Thiết kế vector chuyển gen kháng virut trên cây thuốc lá mang gen chọn lọc thân thiện môi trường

I

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG VĂN SÔNG

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUT
TRÊN CÂY THUỐC LÁ MANG GEN CHỌN LỌC
THÂN THIỆN MÔI TRƢỜNG

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 0201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Lê Văn Sơn

Thái Nguyên, năm 2013
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

II

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số
liệu và kết quả nêu trọng luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố
trong công trình nghiên cứu khác.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013
Tác giả

Hoàng Văn Sông

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

III

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Văn Sơn, Phòng Công nghệ
Tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, ThS. Phạm Thị
Vân, KS. Nguyễn Thị Thu Hiền, KS. Nguyễn Văn Đoài, cùng tập thể cán bộ,
nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện
Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh
nghiệm làm việc quý báu trong suôt quá trình hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo
Khoa khoa học sự sông – Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã luôn
quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè
những người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện khóa luận.
Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2013
Học viên
Hoàng Văn Sông

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

IV

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. I
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... III
MỤC LỤC........................................................................................................... IV
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT........................................ VII
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................... VIII
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................... IX
MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 2
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ ............................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc cây thuốc lá ............................................................................... 3
ồn gốc ............................................................................... 4
1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị khoa học của cây thuốc lá...................................... 4
1.2. MỘT SỐ BỆNH VIRUS THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ ................... 5
1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá ........................................................................ 5
1.2.2. Sơ lƣợc về virus gây bệnh khảm TMV trên cây thuốc lá ............................... 7
1.2.3. Biện pháp phòng chống bệnh virus .......................................................... 10
1.2.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh ..................................................................... 10
1.2.3.2. Sử dụng giống sạch bệnh ........................................................................ 10
1.2.3.3. Các biện pháp canh tác ........................................................................... 11
1.2.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học .................................................. 11
1.3. Ứ
.............................................................................................. 15
1.3.1. Giới thiệu chung ........................................................................................ 15
1.3.2. Phƣơng pháp để tránh hoặc loại bỏ gen chọn lọc ..................................... 16
1.3.3. Gen mã hóa biến dƣỡng đƣờng mannose. ................................................. 17
1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở

VIỆT NAM ......................................................................................................... 18
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 20
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

V

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................................... 20
2.1.1. Nguồn gen CP của virus ............................................................................ 20
2.1.2. Chủng vi khuẩn ......................................................................................... 20
2.1.3. Nguồn thực vật: ......................................................................................... 20
2.1.4. Hóa chất .................................................................................................... 20
2.1.5. Thiết bị ...................................................................................................... 20
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 21
2.2.1. Thiết kế vector RNAi gốc chọn lọc bằng mannose ................................... 21
2.2.1.1. Chuẩn bị tế bào khả biến ........................................................................ 21
2.2.1.2. Xử lý vector pK7GWIWG2(II) .............................................................. 22
2.2.1.3. Xử lý vector pNOV-Gusplus .................................................................. 24
2.2.1.4. Tạo vector chuyển gen pK7_M mang gen chọn lọc mannose ................ 25
2.2.2. Thiết kế vector RNAi chuyển đơn gen TMV chọn lọc bằng mannose ............ 26
2.2.3. Nghiên cứu nồng độ đƣờng mannose thích hợp để chọn lọc .................... 29
2.2.4. Chuyển gen vào thuốc lá thông qua Agrobacterium tumefaciens.............. 30
2.2.4.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium ........................................ 30
2.2.4.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen ................................................................... 30
2.2.4.3. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy .............................................................. 30
2.2.4.4. Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen ...................................................... 31
2.2.4.5. Tạo rễ và cây hoàn chỉnh ........................................................................ 31
2.2.4.6. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen ......................................... 31
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 33

3.1. Thiết kế vector RNAi gốc chọn lọc bằng mannose ...................................... 33
3.1.1. Kết quả xử lý vector pK7GWIWG2(II) ..................................................... 33
3.1.2. Kết quả xử lý vector pNOV-gusplus ......................................................... 34
3.1.3. Tạo vector chuyển gen pK7_M mang gen chọn lọc mannose ................... 35
3.2. Thiết kế vector RNAi chuyển đơn gen TMV chọn lọc bằng mannose ......... 36
3.2.1. Kết quả chọn dòng bằng phản ứng cắt bởi emzyme hạn chế .................... 37
3.2.2. Kết quả chọn dòng bằng phản ứng PCR ................................................... 38
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

VI

3.3. Nghiên cứu nồng độ đƣờng mannose thích hợp để chọn lọc ........................ 40
3.3.1. Xác định nồng độ mannose đối với mảnh lá thuốc lá ................................ 40
3.3.2. Ảnh hƣởng của mannose tới sự phát triển của chồi/cây thuốc lá ............... 41
3.4. Chuyển gen và tái sinh vào cây thuốc lá....................................................... 42
3.4.1. Chuyển cấu trúc RNAi TMV-M-CPi vào giống thuốc lá C9-1 và K326
thông qua Agrobacterium tumefaciens ................................................................ 42
3.4.2. Phân tích cây chuyển gen .......................................................................... 44
3.4.2.1. Phân tích khả năng kháng TMV của các cây chuyển gen ...................... 44
3.4.4.2. Kết quả phản ứng PCR ........................................................................... 46
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 48
Kết luận ............................................................................................................... 48
Kiến nghị ............................................................................................................. 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 49

