermentum, cùng với sự sản sinh ra acid lactic. Các vi khuẩn này cũng tham gia vào
quá trình phân hủy các chất đường.
Khi chất nhầy bị tan vỡ và dịch ca cao chảy ra làm môi trường ủ thông thoáng, độ
acid giảm, pH đạt khoảng 5 vào cuối giai đoạn lên men do sự mất đi của acid citric. Lúc
này phản ứng oxy hóa cồn thành acid acetic diễn ra mạnh do sự xâm nhập của không khí
vào khối ủ tạo điều kiện cho vi khuẩn Acetobacter spp. và Gluconobacter khi chất nhầy bị
hủy hoại. Các vi khuẩn này hoạt động mạnh làm nhiệt độ khối ủ tăng lên. Nhệt độ tăng
đều trong 48 giờ đầu đạt 42 – 48
0
C, sau khi được đảo trộn nhiệt độ tăng đến 50

0
C, sau đó
giảm xuống. Sau 6 ngày ủ nhiệt độ đạt cỡ 48
0
C.
Khi ủ một khối lượng lớn, nhiệt độ trong lòng khối ủ tăng chậm hơn và tỉ số hạt
còn sống ở giữa khối còn cao, trong lúc đó ở lớp trên thì coi như không còn nữa. Vì vậy
trong quá trình ủ cần phải đảo trộn để làm cho khối ủ được thông khí giúp cho các hạt lên
men đều đặn. Ngoài ra còn giúp cho nấm mốc không nảy nở trên bề mặt và hạt không bị
quá khô.
10
(Theo Wood G.A.R, a. R. A. L., 2001).
Hình 2.7: Sự chuyển biến đường của cơm nhầy trong quá trình lên men
 Phơi, sấy ca cao:
Sau khi ủ ẩm độ của hạt ca cao khoảng 55 % (ẩm độ theo cơ sở ướt) và ẩm độ này
phải giảm xuống đến giá trị 6 – 7 % mới đảm bảo an toàn được, nhưng nếu hạ thấp ẩm độ
xuống dưới 5 % hạt ca cao sẽ rất giòn và dễ gãy (Theo Phạm Trí Thông, 1999).
Mục đích của việc phơi sấy: Ngoài việc hạ thấp ẩm độ nhằm ngăn ngừa nấm mốc
phát triển còn để hoàn tất các biến đổi hóa học xảy ra tiếp tục bên trong hạt sau thời kỳ
lên men để tạo hương vị đặc biệt cho ca cao ( />muc/ung-dung-khoa-h oc-cong-nghe/289-qui-trinh-len-men-ht-ca-cao.html ).
Trong giai đoạn phơi (sấy) thì các phản ứng sinh hóa tiếp tục xảy ra (dưới tác động
của các enzyme được sinh ra trong quá trình lên men), trong đó đặc biệt là các phản ứng
phân hủy protein thành các amino acid, phân hủy tinh bột thành đường và các phản ứng
11
oxy hóa polyphenol tạo màu nâu và các tền hương vị chocolate trong nhân hạt ca cao
(Theo Phan Thanh Bình, 2009).
Hạt được ủ và phơi sấy tốt sẽ có màu tím nhạt và màu nâu chocolate. Khi bóp
mạnh bằng tay sẽ nghe âm thanh rắc rắc và dễ nghiền thành bột.
 Bảo quản
Hạt ca cao đã ủ và phơi có thể bảo quản khá tốt ở các vùng ôn đới nhưng lại là một