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

VII

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT

A.tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

bp

Base pair

CP

Coat protein (protein vỏ)

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene Diamine tetra-acetate acid

EtBr

Ethidium Bromide

et al

Đồng tác giả

Kb

Kilobase

kDa

Kilodalton

LB

Luria and Bertani

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

RNAi

RNA interference

RNase

Ribonuclease

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq

Thermus aquaticus

TMV

Tobacco mosaic virus

v/p

vòng/phút

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

VIII

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Bệnh virus trên thuốc lá ........................................................................ 6
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt pK7GWIWG2(II) enzyme Sph I ................ 22
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng bởi T4 DNA Polymerase ................................ 23
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt bởi enzyme Hind III ................................... 24
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt pNOV-Gusplus bởi Hind III và Pme I ....... 25
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng ghép nối nhờ enzyme T4 ligase. ...................... 25
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng .......................................................................... 26
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế ................................. 27
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR ................................................................. 28
Bảng 2.9. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ......................................................... 29
Bảng 2.10: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy ...................................................... 29
Bảng 3.1. Các phân đoạn thu đƣợc theo tính toán lý thuyết khi cắt plasmid ...... 37
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của mannose tới khả năng sống sót và sinh trƣởng .......... 40
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của mannose tới khả năng sống sót và sinh trƣởng ......... 42
Bảng 3.4. Kết quả của biến nạp cấu trúc RNAi TMV-M-CP vào thuốc lá. ......... 44
Bảng 3.5. Kết quả lây nhiễm virus các dòng thuốc lá chuyển gen ..................... 45
Bảng 3.6. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của các gen cần chuyển ................... 47

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

IX

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây thuốc lá .......................................................................................... 3

Hình 1.2. Cấu trúc TMV và tổ chức hệ gen .......................................................... 8
Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi virus TMV ................................................................. 9
Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc genome của TMV ........................................................ 10
Hình 1.5: Cơ chế hoạt động RNAi. ..................................................................... 13
Hình 1.6: Quy trình chuyển gen sử dụng mannose làm chất chọn lọc................. 17
Hình 2.1: Mô hình thiết kế vector pK7_M .......................................................... 21
Hình 3.1: Biến nạp vector pK7GWIWG2(II) vào tế bào khả biến E.coli DB 3.1 33
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm tách chiết plasmid pK7GWIWG2(II) ......... 33
Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pK7GWIWG2(II) .................... 34
Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm tách chiết plasmid pNOV-gusplus.............. 35
Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm cắt pNOV-gusplus ...................................... 35
Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm tách chiết plasmid ...................................... 36
Hình 3.7. Bản đồ cấu trúc pK7M/TMV-CPi. ..................................................... 37
Hình 3.8. Phân tích sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pK7M/TMV-CPi ............. 38
Hình 3.9. Các vị trí gắn của các cặp mồi trên pK7M/TMV-CPi ......................... 39
Hình 3.10. Phân tích sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc mang .............. 39
Hình 3.11: Hình ảnh về sự ảnh hƣởng của mannose tới khả năng sống sót ...... 41
Hình 3.12. Hình ảnh qua các bƣớc nghiên cứu của thí nghiệm ........................... 43
Hình 3.13. Hình ảnh của cây chuyển gen sau lây nhiễm ..................................... 45
Hình 3.14. Hình ảnh điện di DNA tổng số của một số dòng thuốc lá ................. 46
Hình 3.15. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong mẫu thuốc lá . . 46

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

1

MỞ ĐẦU
LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị
kinh tế cao và đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia trên thế
giới. Việc trồng và sản xuất thuốc lá cũng thu hút nhiều nhân công, góp phần tạo
công ăn việc làm và thu nhập cho nhiều đối tƣợng lao động. Cây thuốc lá còn
đƣợc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ
sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt. Ngoài ra, thuốc lá còn đƣợc xem là cây
mô hình cho nhiều nghiên cứu sinh học cơ bản nhƣ nghiên cứu quá trình trao đổi
chất ở thực vật, hay vai trò, chức năng của gen và protein,… với khả năng dễ tái
sinh và chấp nhận gen ngoại lai. Vì vậy, thuốc lá là một trong những đối tƣợng
đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là
làm đối tƣợng chuyển gen.
Tuy nhiên, hiện nay thuốc lá đang chịu thiệ

ởi bệ

bệnh khảm thuốc lá
TMV (Tobacco mosaic virus). Đây là loại virus đang gây thiệt hại nặng nề làm
giảm năng suất và chất lƣợng cho hầu hết các thửa ruộng trồng thuốc lá.
Để hạn chế sự lây lan của virus thực vật, những biện pháp truyền thống đã đƣợc
áp dụng nhƣ loại bỏ những cây bị bệnh ngay khi mới phát hiện, phun thuốc hoặc vệ sinh
đồng ruộng... không những không mang lại hiệu quả mà còn đòi hỏi nhiều thời gian,
công sức và ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng. Việc tìm ra các biện pháp để ngăn chặn sự
phát triển và lây lan của virus thực vật đang là một vấn cấp bách.
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có rất nhiều ứng dụng
sinh học phân tử trong chọn tạo giống cây trồng kháng virus, trong đó, công
nghệ RNA interference (RNAi) tỏ ra là một giải pháp hữu hiệu nhất thông qua
việc sử dụng các vật liệu di truyền từ virus gây bệnh nhƣ gen mã hóa protein vỏ
(coat protein, CP), protein di chuyển (movement protein, MP) chuyển vào cây
trồng tạo cây trồng chuyển gen kháng chính virus đó.
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