thứ nông sản dễ hư hỏng trong các vùng nhiệt đới. Cho nên cần chú ý đến các điều kiện
trong bảo quản để phẩm chất của hạt không bị tổn hại và giảm sút (Theo Phạm Trí Thông,
1999).
2.2. Tổng quan về enzyme
2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme
2.2.1.1. Khái niệm:
Enzyme là chất xúc tác sinh học, nó cho phép các phản ứng cần thiết cho sự sống
và sự sinh sản của tế bào diễn ra ở một vận tốc cao và với tính chất đặc thù không tạo ra
các sản phẩm phụ như ở các phản ứng thông thường. Enzyme có mặt trong trong tế bào
của mọi sinh vật, không những chỉ xúc tác cho các phản ứng trong cơ thể sống mà còn
xúc tác cho cả các phản ứng ngoài tế bào (Theo Nguyễn Phước Nhuận và ctv, năm 2003).
Ngày nay, enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: chăn nuôi, thú y,
công nghiệp chế biến thực phẩm…
2.2.1.2. Bản chất của enzyme:
Bản chất của enzyme là protein cấu trúc bậc I, II, III và đôi khi bậc IV.
Về mặt cấu tạo, enzyme được chia làm 2 nhóm:
12
- Enzyme một cấu tử: Là enzyme trong thành phần cấu tạo của nó chỉ có
protein. Một số enzyme được cấu tạo bằng một chuỗi polypeptide duy nhất, đa số enzyme
được cấu tạo bằng nhiều chuỗi polypeptide giống nhau hoặc khác nhau.
- Enzyme nhị cấu tử: Một vài enzyme cần phải liên kết với một thành phần
phi protein để thực hiện chức năng xúc tác của mình, thành phần phi protein này được gọi
là cofactor. Trong trường hợp này, thành phần protein được gọi là apoenzyme và kết hợp
hai thành phần trên được gọi là holoenzyme, trong đó các cofactor tham gia trực tiếp vào
quá trình xúc tác và ảnh hưởng đến đặc điểm của phản ứng xúc tác (oxy hóa, vận
chuyển…) còn apoenzyme chịu trách nhiệm về tính đặc hiệu của enzyme đối với cơ chất.
2.2.1.3. Cơ chế tác động của enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc điểm
của chất xúc tác nói chung.
Các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản ứng va

chạm với nhau ở vị trí xảy ra phản ứng và phải ở trạng thái hoạt động. Muốn hoạt hoá các
phân tử thì cần cung cấp năng lượng cho chúng. Năng lượng đó gọi là năng lượng hoạt
hóa. Chất xúc tác nói chung và xúc tác enzyme đều có khả năng làm giảm năng lượng
hoạt hóa mà phản ứng yêu cầu bằng cách tiến hành qua các phản ứng tạo phức trung gian
mà tổng số năng lượng hoạt hóa của chúng nhỏ hơn trường hợp không có chất xúc tác
(Theo Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, năm 1998).
Sự tạo thành phức ES và biến đổi phức này thành sản phẩm P trải qua 3 giai đoạn
sau:
E + S  ES  P +E.
- Trong giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo
thành phức enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng
lượng hoạt hóa thấp.
13
- Trong giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn đến sự kéo căng và
phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng này. Kết quả là làm cho cơ chất được
hoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn.
- Trong giai đoạn thứ ba: Sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải phóng
dưới dạng tự do.
Trong quá trình tác dụng enzyme thể hiện tính đặc hiệu cao.
2.2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme
- Nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng bậc nhất
phụ thuộc vào nồng độ enzyme.
Đường biểu diễn có dạng sau: Khi thừa cơ chất thì khi nồng độ enzyme tăng, vận
tốc tăng. Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận
tốc không thay đổi.
(Theo Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, năm 1998).
Hình 2.8: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới tốc độ phản ứng
V: Vận tốc phản ứng
E: Nồng độ enzyme
- Nồng độ cơ chất: trong các phản ứng enzyme xúc tác trước hết tạo thành

phức trung gian giữa enzyme lại tiếp tục kết hợp với phân tử cơ chất khác.
14
Giả sử phản ứng chỉ có một cơ chất S và tạo thành sản phẩm P, phản ứng xảy ra
như sau:
E + S ES P + E.
ES là chất trung gian “enzyme – cơ chất”. Tốc độ phản ứng tỉ lệ với nồng độ phức
chất trung gian này. Nồng độ ES càng cao, tốc độ phản ứng càng lớn, khi toàn bộ lượng
enzyme trong phản ứng đều tham gia vào phức chất ES, tốc độ sẽ đạt cực đại.
Hình 2.9: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới tốc độ phản ứng
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: vì bản chất của enzyme là protein do đó khi tăng
nhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tính
của protein. Trong khoảng nhiệt độ mà enzyme chưa bị biến tính thì: khi tăng nhiệt độ lên
10
0
C thì vận tốc phản ứng tăng lên từ 1,4 đến 2 lần. Khi bắt đầu có biến tính protein thì
xảy ra hai hiện tượng: một mặt vận tốc phản ứng vẫn tăng theo sự tăng nhiệt độ, mặt khác
vận tốc biến tính protein xảy ra nhanh hơn. Kết quả là vận tốc phản ứng giảm dần tới đình
chỉ hoàn toàn.
Nhiệt độ ứng với vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích. Nhiệt độ mà tại đó
enzyme bị bất hoạt hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn. Nhiệt độ quá thấp cũng làm
giảm mạnh hoạt độ enzyme.
15
- Ảnh hưởng của pH môi trường: pH có ảnh hưởng lớn tới vận tốc phản ứng
enzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH nhất định gọi là pH hoạt
động tối thích của enzyme.
pH làm thay đổi trạng thái ion hóa các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động
enzyme làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong phản ứng xúc tác và có
thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme.
pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của cơ chất, tại pH tối thích phân tử cơ
chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme.