2

Ở Việt Nam, năm 2005-2006 trình tự gen CP của TMV gây bệnh trên cây
thuốc lá thu thập tại một số vùng chuyên canh đã đƣợc xác định và đánh giá đa
dạng di truyền [4]. Dựa vào kết quả nghiên cứu này vùng gen CP của TMV Việt
Nam có độ bảo thủ cao đã đƣợc sử dụng trong “Nghiên cứu tạo cây chuyển gen
kháng virus bằng công nghệ RNAi” [2]. Tuy nhiên vector chuyển gen đƣợc sử
dụng trong nghiên cứu này mang gen chọn lọc đƣợc dùng là các gen kháng lại
kháng sinh nhƣ kanamycin (nptII). Đƣợc chuyển vào gen chọn lọc trong cây
trồng đã gây nên những lo lắng về mặt sức khỏe của ngƣời sử dụng và môi
trƣờng. Mặc dù cho đến hiện nay chƣa có thí nghiệm nào đƣa ra đƣợc bằng
chứng rằng các gen chọn lọc kháng lại các chất kháng sinh đang sử dụng là có
nguy cơ gây hại đến sức khỏe ngƣời hoặc vật nuôi. Vì vậy, đã có những nghiên
cứu liên quan đến việc sử dụng các gen chọn lọc thay thế, không có hại đến hoạt
động sống hay trao đổi chất của tế bào thực vật hay còn gọi là chọn lọc tích cực
(positive selection). Trong trƣờng hợp này, các tế bào chuyển gen sẽ sử dụng
một số chất không độc hại mà trong điều kiện bình thƣờng không thể sử dụng.
Một trong những gen chọn lọc tích cực đƣợc biết đến là gen mã hóa biến dƣỡng
đƣờng mannose [37].
Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển
gen kháng virus trên cây thuốc lá mang gen chọn lọc thân thiện môi trường”.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
-Thiết kế đƣợc vector RNAi chuyển gen mang các gen đặc thù của virus
khảm thuốc lá.
- Tạo chủng Agrobacterium mang vector chuyển gen.
- Tạo cây thuốc lá mang gen chọn lọc mannose.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu phân lập gen mã hóa đƣờng mannose từ vector gốc và gắn
gen mã hóa đƣờng mannose vào vector RNAi gốc tạo thành vector RNAi chọn
lọc bằng mannose.
- Nghiên cứu thiết kế các đoạn đơn gen CP của virus gây bệnh thuốc lá.
- Nghiên cứu thiết kế vector RNAi đơn của TMV chọn lọc bằng đƣờng
mannose.
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

3

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ
1.1.1. Nguồn gốc cây thuốc lá
Thuốc lá đƣợc trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới nhƣng nó có nguồn
gốc từ Nam Mỹ [12]. Khi Christopher Columbus đặt chân lên Tây Ấn Độ Dƣơng,
ông đã phát hiện ngƣời bản xứ vừa nhảy múa, vừa hút một loại lá cuộn tròn gọi là
Tabaccos. Chƣa có một ghi nhận rõ ràng nào nói về lịch sử cây thuốc lá ở các vùng
trên thế giới. Các thông tin về sự phân bố rất sớm của thuốc lá ở các vùng khác
nhau đã đƣợc một số tác giả đƣa ra [14].
Thuốc lá đƣợc đƣa vào châu Âu vào khoảng năm 1496 - 1498 do nhà
truyền đạo ngƣời Tây Ban Nha là Roman Pano mang từ châu Mỹ về. Andre
Teve mang hạt từ Braxin về trồng ở Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha năm 1556 [1].
Thuốc lá du nhập vào Trung Quốc và Nhật Bản vào giữa thế kỷ thứ 16, vào Ấn
Độ khoảng năm 1605. Từ đó, các nƣớc này đã trở thành các nhà sản xuất thuốc
lá lớn, phục vụ cho tiêu dùng nội địa và cả thị trƣờng thuốc lá thế giới.

Hình 1.1: Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.)

Ở nƣớc ta, thuốc lá đƣợc du nhập vào từ năm 1660 thời vua Lê Thánh
Tông, nhƣng mãi đến năm 1876, nghề trồng thuốc lá ở nƣớc ta mới chính thức
đƣợc phát triển tại Gia Định, năm 1899 tại Tuyên Quang, năm 1940 ở một số
tỉnh miền bắc với giống ban đầu là Virginia Bland Cash [5].
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

4

ồn gốc
: Nicotiana
Giống Nicotiana

Solanaceae.
, căn cứ

-

,

màu sắc của hoa ngƣời ta phân chia thành 4 loại chính:
Nicotiana tabacum
.
Nicotiana rustica
.
Nicotiana petunioide
.
Nicotiana polidieide
.