2.2.2. Enzyme chủ yếu trong quá trình lên men ca cao
Chất lượng hạt ca cao được hình thành nên bởi các chất hóa học (tiền chất) để tạo
thành hương vị đặc trưng cho chocolate. Các chất hóa học này sinh ra trong quá trình lên
men, phơi (sấy) và hoàn thiện dần trong quá trình bảo quản hạt. Tác động của enzyme vào
các phản ứng sinh hóa trong quá trình lên men và phơi sấy sẽ làm tăng tốc độ phản ứng,
làm tăng hiệu quả của các phản ứng và từ đó tạo ra nhiều tiền chất chocolate và làm tăng
chất lượng sản phẩm.
Tác động của các enzyme trong quá trình lên men ca cao (Theo Phan Thanh Bình,
2009):
- Giai đoạn đầu, các enzyme pectinase sẽ tác động vào các phân tử pectin làm
gãy các liên kết và tạo thành các phân tử nhỏ hơn làm cho lớp dịch nhầy rữa ra và thoát
bớt. Trong giai đoạn này enzyme cellulase cũng có tác dụng để phân cắt các sợi cellulose
nhằm làm cho lớp nhầy nhanh phân hủy.
- Giai đoạn tiếp theo, các enzyme phân hủy như: invertase, β – glocodase để
tạo nên nguyên liệu cho phản ứng tạo rượu. Enzyme invertase trong phần cơm nhầy hoạt
động mạnh phân hủy các đường không khử thành đường khử, cơ chất cho phản ứng tạo
màu Maillar (phản ứng giữa acid amin và đường khử).
- Giai đoạn tiếp theo, khi có không khí các enzyme protease, amylase,
glycosidase và polyphenol oxydase, lactatdehydrogenase, aldehydehydrogenase sẽ hoạt
16
động thủy phân các chất tương ứng tạo nên các tiền chất cũng như các chất tạo hương của
sản phẩm.
Enzyme polyphenol oxydase, peroxidase đã xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử
để tạo nên các tiền hương vị chocolate và tiền chất tạo màu. Enzyme carboxypeptide phân
hủy peptid thành các oligopeptid và các amino acid tự do.
- Giai đoạn cuối quá trình lên men và trong quá trình phơi, các acid hình
thành sẽ dịch chuyển từ lớp nhớt vào trong nhân và tác động đến các tế bào chứa
polyphenol để giải phóng các polyphenol và dưới tác dụng của enzyme polyphenol
oxydase sẽ oxy hóa để tạo thành các chất màu có trong hạt ca cao.
2.2.3. Giới thiệu về Enzyme Protease