ỹ
Lan, Đ

, Ba

ỹ.
ợ
-83, K 51E, Coker

176, K326, Burley và Flue-Cured virginia trồ

. Hiện

nay, giống thuốc lá N. tabacum L. K326 đƣợc trồng phổ biến nhất [7].
1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị khoa học của cây thuốc lá
ệ
, mộ

ộ
, Zimbabue,

Mỹ

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

5

im

[3]. Ở Việt Nam, cây thuốc lá đƣợc trồng phổ biến ở các tỉnh thuộc Bắc Bộ và
Nam Bộ. Đây là cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho
nông dân và thu nhập cho quốc gia. Theo thống kê của Tổng công ty thuốc lá
Việt Nam (Vinataba) trong 3 năm (2006-2008) tổng doanh thu đạt 47,656 tỷ
đồng, nộp ngân sách nhà nƣớc đƣợc 9,653 tỷ đồng, kim ngạch xuất khẩu đạt
192,136 triệu USD, việc làm của ngƣời lao động đƣợc bảo đảm, đời sống từng
bƣớc đƣợc nâng cao với thu nhập bình quân đầu ngƣời tăng 15,59%/ năm.
Ngoài giá trị to lớn về kinh tế, cây thuốc lá còn có giá trị khoa học, thuốc
lá là một trong những cây mô hình quan trọng trong các nghiên cứu trên đối
tƣợng thực vật nhƣ: nuôi cấy mô tế bào thực vật, chuyển gen thực vật… vì nó có
sức sinh trƣởng và sức chống chịu tốt. Trong y dƣợc học, thuốc lá là dƣợc liệu
tốt để trị giun đũa, ký sinh trùng nhƣ chấy, rận, ghẻ, lá khô giã đắp vào vết
thƣơng để cầm máu [63].
Thuốc lá là làm cây mô hình đối với ngành công nghệ sinh học cây trồng
cho những nghiên cứu cơ bản cũng nhƣ ứng dụng nhờ khả năng dễ dàng tiến
hành nuôi cấy in vitro và chuyển gen [44].
1.2. MỘT SỐ BỆNH VIRUS THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ
1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá
Hiện nay, năng suất và chất lƣợng thuốc lá giảm sút nghiêm trọng do bệnh
virus hoành hành (bảng 1.1). Trong đó, TMV là virus gây bệnh khảm phổ biến
và nghiêm trọng nhất.
Năm 2008 thống kê của Nguyễn Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích thuộc
Tổng công ty thuốc lá Việt Nam, TMV là loại virus gây hại chủ trên cây thuốc lá
ở tất cả các vùng trồng thuốc lá ở Việt Nam. Bệnh khảm xuất hiện khá sớm với
tỷ lệ thấp (2,3-5,2%) và tăng dần hoặc tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo vùng,
từ 18,5-26,5% thậm chí lên tới 100% nhƣ ở xã Lâu Thƣợng, tỉnh Thái Nguyên,
trong đó giống thuốc lá rất mẫn cảm với TMV chủ yếu là K326. Thiệt hại do
virus gây ra ở cây thuốc lá lên đến hàng chục tỷ đồng [7].
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

6

Đối với bệnh do virus nói chung và bệnh khảm do virus TMV gây ra nói
riêng hiện vẫn chƣa có loại thuốc hoá học nào có thể phòng trị đƣợc một cách
hữu hiệu, do đó các biện pháp phòng bệnh tốt nhất là sử dụng các hạt giống sạch
bệnh để trồng, không sử dụng các hạt giống từ các ruộng trƣớc đó đã bị các bệnh
nói trên để làm giống cho vụ sau. Thƣờng xuyên kiểm tra đồng ruộng để phát
hiện và phun thuốc diệt trừ các loại côn trùng chích hút nhƣ bọ cánh tơ, bọ phấn,
rệp muội, bằng các loại thuốc trừ sâu để tránh lây lan. Khi phát hiện các triệu
chứng bệnh trên đồng ruộng cần tập trung nhổ bỏ cây, đem ra khỏi ruộng tiêu huỷ
để tránh lây lan.
Bảng 1.1. Bệnh virus trên thuốc lá* />Tên bệnh

Tên virus gây bệnh

Khảm linh lăng

Alfalfa mosaic virus (Virus khảm linh lăng)

Quăn ngọn cúc tần

Beet curly top virus (Virus gây bệnh quăn ngọn cây cúc tần)

Ngọn cây bụi

Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (Virus gây biến dạng gân thuốc lá) và
tobacco bushy top virus (Virus ngọn cây bụi thuốc lá)

Khảm cà chua

Cucumber mosaic virus (Virus gây bệnh khảm dƣa chuột)

Vàng chết hoại rau diếp

Lettuce necrotic yellows virus (virus dây bệnh vàng chết hoại rau diếp) trên
Nicotiana glutinosa

Còi cọc cây lạc

Peanut stunt virus

Bệnh hình hoa hồng

Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus
tobacco mottle virus (virus gây bệnh đốm thuốc lá)

ốc lá

Tobacco etch virus (Virus gây bệ

ốc lá) và

ốc lá)

Xoăn lá thuốc lá

Tobacco leaf curl virus (Virus gây xoăn lá thuốc lá)