Protease là các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân của liên kết peptide
(CO – NH) giữa các L_acidamin và chúng cũng thường tác dụng lên các liên kết este đơn
giản, ngoài ra còn có khả năng thủy phân các liên kết ester, liên kết amide và tham gia
phản ứng chuyển vị gốc amino acid (Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv, năm 2006)
Có nhiều cách phân loại protease khác nhau theo sự phân bố của chúng, pH hoạt
động, tính đặc hiệu cơ chất, nguồn thu nhận enzyme (Theo Đinh Ngọc Loan, 2008).
2.2.4. Giới thiệu về enzyme pectinase
Enzyme pectinase là tên gọi chung của một nhóm enzyme có khả năng phân giải
pectin là một polysaccharid.
Cấu tạo pectin chủ yếu là mạch chính gồm các gốc acid galacturonic liên kết nhau
bằng liên kết 1-4 glucosid còn gọi là polygalacturonic hay acid peptic.
Theo Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1997, các pectinase được chia thành hai nhóm chủ
yếu:
17
 Enzyme pectinesterase (PE) hay pectimetylesterase (pectinhydrolase) (EC
3.1.1.11) là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết este trong phân tử pectin hoặc acid
pectinic khi toàn bộ các nhóm metoxyl đề bị tách ra khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là
metanol và các acid polygalacturonic. Sự thủy phân chỉ xảy ra ở liên kết este kề liền với
nhóm carboxyl tự do.
Enzyme pectinesterase chỉ phân cắt các nhóm methoxyl đứng cạnh nhóm COOH
tự do. Bắt đầu từ nhóm COOH tự do, Kết quả là tạo thành acid pectic và methanol.
(Ashraf F., 1993).
Hình 2.10: Phản ứng được xúc tác bởi enzyme pectinesterase
pH tối ưu là 5,5 – 6; nhiệt độ tối ưu là 55 – 60
0
C
Đối với enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc, nhiệt độ tối ưu là 30
0
C – 40
0

C
 Enzyme polygalacturonase (PG)
Enzyme polygalacturonase phân cắt liên kết glucozit 1,4 trong mạch pectin,tạo ra
acid galacturonic
18
(Ashraf, F., 1993)
Hình 2.11. Hoạt động thủy phân của enzyme polygalacturonase
Nhiệt độ tối thích của PG là 40
0
C – 50
0
C, pH tối thích là 4 – 4,5.
- Có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau: polymethyl
galacturonase tác dụng chủ yếu lên các este metylic của các acid polygalacturonic. Các
enzyme này được chia thành hai nhóm nhỏ tùy theo vị trí liên kết glucozit bị cắt đứt dưới
sự xúc tác của enzyme ở đầu hay giữa mạch.
+ Endoglucozidase – polymetylgalacturonase I: xúc tác sự thủy phân các liên kết
glucozit nội mạch ở các phân tử acid polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao.
+ Exo – glucozidase – polymetylgalacturonase III: xúc tác sự thủy phân các liên
kết glucozit ở đầu mạch để tách từng gốc acid galacturonic ra khỏi phân tử pectin, bắt đầu
từ đường không khử.
- Polygalacturonase là các enzyme có tác dụng chủ yếu lên các acid pectic
(các acid polygalacturonic không bị este hóa) và acid pectinic (các acid polygalacturonic
bị este hóa ở mức độ thấp). Các enzyme này cũng được chia làm hai nhóm nhờ vào vị trí
liên kết glucozit bị cắt đứt:
+ Endo - glucozidase – polygalacturonase II: xúc tác sự thủy phân các liên kết
glucozit ở giữa mạch của các phân tử acid pectic hoặc acid pectinic, các enzyme này tác
dụng ở vị trí liên kết đầu nhóm carboxyl tự do.
19
+ Exo - glucozidase – polygalacturonase IV: xúc tác sự thủy phân các liên kết

glucozit ở đầu mạch của phân tử acid pectic hoặc acid pectinic.
Các enzyme thủy phân pectin có tính bền nhiệt và pH hoạt động tối thích khác
nhau. Các exo polygalacturonase của Asp.awamori 16 hoạt động mạnh ở pH 3,5; các endo
polymetylgalacturonase hoạt động mạnh ở pH 4,2; còn pectinesterase chỉ hoạt động mạnh
ở pH 5. Nhiệt độ hoạt động tối thích của các enzyme này trong khoảng 45 – 52
0
C.
Trong công nghiệp, pectinase được ứng dụng để phân giải pectin nhằm nâng cao
hiệu suất ép, lọc nước quả, chiết dược liệu, làm trong rượu vang và nước quả.
2.2.5. Giới thiệu về enzyme invertase
Invertase, tên khoa học là -fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26), là
enzyme thuộc nhóm enzyme saccharase, là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân
saccharose thành glucose và fructose (tỉ lệ mol 1:1), còn được gọi là đường nghịch đảo.
Đường nghịch đảo được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là
trong công nghệ sản xuất bánh kẹo và nước giải khát do đặc tính hút ẩm cao, tác dụng ổn
định, tránh hiện tượng khô cứng (Theo Đinh Ngọc Loan, năm 2008).
Invertase có trong động thực vật, vi sinh vật và đặc biệt là nấm men có khả năng
tổng hợp invertase cao. Saccharomyces hiện là vi sinh vật được quan tâm nhiều nhất trong
lĩnh vực lên men tạo invertase, invertase của Saccharomyces gồm hai loại như sau :
invertase nội bào và invertase ngoại bào ( Theo Nam Sun Wang, 2003).
Theo R.Bergamasco, F.J.Bassetti, F.F.de Moraes and G.M.Zanin, 2000, phản ứng
thủy phân saccharose do invertase xúc tác như sau:
Invertase
Saccharose (đường không khử) α-Glucose + β-Fructose (đường khử)
20
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm đã được tiến hành tại phòng thí nghiệm sinh hóa phòng sinh hóa và
công nghệ sinh học Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên, Đaklak.