Khảm thuốc lá

Tobacco mosaic virus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá) và Satellite Tobacco
mosaic Virus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá vệ tinh)

Hoạ

ốc lá

Tobacco necrosis virus (Virus gây hoạ

ốc lá)

Bung hạt thuốc lá

Tobacco rattle virus (Virus gây bung hạt thuốc lá)

Đốm vòng thuốc lá

Tobacco ring spot virus (Virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá)

Sọc thuốc lá

Tobacco streak virus (Virus gây bệnh sọc thuốc lá)

Còi cọc thuốc lá

Tobacco stunt virus (Virus gây bệnh còi cọc thuốc lá)

Vằn gân lá thuốc lá

Tobacco vein mottling virus (Virus gây bệnh vằn gân lá thuốc lá)

Héo đốm cà chua

Tomato spotted wilt virus (Virus gây bệnh héo đốm cà chua)

Viền gân lá

Potato virus Y (Virus Y khoai tây)

U vết thƣơng

Wound tumor virus (Virus gây bệnh khối u vết thƣơng)

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

7

1.2.2. Sơ lƣợc về virus gây bệnh khảm TMV trên cây thuốc lá
TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong những virus gây hại trên thực
vật đƣợc mô tả sớm nhất bởi Mayer 1886); Iwanowski 1892); Allard 1914) và
Stanley 1935) [35]. TMV là virus hình que có chiều dài 300 A0 và đƣờng kính
từ 150 đến 170 Ao. Hình ống rỗng và cấu tạo protein sắp xếp cuộn xoắn xung
quanh lõi trung tâm, lõi trung tâm có đƣờng kính 40 A0 cuộn vòng theo chiều
dài của virus.
TMV là virus RNA đơn dƣơng (ssRNA) có hình cuộn xoắn. TMV dạng
que hoàn chỉnh của có 2130 đơn vị hợp thành capsid (capsomeres), cứ 16

capsomer tạo thành một vòng xoắn. Mỗi capsomer có 158 amino acid và có
trọng lƣợng là 1800 Daltons. Virion có chiều dài 300 nm và đƣờng kính là 18
nm [46]
Genome của TMV gồm có 6400 nucleotide đƣợc chia thành 4 khung đọc
mở (open reading frames - ORFs). RNA của TMV có cấu trúc mũ 7methylguanosine ở đầu 5’ [57], nối tiếp 68 nucleotide không mã hoá trợ giúp
quá trình dịch mã [24]. Tiếp theo vùng này là hai ORF mã hoá cho các protein
với kích thƣớc tƣơng ứng là 183 kDa và 126 kDa [25]. Đây là hai protein có vai
trò quan trọng trong quá trình sao chép của virus. Sự dịch mã của 2 protein này
đƣợc bắt đầu ở cùng bộ ba mã hoá methionine. Protein có kích thƣớc 183 kDa
đƣợc tạo ra kéo dài qua bộ ba kết thúc ở đầu cuối ORF 126 kDa, với tần suất
xuất hiện là 5%. ORF thứ 3 mã hoá protein 30 kDa đƣợc tạo ra bởi sự dịch mã
của RNA dƣới genome (subgenome). Protein 30 kDa cần thiết cho sự di chuyển
qua gian bào của virus.

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

8

5’UTR

Genome RNA (6295nt)

TMV (tobamovirus)
Subgenome RNA

Hình 1.2. Cấu trúc TMV và tổ chức hệ gen [18]
Vị trí của các ORF của hệ gen RNA đƣợc biểu thị bởi các hình chữ nhật. Kích thƣớc của
protein (kDa) tƣơng ứng với các ORF trên đƣợc chỉ ra trong ngoặc.Vỏ protein với kích thƣớc 17,5

kDa đƣợc mã hoá bởi ORF thứ 4. Các đặc điểm của hệ gen và các subgenomic đƣợc chú thích ở phía
trên và bên dƣới.

ORF 4 mã hoá protein vỏ (coat protein, cp) 17,5 kDa, vỏ protein đƣợc tạo
ra từ đầu 3’ của RNA dƣới genome thứ hai (second 3’ coterminal subgenomic
RNA) có đầu mũ 5’ và bắt đầu với 9 nucleotide ngƣợc chiều với methionine
khởi đầu của vỏ protein. Gen CP của TMV theo sau vùng không dịch mã có
chứa vài trình tự pseudoknot, trình tự này liên quan đến sự tăng cƣờng dịch mã
[36]. Tại đầu 3’ của hệ gen RNA mang cấu trúc giống RNA vận chuyển (tRNA)
có thể đƣợc aminoacyl hoá. CP là protein cần thiết cho quá trình hình thành
virion và có thể điều khiển tạo ra protein di chuyển (movement protein, MP) vì
vậy điều khiển sự lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác của virus [43] [33].
Vai trò này của gen CP cũng cho phép sử dụng gen CP làm nguyên liệu cho tạo
cây trồng chuyển gen kháng virus TMV bằng cơ chế bất hoạt RNA (RNA
interference) [56].
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

9

TMV có thể gây bệnh ít nhất 199 loài trong 35 họ [47] thực vật khác nhau
nhƣng nhiều nhất là trên cây thuốc lá. Khi cây bị bệnh các lá non đều biến màu
thành dạng khảm bao gồm các vùng xanh nhạt xanh đậm không đều xen lẫm
nhau, hình loang lổ, hay còn gọi là dạng khảm. TMV lan truyền bằng đƣờng cơ
giới do tiếp xúc virus thâm nhập vào các tế bào qua vết thƣơng và qua khí khổng
lá, thân hoặc rễ. TMV rất bền nhƣ ở dạng kết tủa cồn, ở lá khô virus vẫn còn
hoạt tính gây bệnh sau một năm. Trong nhiều trƣờng hợp TMV phối hợp với
virus X khoai tây (PVX) cùng gây hại trên cà chua gây ra bệnh đốm sọc đôi
(double virus streak hay là Mixed virus streak). Bệnh nặng làm đầu lá bị khô và ngọn

cà chua bị chết [26].
Ở Việt Nam, có thể có hai dòng TMV chủ yếu: Dòng mạnh và dòng yếu.
Dòng mạnh sẽ làm cây biến dạng nhiều, thƣờng lá có dạng sợi chỉ. Dòng yếu
làm cây biến dạng ít hơn, thƣờng chỉ gây khảm lá. Bệnh có thể mất triệu chứng
ở thấp hơn 11˚ C hoặc cao hơn 37˚C [13].
Virus TMV xâm nhiễm vào cây thông qua con đƣờng cơ giới do tiếp xúc
virus thâm nhập vào các tế bào thông qua vết thƣơng và qua khí khổng lá, thân
. TMV có độ bền vững cao đối với nhiệt độ. Đa

hoặc rễ

số TMV bị mất hoạt tính ở 90-100oC trong 10 phút, nhƣng vẫn còn một số rất ít
TMV tồn tại và chúng còn khả năng gây bệ

theo chủng [13].

Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi virus TMV [64]

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

10

Virus TMV có genome là một sợi RNA đơn dƣơng, có chiều dài khoảng
6,4 Kb [25] mã hoá cho các protein gồm: protein vỏ virus (trọng lƣợng 17,6
kDa), protein vận chuyển (trọng lƣợng phân tử 30kDa) giữ vai trò trong sự
chuyển dịch của virus giữa các tế bào và các protein mã hóa cho các enzyme
tham gia vào quá trình phiên mã nhƣ replicase (trọng lƣợng phân tử 183kDa) và
quá trình tháo xoắn bắt đầu phiên mã nhƣ helicase (126 kDa) [20]

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc genome của TMV [20]
RdRp: replicase; CP: protein vỏ; helicase: enzyme liên quan tới quá trình duỗi xoắn;
MP: protein vận chuyển. Chiều mũi tên thể hiện chiều dịch mã

1.2.3. Biện pháp phòng chống bệnh virus
Bệnh virus là bệnh khó phòng chống, chúng không thể tiêu diệt xử lý
bằng các chất hóa học nhƣ bệnh nấm, vi khuẩn hay sâu bọ. Hiện nay đã có rất
nhiều phƣơng pháp đƣợc đƣa ra nhằm chống lại bệnh virus nhƣ:
1.2.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh
Sử dụng các loại giống đã đƣợc nghiên cứu có thể kháng lại những virus
gây bệnh. Phƣơng pháp này đem lại hiệu quả cao, không gây ô nhiễm môi
trƣờng và tạo đƣợc cây sạch bệnh. Tuy nhiên hạn chế của biện pháp này đó là số
lƣợ

ặp nhiều hạn chế về số lƣợng giống kháng bệ

nguồn vật liệu di truyền kháng virus phục vụ cho cho công tác lai tạo giống.
1.2.3.2. Sử dụng giống sạch bệnh
Giống sạch bệnh thu từ cây thuốc lá khỏe chọn giống chống bệnh bằng
cách lai với các giống thuốc lá dại sử dụng nguồn vật liệu giống sạch bệnh đƣợc
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

11

xem là biện pháp quan trọng nhất để hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng.
Nhƣợc điểm của biệ
.

1.2.3.3. Các biện pháp canh tác
Luân canh: nên luân canh với lúa (thuốc lá - luá - lúa - thuốc lá) vì trong
điều kiện ngập nƣớc, phần lớn TMV sẽ bị tiêu diệt.
Vệ sinh đồng ruộng: làm sạch cỏ dại, thiêu hủy xác cây bệnh trƣớc và
sau khi thu hoạch, phát hiện bệnh sớm và thiêu hủy cây bệnh, Cẩn thận khi
tiếp xúc với cây bệnh. Không nên để vụ thuốc tái sinh ở những ruộng bị
nhiễm bệnh [61].
Phòng trị bệnh cho cây con ở vƣờn ƣơm: đây là biện pháp có hiệu quả
kinh tế cao. Chọn đất sạch mầm bệnh để làm vƣờn ƣơm, cách xa ruộng sản xuất
đại trà. Chỉ chọn cây con không bệnh đem đi trồng.
Sử dụng các biện pháp kiểm soát côn trùng trung gian truyền bệnh: các
loại rệp, bọ trĩ.
1.2.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học
Thành công trong việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống cây
trồng kháng bệnh virus đƣợc đánh dấu bởi công bố của [33]. khi những cây
thuốc lá chuyển gen mã hóa protein vỏ của TMV (cấu trúc dạng sense) đã biểu
hiện tính kháng với virus này. Sau đó Beachy và cộng sự đã phát triển những thí
nghiệm của mình thành phƣơng pháp CP tạo cây trồng kháng virus. Phƣơng
pháp này đã đƣợc áp dụng tạo những dòng cây chuyển gen kháng nhiều loại
virus gây bệnh trên thực vật hai lá mầm và sau đó là thực vật một lá mầm [28].
Tuy vậy, các cây chuyển gen này chỉ kháng đƣợc duy nhất một chủng virus
mang gen mã hóa protein vỏ mà nó chuyển vào. Điều này gây trở ngại trong
việc phát triển các giống cây trồng kháng virus dựa trên phƣơng pháp CP do độ
đa dạng của virus thƣờng khá cao [42].