Thời gian tiến hành thí nghiệm: từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2010.
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu là dịch cơm nhầy của quả ca cao giống forastero hái từ vườn kinh
doanh của Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên, Daklak.
Độ chín của quả ban đầu dùng cho các thí nghiệm là quả có màu sắc vàng trên toàn
bộ đường rãnh quả hoặc trên cả bề mặt quả từ 1/2 trở xuống.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
Thí nghiệm của đề tài gồm 3 nội dung chính, mỗi nội dung có vật liệu nghiên cứu
riêng:
3.2.1. Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
Nội dung 1: sử dụng chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L (Novozyme).
Pectinex Ultra SP-L là chế phẩm enzyme chứa enzyme pectinase, enzyme
pectolytic, protease, cellulase (chủ yếu là polygalacturonase) được chiết xuất từ 3 vi
khuẩn chủ yếu là Aspergillus aculeatus, Trichoderma reesei và Aspergillus niger.
Pectinex Ultra SP-L là chế phẩm enzyme dạng lỏng, có màu nâu, mùi nhẹ của sản phẩm
lên men, dễ tan trong nước, pH hoạt động từ 3 – 6, pH tối ưu là 4,7 – 5,2. Bảo quản ở 0 –
10
0
C (32
0
F – 50
0
F), nhiệt độ hoạt động là 10
0
C (50
0
F) – 57
0
C (135

0
F), nhiệt độ tối
thích là 40 – 45
0
C (Theo Lê Mỹ Hồng, 2005).
3.2.2. Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme protease
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
Nội dung 2: Sử dụng chế phẩm enzyme flavourzyme TM 500L (Novozyme).
21
Chế phẩm enzyme protease flavourzyme (Novozyme) được chiết xuất từ
Aspergillus oryzae. Nhiệt độ thích hợp cho enzyme flavourzyme hoạt động là 40 – 55
0
C,
nhiệt độ tối thích là 50 – 55
0
C (Đề tài khoa học. Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản
cố 03/2007 ĐH Nha trang). pH thích hợp là 5 – 7, pH tối ưu là 6 ( Theo Rasa và ctv,
2005). Chế phẩm enzyme flavourzyme có dạng bột, màu nâu.
3.2.3. Nội dung 3: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme invertase
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
Nội dung 3: Sử dụng chế phẩm enzyme invertase (Novozyme).
Chế phẩm enzyme invertase có dạng bột, màu vàng nhạt, nên bảo quản ở
5 – 10
0
C trong môi trường lạnh và khô hoạt tính của enzyme có thể giữ được trong 1
năm. pH hoạt động của chế phẩm enzyme này là 3 – 5, pH tối thích là 4,5. Nhiệt độ tối
thích của enzyme là 60
0
C.
3.3. Bố trí thí nghiệm

3.3.1. Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
Trong nội dung 1 ta có 2 thí nghiệm:
3.3.1.1. Thí nghiệm 1: Xác định điều kiện pH:
Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại.
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm 1
Công
thức
pH Tỉ lệ enzyme
sử dụng
Thể tích dịch
cơm nhầy
Thể tích
enzyme
CT1
CT2
CT3
CT4
3,5
4,5
5,5
6,5
30 ppm 650 ml 19,5 µml
22
3.3.1.2. Thí nghiệm 2: Xác định điều kiện nhiệt độ
Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức nhiệt độ (35
0
C, 40
0
C, 45

0
C, 50
0
C), 2 lần lặp lại.
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm 2
Công
thức
Nhiệt độ Tỉ lệ enzyme
sử dụng
Thể tích dịch
cơm nhầy
Thể tích
enzyme
CT1
CT2
CT3
CT4
35
0
C
40
0
C
45
0
C
50
0
C
30 ppm 650 ml 19,5 µml

Ở mỗi công thức của thí nghiệm 1 và 2 ta có một mẫu đối chứng (không cho
enzyme) và một mẫu thí nghiệm (có bổ sung enzyme). Mỗi mẫu thí nghiệm cần 650 ml
dịch cơm nhầy của hạt ca cao.
Tỉ lệ enzyme sử dụng (30 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối với
mỗi mẫu thí nghiệm cần 19,5 µml enzyme.
3.3.2. Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme protease
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
Trong nội dung 2 ta cũng có 2 thí nghiệm:
3.3.2.1. Thí nghiệm 3: Xác định điều kiện pH
Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại.
23
Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm 3
Công
thức
pH Tỉ lệ enzyme
sử dụng
Thể tích dịch
cơm nhầy
Thể tích
enzyme
CT1
CT2
CT3
CT4
3,5
4,5
5,5
6,5
5 ppm 20 ml 0,1 µml
3.3.2.2. Thí nghiệm 4: Xác định điều kiện nhiệt độ

Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức nhiệt độ (35
0
C, 40
0
C, 45
0
C, 50
0
C),
2 lần lặp lại.
Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm 4
Công
thức
Nhiệt độ Tỉ lệ enzyme
sử dụng
Thể tích dịch
cơm nhầy
Thể tích
enzyme
CT1
CT2
CT3
CT4
35
0
C
40
0
C
45

0
C
50
0
C
5 ppm 20 ml 0,1 µml
Ở mỗi công thức của thí nghiệm 3 và 4 ta có một mẫu đối chứng (không cho
enzyme) và một mẫu thí nghiệm (có bổ sung enzyme). Mỗi mẫu thí nghiệm cần 20 ml
dịch cơm nhầy của hạt ca cao.
Tỉ lệ enzyme sử dụng (5 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối với
mỗi mẫu thí nghiệm cần 0,1 µml enzyme.
3.3.3. Nội dung 3: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme invertase
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao:
3.3.3.1. Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện pH
Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại.
Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm 5
24
Công
thức
pH Tỉ lệ enzyme
sử dụng
Thể tích dịch
cơm nhầy
Thể tích
enzyme
CT1
CT2
CT3
CT4
3,5

4,5
5,5
6,5
20 ppm 50 ml 1 µml
3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định điều kiện nhiệt độ
Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức nhiệt độ (35
0
C, 40
0
C, 45
0
C, 50
0
C),
2 lần lặp lại.
Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm 6
Công
thức
Nhiệt độ Tỉ lệ enzyme
sử dụng
Thể tích dịch
cơm nhầy
Thể tích
enzyme
CT1
CT2
CT3
CT4
35
0

C
40
0
C
45
0
C
50
0
C
20 ppm 50 ml 1 µml
Ở mỗi công thức của thí nghiệm 5 và 6 ta có một mẫu đối chứng (không cho
enzyme) và một mẫu thí nghiệm (có bổ sung enzyme). Mỗi mẫu thí nghiệm cần 50 ml
dịch cơm nhầy của hạt ca cao.
Tỉ lệ enzyme sử dụng (20 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối với
mỗi mẫu thí nghiệm cần 1 µml enzyme.
3.4. Chỉ tiêu và phương pháp xác định
3.4.1. Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase
trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao
- Chỉ tiêu khảo sát: độ nhớt của dịch cơm nhầy.
- Ph ươ ng pháp nghiên c ứu: để xác định điều kiện nhiệt độ và pH để hoạt hóa
enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao ta sử dụng phương pháp đo
độ nhớt.
Theo dõi sự thay đổi độ nhớt của dịch cơm nhầy ca cao trong 60 phút. Sau 5 phút
đo độ nhớt của dịch cơm nhầy một lần.
25