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

12

Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay
kỹ thuật RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong việc
chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. RNAi là cơ chế ức chế sự biểu
hiện vật chất di truyền ở giai đoạn RNA. Ở thực vật có ba con đƣờng ức chế
RNA, con đƣờng đầu tiên là sự ức chế gen sau phiên mã PTGS (posttranscriptional gen silencing) qua trung gian là các RNA nhỏ có vai trò ức chế
siRNA (short interfering RNA) đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong những
nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. Quá trình này xảy ra ở tế bào chất
và là con đƣờng quan trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus nơi mà sợi RNA
kép hoặc cấu trúc thứ cấp của RNA virus sợi đơn có thể sao chép gián tiếp.
Trong trƣờng hợp virus DNA, dsRNA có thể đƣợc tạo ra nhờ quá trình phiên
mã bổ sung liên tiếp [16]. Cơ chế

ảy ra tƣơng tự nhƣ ở động vật. Khi có

sự xâm nhập của dsRNA, Dicer bản chất là RNaseIII đặc hiệu cho dsRNA cắt
những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotide,
gọi là siRNA . Sau đó, các siRNA kép hình thành đƣợc tách ra làm hai chuỗi
đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing)
nhỏ nhất tiếp tục liên kết với Argonaute trong phức hệ RISC. Tiếp đó, phức hệ
RISC đã gắn đoạn siRNA nhận biết các mRNA của tế bào có trình tự tƣơng
đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA này. Sau khi nhận dạng mRNA
qua việc bắt cặp các base tƣơng đồng với trình tự của chuỗi đơn siRNA, mRNA
bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ
khoảng 12 nucleotid từ đầu 3’. Sau khi bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu
huỷ bởi các RNA nuclease [19].

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

13

Hình 1.5: Cơ chế hoạt động RNAi.

Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó
là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật. Các bƣớc chính
trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc
RNAi, (2) biến nạp vector chuyển mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh,
(3) sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng
virus của các cây chuyển gen [48]. Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc
tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hóa protein vỏ CP,
enzyme phiên mã RdRp,…) có khả năng kháng lại chính virus đó đã đƣợc
chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại
virus khác nhau nhƣ: Potato virus Y - PVY [45] [52]. Cucumber mosaic virus CMV, Plum pox potyvirus - PPV [22]. Tobacco mosaic virus - TMV và Tomato
yellow leaf curl virus - TYLCV [60]. Rice tungro bacilliform virus - RTBV,
African cassava mosaic virus - ACMV [51]. Trong những nghiên cứu này, cấu
trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thƣờng đƣợc sử dụng
để chuyển vào cây và sẽ đƣợc biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc
(hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt
động khi có sự xâm nhập của virus vào cây.
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

14

Ngƣời ta đã nhận thấy rằ

ệm của hpRNA đƣợc lặp lại với

một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao
nhất [45] [53]. Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra đƣợc một dòng cây đậu
chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên
đế

, Shinichiro Kamachi và cộng sự [32]. Đã công bố kết

quả tạo ra đƣợc một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có
khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV
đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã đƣợc phát hiện trong
những dòng cây chuyển gen này. Nói chung, hầu hết các cây chuyển gen làm
chậm sự

ậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh [27].

Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus đƣợc
công nhận và trồng thƣơng mại nhƣ: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng
(papaya ringspot virus, PRSV) đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc,
Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại virus Cucumber mosaic virus,
Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã đƣợc công nhận và
trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, đƣợc
công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng
chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để đƣợc
công nhận là giống cây trồng thƣơng mại nhƣ: sắn chuyển gen kháng African
cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus
(Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X
(Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa
chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen

kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus...
Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh đƣợc sử dụng chuyển
vào cây trồng để tạo tính kháng có thể là các loại khác nhau nhƣ: các cấu trúc
của virus theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngƣợc (antisense), các cấu trúc dạng
kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) và các miRNA nhân tạo có đích là các trình tự
gen của virus gây bệnh, hay kỹ thuật RNAi “RNA interference”, đang đƣợc
quan tâm nhiều và ứng dụng rộng rãi.
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

15

1.3. Ứ
1.3.1. Giới thiệu chung
Trong quá trình tái sinh cây chuyển gen, việc sử dụng các gen có khả
năng chọn lọc đi kèm với gen đích là hết sức cần thiết nhằm tách ra đƣợc số
lƣợng ít ỏi các tế bào chuyển gen trong vô số các tế bào không mang gen
chuyển. Thông thƣờng các gen chọn lọc đƣợc dùng là các gen kháng lại kháng
sinh nhƣ hygromycin (hpt) và kanamycin (nptII) hoặc kháng lại các chất diệt cỏ
nhƣ phosphinothricin (bar) và chlorosulfuron (als). Các chất này đƣợc gọi là các
chất chọn lọc và có tác dụng diệt các tế bào không mang các gen kháng lại nó
nhƣng không làm ảnh hƣởng đến các tế bào có mang gen chuyển. Trong thực tế,
những gen này sẽ không cần thiết đổi với cây đã trƣởng thành và đặc biệt đối
với cây đã trồng ngoài cánh đồng. Việc có mặt của các gen chọn lọc này trong
cây trồng chuyển gen đã gây nên những lo lắng trong công chúng về mặt sức
khỏe của ngƣời sử dụng và môi trƣờng, mặc dù, cho đến hiện này chƣa có thí
nghiệm nào đƣa ra đƣợc bằng chứng rằng các gen chọn lọc kháng lại các chất
kháng sinh đang sử dụng là có nguy cơ gây hại đến sức khỏe ngƣời hoặc vật
nuôi. Tuy vậy những lo ngai trên, thực tế đã làm chậm quá trình sử dụng nguồn

lợi từ cây chuyển gen [6].
Vì thế, đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành theo hƣớng phát triển các
phƣơng pháp chuyển gen không sử dụng gen chọn lọc hoặc loại bỏ các gen chọn
lọc. Bên cạnh việc giảm bớt những lo lắng của công chúng, việc vắng mặt các
gen chọn lọc trong cây chuyển gen đồng thời giảm chi phí trong việc phát triển
cây chuyển gen và thời gian cần thiết để đánh giá về an toàn và vì thế sẽ thúc
đẩy việc thƣơng mại hóa các sản phẩm chuyển gen. Việc tạo ra cây chuyển gen
không mang gen chọn lọc còn tạo cơ hội cho việc chuyển nhiều gen liên quan
đến những tính trang phức tạp nhƣ chống chịu với nhiều loại bênh và các tác
nhân bất lợi của môi trƣờng [6].
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

16

1.3.2. Phƣơng pháp để tránh hoặc loại bỏ gen chọn lọc
Không sử dụng gen chọn lọc. Về mặt lý thuyết, có thể xác định đƣợc tế
bào mang gen chuyển trong vô số các tế bào không mang gen chuyển bằng các
phƣơng pháp phân tử mà không cần sử dụng gen chọn lọc. Tuy nhiên, công việc
nhƣ vậy đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và cho đến này chƣa có một công
trình nào sử dụng phƣơng pháp này đã đƣợc công bố;
1. Đồng thời chuyển hai gen, một gen đích và một gen chọn lọc và sau
đó loại bỏ gen chọn lọc ở các thế hệ sau thông qua phân ly. Đây là phƣơng
pháp đơn giản nhất và đã đƣợc dùng thành công trong một vài cây trồng có
tần số chuyển gen từ 85% trở lên. Tuy nhiên việc dựa vào phân ly sẽ không
thể tiến hành với những cây nhân giống vô tính. Một hạn chế khác là quá
trình chọn lọc các cá thể chỉ mang gen đích đòi hỏi thời gian và nhiều công
sức, vì về mặt thống kê tổ hợp tính trạng mong muốn chỉ có thể tìm thấy một
trong 16 cá thể con.

2. Cắt bỏ các gen chọn lọc sau khi đã tìm đƣợc cây mang gen chuyển
thông qua hệ thống tái tổ hợp tại những trình tự xác định (site-specific
recombination), hệ thống gen nhảy (transposition) hoặc tái tổ hợp đồng hợp tử
(homologous recombination). Trong hệ thống tái tổ hợp tai những trình tự xác
định, cac enzyme recombinase chịu trách nhiệm tái tổ hợp sẽ đƣợc dùng để loại
bỏ gen chọn lọc ở giai đoạn sau. Các gen mã hóa cho các enzyme này đƣợc gắn
bên cạnh các gen chọn lọc. Một khi các tế bào mang gen đích đã đƣợc chọn, các
gen recombinase có thể đƣợc kích hoạt bởi những yếu tố bên ngoài và loại bỏ
các gen chọn lọc và chính nó ra khỏi genome thực vật, tạo ra các cây chuyển gen
không mang các gen chọn lọc. Có ba hệ thống tái tổ hợp đặc hiệu đã đƣợc ứng
dụng thành công để loại bỏ gen chọn lọc. Thƣờng đƣợc dùng nhất là hệ thống
Cre/loxP của bacteriophage P1, trong đó recombinase Cre xúc tác cho phản ứng
tái tổ hợp giữa hai trình tự loxP gắn hai đầu của gen chọn lọc dẫn đến việc cắt
bỏ gen chọn lọc ra khỏi genome thực vật. Việc sử dụng hệ thống gen nhảy tại vị
trí nhất định trong genome của thực vật cũng có khả năng loại bỏ các gen chọn
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>